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CN100471486C - 免疫调节组合物,其制备方法和使用方法 - Google Patents

免疫调节组合物,其制备方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的免疫调节组合物，它包含阳离子缩合剂、免疫调节化合物和稳定剂。与没有配制在本发明组合物中的免疫调节化合物相比，本发明的组合物通常形成了免疫调节活性提高的颗粒。本发明还提供了制备该组合物的方法以及该组合物的治疗用途方法。

Description

免疫调节组合物，其制备方法和使用方法
技术领域
本发明涉及免疫调节制剂，该免疫调节制剂的制备方法以及使用方法。具体地说，本发明涉及免疫调节制剂，它包含阳离子缩合剂、免疫调节化合物(IMC)以及稳定剂。本发明还涉及给予免疫调节制剂来调节至少一种免疫应答。
背景技术
针对感染或其它抗原性攻击而产生的免疫应答的类型通常可根据该应答中参与的T辅助(Th)细胞的亚组来区分。Th1亚组负责典型的细胞介导免疫功能，如迟发型超敏性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的激活，而Th2亚组则是更有效地起B细胞激活辅助物的功能。对抗原的免疫反应类型通常受细胞响应该抗原而产生的细胞因子的影响。Th1和Th2细胞分泌的细胞因子的差别被认为是反映了这两个亚组的不同生物学功能。例如参见，Romagnani(2000)Ann.Allergy Asthma Immunol.85：9-18。
Th1亚组特别适合对病毒感染、胞内病原体以及肿瘤细胞发生反应，因为它分泌IL-2和IFN-γ，而这些物质激活CTL。Th2亚组则更适合对自由生活的细菌和肠道寄生虫发生反应，它能介导变态反应，因为已经知道IL-4和IL-5分别诱导IgE产生和嗜酸性粒细胞的激活。通常，Th1和Th2细胞分泌不同的细胞因子类型，因此一类反应能够中和另一类反应的活性。Th1/Th2平衡的移动能导致例如变态反应，或者导致CTL反应增加。
对于许多感染性疾病如结核病和疟疾，Th2型反应对于感染几乎没有保护力。建议的疫苗采用了衍生自靶抗原的小肽以及其它目前使用的抗原剂而避免使用有潜在感染性的完整病毒颗粒，但是其并不能引发达到治疗效果所需的免疫反应(免疫应答)。这种缺陷的一个不幸例子是缺少在治疗上有效的人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗。基于蛋白质的疫苗通常诱导Th2-型免疫反应，其特征是有高滴度的中和抗体，但是没有明显的细胞介导的免疫力。
而且，在某些症状中，一些类型的抗体反应是不合适的，这在IgE抗体反应导致过敏休克的变态反应中尤为显著。通常，变态反应也涉及Th2-型免疫反应。包括变应性哮喘在内的变态反应的特征是有在接触变应原后数秒至数分钟内发生的特征是细胞脱颗粒的早期反应，以及在4至24小时后发生的特征为嗜酸性粒细胞渗透入接触变应原的部位的晚期反应。具体地说，在变态反应的早期，变应原与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的IgE抗体交联，从而引发脱颗粒，而随后从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中释放出组胺以及其它炎症介导物。在晚期反应期间，嗜酸性粒细胞渗入接触变应原的部位，从而导致组织损失和功能障碍。
对变应性疾病的抗原免疫治疗是皮下注射少的但是逐渐增加量的抗原。这种免疫治疗防止了诱导产生IgE-介导的过敏反应的发生，但是不能有效地解决变态反应后期反应的细胞因子介导的行为。因此，到目前为止，该方法获得了有限的成功。
通过给予某些DNA序列(通常称为免疫刺激序列或“ISS”)，诱导产生了偏向Th1型的免疫反应(通过Th1-相关细胞因子的分泌来表明)。将免疫刺激多核昔酸和抗原的给药产生了针对所给予的抗原的Th1型免疫反应。Roman等人(1997)Nature Med.3：849-854。例如，真皮内注射了以盐水或佐剂明矾配制的大肠杆菌β半乳糖苷酶(β-Gal)的小鼠的反应是产生了特异性IgG1和IgE抗体以及分泌IL-4和IL-5但不分泌IFN-γ的CD4+细胞，这表明T细胞主要是Th2亚组。然而，皮内(或用齿形皮肤刮擦涂药器)注射了编码β-Gal并含有ISS的质粒DNA的小鼠的反应是产生了IgG2a抗体和分泌IFN-γ但不分泌IL-4和IL-5的CD4+细胞，表明T细胞主要是Th1亚组。另外，注射了质粒DNA的小鼠的特异性IgE产生减少66-75％。Raz等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5141-5145。通常，对裸DNA免疫的反应的特征是受抗原激活的CD4+T细胞产生IL-2、TNFα和IFN-γ，其表明是Th1型反应。如减少的IgE产生所表明的，这是治疗过敏和哮喘中特别重要的。免疫刺激多核苷酸刺激Th1型免疫反应的能力用细菌抗原、病毒抗原和变应原得到了证明(例如参见，WO 98/55495)。令人感兴趣的是，ISS通过细胞表面受体(Toll样受体或TLR9)作用，但是最近的一个报道提示ISS的内化是激活TLR9所需要的。Chuang等人，2002，J.Leukoc.Biol.71(3)：538-44；Ahmad-Nejad等人，2002，Eur.J.Immunol.32(7)：1958-68。
其它基于DNA的治疗方法在DNA作用前必需内化。尽管某些组织能摄取有限量的核酸(Wolff，1997，Neuromuscul.Disord.7(5)：314-8)，但是更多的注意力放在了提高基因治疗和反义构建物内化的制剂上。这些制剂通常包括使用一种阳离子来使DNA和一种或多种脂质(通常脂质体形式)缩合，以促进膜融合。例如，Semple等人，2001，Bioch.Biophys.Acta 1510：152-166，Cappaccioli等人，1993，Bioch.Biophys Res.Comm.197(2)：818-25，Maurer等人，2001，Biophys.J.80：2310-26，Shi等人，2001，Nucl.Acid Res.29(10)：2079-87，和Meyer等人，1998，J.Biol.Chem.273(25)：15621-27，它们均公开了在体外在含血清的培养基内使用阳离子脂质/DNA的组合物。其它阳离子/DNA组合已经在含血清培养基中作了测试，包括DNA和聚-L-赖氨酸(Ginobbi等人，1997，Anticancer Res.17：29-36，Stewart等人，199，Mol.Pharmacol.50：1487-94，和Gonzalez-Ferreiro等人，2001，J.Controlled Release 73：381-90)，阳离子型肽(Junghans等人，2000，Nucl.Acid Res.28(10)：e45，Wyman等人，1997，Biochemistry36：3008-17)，聚合的阳离子型洗涤剂(Dauty等人，2001，J.Am.Chem.Soc.123(38)：9227-34)，聚氨基脂质(Guy-Caffey等人，1995，J.Biol.Chem.270(52)：31391-96)，阳离子嵌段共聚物(Kabanov等人，1995，Bioconj.Chem.6(6)：639-43)，以及阳离子树突状聚合物(dendrimer)(Bielinska等人，1996，Nucl.Acid Res.24(11)：2176-82，Yoo等人，1999，Pharmaceut.Res.16(12)：1799-1804)。Legendre等人在Proc.Nat’l Acad.SciUSA 90：893-97(1993)中公开了使用几种不同的阳离子(包括阳离子性抗生素禾头孢素(gramidin)S以及多粘菌素B)来提高基因治疗构建物的转导。美国专利No.5,744,166公开了聚阳离子聚合物和DNA的药物组合物，其可任选地含有泊洛沙姆407或明胶。Chavany等人(1992，Pharmaceut.Res.9(4)：441-49)公开了非离子型洗涤剂(泊洛沙姆188)对于含有烷基三甲铵盐(CTAB)和DNA的制剂的影响。另外，国际专利申请No.WO 01/15726公开了带电荷脂质和ISS的组合。
发明概述
本发明涉及用于调节个体尤其是人体内免疫反应的新的组合物和方法。申请人发现，该新的免疫调节组合物具有显著提高的免疫调节活性。
本发明一方面涉及一种组合物，它包含阳离子缩合剂、免疫调节化合物(IMC)以及稳定剂。另一方面，本发明涉及包含阳离子缩合剂、免疫调节化合物(IMC)以及稳定剂的颗粒组合物。本发明还包括药物组合物，其包含本发明的免疫调节组合物以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本发明的组合物还可包括或任选地排除其它组分，包括脂肪酸和/或抗原分子。
本发明另一方面涉及调节个体内免疫反应的方法，该方法包括将本发明免疫调节组合物给予该个体，其给予的量足以调节所述个体内的免疫反应。根据本发明方法进行免疫调节可实施在个体上，这些个体包括患有Th2型免疫反应相关疾病(如过敏或变应原诱导的哮喘)的个体、接受疫苗如治疗性疫苗(如包含变应原表位、分枝杆菌表位或肿瘤相关表位的疫苗)或预防性疫苗的个体、患癌症的个体、患感染性疾病的个体以及有可能接触传染性因子的个体。
本发明另一方面涉及增加个体内γ干扰素(IFN-γ)的方法，该方法包括将有效量的本发明免疫调节组合物给予该个体。本发明的免疫调节组合物的给予增加了该个体内的IFN-γ。适合这些方法的对象包括患有自发性肺纤维化(IPF)、硬皮病、辐射诱导的皮肤纤维化、肝纤维化(包括血吸虫诱导的肝纤维化)、肾纤维化以及可通过给予IFN-γ来改善的其它病症的对象。
本发明另一方面涉及一种增加个体内IFN-α的方法，该方法包括将有效量的本发明免疫调节组合物给予该个体。本发明的免疫调节组合物的给予增加了该个体内的IFN-α水平。适合这些方法的对象包括患有对IFN-α的给予有应答反应的疾病(包括病毒感染和癌症)的对象。
本发明另一方面涉及缓解感染性疾病的一种或多种症状的方法，该方法包括将有效量的本发明免疫调节组合物给予患感染性疾病的个体。本发明的免疫调节组合物的给予缓解了该感染性疾病的一种或多种症状。可用本发明来治疗的感染性疾病包括由细胞病原体引起的感染性疾病(例如分枝杆菌疾病、疟疾、利什曼病、弓形虫病、血吸虫病或华支睾吸虫病)，可包括或排除病毒性疾病。
本发明还涉及进行本发明方法的药盒。本发明的药盒通常包含一个容器，该容器有本发明的免疫调节组合物(或如本文所述的，用于产生本发明免疫调节组合物的材料)，并任选地包括一说明书，该说明书是关于该免疫调节组合物在例如当个体患有与Th2型免疫反应相关的疾病(例如变态反应或变应原诱导的哮喘)时、当个体接受疫苗如治疗性疫苗(如包含变应原表位、分枝杆菌表面或肿瘤相关表位的疫苗)或预防性疫苗时，当个体患有癌症时，当个体患感染性疾病时，或当个体有可能接触传染性因子时，对个体进行免疫调节。
本发明还提供了制备本发明制剂的方法，该方法包括将免疫调节化合物(IMC)、稳定剂和阳离子缩合剂组合起来制成一混合物。在一些实施方案中，制备本发明制剂的方法包括将免疫调节化合物(IMC)与稳定剂组合起来制成初步的混合物，然后在该最初混合物内加入阳离子缩合剂制成免疫调节组合物。本发明还提供了用这些方法制得的免疫调节制剂。
发明详述
本发明人已经发现了新的组合物和方法来调节个体、包括且尤其是人体内的免疫应答反应。本发明的组合物包含阳离子缩合剂、免疫调节化合物(IMC)和稳定剂的颗粒复合物。令人惊奇的是，本发明者发现IMC和阳离子缩合剂以及稳定剂一起配制后其免疫调节活性比该免疫调节化合物单独时有显著增加。
通用术语
除非另有所述，本发明的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些均是本领域技术人员所知道的。这些技术在例如以下文献中有充分的描述：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，second edition(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller & M.P.Calos编，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(FM.Ausubel等编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等编，1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1991)；The Immunoassay Handbook(D.Wild编，Stockton Press NY，1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson编，AcademicPress，1996)；和Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert，和N.A.Staines编，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)。
定义
本文所用的单数形式“一个(种)”和“这个(种)”包括指代复数，除非另有所述。例如，“一个(种)”IMC包括一个(种)或多个(种)IMC。
本文所用的术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换，其包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)，单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)、经修饰的寡核苷酸和寡核苷或其组合。寡核苷酸的构型可以呈线形或环状，或者寡核苷酸可有线性和环形的片段。寡核苷酸是由核苷通常通过磷酸酯键连接而成的聚合物，但是寡核苷酸中也可采用其它连接键如硫代磷酸酯键。核苷由嘌呤(腺嘌呤、鸟嘌呤或肌苷或其衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶或其衍生物)碱基与糖相连而组成。DNA中的四种核苷单元(或碱基)称为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶。核苷酸是核苷的磷酸酯。
本文采用单字母来表示核苷酸序列的碱基，其中A表示腺嘌呤、G是鸟嘌呤、C是胞嘧啶、T是胸腺嘧啶、U是尿嘧啶、I是肌苷、R是嘌呤、Y是嘧啶。
本文所用的术语“ISS”指能在体外、体内和/或活体外引起可测定的免疫应答反应的多核苷酸序列。可测定的免疫反应例子包括，但不局限于，抗原特异性抗体的产生、细胞因子的分泌、淋巴细胞群如NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞等的激活或扩增。较佳的是，ISS序列优先激活Th1型应答反应。用于本发明的多核苷酸含有至少一个ISS。本文所用的术语“ISS”也是含ISS多核苷酸的简称。
本文所用的术语“免疫调节”和“调节免疫反应”指免疫刺激性和免疫抑制性效应。免疫调节主要是免疫反应整体的定量变化，但是伴随免疫调节也会发生定性变化。根据本发明而免疫调节的免疫反应是偏向“Th1型”免疫反应而非“Th2型”免疫反应移动的免疫反应。Th1型应答反应通常被认为是细胞免疫系统(例如细胞毒性淋巴细胞)的反应，而Th2型应答反应通常是基于“体液”或抗体的。Th1型免疫反应通常具有对抗原的反应“迟发性超敏”的特征，并且可以在生物化学水平上通过Th1相关的细胞因子(如IFN-γ，IL-2，IL-12，和TNF-β以及IFN-α和IL-6)水平的增加来检测，但是Il-6也与Th2型反应相关。Th1型免疫反应通常伴随产生细胞毒性淋巴细胞(CTL)和低水平或短时的抗体产生。Th2型免疫反应通常伴有较高水平的抗体产生，包括IgE的产生，其没有或有很少的CTL产生，以及Th2相关细胞因子(如IL-4)的表达。因此，本发明的免疫调节可通过例如经本发明方法处理的个体内相对于未处理个体IFN-γ的增加和/或IgE产生的减少来识别。
术语“免疫调节”可以指颗粒组合物和/或多核苷酸。因此，即便当组合物所含的多核苷酸具有的序列在以单独多核苷酸形式存在时没有表现出相当的免疫调节活性，本发明的免疫调节组合物可能表现出免疫调节活性。在一些实施方案中，当本发明的免疫调节组合物的多核苷酸单独存在时，其没有“分离的免疫调节活性(独自的免疫调节活性)”或有“较差的分离的免疫调节活性”(即与颗粒组合物相比)。多核苷酸的“分离的免疫调节活性(独自的免疫调节活性)”是通过用表示免疫反应至少一个方面的标准试验(如本文所公开的那些)测定具有相同核酸骨架(例如硫代磷酸酯、磷酸二酯、嵌合体)的分离的多核苷酸的免疫调节活性来确定的。
本文所用的术语“免疫调节化合物”或“IMC”指具有免疫调节活性且具有含序列5′-CG-3′的核酸部分的分子。IMC可以由一含有多个ISS、由一个ISS组成或本身没有免疫调节活性的核酸部分组成。IMC可以由多核苷酸组成(“多核苷酸IMC”)，或可含有其它部分。因此，术语IMC包括嵌合的免疫调节化合物(“CIC”)，其中加入了两个或多个核酸部分，其中至少一个部分包含与非核苷酸间隔部分共价连接的序列5′-CG-3′。
本文所用的术语“免疫调节组合物”、“颗粒组合物”以及“免疫调节颗粒组合物”指含有阳离子缩合剂、IMC和稳定剂的组合物。
术语“抗原”指被抗体或T细胞抗原受体识别并与之特异性结合的物质。抗原可包括肽、蛋白质、糖蛋白、多糖、碳水化合物复合物、糖、神经节苷脂、脂质和磷脂，以及其部分和其组合。抗原可以是那些天然发现的或是合成的抗原。适合包括在本发明组合物内的抗原包括能引发B细胞或T细胞抗原特异性反应的任何分子。较佳的是，抗原引发了对抗原有特异性的抗体的应答反应。半抗原包括在“抗原”的范围内。半抗原是低分子量的化合物，其本身没有免疫原性，但是当其与含有抗原决定簇的免疫原性分子偶联时其被赋予了免疫原性。小分子可能需要进行半抗原化以赋予其抗原性。本发明抗原宜包括肽、脂质(如甾醇、脂肪酸以及磷脂)、多糖(如流感嗜血菌疫苗中所用的那些多肽)、神经节苷脂和糖蛋白。
“佐剂”指这样的物质，当其加入免疫原性制剂(如抗原)中后，它非特异性地增强了受体宿主接触该混合物后对于该制剂的免疫反应。
术语“肽”是多肽，其具有足够的长度和一定组成来实现生物学反应，例如产生抗体或细胞因子活性，无论该肽是否是半抗原。肽长度通常有至少6个氨基酸残基。术语“肽”还包括经修饰的氨基酸(无论是天然还是非天然存在的)，这些修饰包括但不局限于磷酸化、糖基化、PEG化、脂质化和甲基化。
“抗原性肽”包括纯化的天然肽、合成肽、重组肽、肽粗提物或处于部分纯化或未纯化的活性状态的肽(如作为减毒或灭活病毒、细胞或微生物一部分的肽或这些肽的片段)。因此，“抗原性肽”或“抗原多肽”指表现出一种或多种抗原性的整个或部分多肽。因此，例如“Amb a 1抗原性多肽”或“Amb a 1多肽抗原”是来自表现出抗原性(即与抗体或T细胞受体特异性结合)的Amb a 1的氨基酸序列，不管它是整个序列还是序列的一部分和/或修饰序列。
“对抗原的变态反应”指一种免疫反应，其特征通常是产生嗜酸性粒细胞和/或抗原特异性IgE及其所得的效应。如本领域所熟知的，IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受体结合。在以后接触IgE所识别的抗原时，抗原与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE交联，导致这些细胞脱颗粒(包括但不局限于组胺释放)。可以理解和预计，术语“对抗原的变态反应”、“过敏反应”、“变应性疾病”是同等适用于本发明的某些方法的。而且，可以理解并预计本发明的方法包括那些同样适合预防变态反应以及治疗先前存在的变应性疾病的方法。
本文所用的术语“变应原”指通常为蛋白质的抗原或分子的抗原性部分，它在与对象接触后引发变应性反应。通常该对象对于变应原有变态反应，这可通过丘疹以及发红(flare)试验或本领域已知的方法来显示。即便只有少数对象在接触该分子后表现出变应性(例如IgE)免疫反应，仍称该分子是变应原。许多分离的变应原是本领域中已知的。它们包括但不局限于本文表1所提供的那些。
术语“脱敏”指给予表现出过敏反应的对象增加剂量的变应原的过程。用于脱敏的变应原剂量的例子是本领域中已知的，例如参见，Fornadley(1998)Otolaryngol.Clin.North Am.31：111-127。
“抗原特异性免疫治疗”指涉及抗原并产生免疫反应的抗原特异性调节的任何形式的免疫治疗。就变应原而言，抗原特异性免疫治疗包括但不局限于脱敏治疗。
“个体”是脊椎动物，较佳的是哺乳动物，更佳的是人。哺乳动物包括但不局限于人、灵长动物、农场动物、运动场动物、啮齿类动物和宠物。脊椎动物还包括但不局限于鸟类(即禽类)和爬行动物。
物质的“有效量”或“充足量”是该量足以实现有利的或所需的结果，包括临床结果。因此，“有效量”取决于其施用时的情况。在给予调节对抗原的免疫反应的组合物的情况下，有效量的免疫调节制剂是，与单独给予抗原时获得的免疫反应相比，该量足以实现这样的调节。有效量可以通过一次或多次给药来给予。
本文所用的术语“共同给予”指至少两种不同物质的给药时间足够地靠近，以调节免疫反应。较佳的是，共同给药指同时给予至少两种不同的物质。
免疫反应如Th1反应的“刺激”指反应的增加，它可以是反应的引发和/或增强。
“IgE相关疾病”是这样的生理症状，其部分特征是有持续或不持续的升高的IgE水平。IgE相关疾病包括但不局限于过敏和变态反应、过敏相关疾病(下述)、哮喘、鼻炎、结膜炎、风疹、休克、膜翅目刺痛过敏以及药物过敏和寄生虫感染。该术语还包括这些疾病的相关表现。这些疾病中的IgE通常是抗原特异性的。
“过敏相关疾病”指由抗原特异性IgE免疫反应的结果引起的疾病。这些结果可包括但不局限于低血压和休克。过敏症是过敏相关疾病的一个例子，在其期间组胺被释放到循环系统内，引起血管扩张以及毛细管渗透性提高，从而导致血循环大量失去血浆。过敏症可以是全身发病(所伴随的效应发生在整个身体上)，也可以是局部发病(反应局限于特定的靶组织或器官)。
本文所用的术语“病毒(性)疾病”指以病毒为病因制剂的疾病。病毒性疾病的例子包括乙肝、丙肝、流感、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和带状疱疹。
本文所用的且本领域熟知的术语“治疗”是一种获得有利的或需要的结果(包括临床结果)的方法。在本发明中，有利的或希望的临床结果包括，但不局限于，一种或多种症状的缓解或缓和、病情减轻、病情稳定(即不再恶化)、防止疾病扩散、延迟或减缓疾病的进展、缓解或减轻疾病状况、以及消除疾病(部分或全部)，这些结果是可检测的或不能检测的。“治疗”还指与不接受治疗所预计的存活相比存活时间延长。
疾病的“减轻”指与未治疗疾病相比，疾病或病情的程度和/或不希望的临床表现减少了，和/或进展的时间历程减缓或延长了。尤其是在变态反应的情况下，如本领域技术人员所熟知的，减轻不一定通过给予一剂就能发生，而通常是在给予一系列剂量后发生的。因此，足以减轻反应或疾病的量可以一次或多次给予。
由本发明免疫调节组合物引发的“抗体滴度”或“抗体量”指在给予免疫调节组合物后某时间点测得的给定抗体的量。
“Th1相关抗体”是这样的抗体，它的产生和/或增加与Th1免疫反应相关。例如，IgG2a在小鼠内是Th1相关抗体。在本发明中，Th1相关抗体的测定可以是对一种或多种此类抗体的测定。例如，在人体内，Th1相关抗体的测定可以测定IgG1和/或IgG3。
“Th2相关抗体”是这样的抗体，它的产生和/或增加与Th2免疫反应相关。例如，IgG1在小鼠内是Th2相关抗体。在本发明中，Th2相关抗体的测定可以是对一种或多种此类抗体的测定。例如，在人体内，Th2相关抗体的测定可以测定IgG2和/或IgG4。
“抑制”某功能或活性(如细胞引子产生、抗体产生或组胺释放)是指，当与其它条件相同只是感兴趣参数不同的情况相比，或与另一状况相比，功能或活性减少。例如，本发明的免疫调节组合物和抑制组胺释放的抗原一起给予或包含该抗原后，组胺的释放比单独抗原所诱导的组胺释放减少了。
“血清蛋白质”是在未患疾病的哺乳动物(尤其是未患疾病的牛)的血清内通常发现的蛋白质。最普遍的血清蛋白是血清白蛋白。
本文所用的术语“包含”及其同义词指的是包括的意思，即，等价于术语“包括”及其相应的同义词。
组合物
本发明提供用于调节个体内免疫反应的新的组合物。该新的组合物是包含阳离子缩合剂、IMC和稳定剂的制剂。在一些实施方案中，本发明的组合物还可包含抗原和/或脂肪酸。
本发明的组合物通常呈颗粒形式。如本领域技术人员所明显知道的，本发明的颗粒组合物由一群大小不同的颗粒组成。由于这一天然产生的差异，本发明组合物中的颗粒大小是用范围或以最大或最小直径来描述的。如果至少95％的颗粒(以质量计)符合指定的尺寸，则认为其具有该尺寸的颗粒(例如，如果至少97％的颗粒的直径小于20微米，则认为组合物由直径小于20微米的颗粒组成)。颗粒大小可用本领域已知的任何常规方法来测定，包括过滤(例如用“深”过滤来捕获大于截留尺寸的颗粒)、动态光散射、电子显微镜包括TEM(尤其是与冷冻破裂加工联合)和SEM等。
本发明的组合物宜包含直径小于约50微米的颗粒，更佳的是直径小于大约20微米的颗粒，但是在某些实施方案中，颗粒的直径可小于大约3、2或1微米。较佳的颗粒大小范围包括直径为大约0.01-50微米、0.02-20微米、0.05-5微米以及0.05-3微米。
本发明组合物的组分可以各种比例/量存在于组合物内，但是考虑稳定剂以及任选组分(如脂肪酸)与抗原的量保持相对不变，稳定剂通常在大约0.1-0.5％(v/v)范围内，脂肪酸在大约0-0.5％范围内，抗原浓度在大约0.1-100微克/毫升范围内，较佳在大约1-100微克/毫升，更佳在大约10-50微克/毫升范围内。在本发明组合物中，IMC和阳离子缩合剂的量和比例可在较大的范围内变化。IMC的用量在某种程度上根据IMC的分子量而变，通常在大约50微克/毫升至2毫克/毫升范围内，较佳在大约100微克/毫升至1毫克/毫升范围内。阳离子缩合剂存在的量通常超过IMC(以质量计)，通常的比例为大约1∶2(IMC：阳离子缩合剂)至1∶6，更佳的约为2∶5至1∶5。
本发明组合物的颗粒大小是随许多变量而变的函数。发明人发现，组合物颗粒的大小分布可通过改变阳离子缩合剂与IMC之比来调节。例如，在列举性的+ISS/0.4％吐温85/0.4％油酸酯/多粘菌素B的组合物中，改变阳离子缩合剂与IMC之比可以使平均粒径从阳离子缩合剂：IMC为1时的大约1.5微米变为阳离子缩合剂：IMC为10时的大约45微米。
在某些实施方案中，该组合物包含阳离子缩合剂、IMC以及作为稳定剂的非离子型洗涤剂。在其它实施方案中，该组合物包含使膜破裂的阳离子型脂肽(较佳的是多粘菌素，更佳的是多粘菌素B(PMXB))、IMC和稳定剂。在一些实施方案中，所述稳定剂不是血清蛋白质(尤其不是牛血清蛋白质)。此类实施方案的一个典型组合物采用了多氧乙烯醚洗涤剂如吐温80或吐温85作为稳定剂，用油酸酯作为任选的额外稳定剂。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含免疫调节颗粒，其中该颗粒是通过将阳离子缩合剂、IMC和作为稳定剂的非离子型洗涤剂相混合起来而制得。在其它实施方案中，本发明的组合物包含免疫调节颗粒，其中该颗粒是通过将膜破裂阳离子型脂肽(较佳的是多粘菌素，更佳的是PMXB)、IMC和稳定剂混合起来而制得的。在一些实施方案中，稳定剂不是血清蛋白(尤其不是牛血清蛋白质)。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含免疫调节颗粒，其中该颗粒是通过将IMC和作为稳定剂的非离子型洗涤剂混合起来形成IMC/稳定剂混合物、然后将阳离子缩合剂与该IMC/稳定剂混合物合并起来而形成的。在其它实施方案中，本发明的组合物包含免疫调节颗粒，其中该颗粒是通过将IMC和稳定剂混合起来形成IMC/稳定剂混合物、然后将膜破裂阳离子脂肽(较佳的是多粘菌素，更佳的是PMXB)与该IMC/稳定剂混合物合并起来而形成的。在某些方案中，稳定剂不是血清蛋白(尤其不是牛血清蛋白质)。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含免疫调节颗粒，其中该颗粒包含阳离子缩合剂、IMC和作为稳定剂的非离子型洗涤剂。在其它实施方案中，本发明的组合物包含免疫调节颗粒，其中颗粒包含膜破裂阳离子脂肽(较佳的是多粘菌素、更佳的是PMXB)IMC和稳定剂。在一些实施方案中，稳定剂不是血清蛋白质(尤其不是牛血清蛋白质)。
阳离子缩合剂
用于本发明组合物和方法阳离子缩合剂是在生理pH(即，pH约为7.0-7.5)下带正电荷的分子。较佳的是，用于本发明的阳离子缩合剂不是两性的，是聚阳离子的，即每个分子有多个正电荷。用于本发明的阳离子缩合剂包括亲水性或两性聚阳离子。
较佳的阳离子缩合剂包括：(a)膜破裂阳离子脂肽，其包括但不局限于，多粘菌素A、多粘菌素B(包括多粘菌素B1和多粘菌素B2)、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E(也称为粘杆菌素)、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S和多粘菌素T；环杆菌素类、包括环杆菌素A、环杆菌素B、环杆菌素C、环杆菌素D、环杆菌素E和环杆菌素F；八肽素(octapeptin)；两性霉素类，包括两性霉素B以及乙酰化肽，包括辛酰基-KFFKFFKFF和酰基KALA(辛酰基-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA；(b)膜破裂阳离子肽，包括但不局限于多粘菌素B(PMXB)九肽；杀菌肽类包括杀菌肽A，杀菌肽B和杀菌肽P1，KFFKFFKFF和KALA(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)；(c)单链阳离子表面活性剂，包括但不局限于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，苄基-二甲基-溴化铵(BDAB)、CpyrB(十六烷基-溴化吡啶鎓)，CimB(十六烷基溴化咪唑鎓)；和聚阳离子性聚合物，包括但不局限于，聚-L-赖氨酸(PLL)和聚乙烯胺(PEI)。在某些实施方案中，阳离子缩合剂是膜破裂阳离子脂肽，较佳的是多粘菌素，更佳的是PMXB。在一些实施方案中，阳离子缩合剂可不包括脂肪酸酯(即，脂质)和双链阳离子表面活性剂。
免疫调节化合物
根据本发明，免疫调节化合物(IMC)是具有免疫调节活性且包含具有序列5′-CG-3′的核酸部分的分子。IMC可以是多核苷酸，或是掺入了核酸部分且其中至少一个包含序列5′-CG-3′如CIC的化合物。当IMC是多核苷酸时，该多核苷酸可含有至少一个ISS，也可含有多个ISS。ISS可以和多核苷酸毗连，或是在该多核苷酸内隔开有其它核苷酸碱基。在某些实施方案中，IMC由一个ISS组成。因此多核苷酸IMC可含有本文所述的任何一个或多个ISS的组合。或者，IMC可以是包含至少两个核酸部分的CIC，其中至少一个包含与间隔臂部分共价连接的序列5′-CG-3′。当作为本发明免疫调节组合物的一个组分给予时，IMC影响了在体外、体内和/或活体外可测定的免疫反应。
多核苷酸IMC可以有大于6个碱基或碱基对的任何长度，其通常包含序列5′-胞嘧啶，鸟嘌呤-3′，较佳的是大于15个碱基或碱基对，更佳的是大于20个碱基或碱基对。如本领域中所熟知的，5′-胞嘧啶，鸟嘌呤-3′中的胞嘧啶通常是非甲基化的，尤其是在C-5位，但是在某些实施方案中，胞嘧啶允许甲基化，例如在N-4位。多核苷酸IMC还可包含序列5′-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3′。多核苷酸IMC还可包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，C-3’。如下文多核苷酸序列所示，多核苷酸IMC可包含(即，含有一个或多个)序列5’-T，C，G-3’或5’-T，C，G，A-3’。因此，多核苷酸IMC可包含5′-CG-3′和/或5’-TCG-3’和/或5’-TCGA-3’，在某些实施方案中，尿嘧啶(U)可以代替胸腺嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸IMC可包含序列5’-C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3’(例如5’-CGTTCG-3’)。在一些实施方案中，多核苷酸IMC可包含序列5’-C，G，嘧啶，嘧啶，C，G，嘌呤，嘌呤-3’。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶-3’(例如5’-AACGTT-3’)。如下文进一步讨论的，多核苷酸IMC可含有5-溴胞嘧啶以代替ISS中5′-CG-3′，5’-TCG-3’，5’-TCGA-3’，5’-UCG-3’，或5’-UCGA-3’中的＂C＂。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC可包含序列5’-嘌呤，T，C，G，嘧啶，嘧啶-3’。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：GACGCTCC；GACGTCCC；GACGTTCC；GACGCCCC；AGCGTTCC；AGCGCTCC；AGCGTCCC；AGCGCCCC；AACGTCCC；AACGCCCC；AACGTTCC；AACGCTCC；GGCGTTCC；GGCGCTCC；GGCGTCCC；GGCGCCCC；GACGCTCG；GACGTCCG；GACGCCCG；GACGTTCG；AGCGCTCG；AGCGTTCG；AGCGTCCG；AGCGCCCG；AACGTCCG；AACGCCCG；AACGTTCG；AACGCTCG；GGCGTTCG；GGCGCTCG；GGCGTCCG；GGCGCCCG。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：GACGCT；GACGTC；GACGTT；GACGCC；GACGCU；GACGUC；GACGUU；GACGUT；GACGTU；AGCGTT；AGCGCT；AGCGTC；AGCGCC；AGCGUU；AGCGCU；AGCGUC；AGCGUT；AGCGTU；AACGTC；AACGCC；AACGTT；AACGCT；AACGUC；AACGUU；AACGCU；AACGUT；AACGTU；GGCGTT；GGCGCT；GGCGTC；GGCGCC；GGCGUU；GGCGCU；GGCGUC；GGCGUT；GGCGTU.
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：GABGCT；GABGTC；GABGTT；GABGCC；GABGCU；GABGUC；GABGUU；GABGUT；GABGTU；AGBGTT；AGBGCT；AGBGTC；AGBGCC；AGBGUU；AGBGCU；AGBGUC；AGBGUT；AGBGTU；AABGTC；AABGCC；AABGTT；AABGCT；AABGUC；AABGUU；AABGCU；AABGUT；AABGTU；GGBGTT；GGBGCT；GGBGTC；GGBGCC；GGBGUU；GGBGCU；GGBGUC；GGBGUT；GGBGTU，其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：GABGCTCC；GABGTCCC；GABGTTCC；GABGCCCC；AGBGTTCC；AGBGCTCC；AGBGTCCC；AGBGCCCC；AABGTCCC；AABGCCCC；AABGTTCC；AABGCTCC；GGBGTTCC；GGBGCTCC；GGBGTCCC；GGBGCCCC；GABGCTCG；GABGTCCG；GABGCCCG；GABGTTCG；AGBGCTCG；AGBGTTCG；AGBGTCCG；AGBGCCCG；AABGTCCG；AABGCCCG；AABGTTCG；AABGCTCG；GGBGTTCG；GGBGCTCG；GGBGTCCG；GGBGCCCG；GABGCTBG；GABGTCBG；GABGCCBG；GABGTTBG；AGBGCTBG；AGBGTTBG；AGBGTCBG；AGBGCCBG；AABGTCBG；AABGCCBG；AABGTTBG；AABGCTBG；GGBGTTBG；GGBGCTBG；GGBGTCBG；GGBGCCBG，其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：GABGCUCC；GABGUCCC；GABGUTCC；GABGTUCC；GABGUUCC；AGBGUUCC；AGBGTUCC；AGBGUTCC；AGBGCUCC；AGBGUCCC；AABGUCCC；AABGUUCC；AABGUTCC；AABGTUCC；AABGCUCC；GGBGUUCC；GGBGUTCC；GGBGTUCC；GGBGCUCC；GGBGUCCC；GABGCUCG；GABGUCCG；GABGUUCG；GABGUTCG；GABGTUCG；AGBGCUCG；AGBGUUCG；AGBGUTCG；AGBGTUCG；AGBGUCCG；AABGUCCG；AABGUUCG；AABGUTCG；AABGTUCG；AABGCUCG；GGBGUUCG；GGBGUTCG；GGBGTUCG；GGBGCUCG；GGBGUCCG；GABGCUBG；GABGUCBG；GABGUUBG；GABGUTBG；GABGTUBG；AGBGCUBG；AGBGUUBG；AGBGUCBG；AGBGUTBG；AGBGTUBG；AABGUCBG；AABGUUBG；AABGUTBG；AABGTUBG；AABGCUBG；GGBGUUBG；GGBGUTBG；GGBGTUBG；GGBGCUBG；GGBGUCBG，其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些实施方案中，免疫调节化合物包含序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)。在其它实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：
5’-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：2)；
5’-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3’(SEQ ID NO：3)；
5’-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：4)；
5’-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3’(SEQ ID NO：5)；
5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO：6)，其中B是5-溴胞嘧啶；
5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：7)，其中B是5-溴胞嘧啶；
5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3’(SEQ ID NO：8)，其中B是5-溴胞嘧啶；
5’-GAAABGUTCG-3’(SEQ ID NO：9)，其中B是5-溴胞嘧啶；
5’-BGAABGUTCG-3’(SEQ ID NO：10)，其中B是5-溴胞嘧啶；
5’-TCGAGCGTTCT-3’(SEQ ID NO：11)；
5’-TGAACGUTCG-3’(SEQ ID NO：12)；
5’-GAACCGTTCG-3’(SEQ ID NO：13)；
5’-CGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO：14)；
5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’(SEQ ID NO：15)；
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO：16)；
5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’(SEQ ID NO：17)；
5’-TCGTCGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO：18)；
5’-TCGTCGAACGTT-3’(SEQ ID NO：19)；
5’-TCGAACGTTC-3’(SEQ ID NO：20)，以及
5’-TCGTCGAT-3’。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC可以有7个碱基(或碱基对)或更多。因此，在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含或由下式的序列组成：5’-TCGX1X2X3X4-3’或5’-UCGX1X2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：5’-TCGTTTT-3’；5’-TCGAAAA-3’；5’-TCGCCCC-3’；5’-TCGGGGG-3’；5’-TCGUUUU-3’；5’-TCGIIII-3’；5’-UCGTTTT-3’；5’-UCGAAAA-3’；5’-UCGCCCC-3’；5’-UCGGGGG-3’；5’-UCGUUUU-3’；5’-UCGIIII-3’。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含或由下式的序列组成：5’-X1TCGX2X3X4-3’或5’-X1UCGX2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：5’-TTCGTTT-3’；5’-ATCGATT-3’；5’-TUCGTTT-3’；5’-AUCGATT-3’。在其它实施方案中，多核苷酸IMC包含或由下式序列组成：5’-X1X2TCGX3X4-3’或5’-X1X2UCGX3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：5’-TTTCGTT-3’；5’-AATCGAT-3’；5’-TTUCGTT-3’；5’-AAUCGAT-3’。
在某些实施方案中，多核苷酸IMC包含下式的序列：5’-X1X2A X3C G X4T C G-3’(SEQ ID NO：21)其中X1是T，G，C或B(B＝5-溴胞嘧啶)，其中X2是T，G，A或U，其中X3是T，A或C，其中X4是T，G或U。在某些实施方案中，根据该式的多核苷酸IMC不包括5’-TGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO：22)或5’-GGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO：23)。
在其它实施方案中，多核苷酸IMC包含下式的序列：5’-X1X2A X3B G X4T CG-3’(SEQ ID NO：24)其中B是5-溴胞嘧啶，其中X1是T，G，C或B(B＝5-溴胞嘧啶)，其中X2是T，G，A或U，其中X3是T，A或C，其中X4是T，G或U。在某些实施方案中，根据该式的多核苷酸IMC不包括5’-TGAABGTTCG-3’(SEQ ID NO：25)(B＝5-溴胞嘧啶)。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含序列5’-TCGTCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在其它实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：5’-TCGTCGA-3’；5’-TCGTCGC-3’；5’-TCGTCGG-3’；5’-TCGTCGT-3’；5’-TCGTCGU-3’；5’-TCGTCGI-3’。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含序列5’-TCGUCGX1-3’，5’-UCGTCGX1-3’，或5’-UCGUCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：5’-TCGUCGA-3’；5’-TCGUCGC-3’；5’-TCGUCGG-3’；5’-TCGUCGT-3’；5’-TCGUCGU-3’；5’-TCGUCGI-3’；5’-UCGTCGA-3’；5’-UCGTCGC-3’；5’-UCGTCGG-3’；5’-UCGTCGT-3’；5’-UCGTCGU-3’；5’-UCGTCGI-3’；5’-UCGUCGA-3’；5’-UCGUCGC-3’；5’-UCGUCGG-3’；5’-UCGUCGT-3’；5’-UCGUCGU-3’；5’-UCGUCGI-3’。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含根据下式的序列：5’-T mC GX1X2X3X4-3’或5’-U mC GX1X2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸，mC是如本文所述的修饰的胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含根据下式的序列：5’-X1T mCGX2X3X4-3’或5’-X1U mC GX2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些实施方案中，ISS包含根据下式的序列：5’-X1X2T mC GX3X4-3’或5’-X1X2U mC GX3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含根据下式的序列：5’-T mC GTCGX1-3’，5’-T mC GUCGX1-3’，5’-U mC GTCGX1-3’或5’-U mC GUCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含根据下式的序列5’-TCGT mC GX1-3’，5’-UCGT mC GX1-3’，5’-TCGU mC GX1-3’或5’-UCGU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。在其它实施方案中，多核苷酸IMC包含根据下式的序列：5’-T mC GT mC GX1-3’，5’-U mC GT mC GX1-3’，5’-T mC GU mC GX1-3’或5’-U mC GU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。如本文所述，修饰的胞嘧啶(mC)包括在胞嘧啶的C-5和/或C-6增加吸电子部分，其包括但不局限于，C-5位卤化的胞嘧啶，例如5-溴胞嘧啶。
因此，在一些实施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一个：5’-TBGTTTT-3’；5’-TBGAAAA-3’；5’-TBGCCCC-3’；5’-TBGGGGG-3’；5’-TBGUUUU-3’；5’-TBGIIII-3’；5’-TBGTCGA-3’；5’-TBGTCGC-3’；5’-TBGTCGG-3’；5’-TBGTCGT-3’；5’-TBGTCGU-3’；5’-TBGTCGI-3’；5’-TCGTBGA-3’；5’-TCGTBGC-3’；5’-TCGTBGG-3’；5’-TCGTBGT-3’；5’-TCGTBGU-3’；5’-TCGTBGI-3’；5’-TBGTBGA-3’；5’-TBGTBGC-3’；5’-TBGTBGG-3’；5’-TBGTBGT-3’，5’-TBGTBGU-3’；5’-TBGTBGI-3’；其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC由序列5’-TCGTCGX1-3’组成，其中X1是核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸IMC由序列5’-TCGTCGA-3’；5’-TCGTCGC-3’；5’-TCGTCGG-3’；5’-TCGTCGT-3’；5’-TCGTCGU-3’；5’-TCGTCGI-3’组成。在一些实施方案中，多核苷酸IMC由序列5’-TCGUCGX1-3’，5’-UCGTCGX1-3’，或5’-UCGUCGX1-3’组成，其中X1是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下列序列的任一个组成：5’-TCGUCGA-3’；5’-TCGUCGC-3’；5’-TCGUCGG-3’；5’-TCGUCGT-3’；5’-TCGUCGU-3’；5’-TCGUCGI-3’；5’-UCGTCGA-3’；5’-UCGTCGC-3’；5’-UCGTCGG-3’；5’-UCGTCGT-3’；5’-UCGTCGU-3’；5’-UCGTCGI-3’；5’-UCGUCGA-3’；5’-UCGUCGC-3’；5’-UCGUCGG-3’；5’-UCGUCGT-3’；5’-UCGUCGU-3’；5’-UCGUCGI-3’。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下式的序列组成：5’-T mC GX1X2X3X4-3’或5’-U mC GX1X2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸，其中mC是如本文所述的修饰的胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下式的序列组成：5’-X1T mCGX2X3X4-3’或5’-X1U mC GX2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下式序列组成：5’-X1X2T mC GX3X4-3’或5’-X1X2U mCGX3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下式序列组成：5’-T mC GTCGX1-3’，5’-TmC GUCGX1-3’，5’-U mC GTCGX1-3’或5’-U mC GUCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下式序列组成：5’-TCGT mC GX1-3’，5’-UCGT mCGX1-3’.5’-TCGU mC GX1-3’或5’-UCGU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下式序列组成：5’-T mC GT mC GX1-3’，5’-U mC GT mCGX1-3’，5’-T mC GU mC GX1-3’或5’-U mC GU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。如本文所述，修饰的胞嘧啶(mC)包括在胞嘧啶的C-5和/或C-6位增加吸电子部分，其包括但不局限于，C-5位卤化的胞嘧啶，例如5-溴胞嘧啶。
因此，在一些实施方案中，多核苷酸IMC由下列序列的任一个组成：5’-TBGTTTT-3’；5’-TBGAAAA-3’；5’-TBGCCCC-3’；5’-TBGGGGG-3’；5’-TBGUUUU-3’；5’-TBGIIII-3’；5’-TBGTCGA-3’；5’-TBGTCGC-3’；5’-TBGTCGG-3’；5’-TBGTCGT-3’；5’-TBGTCGU-3’；5’-TBGTCGI-3’；5’-TCGTBGA-3’；5’-TCGTBGC-3’；5’-TCGTBGG-3’；5’-TCGTBGT-3’；5’-TCGTBGU-3’；5’-TCGTBGI-3’；5’-TBGTBGA-3’；5’-TBGTBGC-3’；5’-TBGTBGG-3’；5’-TBGTBGT-3’，5’-TBGTBGU-3’；5’-TBGTBGI-3’；其中B是5-溴胞嘧啶。
如本文所述，多核苷酸IMC的长度大于6个碱基或碱基对。因此，在一些实施方案中，多核苷酸IMC小于下列任一长度(碱基或碱基对)：10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；20；18；16；14。在一些实施方案中，多核苷酸IMC大于下列任一长度(碱基或碱基对)：6；7；8；10；12；14；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000。或者，多核苷酸IMC的大小可以有一个范围，该范围的上限为10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；20；18；或16，以及独立选择的下限7；8；10；12；14；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500，其中下限低于上限。
IMC的多核苷酸部分可有例如本领域所知的修饰，其包括但不局限于，3’OH或5’OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组分的修饰以及磷酸酯基团的修饰。下面描述各种此类修饰。
较佳的是，IMC的核苷酸部分中的胞嘧啶没有甲基化，但是在某些实施方案中，IMC可含有一个或多个甲基化的胞嘧啶。在这些实施方案中，核苷酸部分的5′-CG-3′中的胞嘧啶在C-5位没有甲基化。然而，在具有甲基化胞嘧啶的这些IMC中，可考虑对N-4位进行甲基化。
IMC的核苷酸部分可以是单链或双链DNA，以及单链或双链RNA或其它修饰的多核苷酸。IMC核苷酸部分可以包括或不包括一个或多个可存在于上述基序中的或可延伸在该基序外的回文区域，还可包含其它的侧接序列，其中的一些在本文有所描述。
IMC的核苷酸部分可含有天然存在的或经修饰的、非天然存在的碱基，可含有经修饰的糖、磷酸酯和/或末端。例如，磷酸酯修饰包括但不局限于，磷酸甲酯、硫代磷酸酯、亚磷酰胺(桥连的或非桥连的)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，这些修饰可以组合使用。例如参见，表8中列举的IMC。还可用其它非磷酸酯键。较佳的是，本发明的寡核苷酸包含磷酸二酯和/或硫代磷酸酯骨架。也可制备本领域已知的糖修饰，如2’-烷氧基-RNA类似物、2’-氨基-RNA类似物以及2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合体以及本文描述的其它修饰物，并与任何磷酸酯修饰组合。碱基修饰的例子包括，但不局限于，在ISS的胞嘧啶的C-5位和/或C-6位加入吸电子部分(例如5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶)。例如参见，国际专利申请No.WO 99/62923。
IMC的核苷酸部分可用本领域熟知的技术和核酸合成设备来合成，这些技术包括但不局限于酶方法、化学方法以及从较大的寡核苷酸的序列降解。例如参见，Ausubel等人(1987)；以及Sambrook等人(1989)。当用酶方法组装时，可用诸如T4 DNA或RNA连接酶等连接酶将各个单元连接起来。美国专利No.5,124,246。寡核苷酸降解可通过使寡核苷酸接触核酸酶来实现，例如美国专利No.4,650,675中所列举的那样。
IMC的核苷酸部分也可用常规的多核苷酸分离步骤来分离。这些步骤包括，但不局限于，使探针与基因组或cDNA文库杂交以检测共有的核苷酸序列，对表达库进行抗体筛选以检测共有的结构特征，以及用聚合酶链反应合成特定的天然序列。
环状多核苷酸IMC部分可以分离、用重组方法合成或用化学方法合成。当通过分离或重组方法获得环状多核苷酸IMC部分时，它宜为质粒。较小环状多核苷酸的化学合成可用文献中描述的任何方法来进行，例如参见Gao等人(1995)Nucleic AcidsRes.23：2025-2029；和Wang等人(1994)Nucleic Acids Res.22：2326-2333。
制备寡核苷酸和经修饰的寡核苷酸的技术是本领域中已知的。具有磷酸二酯键的天然存在的DNA或RNA通常是用以下方法来合成的：依次将合适的核苷亚磷酰胺连接到正在生长的3′端连于固相载体的寡核苷酸的5′-羟基上，然后使中间产物亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯。一旦合成了所需的寡核苷酸序列，从载体上取下寡核苷酸，将磷酸三酯去保护成磷酸二酯，用氨水或其它碱使核苷碱基去保护。例如参见，Beaucage(1993)“寡脱氧核糖核苷酸的合成(Oligodeoxyribonucleotide Synthesis)”，Protocols forOligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties(Agrawal编)Humana Press，Totowa，NJ；Warner等人(1984)DNA 3：401以及美国专利No.4,458,066。
IMC核苷酸部分还可含有磷酸酯修饰的寡核苷酸。含有经修饰的磷酸酯键或非磷酸酯键的多核苷酸的合成也是本领域已知的。关于综述可见Matteucci(1997)“寡核苷酸类似物回顾(Oligonucleotide Analogs：an Overview)”，Oligonucleotides as TherapeuticAgents，(D.J.Chadwick和G.Cardew编)John Wiley and Sons，New York，NY。在本发明的寡核苷酸中，可以与糖或糖类似物部分相连的磷酸衍生物(或经修饰的磷酸酯基团)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备及其掺入核苷酸、经修饰的核苷酸和寡核苷酸本身均是已知的，因此这里不再加以赘述。Peyrottes等人(1996)Nucleic Acids Res.24：1841-1848；Chaturvedi等人(1996)Nucleic Acids Res.24：2318-2323；以及Schultz等人(1996)Nucleic Acids Res.24：2966-2973。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸的合成与上述天然存在的寡核苷酸的合成相似，只是氧化步骤被硫化步骤代替(Zon(1993)“寡核苷硫代磷酸酯(Oligonucleoside Phosphorothioates)”Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Synthesis and Properties(Agrawal编)Humana Press，pp.165-190)。类似的，其它磷酸酯类似物的合成，例如磷酸三酯(Miller等人(1971)JACS 93：6657-6665)，非桥连的亚磷酰胺(Jager等人(1988)Biochem.27：7247-7246)，N3’至P5’的亚磷酰胺(Nelson等人(1997)JOC 62：7278-7287)以及二硫代磷酸酯(美国专利No.5,453,496)的合成也已有所描述。还可使用其它不基于磷酸的修饰的寡核苷酸(Stirchak等人(1989)Nucleic Acids Res.17：6129-6141)。具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸比具有磷酸二酯骨架的寡核苷酸更具免疫原性，且在注射入宿主体内后更具耐降解能力。Braun等人，(1988)J.Immunol.141：2084-2089；和Latimer等人(1995)Mol.Immunol.32：1057-1064。
用于本发明组合物的IMC的核苷酸部分可含有核糖核苷酸(含有核糖作为唯一或主要的糖组分)、脱氧核糖核苷酸(含有脱氧核糖作为主要的糖组分)，或者如本领域中已知的，核苷酸部分中可掺入经修饰的糖或糖类似物。因此，除了核糖和脱氧核糖，糖组分可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖以及糖“类似物”环戊基。糖可以是吡喃糖型或呋喃糖型。IMC核苷酸部分的糖部分宜为核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2′-O-烷基核糖的呋喃糖苷，糖可以α或β端基异构连接在各自的杂环碱基上。糖修饰物包括，但不局限于，2′-烷氧基-RNA类似物、2′-氨基-RNA类似物和2′-烷氧基或氨基-RNA/DNA嵌合体。这些糖或糖类似物的制备以及糖或类似物与杂环碱基(核酸碱基)本身相连而成的各个“核苷”是已知的，无需在此赘述，只需描述到这些制备物能与任何具体实施例相关的程度即可。在制备IMC的核苷酸部分时，还可制备糖修饰并与任何磷酸酯修饰组合。
掺入IMC核苷酸部分的杂环碱基或核酸碱基可以是天然存在的主要的嘌呤和嘧啶碱基(即上述的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、肌苷、腺嘌呤和鸟嘌呤)，以及所述主要碱基的天然存在的和合成的修饰物。
本领域技术人员会认识到，本领域中可获得大量包含各种杂环碱基和各种糖部分(以及糖类似物)的“合成的”非天然核苷，只要其能满足本发明的其它标准，那么IMC的核苷酸部分可包括除天然存在的核苷酸的主要5种碱基组分外的一种或数种杂环碱基。然而，核苷酸部分中的杂环碱基宜包括，但不局限于，尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基，2-氨基-4-氧吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基，2-氨基-4-氧吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤通过9位、嘧啶通过1-位、吡咯并嘧啶通过7-位、吡唑并嘧啶通过1-位与ISS的糖部分相连。
IMC的核苷酸部分可含有至少一个例如国际申请WO 99/62923中所述的经修饰的碱基。本文所用的术语“经修饰的碱基”是“碱基类似物”的同义词，例如“经修饰的胞嘧啶”与“胞嘧啶类似物”同义。类似地，“经修饰的”核苷或核苷酸在本文中定义为与核苷或核苷酸“类似物”同义。碱基修饰的例子包括但不局限于在ISS的胞嘧啶的C-5位和/或C-6位加入吸电子部分。该吸电子部分宜为卤素。经修饰的胞嘧啶可包括，但不局限于，氮胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯代的胞嘧啶、环胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、5，6-二氢胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羟基脲、5-硝基胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶以及任何其它嘧啶类似物或经修饰的嘧啶。较佳的经修饰的尿嘧啶是C-5和/或C-6位经过修饰的，较佳的是用卤素修饰，其包括但不局限于溴尿嘧啶例如5-溴尿嘧啶、氯尿嘧啶例如5-氯尿嘧啶、氟尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶、碘尿嘧啶例如5-碘尿嘧啶、以及羟基尿嘧啶。另见Kandimalla等人，2001，Bioorg.Med.Chem.9：807-813。例如参见，国际专利申请No.WO 99/62923。碱基修饰的其它例子包括在碱基内加入一个或多个硫醇基团，其包括但不局限于，6-硫代-鸟嘌呤，4-硫代-胸腺嘧啶以及4-硫代-尿嘧啶。另外，一些核苷酸部分可包含经修饰的碱基，如7-脱氮鸟苷代替任何鸟苷残基，或用选自N-乙基胞嘧啶或N-4-甲基胞嘧啶的修饰的胞嘧啶代替任何胞嘧啶残基，包括5′-CG-3′中的胞嘧啶。
碱基修饰的核苷的制备和用所述碱基修饰的核苷作为前体来合成经修饰的多核苷酸的方法在例如美国专利4,910,300，4,948,882，和5,093,232中有所描述。这些碱基经修饰的核苷经过设计，从而使得它们能用化学合成方法掺入寡核苷酸的二末端之一或内部。这些在寡核苷酸二末端之一或内部的碱基修饰的核苷可作为肽或其它抗原的连接位点。糖部分经修饰的核苷也已有描述(包括但不局限于，例如美国专利4,849,513，5,015,733，5,118,800，5,118,802)，其可用类似方法使用。
在某些实施方案中，IMC是嵌合的免疫调节化合物(“CIC”)，例如在2002年6月21日提交的共同拥有的美国专利申请No.10/176,883和10/177,826中描述的那些，这些文献均全部纳入本文作为参考。
CIC含有一个或多个核酸部分和一个或多个非核酸间隔臂部分。考虑将符合各种结构式的CIC用作IMC，包括在下式I-VII中描述的核心结构。式I-III显示了“线性CIC”的核心序列。式IV-VI显示了“支链CIC”的核心序列。式VII显示了“单间隔臂CIC”的核心结构。
在本文提供的每个式子中，“N”表示核酸部分(以5′到3′或3′到5′的方向排列)，“S”表示非核酸间隔臂部分。破折号(“-”)表示核酸部分和非核酸部分之间的共价键。双破折号(“--”)表示非核酸间隔臂部分和至少二个核酸部分之间的共价键。三破折号(“---”)表示非核酸间隔臂部分和多个(即至少3个)核酸部分之间的共价键。下标用来表示核酸或非核酸间隔臂部分处于不同位置。然而，用下标来区分不同的核酸部分并不意味着这些部分必须有不同的结构或序列。类似地，用下标区分不同的间隔臂部分并不意味着这些部分必须有不同的结构。例如，在下式II中，表示为N1和N2的核酸部分可以有相同或不同的序列，表示为S1和S2的间隔臂部分可以有相同或不同的结构。而且，在核心结构的末端还可共价连接额外的化学部分(例如磷酸酯、单核苷酸、额外的核酸部分、烷基、氨基、巯基或二硫键或连接基团和/或间隔臂部分)。
线性CIC具有核心结构中的非核酸间隔臂部分与不超过2个核酸部分共价连接的结构。典型线性CIC符合以下式子：
N1-S1-N2               (I)
N1-S1-N2-S2-N3         (II)
N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A   (III)
其中A是大约1-100之间的整数，[Nv-Sv]表示与非核酸间隔臂部分偶联的核酸部分的A个额外的重复。下标“v”表示N和S每个“[Nv-Sv]”重复中的N和S是独立选择的。“A”有时在1-10之间，有时在1-3之间，有时为确切的1，2，3，4或5。在一些实施方案中，A是在1，2，3，4，或5的下限和10，20，50或100的独立选择的上下的范围内(例如在3和10之间)的一个整数。
典型的线性CIC包括：
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-OH                        (Ia)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-PO4                       (Ib)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG                       (Ic)
HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG                   (Id)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA               (Ie)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-(HEG)4-TCGTCGA            (If)
(TCGTCGA)2-glycerol-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA       (Ig)
PO4-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA                       (Ih)
TCGTCGA-(HEG)15-T                             (Ii)
(TCGTCGA-HEG)2-甘油-HEG-TCGTCGA               (Ij)
TCGTCGA-HEG-T-HEG-T                           (Ik)
较佳的线性CIC包括5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’，5’-TCGTCG-HEG-AACGTT-HEG-AGATGAT-3’，和5’-TCGTCGA-C3-ACGTTCG-C3-AGATGAT-3’。
支链CIC包含与至少3个核酸部分共价连接的多价的间隔臂部分(Sp)。典型的支链CIC用下式来描述
[Nv]A---Sp          (IV)
[Sv-Nv]A---Sp       (V)
(S1-N1)-Sp--(Nv)A   (VI)
其中Sp是与数量为“A”的独立选择的核酸部分Nv、Sv-Nv(其包含与核酸部分共价连接的间隔臂部分)共价连接的多价间隔臂。对于式IV和V，A至少为3。在式IV和V的各个实施方案中，A是3-100之间的整数(包括端值)，但是A可以是在由下限为大约3，5，10，50，或100以及独立选择的上限约为5，7，10，50，100，150，200，250，或500所确定的范围之内的整数，或A可以大于500。对于式VI，A至少是2，是在下限为2，5，10，50，或100以及独立选择的上限为5，10，50，100，150，200，250，或500的范围内的整数，或是大于500。
典型的支链CIC包括：
(TCGTCGA)2-甘油-TCGTCGA                   (IVa)
(TCGTCGA-HEG)2-甘油-TCGTCGA               (IVb)
(TCGTCGA-HEG-TCGTCGA)2-甘油-TCGTCGA       (IVc)
[(TCGTCGA)2-甘油-TCGTCGA]2-甘油-TCGTCGA   (IVd)
较佳的支链CIC包括(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-TCGACGT-3’和(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-AACGTTC-3’。
单间隔臂CIC包含单个核酸部分与单个间隔臂部分共价偶联的结构，即，
N1-S1         (VII)
在一较佳的实施方案中，S1具有多聚物的结构，该多聚物包含通常通过酯键(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)相连接的较小单元(例如HEG，TEG，甘油，1’2’-二脱氧核糖，C2烷基-C12烷基亚单位等)(如上所述)。例如参见下文的式VIIa。该多聚物可以是异聚体或均聚体。在一个实施方案中，间隔臂是单体单元(例如HEG，TEG，甘油，1’2’-二脱氧核糖，C2烷基-C12烷基接头等)通过酯键(例如磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接的异聚体。例如参见下文式VIIb。
典型的单间隔臂CICs包括：
TCGTCGA-(HEG)15       (VIIa)
TCGTCGA-HEG-丙基-HEG-丙基-HEG       (VIIb).
在某些实施方案中，CIC的末端结构共价相连接的(例如核酸部分与核酸部分连接；间隔臂部分与间隔臂部分连接，或核酸部分与间隔臂部分连接)，结果产生了环状结构。
用于本发明的免疫调节组合物中的IMC的CIC包括至少一个核酸部分。本文所用的术语“核酸部分”指核苷酸单体(即，单核苷酸)或核苷酸聚合物(即，包含至少2个毗连的核苷酸)。如本文所述，核苷酸包含(1)与磷酸酯基团以酯键连接的糖连接的嘌呤或嘧啶，或(2)用例如下文所述的类似物代替碱基和/或糖和/或磷酸酯的类似物。在有多个核酸部分的CIC中，核酸部分可以相同或不同。
掺入免疫调节组合物中的CIC中所用的核酸部分可包含本文公开的任何多核苷酸IMC序列，而且还是有6个碱基对或更少的序列。预期在包含多个核酸部分的CIC，核酸部分可以有相同或不同的长度。6个或更少核苷酸的核酸部分宜包括序列5′-CG-3′，或任选的5’-TCG-3’或5’-ACG-3’，但是在某些实施方案中，当CIC包含多个核酸部分时，只需一个部分包含序列5′-CG-3′。
预计在包含多个核酸部分的CIC中，核酸部分可以是相同或不同的。因此，在各个实施方案中，掺入免疫调节组合物的CIC包含(a)具有相同序列的核酸部分；(b)核酸部分的多个重复；或(c)两种或多种不同的核酸部分。单个核酸部分可包含多个ISS，这些ISS可以是毗连的，重叠的，或由核酸部分内的额外核苷酸碱基分开。在一个实施方案中，核酸部分包括一个或多个回文区。在单链寡核苷酸的情况下，术语“回文”指，如果寡核苷酸与互补序列复合形成双链分子，则该序列是回文的。在另一实施方案中，一个核酸部分的序列是与CIC中的第二核酸部分相关的回文或部分回文序列。在本发明的实施方案中，CIC的一个或多个核酸部分的序列不是回文序列。在本发明的另一实施方案中，CIC的一个或多个核酸部分的序列不包括超过四个碱基、任选地超过6个碱基的回文序列。
掺入免疫调节组合物的CIC包含一个或多个与核酸部分共价连接的非核酸间隔臂部分。为了方便，本文有时将非核酸间隔臂部分简称为“间隔臂”或“间隔臂部分”。间隔臂的分子量通常约为50-50000，典型的约为75-5000，更通常的情况是在大约75-500之间。在各个实施方案中，它们与一个、两个、三个或三个以上的核酸部分共价连接。有各种制剂适合用来连接核酸部分。例如在科学文献中被称为“非核酸接头”、“非核苷酸接头”或“化合价平台分子”的各种化合物可用作CIC中的间隔臂。在某些实施方案中，间隔臂包含多个共价连接的亚单位，并可有均聚或异聚的结构。可以理解，非核酸间隔臂的定义内不包括单核苷酸和多核苷酸，没有这一区别的话，核酸部分和毗连的非核酸间隔臂部分将没有区别。
在某些实施方案中，间隔臂可包含一个或多个脱碱基核苷酸(即，缺少核苷酸碱基，但是有糖和磷酸酯部分)。典型的脱碱基核苷酸包括1’2’-二脱氧核糖，1’-脱氧核糖，1’-脱氧阿拉伯糖及其聚合物。
其它合适的间隔臂包含任选取代的烷基、任选取代的聚二醇、任选取代的聚胺、任选取代的多元醇、任选取代的聚酰胺、任选取代的聚醚、任选取代的聚亚胺、任选取代的聚磷酸二酯(例如聚(1-磷酸-3-丙醇)等。任选的取代基包括醇、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基和丙氧基)、直链或支链烷基(例如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(例如氨基C1-C12烷基)、亚磷酰胺、磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、卤素(例如F、C1、Br、或I)、酰胺、烷基酰胺(例如酰胺C1-C12烷基)、羧酸、羧酸酯、羧酸酸酐、羧酸卤、磺酰卤、亚氨基酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳化二亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤、磺酸烷酯、NR1R2其中R1R2是-C(＝O)CH＝CHC(＝O)(马来酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(例如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α，β-不饱和羰基、烷基汞、α，β-不饱和砜。
合适的间隔臂可包含多环分子，例如有苯基或环己基环的那些分子。间隔臂可以是聚醚，如聚磷酸丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、双功能的多环分子如双功能的并环戊二烯、茚、萘、甘菊环、庚间三烯并庚间三烯、亚联苯基、asymindacene、sym-indacene、苊烯、芴、phenalene、菲、蒽、萤蒽、acephenathrylene、aceanthrylene、苯并菲、芘、屈、萘并萘、噻蒽、异苯并呋喃、色烯、氧杂蒽、phenoxathiin，它们可以是取代或修饰或聚醚和多环分子的组合。多环分子可以被C1-C5烷基、C6烷基、链烯基、羟基烷基、卤素或卤代烷基取代或多取代。含氮多杂环分子(例如中氮茚)通常不是合适的间隔臂。间隔臂还可以是多元醇如甘油或季戊四醇。在一个实施方案中，间隔臂包含1-磷酸丙烷(phosphopropane))3-磷酸酯或1-磷酸丙烷)4-磷酸酯(也称为四磷酸丙二醇和五磷酸丙二醇)。在一个实施方案中，间隔臂包含衍生的2，2’-亚乙基二氧二乙胺(EDDA)。
用于CIC的非核酸间隔臂的具体例子包括在以下文献中描述的“接头”：Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.(1991)，113：6324；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.(1991)，113：5109；Ma等人，Nucleic Acids Research(1993)，21：2585；Ma等人，Biochemistry(1993)，32：1751；McCurdy等人，Nucleosides & nucleotide(1991)，10：287；Jaschke等人，Tetrahedron Lett.(1993)，34：301；Ono等人，Biochemistry(1991)，30：9914；以及Arnold等人，题目为“用于核苷酸探针的非核酸连接剂”的国际出版物No.WO89/02439。
其它合适的间隔臂包括有以下文献描述的接头：Salunkhe等人，J.Am.Chem.Soc.(1992)，114：8768；Nelson等人，Biochemistry 35：5339-5344(1996)；Bartley等人，Biochemistry 36：14502-511(1997)；Dagneaux等人.Nucleic Acids Research 24：4506-12(1996)；Durand等人，Nucleic Acids Research 18：6353-59(1990)；Reynolds等人，NucleicAcids Research，24：760-65(1996)；Hendry等人Biochemica et Biophysica Acta，1219：405-12(1994)；Altmann等人，Nucleic Acids Research，23：4827-35(1995)。还有其它合适的间隔臂在欧洲专利No.EP0313219B1(Arnold等人)，“用于核苷酸探针的非核酸连接剂”以及美国专利No.6,117,657(Usman等人)中有所描述。
典型的非核酸间隔臂包含寡聚-乙二醇(例如三甘醇，四甘醇，六甘醇间隔臂，以及含有多达约10、20、40、50、100或200个乙二醇单元的其它聚合物)，烷基间隔臂(例如丙基，丁基，己基，和其它C2-C12烷基间隔臂，例如常用的C2-C10烷基间隔臂，最常用的C2-C6烷基间隔臂)，脱碱基核苷酸间隔臂，从甘油衍生得到的对称或不对称的间隔臂，季戊四醇或1，3，5-三羟基环己烷(如本文描述的对称的二倍或三倍间隔臂部分)。间隔臂还可包含上述化合物的异聚或均聚的寡聚物和聚合物(例如通过酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物(二硫键)、磷酸二酯、硫代磷酸酯、亚磷酰胺、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯等其它连接键连接)。
合适的间隔臂部分可赋予CIC电荷和/或疏水性，赋予CIC有利的药物动力学性质(例如稳定性提高、在血液内的驻留时间延长)，和/或使CIC靶向特定细胞或器官。可选择或修饰间隔臂部分来适应CIC以获得所需的药物动力学性质或适合所需的给药模型(例如口服给药)。读者将会理解，为了方便起见，间隔臂(或间隔臂组分)有时会采用衍生获得该间隔臂组分的化合物的化学名称(例如六甘醇)，但能理解CIC实际上是含有该化合物和毗连核酸部分或其它间隔臂部分组件的偶联物。
在包含多个间隔臂部分的CIC中，间隔臂可以相同或不同。因此，在一个实施方案中，CIC中的所有非核酸间隔臂部分具有相同的结构。在一个实施方案中，CIC包含的非核酸间隔臂具有至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或更多不同的结构。
在本发明考虑的某些实施方案中，CIC的间隔臂部分定义为排除某些结构。因此，在本发明的一些实施方案中，间隔臂不是脱碱基核苷酸或脱碱基核苷酸的聚合物。在本发明的一些实施方案中，间隔臂不是寡聚(乙二醇)(例如HEG、TEG等)或多聚(乙二醇)。在一些实施方案中，间隔臂不是C3烷基间隔臂。在一些实施方案中，间隔臂不是多肽。因此，在某些实施方案中，免疫原性分子如蛋白质或多肽不适合作为间隔臂部分的组件。然而，如下文所讨论的，预期在某些实施方案中，CIC是“蛋白质类的CIC”，即，它包含了含有多肽的间隔臂。例如下文所讨论的，在某些实施方案中，可用多肽抗原作为平台(多价间隔臂)来与多个核酸部分偶联。然而，在某些实施方案中，间隔臂部分不是蛋白质和/或不是抗原(即，如果不从CIC分离出来，间隔臂部分不是抗原)。
合适的间隔臂部分不会使得其作为组分的CIC不溶于水溶液(例如PBS，pH7.0)。因此，间隔臂的定义不包括微米载体或纳米载体。另外，具有低溶解度的间隔臂部分如十二烷基间隔臂(当以1，12-二羟基十二烷的二醇前体形式测定时，其溶解度小于5毫克/毫升)不是较佳的，因为它可能降低CIC的亲水性和活性。当以二醇前体形式测定时，间隔臂部分宜具有比5毫克/毫升高得多(例如大于等于20毫克/毫升、大于等于50毫克/毫升或大于等于100毫克/毫升)的溶解度。
CIC的电荷可由核酸部分中的磷酸酯、硫代磷酸酯或其它基团以及非核酸间隔臂部分的基团提供。在本发明的某些方案中，非核酸间隔臂部分携带净电荷(例如净正电荷或净负电荷，当其pH下测定时)。在一个有用的实施方案中，CIC具有净负电荷。在一些实施方案中，CIC中的间隔臂部分的负电荷可通过对本文所述的间隔臂亚单位进行衍生处理以增加其电荷来提高。例如，甘油可以与两个核酸部分共价连接，其余的醇可与活化的亚磷酰胺反应，然后通过氧化或硫化分别形成磷酸酯或硫代磷酸酯。在某些实施方案中，CIC中非核酸间隔臂部分提供的负电荷(即，当有多个间隔臂时，是电荷总数)大于CIC中核酸部分提供的负电荷。电荷可根据分子式来计算，或用试验测定，例如用毛细管电泳方法来测定(Li编，1992，Capillary electrophoresis，Principles，Practice and Application Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands，pp202-206)。
如上所述，合适的间隔臂可以是较小的非核酸(例如非核苷酸)化合物的聚合物，这些化合物如本文所述，它们本身可用作间隔臂，包括通常称为非核苷酸“接头”的化合物。这样的聚合物(即多单元间隔臂)可以是异聚或均聚的，通常含有通过酯键(例如磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接的多个单体单元(例如HEG、TEG、甘油、1′2′-二脱氧核糖等)。因此，在一个实施方案中，间隔臂包含非核苷酸单元(例如2至约100个单元，或2至约50个，例如2至约5个，或者例如约5至50个，例如约5-20个)的聚合(例如异聚)结构。
为了描述，含有多单元间隔臂的CIC包括
5’-TCGTCG-(C3)15-T
5’-TCGTCG-(甘油)15-T
5’-TCGTCG-(TEG)8-T
5’-TCGTCG-(HEG)4-T
其中(C3)15指15个丙基接头通过硫代磷酸酯相连；(甘油)15指15个甘油接头通过硫代磷酸酯连接；(TEG)8指8个三甘醇接头通过硫代磷酸酯连接；(HEG)4指4个六甘醇接头通过硫代磷酸酯连接。应理解，某些多单元间隔臂具有净负电荷，可通过增加酯-连接的单体单元的数量来增加负电荷。
在某些实施方案中，间隔臂部分是多价非核酸间隔臂部分(即“多价间隔臂”)。如本文所述，含有多价间隔臂的CIC含有与三个或多个核酸部分共价连接的间隔臂。多价间隔臂有时在本领域中称为“平台分子”。多价间隔臂可以是聚合的或非聚合的。合适的分子例子包括甘油或取代的甘油(例如2-羟基甲基甘油、菊芋糖基(levulinyl)-甘油)；四氨基苯，七氨基β环糊精，1，3，5-三羟基环己烷，季戊四醇以及季戊四醇衍生物，四氨基季戊四醇，1，4，8，11-四氮杂环十四烷(Cyclam)，1，4，7，10-四氮杂环十二烷(Cyclen)，聚乙烯亚胺，1，3-二氨基-2-丙醇和取代的衍生物，丙基氧甲基]乙基化合物(例如“三倍体”)，聚乙二醇衍生物例如所谓的“星形PEGs”和“bPEG”(例如参见Gnanou等人，1988，Makromol.Chem.189：2885；Rein等人，1993，Acta Polymer 44：225，Merrill等人，美国专利5，171,264；Shearwater Polymers Inc.，Huntswlle AL)以及树突状聚合物。
树突状聚合物是本领域中已知的，它是化学上定义的球状分子，通常通过多官能单体的多步或反复反应获得支链结构来制得的(例如参见Tomalia等人，1990，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29：138-75)。已知有各种树突状聚合物，例如以氨基为末端的聚酰胺型胺，聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺树突状聚合物。用于本发明的典型的树突状聚合物包括“致密星形”聚合物或“星反射形”聚合物，如美国专利Nos.4,587,329；5,338,532；和6,177,414中描述的那些，包括所谓的“聚(酰胺基胺)(＂PAMAM＂)树突状聚合物”。适用于本发明的其它多聚间隔臂分子包括在化学上定义的非聚合物的化合价平台分子，如美国专利5,552,391；和PCT申请PCT/US00/15968(出版为WO 00/75105)；PCT/US96/09976(出版为WO 96/40197)，PCT/US97/10075(出版为WO 97/46251)；PCT/US94/10031(出版为WO 95/07073)；和PCT/US99/29339(出版为WO 00/34231)中描述的那些。还可使用其它许多合适的多价间隔臂，它们是本领域技术人员所知道的。
核酸部分与平台分子的偶联可用任何方式来实现，通常涉及核酸部分和平台分子上的官能团和一个或多个交联剂。用标准的合成化学技术将连接基团加到平台上。连接基团可用标准的合成技术加到核酸部分上。
具有各种价数的多价间隔臂可用于本发明的实践，在不同的实施方案中，CIC的多价间隔臂与大约3-400个、通常3-100个、有时3-50个、更通常3-10个核酸部分相连，有时与超过400个核酸部分连接。在不同的实施方案中，多价间隔臂与超过10个、超过25个、超过50个或超过500个核酸部分(它们可以相同或不同)偶联。应当理解，在CIC包含多价间隔臂的某些实施方案中，本发明提供了一群分子结构稍有不同的CIC。例如，当用树突状聚合物作为多价间隔臂制备CIC时，产生了一定程度上异质的混合物，即每个树突状聚合物分子与不同数量(在或主要在可测定的范围内)的核酸部分连接。
经衍生处理而能与核酸部分连接的多糖可作为CIC中的间隔臂。合适的多糖包括天然存在的多糖(如葡聚糖)以及合成的多糖(如Ficoll(菲科))。例如，氨基乙基羧甲基菲科(AECM-Ficoll)可用Inman，1975，J.Imm.114：704-709的方法来制备。然而，AECM-Ficoll可以和异双官能交联剂例如6-马来酰亚胺基己酰基N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，然后与硫醇衍生的核酸部分偶联(见Lee，等人，1980，Mol.Imm.17：749-56)。其它多糖可以用类似方式修饰。
本领域技术人员根据本说明书的指导和本领域中的知识能够用常规方法制备CIC。制备核酸部分(例如寡核苷酸和经修饰的寡核苷酸)的技术是已知的。核酸部分可用包括但不局限于酶学方法、化学方法和酶与化学方法的组合的技术来合成。例如，可用以下方法化学合成含有磷酸二酯键的DNA或RNA：依次将合适的核苷亚磷酰胺依次连接到正在生长的3′端连于固相载体的寡核苷酸的5′-羟基上，然后使中间产物亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯。用于DNA合成的有用的固相载体包括可控孔径玻璃(Controlled Pore Glass)(Applied Biosystems，Foster City，CA)，聚苯乙烯珠粒基质(PrimerSupport，Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)和TentGel(Rapp Polymere GmbH，Tubingen，Germany)。一旦合成了所需的寡核苷酸序列，从载体上移去寡核苷酸，将磷酸三酯去保护成磷酸二酯，用氨水或其它碱使核苷碱基去保护。
例如，含有磷酸二酯键的DNA或RNA多核苷酸(核酸部分)通常通过反复重复以下步骤来合成：a)从3′端与固相载体连接的核苷或核酸的5′羟基上移去保护基团；b)将活化的核苷亚磷酰胺与5′-羟基相连，c)将亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯，和d)给未反应的5′-羟基加帽。含有硫代磷酸酯键的DNA或RNA用上述方法制得，只是氧化步骤被硫化步骤代替。一旦合成了所需的寡核苷酸序列，从载体上移去寡核苷酸，将磷酸三酯去保护成磷酸二酯，用氨水或其它碱使核苷碱基去保护。例如参见，Beaucage(1993)“寡脱氧核糖核苷酸的合成(Oligodeoxyribonucleotide Synthesis)”PROTOCOLSFOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS，SYNTHESIS AND PROPERTIES(Agrawal编)Humana Press，Totowa，NJ；Warner等人(1984)DNA3：401；Tang等人(2000)Org.ProcessRes.Dev.4：194-198；Wyrzykiewica等人(1994)Bioorg.& Med.Chem.Lett.4：1519-1522；Radhakrishna等人(1989)J.Org.Chem.55：4693-4699和美国专利No.4,458,066。能自动合成特定序列的核酸部分的可程控机器可从各种途径获得。其例子包括Expedite8909自动化DNA合成仪(Perseptive Biosystem，Framington MA)；ABI 394(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)；以及OligoPilot II(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
可用含有酸不稳定的5′保护基团和3′-亚磷酰胺的碱基保护的核苷(单体)从3′向5′方向装配多核苷酸。这些单体的例子包括5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-3’-O-(N，N-二异丙基氨基)2-氰基乙基亚磷酰胺，其中保护的核苷例子包括，但不局限于，N6-苯甲酰基腺苷、N4-苯甲酰基胞苷、N2-异丁酰鸟苷、胸苷和尿苷。在这种情况下，所用的固相载体含有3′-连接的保护的核苷。或者，可用含有酸不稳定的3′保护基团和5′-亚磷酰胺的碱基保护的核苷(单体)以5′向3′方向装配多核苷酸。这些单体的例子包括3’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-保护的核苷-5’-O-(N，N-二异丙基氨基)2-氰基乙基亚磷酰胺，其中保护的核苷例子包括，但不局限于，N6-苯甲酰基腺苷、N4-苯甲酰基胞苷、N2-异丁酰鸟苷、胸苷和尿苷(Glen Research，Sterling，VA)。在这种情况下，所用的固相载体含有5′-连接的保护核苷。环状核酸组分可被分离、通过重组方法合成或用化学方法合成。化学合成可用文献中描述的任何方法，例如参见Gao等人(1995)Nucleic Acids Res.23：2025-2029和Wang等人(1994)Nucleic Acids Res.22：2326-2333。
用常规方法可实现非核酸间隔臂部分的加入。加入特定间隔臂部分的方法是本领域中已知的，例如在上文所述的文献中有所描述。例如参见Durand等人，Nucleic AcidsResearch 18：6353-59(1990)。间隔臂部分和核酸部分之间的共价键可以有多种类型，包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、亚磷酰胺、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯和其它连接键。通常，用与合成核酸部分所用的相同的亚磷酰胺类化学物质能方便地将间隔臂部分和核酸部分组合起来。例如，本发明的CIC可以用自动化DNA合成仪(例如Expedite 8909；Perseptive Biosystems，Framington，MA)用亚磷酰胺化学物质来方便地合成(例如参见Beaucage，1993，同上；CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，同上)。然而，本领域技术人员应当理解，用自动化DNA合成仪进行的相同(或等价)合成步骤也可人工进行，如果需要的话。在这样的合成中，通常用4，4′-二甲氧基三苯甲基基团来保护间隔臂(或多聚间隔臂的间隔臂亚单位)的一端，而另一端含有亚磷酰胺基团。
具有必需的保护和反应基团的各种间隔臂可以市售购得，例如：
三甘醇间隔臂或“TEG 9-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)三甘醇-1-O-[(2-
间隔臂”                氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen
                        Research，22825 Davis Drive，Sterling，VA)
六甘醇间隔臂或“HEG     18-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)六甘醇-1-O-[(2-
间隔臂”                氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen
                        Research，Sterling，VA)
丙基间隔臂              3-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)丙基氧-1-O-[(2-
                        氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen
                        Research，Sterling，VA)；
丁基间隔臂              4-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)丁基氧-1-O-[(2-
                        氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Chem
                        Genes Corporation，Ashland Technology Center，
                        200 Homer Ave，Ashland，MA)
己基间隔臂              6-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)己基氧-1-O-[(2-
                        氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺]
2-(羟基甲基)乙基间隔    1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)-3-(菊芋糖基氧)-
臂或“HME间隔臂”       丙基氧-2-O-[(2-氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷
                        酰胺]；也称为“不对称支链”间隔臂
“脱碱基核苷酸间隔臂”  5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，2-二脱氧核糖-
或“脱碱基间隔臂”      3-O-[(2-氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺]
                        (Glen Research，Sterling，VA)
“对称支链间隔臂”或    1，3-O，O-二(4，4’-二甲氧基三苯甲基)甘油-2-O-
“甘油间隔臂”          [(2-氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Chem
                        Genes，Ashland，MA)
“三倍体间隔臂”        2，2，2-O，O，O-三[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基
                        氧)丙基氧甲基]乙基-1-O-[(2-氰基乙基)N，N-
                        二异丙基亚磷酰胺](Glen Research，Sterling，
                        VA)
“对称二倍体间隔臂”    1，3-O，O-二[5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)戊
                        基酰氨基]丙基-2-O-[(2-氰基乙基)N，N-二异丙
                        基亚磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA)
“十二烷基间隔臂”      12-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)十二烷基氧-1-
                        O-[(2-氰基乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺]
                      (Glen Research，Sterling，VA)
这些以及各种其它许多保护的间隔臂前体(例如包括DMT和亚磷酰胺基团保护基团)是可以购得的，或可常规方法来合成，从而用于制备本文所述的CIC。根据生产商说明书来控制仪器，根据所需的次序加入核苷酸单体和间隔臂。
尽管用亚磷酰胺类化学物质能方便地制备某些CIC，但是应理解本发明的CIC并不局限于用任何特定合成或制备方法制得的化合物。
在一个实施方案中，制得了有多价间隔臂与多类核酸部分偶联的CIC。例如，有两个马来酰亚胺基团(其能与含巯基的多核苷酸反应)和两个活性酯基团(其能和有氨基的核酸反应)的平台已有描述(例如参见PCT/US94/10031，出版为WO 95/07073)。这两个活性基团可相互独立反应。这将导致CIC含有总共4个核酸部分，每个序列两个。
具有多价间隔臂含有两种不同核酸序列的CIC也可用上述的对称支链间隔臂以及常规亚磷酰胺化学物质来制备(例如用人工或自动方法)。该对称支链间隔臂含有亚磷酰胺基团和两个保护基团，这两个保护基团是相同的，可以同时除去。例如，在一个方法中，合成第一核酸并与对称的支链间隔臂相连，从间隔臂中除去保护基团。然而，在间隔臂上合成另外两个核酸(具有相同序列)(每一步中采用合成单个核酸部分所用试剂量的两倍)。
类似的方法可用于将三种不同的核酸部分(下面称为核酸I、II和III)与多价平台(例如不对称支链间隔臂)相连。这用自动化DNA合成仪进行最方便。在一个实施方案中，不对称支链间隔臂含有亚磷酰胺基团和两个正交的(orthogonal)保护基团(这两个保护基团可以独立地除去)。首先，合成核酸I，然后将不对称支链间隔臂连接到核酸I上，然后在选择性除去一个保护基团后加入核酸II。对核酸II去保护，加帽，然后除去间隔臂上的其它保护基团。最后合成核酸III。
在一些实施方案中，合成核酸部分，用标准的合成化学技术加入反应性连接基团(例如氨基、羧酸酯、巯基、二硫基等)。反应性连接基团(认为其形成了所得间隔臂部分的一部分)与另外的非核酸化合物偶联，形成间隔臂部分。用核酸合成的标准方法采用文献中描述的或市售的各种试剂将连接基团加到核酸上。例子包括含有保护的氨基、羧酸酯基团、巯基或二硫基以及亚磷酰胺基团的试剂。一旦通过活化的亚磷酰胺基团将这些化合物掺入核酸内并去保护后，它们向核酸提供了氨基、羧酸酯基或巯基反应性。
各种长度的亲水性接头是有用的，例如可用来连接核酸部分和平台分子。各种合适的接头是已知的。合适的接头非限制性地包括乙二醇的线性寡聚物或聚合物。这些接头包括具有下式的接头R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保护基团如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基，例如4-硝基苯酯。这些接头可通过硫醚来连接含巯基反应性基团(如卤代乙酰基、马来酰亚胺等)的分子以及通过酰胺键与含氨基的第二分子连接。连接次序可以不同，即硫醚键可形成在酰胺键之前或之后。其它有用的接头包括Sulfo-SMCC(4-[N-马来酰亚胺基甲基]-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯)Pierce Chemical Co.product 22322；Sulfo-EMCS(N-[γ-马来酰亚胺基己酰氧磺基琥珀酰亚胺酯)Pierce Chemical Co.product 22307；Sulfo-GMBS(N-[ε-马来酰亚胺基丁酰氧]磺基琥珀酰亚胺酯)Pierce Chemical Co.product 22324(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)，以及具有式马来酰亚胺基-R-C(O)NHS酯，其中R＝烷基、环戊基、乙二醇聚合物等的类似化合物。
核酸部分和多价间隔臂共价连接的特别有用的方法在上文所述文献中有所描述。
在某些实施方案中，将多肽如蛋白质抗原或抗原片段作为多价间隔臂部分与多个核酸部分直接或通过接头共价偶联，形成“蛋白类CIC”。该多肽可以是所适合的免疫反应所需要的抗原或免疫原，或是载体(例如白蛋白)。蛋白类CIC通常包含至少一个、通常数个或多个核酸部分，这些核酸部分的长度在2-7之间，更通常地在4-7之间，或者在2-6之间，或为5、4、6，或为4和5个核苷酸。而且，这些核酸部分具有较差的免疫调节活性或没有分离的免疫调节活性。在阅读了本说明书公开内容后，制备蛋白类CIC的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，可用本领域已知的方法使核酸与多肽间隔臂部分共价偶联，该方法包括使核酸部分的3′或5′端(或核酸部分中内部的经合适修饰的碱基处)与具有合适反应基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，它能与胞嘧啶残基的N4位氨基直接反应)相连。另一个例子是，多肽能通过已经掺入核酸部分内的胺、巯基或羧基与核酸的游离5′端相连。另外，该多肽能与本文所述的间隔臂部分相连。另外，一端有保护的胺、巯基或羧基并有亚磷酰胺的连接基团可以与多核苷酸的羟基共价连接，随后去保护，使其官能团能用于共价连接CIC和肽。
包含具有序列5′-CG-3′的核酸部分的免疫调节化合物以及CIC在本领域中已经共同拥有的美国临时申请Nos.60/299,883和60/375,253中有所描述。这些和其它IMC的免疫调节活性很容易用表示免疫反应不同方面(例如细胞因子分泌、抗体产生、NK细胞激活以及T细胞增殖)的标准试验来鉴定。例如参见WO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Krieg等人(1995)Nature 374：546-549；Yamamoto等人(1992)J.Immunol.148：4072-4076；Ballas等人(1996)J.Immunol.157：1840-1845；Klinman等人(1997)J.Immunol.158：3635-3639；Sato等人(1996)Science 273：352-354；Pisetsky(1996)J.Immunol.156：421-423；Shimada等人(1986)Jpn.J.Cancer Res.77：808-816；Cowdery等人(1996)J.Immunol.156：4570-4575；Roman等人(1997)；以及Lipford等人(1997)Eur.J.Inmunol.27：2340-2344。这些方法同样适用于评价本发明的免疫调节组合物的免疫调节活性。
在一些实施方案中，与含有相同IMC的本发明免疫调节组合物相比，IMC在体外、体内和/或活体外没有测得活性(不具有分离的免疫调节活性)或是活性较差(具有较差的分离的免疫调节活性)。如本领域技术人员所能理解的，分离的免疫调节活性的确定可以取决于浓度，而在给定浓度下确定没有“分离的免疫调节活性”的IMC实际上在较高的浓度下有分离的免疫调节活性。
当给予相同浓度的IMC时，测试的多核苷酸的活性比含有相同IMC的本发明免疫调节组合物少时，该IMC就被称为具有“较差的免疫调节活性”。较佳的是，该测试IMC的分离的免疫调节活性不超过免疫调节组合物的大约50％，更佳的不超过大约20％，最佳的不超过免疫调节组合物的大约10％，在某些实施方案中甚至更低。
IMC的“分离的免疫调节活性”是通过测定给定浓度的分离的IMC的免疫调节活性、作为本发明免疫调节组合物的一部分所给予的IMC的免疫调节活性(与分离的IMC处于相同浓度下)以及比较免疫调节活性数值来确定的。免疫调节活性可用表示免疫反应不同方面(如本文所述)的标准试验来测定。例如，可用本文所述的人PBMC试验。当用人PBMC试验时，通常两种化合物在相同条件下(例如用相同的细胞，通常在大约20微克/毫升的浓度下)的平行试验来比较两种化合物的活性。通常，浓度是通过测定260nm下的吸光度并用0.5 OD260/ml＝20微克/毫升的转化值来确定的。这样能使测试样品中的核酸总量标准化。另外，可用本领域已知的其它方法测定浓度或重量。为了说明供血者的差别，通常在多个供血者内进行试验。当大多数供血者的PBMC与IMC接触后IFN-γ分泌量不明显高于没有该测试化合物下的分泌量、或者不明显高于(在某些实施方案中)存在无活性对照化合物(例如5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’)(SEQ ID NO：26)的分泌量时，该IMC就不具有“分离的免疫调节活性”。
稳定剂
用于本发明组合物和方法的稳定剂包括可悬浮于水中减少水的表面张力的那些稳定剂，但是溶于水和/或与水完全混溶的稳定剂是较佳的。有许多类稳定剂能用于本发明的组合物和方法，它们包括蛋白质(较佳的是亲水性蛋白质)、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂(例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸，但是在某些实施方案中，稳定剂的定义中不包括血清蛋白质(尤其是牛血清蛋白质)、脂肪酸和/或离子型洗涤剂。
任何蛋白质可用作本发明的稳定剂。在某些实施方案中，稳定剂是不作为抗原的蛋白质(如下讨论)；在这些实施方案中，蛋白质宜从与组合物受者相同的物种衍生得到(例如，打算将组合物给人用，则用作稳定剂的蛋白质宜为人蛋白)。血清白蛋白是可用作该实施方案中的稳定剂的典型蛋白。在其它实施方案中，采用抗原作为稳定剂，在这种情况下该抗原不需要、通常最好不与预期的接受者种类相匹配。用于本发明的组合物和方法的抗原如下所述。
用于本发明组合物和方法的非离子型洗涤剂包括葡糖酰胺类(glucamides)，例如癸基二甲基氧化膦(APO-10)和二甲基十二烷基氧化膦(APO-12)、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-8)、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-9)和癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)；聚氧乙烯醚洗涤剂，包括聚氧乙烯(10)十二烷酯(Genapol C100)、聚氧乙烯(4)月桂醚(
Figure C03819493D00401
30)、聚氧乙烯(9)月桂醚(
Figure C03819493D00402
PX)聚氧乙烯(23)月桂醚
Figure C03819493D00403
35)、聚氧乙烯(2)十六烷基醚(
Figure C03819493D00404
52)、聚氧乙烯(10)十六烷基醚(
Figure C03819493D00405
56)、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(
Figure C03819493D00406
58)、聚氧乙烯(2)十八烷基醚(
Figure C03819493D00407
72)、聚氧乙烯(10)十八烷基醚(
Figure C03819493D00408
76)、聚氧乙烯(20)十八烷基醚(
Figure C03819493D00409
78)、聚氧乙烯(100)十八烷基醚(
Figure C03819493D004010
700)、聚氧乙烯(2)油基醚(
Figure C03819493D004011
92)、聚氧乙烯(10)油基醚(
Figure C03819493D004012
97)、聚氧乙烯(20)油基醚(
Figure C03819493D004013
98)、异三癸基聚(乙二醇醚)8(Genapol 80)、F-68、
Figure C03819493D004015
F-127、十二烷基聚(乙二醇醚)9(Thesit)聚氧乙烯(10)异辛基苯基醚(
Figure C03819493D004016
X-100)、聚氧乙烯(8)异辛基苯基醚(
Figure C03819493D004017
X-114)、聚乙二醇山梨糖醇酐单月桂酸酯(
Figure C03819493D004018
 20)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯(
Figure C03819493D004019
 40)、聚乙二醇山梨糖醇酐单硬脂酸酯(
Figure C03819493D004020
 60)、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯
Figure C03819493D004021
 65)、聚乙二醇山梨糖醇酐单油酸酯(
Figure C03819493D004022
 80)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯(
Figure C03819493D004023
 85)、泊洛沙姆188和聚乙二醇-p-异辛基苯基醚(Nonidet NP40)，烷基麦芽糖苷(maltoside)洗涤剂(包括环己基-n-乙基-β-D-麦芽糖苷、环己基-n-己基-β-D-麦芽糖苷、和环己基-n-甲基-β-D-麦芽糖苷)、n-癸酰基蔗糖；吡喃葡糖苷类(包括甲基6-O-(N-庚基氨基甲酰)-a-D-吡喃葡糖苷(HECAMEG)；以及烷基吡喃葡糖苷类，例如n-癸基-β-D-吡喃葡糖苷、n-庚基-β-D-吡喃葡糖苷、n-十二烷基-β-D-吡喃葡糖苷、n-壬基-β-D-吡喃葡糖苷、n-辛基-α-D-吡喃葡糖苷、和n-辛基-β-D-吡喃葡糖苷、烷基硫代吡喃葡糖苷类，包括n-庚基-β-D-硫代吡喃葡糖苷、烷基麦芽吡喃糖苷类，包括n-癸基-β-D-麦芽吡喃糖苷和n-辛基-β-D-麦芽吡喃糖苷、n-癸基-β-D-硫代麦芽糖苷、毛地黄皂苷、n-十二烷基蔗糖、n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、庚烷1，2，3-三醇、n-辛酰基-β-D-葡糖基胺(NOGA)、n-辛酰基蔗糖、泊洛沙姆(聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物)，例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，以及磺基三甲铵乙内酯，包括SB-10、SB-12、和SB-14，以及n-十一烷基-β-D-麦芽糖苷。较佳的稳定剂包括聚氧乙烯醚洗涤剂、尤其是聚乙二醇山梨糖醇酐单油酸酯和聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯。
用于本发明组合物和方法的阴离子洗涤剂包括辛酸及其盐、鹅去氧胆酸及其盐、胆酸及其盐、癸烷磺酸及其盐、脱氧胆酸及其盐、葡糖脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)及其盐、月桂酰肌氨酸及其盐、n-十二烷基硫酸酯及其盐(包括钠盐和锂盐)、牛磺鹅脱氧胆酸及其盐、牛磺胆酸及其盐、牛磺脱氢胆酸及其盐、牛磺脱氧胆酸及其盐、牛磺石胆酸及其盐、以及牛磺乌索(urso)脱氧胆酸及其盐。
阳离子洗涤剂包括十六烷基吡啶鎓及其盐，十六烷基三甲铵及其盐(包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))，十二烷基三甲铵及其盐(包括十二烷基三甲基溴化铵)，咪唑啉烷基铵、季咪唑啉以及四癸基三甲铵及其盐，包括四癸基三甲基溴化铵。
选择用作稳定剂的洗涤剂宜为被认为是油/水乳化洗涤剂的那些洗涤剂。油/水乳。化洗涤剂是本领域已知的，其通常的特征是有大约8-18的疏水性/亲脂性平衡(HLB)。掺入颗粒组合物的洗涤剂宜具有大约10-16、更佳约为11-15的HLB值(例如聚乙二醇山梨糖醇酐单油酸酯的HLB为15.4；聚氧乙烯(10)异辛基苯基醚的HLB为13.5；聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯的HLB为11)。
脂肪酸
在某些实施方案中，本发明的组合物还可包括一个或多个脂肪酸或其盐作为额外的组分。在采用脂肪酸作为本发明组合物中的稳定剂组分以及额外组分的实施方案中，用作稳定剂的脂肪酸与用作“附加”组分的脂肪酸是不同的。用于本发明组合物的脂肪酸的碳原子数在4-30范围内，可以是不饱和的(例如硬脂酸)、单不饱和的(例如油酸)或多不饱和的(例如亚油酸)，但是单不饱和和多不饱和的脂肪酸通常是较好的。
在一些实施方案中，本发明的组合物中可加入碳链长度至少约为4，5，6，8，10，15，18，或20个碳原子且少于约30，25，20，19，15或10个碳原子的脂肪酸。因此，在一些实施方案中，用于本发明的脂肪酸可以有在4-30、5-25、10-20或15-20个碳原子的碳链长度。
可用于本发明组合物的脂肪酸包括，但不局限于，花生四烯酸、癸酸、山萮酸、二十二碳六烯酸、花生酸、二十一烷酸、十七烷酸、庚酸、己酸、月桂酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、十九烷酸、壬酸、辛酸、油酸、棕榈油酸、十五烷酸、硬脂酸、二十四烷酸、二十三烷酸、十三烷酸以及十一烷酸，较佳的用于本发明组合物的脂肪酸包括油酸、棕榈油酸和亚油酸。
抗原
在本发明的某些实施方案中，抗原被掺入免疫调节组合物中或与免疫调节组合物一同给予。掺入抗原的那些免疫调节组合物可将抗原掺入颗粒组合物本身中，或是将其溶解或悬浮于颗粒组合物所悬浮的溶液中。任何抗原均可掺入或与本发明的免疫调节组合物一同给予。
在一些实施方案中，抗原是变应原。重组变应原的例子提供在表1中。许多变应原的制备是本领域中熟知的，其包括但不局限于豚草花粉变应原抗原E(Amb a I)(Rafnar等人(1991)J.Biol.Chem.266：1229-1236)，草变应原Lol p 1(Tamborini等人(1997)Eur.J.Biochem.249：886-894)，主要尘螨变应原Der pI和Der PII(Chua等人(1988)J.Exp.Med.167：175-182；Chua等人(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91：124-129)，家养猫变应原Fel d I(Rogers等人(1993)Mol.Immunol.30：559-568)，白桦花粉Bet vl(Breiteneder等人(1989)EMBO J.8：1935-1938)，日本雪松变应原Cryj 1和Cryj 2(Kingetsu等人(2000)Immunology 99：625-629)，以及来自其它树花粉的蛋白抗原(Elsayed等人(1991)Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.204：17-31)。如上所述，来自树木的变应原是已知的，其包括来自桦树、杜松和日本雪松的变应原。从草花粉制备用于体内给药的蛋白抗原已有报道。
在一些实施方案中，变应原是食物变应原，包括但不局限于，花生变应原，例如Ara h I(Stanley等人(1996)Adv.Exp.Med.Biol.409：213-216)；胡桃变应原，例如，Jug rI(Tueber等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.101：807-814)；巴西坚果变应原，例如，白蛋白(Pastorello等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.102：1021-1027；虾变应原，例如Pen a I(Reese等人(1997)Int.Arch.Allergy Immunol.113：240-242)；蛋变应原，例如卵类粘蛋白(Crooke等人(1997)J.Immunol.159：2026-2032)；奶变应原，例如，牛β-乳球蛋白(lactoglobin)(Selot al.(1999)Clin.Exp.Allergy 29：1055-1063)；鱼变应原，例如，小白蛋白(Van Do等人(1999)Scand.J.Immunol.50：619-625；Galland等人(1998)J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.706：63-71)。在一些实施方案中，变应原是乳胶变应原，包括但不局限于，Hevb7(Sowka等人(1998)Eur.J.Biochem.255：213-219)。表1显示了可使用的典型变应原的列表。
表1
重组变应原
 
组 变应原 参考文献
动物：
甲壳纲
虾/龙虾 原肌球蛋白Pan s I Leung等人(1996)J.Allergy Clin.Immunol.98：954-961Leung等人(1998)Mol.Mar.Biol.Biotechnol.7：12-20
昆虫
蚂蚁 Soli 2(毒液) Schmidt等人J Allergy Clin Immunol.，1996，98：82-8
蜜蜂 磷脂酶A2(PLA)透明质酸酶(Hya) Muller等人J Allergy Clin Immunol，1995，96：395-402Forster等人J AllergyClin Immunol，1995，95：1229-35Muller等人Clin Exp Allergy，1997，27：915-20Soldatova等人J Allergy Clin Immunol，1998，101：691-8
蟑虫郎 Bla g Bd9OKBla g 4(calycin)谷胱甘肽S-转移酶Per a 3 Helm等人J Allergy Clin Immunol，1996，98：172-180Vailes等人J Allergy Clin Immunol，1998，101：274-280Arruda等人J Biol Chem，1997，272：20907-12Wu等人Mol Immunol，1997，34：1-8
尘螨 Der p 2(主要变应原) Lynch等人J Allergy Clin Immunol，1998，101：562-4 Hakkaart等人Clin Exp Allergy，1998，
 
Der p2变体Der f2Der p10Tyr p2 28：169-74 Hakkaart等人Clin Exp Allergy，1998，28：45-52 Hakkaart等人Int Arch AllergyImmunol，1998，115(2)：150-6Mueller等人J Biol Chem，1997，272：26893-8Smith等人J Allergy Clin Immunol，1998，101：423-5Yasue等人Clin Exp Immunol，1998，113：1-9Yasue等人Cell Immunol，1997，181：30-7Asturias等人Biochim Biophys Acta，1998，1397：27-30Eriksson等人Eur J Biochem，1998
大黄蜂 抗原5 aka Dol mV(毒液) Tomalski等人Arch Insect Biochem Physiol，1993，22：303-13
蚊子 Aed a I(唾液三磷酸腺苷双磷酸酶) Xu等人Int Arch Allergy Immunol，1998，115：245-51
小黄蜂 抗原5，透明质酸酶和磷脂酶(毒液) King等人J Allergy Clin Immunol，1996，98：588-600
哺乳动物
猫 Feld I Slunt等人J Allergy Clin Immunol，1995，95：1221-8Hoffmann等人(1997)J Allergy Clin Immunol99：227-32Hedlin Curr Opin Pediatr，1995，7：676-82
牛 Bos  d2(鳞屑；脂合成素(lipocalin)β-lactoglobulin(BLG，主要牛奶变应原) Zeiler等人J Allergy Clin Immunol，1997，100：721-7Rautiainen等人Biochem Bioph.Res Comm.，1998，247：746-50Chatel等人Mol Immunol，1996，33：1113-8Lehrer等人Crit Rev Food Sci Nutr，1996，36：553-64
 
狗 Can f I和Can f2，唾液脂合成素 Konieczny等人Immunology，1997，92：577-86Spitzauer等人J Allergy Clin Immunol，1994，93：614-27Vrtala等人J Immunol，1998，160：6137-44
马 Equ c1(主要变应原，脂合成素) Gregoire等人J Biol Chem，1996，271：32951-9
小鼠 小鼠尿蛋白(MUP) Konieczny等人Immunology，1997，92：577-86
其它哺乳动物变应原
胰岛素 Ganz等人J Allergy Clin Immunol，1990，86：45-51Grammer等人J Lab Clin Med，1987，109：141-6Gonzalo等人Allergy，1998，53：106-7
干扰素 干扰素α 2c Detmar等人Contact Dermatis，1989，20：149-50
软体动物 拓扑肌球蛋白 Leung等人J Allergy Clin Immunol，1996，98：954-61
植物变应原：
大麦 Hor v 9 Astwood等人Adv Exp Med Biol，1996，409：269-77
桦树 花粉变应原，Bet v4rBet v 1 Bet v 2：(抑制蛋白) Twardosz等人Biochem Bioph.Res Comm.，1997，239：197Pauli等人J Allergy Clin Immunol，1996，97：1100-9van Neerven等人Clin Exp Allergy，1998，28：423-33Jahn-Schmid等人Immunotechnology，1996，2：103-13Breitwieser等人Biotechniques，1996，21：918-25Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100：356-64
巴西坚果 球蛋白 Bartolome等人Allergol Immunopathol，1997，25：135-44
 
樱桃 Pru a I(主要变应原) Scheurer等人Mol Immunol，1997，34：619-29
玉米 Zml3(花粉) Heiss等人FEBS Lett，1996，381：217-21Lehrer等人Int Arch Allergy Immunol，1997，113：122-4
草 Phl p 1，Phl p 2，Phl p 5(牧草花粉)Hol 1 5绒状草(velvet grass)花粉Bluegrass变应原Cyn d 7百慕大草Cyn d 12(抑制蛋白) Bufe等人Am J Respir Crit Care Med，1998，157：1269-76Vrtala等人J Immunol Jun 15，1998，160：6137-44Niederberger等人J Allergy Clin Immun.，1998，101：258-64Schramm等人Eur J Biochem，1998，252：200-6Zhang等人J Immunol，1993，151：791-9Smith等人Int Arch Allergy Immunol，1997，114：265-71Asturias等人Clin Exp Allergy，1997，27：1307-13Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100：356-64
日本雪松 Jun a 2(Juniperusashei)Cry j 1，Cry j 2(Cryptomeriajaponica) Yokoyama等人Biochem.Biophys.Res.Commun.，2000，275：195-202Kingetsu等人Immunology，2000，99：625-629
杜松 Jun o 2(花粉) Tinghino等人J Allergy Clin Immunol，1998，101：772-7
胶乳 Hev b 7 Sowka等人Eur J Biochem，1998，255：213-9
 
Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100：356-64
Mercurialis Mer a I(抑制蛋白) Vallverdu等人J Allergy Clin Immunol，1998，101：363-70
芥末(黄色) Sin a I(种子) Gonzalez de la Pena等人Biochem Bioph.ResComm.，1993，190：648-53
油菜籽 Bra r I花粉变应原 Smith等人Int Arch Allergy Immunol，1997，114：265-71
花生 Ara h I Stanley等人Adv Exp Med Biol，1996，409：213-6Burks等人J Clin Invest，1995，96：1715-21Burks等人Int Arch Allergy Immunol，1995，107：248-50
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黑麦 Lol p I Tamborini等人Eur J Biochem，1997，249：886-94
胡桃 Jug r I Teuber等人J Allergy Clin Immun.，1998，101：807-14
小麦 变应原 Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100：356-64Donovan等人Electrophoresis，1993，14：917-22
真菌：
曲霉 Asp f 1，Asp f 2，Asp f 3，Asp f 4，rAsp f 6 Crameri等人Mycoses，1998，41 Suppl 1：56-60Hemmann等人Eur J Immunol，1998，28：1155-60Banerjee等人J Allergy Clin Immunol，1997，99：821-7Crameri Int Arch Allergy Immunol，1998，115：99-114
 
过氧化锰歧化酶(MNSOD) Crameri等人Adv Exp Med Biol，1996，409：111-6Moser等人J Allergy Clin Immunol，1994，93：1-11Mayer等人Int Arch Allergy Immunol，1997，113：213-5
Blomia 变应原 Caraballo等人Adv Exp Med Biol，1996，409：81-3
青霉菌 变应原 Shen等人Clin Exp Allergy，1997，27：682-90
裸盖菇(Psilocybe) Psi c 2 Horner等人Int Arch Allergy Immunol，1995，107：298-300
在一些实施方案中，抗原来感染性因子，包括原生动物、细菌、真菌(包括单细胞和多细胞)，以及病毒性感染性因子。病毒抗原的合适例子如本文所述，它们是本领域中已知的。细菌包括流感嗜血菌、结核分枝杆菌以及百日咳博德特氏菌。原生动物感染性因子包括疟原虫、利什曼原虫属、锥虫属和血吸虫属。真菌包括白色念珠菌。
在一些实施方案中，抗原是病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不局限于HIV蛋白如HIV gag蛋白(包括但不局限于膜固着(MA)蛋白、核心衣壳(CA)蛋白以及核衣壳(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基质(M)蛋白和流感病毒核衣壳(NP)蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、乙肝e蛋白(HBeAg)、乙肝DNA聚合酶、丙肝抗原等。讨论流感病毒疫苗接种的参考文献包括Scherle和Gerhard(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4446-4450；Scherle和Gerhard(1986)J.Exp.Med.164：1114-1128；Granoff等人(1993)Vaccine 11：S46-51；Kodihalli等人(1997)J.Virol.71：3391-3396；Ahmeida等人(1993)Vaccine 11：1302-1309；Chen等人(1999)Vaccine 17：653-659；Govorkova和Smirnov(1997)Acta Virol.(1997)41：251-257；Koide等人(1995)Vaccine13：3-5；Mbawuike等人(1994)Vaccine 12：1340-1348；Tamura等人(1994)Vaccine12：310-316；Tamura等人(1992)Eur.J.Immunol.22：477-481；Hirabayashi等人(1990)Vaccine 8：595-599。其它多肽抗原的例子是组特异性或亚组特异性抗原，已知有许多感染性因子，其包括但不局限于，腺病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒和痘病毒。
许多抗原性肽和蛋白质是已知的，是本领域中可以得到。而其它抗原性肽可用常规技术鉴定。为了针对肿瘤形成或治疗已有肿瘤而免疫接种，免疫调节肽可包括肿瘤细胞(活的或辐照的)、肿瘤细胞抽提物、或肿瘤抗原的蛋白亚单位，这些肿瘤抗原例如是Her-2/neu、Mart1、癌胚抗原(CEA)、神经节苷脂、人乳脂肪球(human milk fatglobule，HMFG)、粘液素(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)以及酪氨酸酶。用于免疫为基础的避孕疫苗可以通过与ISS一起给予精蛋白来形成。Lea等人(1996)Biochim.Biophys.Acta 1307：263。
减毒和灭活的病毒适合用作本文中的抗原。这些病毒的制备是本领域中熟知的，其中有许多可以市售购得(例如参见Physicians’Desk Reference(1998)第52版，Medical Economics Company，Inc.)。例如，脊髓灰质炎病毒可购自
Figure C03819493D00491
(PasteurMerieux Connaught)和(Lederle Laboratories)，甲肝病毒可购自
Figure C03819493D0049140015QIETU
(Merck)，麻疹病毒可购自
Figure C03819493D00494
(Merck)，腮腺炎病毒可购自
Figure C03819493D00495
(Merck)，风疹病毒可购自
Figure C03819493D00496
(Merck)。另外，减毒和灭活的病毒如HIV-1、HIV-2、单纯疱疹病毒、乙肝病毒、轮状病毒、人和非人乳头瘤病毒和缓慢脑病毒(slowbrain viruse)可以提供肽抗原。
在一些实施方案中，抗原包含病毒载体如牛痘、腺病毒和金丝雀痘病毒。
抗原可用本领域已知的纯化技术从其来源分离得到，更方便地是可用重组方法产生。
抗原肽可包括纯化的天然肽、合成肽、重组蛋白质、蛋白质粗提物、减毒或灭活的病毒、细胞、微生物或这些肽的片段。免疫调节肽可以是天然的，或是用化学方法或酶方法合成。任何本领域已知的的化学合成方法都是合适的。可用溶液相肽合成来构建中等大小的肽，而对于肽的化学构建，可采用固相合成方法。Atherton等人(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362：833-839。还可用蛋白水解性酶来偶联氨基酸，从而产生肽。Kullmann(1987)Enzymatic Peptide Synthesis，CRC Press，Inc。或者，可利用细胞的生物化学机制或通过从生物学来源分离获得肽。重组DNA技术可用于产生肽。Hames等人(1987)转录和翻译的实用方法(Transcription and Translation：APractical Approach)，IRL Press。肽也可用亲和层析等标准技术来分离。
较佳的是，抗原是肽、脂质(例如甾醇，不包括胆固醇，脂肪酸和磷脂)、如流感嗜血菌疫苗中所用的那些多糖，神经节苷脂、脂蛋白和糖蛋白。它们可用本领域已知的几种方法(包括用化学和酶方法来分离和合成)来获得。在某些情况下，例如对于许多甾醇、脂肪酸和磷脂，分子的抗原性部分是市售购得的。
用于本发明组合物以及使用该组合物的方法的病毒性抗原例子包括，但不局限于，HIV抗原。这些抗原包括，但不局限于，从HIV包膜糖蛋白(包括但不局限于gp160，gp120和gp41)衍生得到的那些抗原。HIV基因和抗原的许多序列是已知的。例如，Los Alamos国立实验室HIV序列数据库收集、管理和注释了HIV核苷酸和氨基酸序列。该数据库可通过因特网地址http://hiv-web.lanl.gov/进入，也可从每年度出版物中获得，见Human Retroviruses and AIDS Compendium(例如，2000版)。
衍生自感染性因子的抗原可用本领域已知的方法从例如天然病毒或细菌抽提物、从被该感染性因子感染的细胞、从纯化的多肽、从重组产生的多肽和/或合成肽获得。
在一些实施方案中，抗原与IMC相连。IMC可以各种方式与抗原相连。该连接可以在IMC的3′或5′端，或与IMC内部经合适修饰的碱基相连。如果肽具有合适的反应性基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)，它可以与胞嘧啶残基的N-4位氨基直接反应。根据IMC中的胞嘧啶的数量和位置，可在一个或多个残基处实现特异性标记。
或者，可将如本领域已知的的经修饰的寡核苷酸掺入IMC的任一末端或其内部位置。它们可以含有封闭的官能团，当这些官能团解除封闭后，它们可与感兴趣肽上存在的各种官能团反应或连接。
抗原可以通过固相载体化学方法与IMC的3′端相连。例如，IMC可以加到预先合成在载体上的多肽上(Haralambidis等人，Nucleic Acids Res.(1990)18：493-99；Haralambidis等人，Nucleic Acids Res.(1990)18：501-505)。或者，可以合成IMC使得其通过3′端延伸的可断裂接头与固相载体相连。在使IMC从载体上化学断裂后，IMC的3′端留有末端巯基(Zuckermann等人，Nucleic Acids Res.(1987)15：5305-5321；Corey等人，(1987)Science 238：1401-1403)，或末端氨基(Nelson等人，Nucleic Acids Res.(1989)17：1781-94)。氨基修饰的IMC与肽氨基的偶联可按照Benoit等人，Neuromethods(1987)6：43-72中描述的那样进行。巯基修饰的IMC与肽的羧基的偶联可按照Sinah等人，Oligonucleotide Analogues：A Practical Approach(1991)IRL Press中描述的那样进行。
抗原可通过IMC合成期间已经掺入IMC的胺、巯基或羧基基团与IMC的5′端相连。较佳的是，当IMC固定在固相载体上时，将一端有包含保护的胺、巯基或羧基而另一端有亚磷酰胺的连接基团共价连接在IMC的5′羟基上(Agrawal等人，NucleicAcids Res.(1986)14：6227-6245；Connolly，Nucleic Acids Res.(1985)13：4485-4502；Coull等人，Tetrahedron Lett.(1986)27：3991-3994；Kremsky等人，Nucleic Acids Res.(1987)15：2891-2909；Connolly，Nucleic Acids Res.(1987)：3131-3139；Bischoff等人，Anal.Biochem.(1987)164：336-344；Blanks等人，Nucleic Acids Res.(1988)16：10283-10299；美国专利Nos.4,849,513，5,015,733，5,118,800，和5,118,802)。在去保护后，可用潜在的胺、巯基和羧基官能团将IMC共价连接到肽上(Benoit等人，同上；Sinah等人，Oligonucleotide Analogues：A Practical Approach(1991)IRL Press)。
肽抗原可以与IMC中任何位置的经修饰的胞嘧啶或尿嘧啶相连。经修饰碱基C-5上掺入具有潜在反应性官能团(如胺或羧基基团)的“接头臂”为肽连接提供了一种手段(Ruth，第4届重组DNA研究会议，p.123)。
IMC与肽的连接也可通过高亲和性的非共价相互作用(如生物素-链霉亲和素复合体)来形成。例如在寡核苷酸经修饰碱基上可以连接生物素基团(Roget等人，NucleicAcids Res.(1989)17：7643-7651)。在肽上掺入链霉亲和素部分后，可使链霉亲和素偶联的肽与生物素化的IMC形成非共价结合的复合体。
IMC与脂质的连接可用标准方法来形成。这些方法包括，但不局限于，合成寡核苷酸-磷脂偶联物(Yanagawa等人，Nucleic Acids Symp.Ser.(1988)19：189-92)、寡核苷酸-脂肪酸偶联物(Grabarek等人，Anal.Biochem.(1990)185：13135；Staros等人，Anal.Biochem.(1986)156：220-22)，以及寡核苷酸-甾醇偶联物(Boujrad等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5728 31)。
IMC与寡糖的连接可用已知的标准方法形成。这些方法包括，但不局限于，合成寡核苷酸-寡糖偶联物，其中寡糖是免疫球蛋白的一部分(O’Shannessy等人，J.AppliedBiochem.(1985)7：347 55)。
IMC与寡糖的连接可用已知的标准方法形成。这些方法包括，但不局限于，合成寡核苷酸-寡糖偶联物，其中寡糖是免疫球蛋白的一部分(O’Shannessy等人，J.AppliedBiochem.(1985)7：347 55)。
还可用基因方法或化学方法将佐剂和细胞因子连接在IMC/抗原偶联物上。此类融合肽的例子是本领域技术人员所知道的，其可参见Czerkinsky等人，Infect.Immun.，57：1072 77(1989)；Nashar等人，Vaccine，11：235-40(1993)；以及Dertzbaugh和Elson，Infect.Immun.，61：48-55(1993)。
环状IMC与抗原的连接可以几种方式形成。当用重组或化学方法来合成环状IMC时，可将经修饰的核苷掺入IMC内(Ruth，Oligonucleotide and Analogues：A PracticalApproach(1991)IRL Press)。然后用标准的连接技术来连接环状IMC和抗原或免疫刺激性肽(Goodchild，1990，Bioconjugate Chem.1：165)。当环状IMC是分离的或用重组或化学方法合成时，连接可通过化学激活或光激活掺入抗原或免疫刺激性肽中的反应性基团(例如碳烯、自由基)来形成。
用于连接肽和其它分子与IMC的其它方法可参见C.Kessler：核酸的非放射活性标记法“Nonradioactive labeling methods for nucleic acids”L.J.Kricka(编)＂NonisotopicDNA Probe Techniques，＂Academic Press 1992以及Geoghegan和Stroh，Bioconjug.Chem.，3：138-146，1992。
在其它实施方案中，IMC和抗原通过连接在平台分子上而紧密相连。该平台可以是蛋白质类或非蛋白质类(即有机物如聚合物和树突状聚合物)。蛋白质类平台的例子包括但不局限于，白蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵白蛋白。Borel等人(1990)Immunol.Methods 126：159-168；Dumas等人(1995)Arch.Dematol.Res.287：123-128；Borel等人(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107：264-267；Borel等人(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.778：80-87。为了适合结合IMC和抗原，平台是多价的(即，含有多个结合或连接部分)，较佳的是可含有多个结合位点。聚合物平台的其它例子是葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、菲可、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺和聚D-谷氨酸/D-赖氨酸。
使用平台分子的理论是本领域熟知的。通常，平台含有或经衍生处理含有IMC和抗原的合适结合位点。另外，对IMC和/或抗原衍生处理以提供合适的连接基团。例如，简单的平台是双官能接头(即有两个结合位点)，例如肽。
较佳的平台分子是生物学上稳定化的，即它们在体内排泌半衰期通常有数小时至数日至数月，以便提供治疗效果，它们宜由合成的组成明确的单链组成。它们的分子量通常在大约200至200000范围内，较佳的在大约200至50000范围内(或少于例如30000)。化合价平台分子的例子是聚合物(或包含聚合物)，如聚乙二醇(PEG)、聚-D-赖氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-赖氨酸(比例为3∶2)。较佳的聚合物是以聚乙二醇为基础的分子量约为200-8000的聚合物。可使用的其它分子是白蛋白和IgG。
适用于本发明的其它较佳的平台分子是如美国专利5,552,391中所述的化学成分明确的非聚合的化合价平台分子。适用于本发明的特别佳的均质的化学成分明确的化合价平台分子是经衍生处理的2，2’-亚乙基二氧二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。其它合适的化合价平台分子包括，但不局限于，四氨基苯、七氨基β环糊精、四氨基季戊四醇、1，4，8，11-四氮杂环十四烷(Cyclam)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。
这些平台通常是用标准的化学合成技术制得的。PEG必须经衍生处理而成为多价，这可用标准技术来实现。适合偶联物合成的一些物质，如PEG、白蛋白和IgG，可以市售购得。
IMC以及核酸与平台分子的偶联可用任何方式来实现，通常是涉及采用抗原和IMC平台以及平台分子上的一种或多种交联剂和官能团。平台和IMC和抗原必须有合适的连接基团。连接基团用标准的合成化学技术加到平台上。连接基团可用标准固相合成技术或重组技术加到多肽抗原和IMC上。为了与接头相连，重组方法可能需要翻译后修饰，这些方法是本领域中已知的。
例如，多肽含有氨基酸侧链部分，该侧链含有作为多肽与平台偶联部位的官能团如氨基、羧基或巯基。如果多肽并未含有这些基团，可将具有这些官能团的残基加入多肽中。残基的掺入可用固相合成技术或重组技术，这两种技术均是肽合成领域中熟知的。当多肽具有碳水化合物侧链(或如果抗原是碳水化合物)时，可用常规化学方法掺入氨基、巯基和/或醛基官能团。例如在氰基氢硼化钠存在下通过与亚乙基二胺反应掺入伯胺基团，通过与半胱胺二盐酸盐反应然后用标准的二硫化物还原剂还原可以引入巯基，而在用高碘酸氧化后可产生醛基。如果平台不具有合适的官能团，它也可用类似方式衍生处理来含有官能团。
具有不同长度的亲水性接头可用来连接IMC和抗原与平台分子。合适的接头包括乙二醇的线性寡聚物或聚合物。这样的接头包括具有下式的接头：R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保护基团如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基，例如4-硝基苯酯。这些接头可通过硫醚与含有巯基反应性基团(如卤代乙酰基、马来酰亚胺等)的分子连接，并通过酰胺键与含有氨基的第二分子连接。这些接头的连接次序是灵活的，即，硫醚可首先或最后形成。
组合物的制备方法
本领域众所周知，DNA与聚阳离子分子复合通常形成了沉淀或非常大的颗粒。本发明中发现制备组合物的方法可以控制颗粒大小，从而实现了组合物的免疫调节效力，因为约0.1-20微米的颗粒具有最优的免疫调节活性。因此，本发明还提供了制备本发明组合物的方法以及用这些方法制得的组合物。
本领域众所周知，DNA与聚阳离子分子复合通常形成了沉淀或非常大的颗粒。本发明中发现制备组合物的方法可以控制颗粒大小，从而实现了组合物的免疫调节效力，因为约0.1-20微米的颗粒具有最优的免疫调节活性。因此，本发明还提供了制备本发明组合物的方法以及用这些方法制得的组合物。
尽管本发明的组合物可以掺入疏水性组分，但是该组合物较好是在水相中制备。水相可以是纯水，但是更好的是含有一种溶质的水溶液，该溶质可以是盐、pH缓冲剂等(统称为“赋形剂”)。由于本发明组合物通常用于药物用途，因此在制备该组合物时所用的赋形剂可以是药学上可接受的赋形剂。然而，也考虑了用药学上不能接受的赋形剂来制备组合物。当用药学上不能接受的赋形剂来制备组合物时，较佳的是对该组合物进行处理以除去或替换药学上不能接受的赋形剂(例如通过渗滤或其它常规技术)。
本发明组合物的制备方法可用本领域已知的常规加工设备来进行，这些设备例如包括混合器、离心机、泵和其它液体和/或浆液处理机器。本发明的组合物宜在无菌条件下制备，或者在制备后进行灭菌(例如无菌过滤)。
免疫调节组合物通常是通过混合至少一种IMC、至少一种稳定剂和至少一种阳离子缩合剂来制得的。较佳的是，将含有IMC的水溶液与一种或多种稳定剂(或是其水溶液、或是纯的稳定剂，这取决于所用稳定剂的物理性质)以及一种或多种阳离子缩合剂混合。在混合组合物的组分后，认为无需进一步处理即可形成颗粒组合物。然而，较佳的是使IMC/稳定剂/阳离子缩合剂静置多达约48小时，更佳的约12、14或24小时。
在一些实施方案中，首先将IMC与一种或多种阳离子缩合剂混合。较佳的是，将含有IMC的水溶液与一种或多种阳离子缩合剂(或是其水溶液、或是纯的阳离子缩合剂，这取决于所用阳离子缩合剂的物理性质)混合。据信在混合IMC和阳离子缩合剂后无需进行培育，但是该混合物可预先制备并储存至需要的时候。
在IMC和阳离子缩合剂的混合物中加入一种或多种稳定剂以形成颗粒。据信无需其它处理即可形成组合物。然而，较佳的是使IMC/稳定剂/阳离子缩合剂静置多达约48小时，更佳的约12、14或24小时。
在一些实施方案中，首先将IMC与一种或多种稳定剂混合。较佳的是，将含有IMC的水溶液与一种或多种稳定剂(或是其水溶液、或是纯的稳定剂，这取决于所用稳定剂的物理性质)混合。据信在混合IMC和稳定剂后无需进行培育，但是该混合物可预先制备并储存至需要的时候。
在IMC和稳定剂的混合物中加入一种或多种阳离子缩合剂以形成颗粒。本发明中发现，当IMC/稳定剂混合物与阳离子缩合剂混合时能自发形成了本发明的组合物，因此认为无需其它处理即可形成组合物。然而，较佳的是使IMC/稳定剂/阳离子缩合剂静置多达约48小时，更佳的约12、14或24小时。
为了制备掺入脂肪酸作为额外组分的那些组合物，可将脂肪酸加入含有IMC的溶液(其本身或与稳定剂的混合物)中、加入IMC/稳定剂的混合物中、或是和阳离子缩合剂一同加入(或作为与稳定剂的混合物形式加入)。
对于掺入抗原的那些组合物，抗原可在制备方法的任何时候加入。例如，抗原可以是最初的IMC/稳定剂混合物中的组分，或在阳离子缩合剂之前、同时或之后加入。当抗原在加入阳离子缩合剂之后加入时，抗原可在颗粒的纯化或大小分级步骤之前或之后加入。
IMC/稳定剂混合物与阳离子缩合剂的混合通常导致产生了大小在一定范围内的颗粒(“散装产物”)。由于大颗粒是免疫调节用途所不希望的而且较不稳定，因此较佳的是对该散装产物进行进一步处理以除去所需大小范围外的颗粒。可以采用各种大小分级技术，包括膜过滤、凝胶渗透过滤、离心甚至简单的沉淀。用于大小分级的确切技术和参数取决于制备散装颗粒产物时所用的赋形剂、所需的颗粒大小范围以及使用者的偏好。
如上所述，用于本发明方法的最优颗粒直径大小约为0.1-20微米。因此，较佳的是对颗粒组合物进行分级以除去大颗粒，收集所需的颗粒组合物。大颗粒可用任何常规技术除去，这些技术包括在标准重力下沉降、离心和过滤。本发明中发现，简单地使散装颗粒产物沉降(即简单地使大颗粒在标准重力的影响下沉降下来)15小时产生了粒径小于2微米的组合物。如果颗粒大小在15小时后保持恒定，这大致等价于在常用的Beckman JA 12 Rotor中以1000RPM离心10分钟。用2.7微米孔径滤膜过滤也产生从散装颗粒产物中除去大颗粒的满意效果。如果制备方法没有在无菌条件下进行，也没有使用无菌材料，较佳的是在此时用例如无菌过滤的方法对组合物进行除菌。
预计颗粒组合物的水相悬浮液适合大多数情况(如果考虑药物用途，需无菌)。如果制备方法没有在药学上可接受的水溶液中进行，那么较佳的是在此时改变构成组合物的赋形剂，以除去药学上不能接受的赋形剂。不能接受的赋形剂可用常规技术例如渗滤、凝胶渗滤层析的缓冲液交换等方法来除去或替代。当大小分级技术允许时，可方便地将大小分级和缓冲液交换合并在一个方法中(例如在导致大小分级和缓冲液交换的条件下进行凝胶渗滤层析)。
本发明的组合物也可经处理形成干制剂，例如将颗粒组合物的水性悬浮液冻干(有或没有赋形剂存在)。较佳的是，在组合物中加入和/或溶解入一种或多种在冻干后产生组合物干粉形式的填充剂。可接受的填充剂包括，但不局限于，碳水化合物(如单糖如右旋糖、核糖、果糖等，醇糖类如甘露糖醇、肌醇和山梨糖醇，二糖类包括海藻糖、蔗糖和乳糖，天然存在的聚合物如淀粉、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸盐、蛋白质类(例如明胶和血清白蛋白)以及糖原，和合成单体和聚合物。蔗糖是典型填充剂，通常以5-15％(w/v)的浓度使用，典型浓度为10％。
当组合物待用作水性悬浮液时，颗粒产物可以随后进行包装，较佳的是在无菌条件下进行包装。包装的确切形式可根据预期的用途和经销渠道、以及制造商和/或用户的偏好而异。对于作为可注射形式的给药，可将颗粒产品分配在小瓶、安瓿或柔软的包装物中以便取出该产品。如果产品打算通过吸入给药，在可将产品分配在小瓶、安瓿等中通过喷雾器给药，或可将其包装在用作便携式治疗装置的一次性包装/喷嘴组合物中，例如AERx@吸入装置(Aradigm Corp.)。或者，可将组合物分配在适合经皮肤或表皮给药装置的包装内。该组合物还可在包装前与其它赋形剂或载体(例如增强渗透性的化合物、洗液、药膏等)混合。
治疗方法
本发明提供了调节个体、较佳是哺乳动物、更佳是人体内免疫反应的方法，该方法包括给予该个体本发明的组合物。免疫调节可包括刺激Th1型免疫反应和/或抑制或减少Th2型免疫反应。本发明组合物给予的量足以调节免疫反应。如本文所述，免疫反应的调节可以是体液和/或细胞免疫反应，其用本领域已知的以及本文描述的标准技术来测定。
本发明提供了调节个体、较佳是哺乳动物、更佳是人体内免疫反应的方法，该方法包括给予该个体本发明的组合物。免疫调节可包括刺激Th1型免疫反应和/或抑制或减少Th2型免疫反应。本发明组合物给予的量足以调节免疫反应。如本文所述，免疫反应的调节可以是体液和/或细胞免疫反应，其用本领域已知的以及本文描述的标准技术来测定。
许多个体适合接受本文所述的免疫调节组合物。该个体宜为但不必定为人。
在某些实施方案中，该个体患有与Th2型免疫反应相关的疾病，例如变态反应或过敏诱导的哮喘。本发明组合物的给予产生了免疫调节，增加了一种或多种与Th1型反应相关的细胞因子的水平，从而可导致与个体对变应原反应相关的Th2型反应特征减少。免疫调节患Th2型反应相关疾病的个体导致一种或多种疾病症状减少或改善。当疾病是变态反应或变态反应诱导的哮喘时，一种或多种症状的改善包括一种或多种下列症状的减少：鼻炎、过敏性结膜炎、IgE的循环水平、组胺的循环水平和/或对“拯救”吸入治疗(例如用计量吸入器或喷雾器吸入舒喘宁)的需要的减少。
在其它实施方案中，本发明免疫调节治疗的个体对象是接受疫苗的个体。疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗。预防性疫苗含有一个或多个与个体有可能患的疾病有关的表位(例如用结核分枝杆菌抗原作为预防肺结核的疫苗)。治疗性疫苗包含一个或多个与影响个体的特定疾病有关的表位，例如在结核病患者体内的结核分枝杆菌或牛分枝杆菌表面抗原，在过敏个体内对个体有变态反应的抗原(即变态反应脱敏治疗)、来自癌症个体的肿瘤细胞(例如美国专利No.5,484,596)，或癌症患者中的肿瘤相关抗原。如下文实施例5所述，给予了含有肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原HbsAg)的本发明组合物后，小鼠中的抗HBsAg抗体滴度比单用HBsAg有所增加。
本发明的组合物可以和疫苗一同给予(例如在同一注射剂中，或同时但分开注射)，或者，本发明组合物可以分开给予(例如在给予疫苗之后或之前至少12小时)。在某些实施方案中，疫苗抗原是组合物的一部分，它可以与IMC共价或非共价连接，或是与颗粒组合物混合。与接受没有本发明组合物的疫苗的个体相比，将免疫调节组合物治疗给予接受疫苗的个体导致个体对疫苗的免疫反应向Th1型反应偏移。向Th1型反应偏移可通过对疫苗中的抗原有迟发型超敏(DTH)反应、IFN-γ以及其它Th1型反应相关的细胞因子增加、疫苗抗原特异性CTL的产生、低的或减少水平的疫苗抗原特异性IgE、疫苗抗原特异的Th2相关抗体的减少来识别。在治疗性疫苗的情况下，给予本发明组合物和疫苗导致一种或多种疫苗要治疗的疾病症状缓解。本领域技术人员清楚，改善的确切症状和方式将取决于待治疗的疾病。例如，当治疗性疫苗用于治疗结核病时，用本发明组合物加上疫苗的治疗导致咳嗽、胸膜或胸壁疼痛、发热和/或本领域已知的的其它症状减少。当疫苗是变应反应脱敏治疗中所用的变应原时，治疗导致变态反应症状减少(例如鼻炎、过敏性结膜炎、IgE循环水平和/或组胺循环水平减少)。
本发明的其它实施方案涉及对已患疾病如癌症或感染性疾病的个体进行免疫调节治疗。癌症是有吸引力的免疫调节目标，因为大多数癌症表达了体内细胞上未见的肿瘤相关抗原和/或肿瘤特异抗原。刺激抗肿瘤细胞的Th1型反应导致免疫系统直接和/或间接杀伤肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞减少和/或症状减少。将本发明的组合物给予癌症个体将激活对肿瘤细胞的Th1型免疫应答反应。这样的免疫反应能够通过细胞免疫系统细胞(例如CTL)或体液免疫系统的组分的直接作用来杀伤肿瘤细胞，或通过对接近免疫系统所靶向细胞的旁路效应来杀伤肿瘤细胞。例如参见，Cho等人(2000)Nat.Biotechnol.18：509-514。在癌症情况下，本发明组合物的给予进一步包括给予一种或多种其它治疗剂，例如抗肿瘤抗体、化疗方案和/或辐射治疗。抗肿瘤抗体包括但不局限于抗肿瘤抗体片段和/或其衍生物，以及单克隆抗肿瘤抗体、片段和/或其衍生物，它们是本领域已知的用于癌症治疗的抗体制剂(例如
Figure C03819493D00571
(rituximab)；
Figure C03819493D00572
(trastuzumab))。一种或多种其它治疗剂可在给予颗粒组合物之前、之后和/或同时给予。
本发明的免疫调节治疗还可用于患感染性疾病，尤其是对体液免疫反应有耐受性的感染性疾病(例如由分枝杆菌感染和细胞病原体引起的疾病)的个体。免疫调节治疗可用来治疗由细胞病原体(例如细菌或原生动物)或亚细胞病原体(例如病毒)引起的感染性疾病。本发明组合物可给予患有分枝杆菌疾病如结核病(例如结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌感染)、麻风(即麻风分枝杆菌感染)、或瘰疬分枝杆菌或溃疡分枝杆菌感染的个体。本发明组合物还可用于治疗病毒性感染，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒(尤其是单纯疱疹病毒)、和乳头瘤病毒感染。由细胞内寄生虫引起的疾病如疟疾(例如间日疟原虫(Plasmodium vivax)，耶亚疟原虫(P.ovale)，恶性疟原虫(P.falciparum)和/或三间疟原虫(P.malariae)引起的感染)，利什曼病(例如杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)，热袋利什曼原虫(L.tropica)，墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)，巴西利什曼原虫(L.braziliensis)，秘鲁利什曼原虫(L.peruviana)，婴儿利什曼原虫(L.infantum)，恰加斯利什曼原虫(L.chagasi)，和/或埃塞俄比亚利什曼原虫(L.aethiopica)引起的感染，以及弓形虫病(即，Toxoplasmosis gondii引起的疾病)也可得益于颗粒组合物的治疗。免疫调节组合物治疗还可用于治疗寄生虫疾病，例如血吸虫病(即，由血吸虫属例如埃及血吸虫S.haematobium，曼氏血吸虫S.mansoni，日本血吸虫S.japonicum，和湄公河血吸虫S.mekongi引起的感染)以及华支睾吸虫病(即，由华支睾吸虫Clonorchis sinensis感染引起)。将本发明的颗粒组合物给予患有感染性疾病的个体使得这些感染性疾病的症状缓解。在一些实施方案中，感染性疾病不是病毒性疾病。
本发明还提供了增加或刺激个体内至少一种Th1相关细胞因子(包括IL-2，IL-12，TNF-β，IFN-γ和IFN-α)的方法。在某些实施方案中，本发明提供了增加或刺激个体(尤其是需要增加IFN-γ水平的个体)内IFN-γ的方法，该方法是将有效量的免疫调节组合物给予该个体，从而增加IFN-γ。需要增加IFN-γ的对象是对IFN-γ的给予通常有反应的疾病患者。这些疾病包括许多炎性疾病，包括但不局限于溃疡性结肠。这类疾病还包括许多纤维化疾病，包括但不局限于自发性肺纤维化(IPF)、硬皮病、辐射诱导的皮肤纤维化、肝纤维化(包括血吸虫诱导的肝纤维化)、肾纤维化以及可通过给予IFN-γ来改善的其它疾病。给予本发明的免疫调节组合物可提高IFN-γ水平，缓解和稳定对IFN-γ反应的疾病的一种或多种症状、和/或预防或减缓疾病进展(例如减少或消除了额外的病灶或症状)。
本发明方法可以与构成该疾病标准护理的其它治疗方法(例如给予抗炎剂，例如在IPF中的全身皮质固醇治疗(如可的松))联用。
在某些实施方案中，本发明提供了增加个体(尤其是需要增加IFN-α水平的个体)内IFN-α的方法，该方法是给予该个体有效量的免疫调节组合物，从而增加IFN-α水平。需要增加IFN-α水平的个体是患有通常对IFN-α(包括重组IFN-α)的给予有反应的疾病(包括但不局限于病毒感染和癌症)的个体。在某些实施方案中，IMC包括有效诱导IFN-α产生的一种或多种免疫调节多核苷酸，包括除5′-CG-3′之外的一种或多种TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，尤其是在本文所述的免疫调节多核苷酸的5′端。所述额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列可在紧靠CG序列的5′端，或是与CG序列的5′端相隔一个或多个碱基以隔开TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列与CG序列。在一些实施方案中，额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列是通过在CG序列的5′端加入T或TC或T，5-溴胞嘧啶，G序列而产生的。某些实施方案中，当通过在免疫调节多核苷酸5′端加入T或TC或T，5-溴胞嘧啶，G序列来产生额外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列时，额外的序列可产生含ISS的TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
特别有效地诱导IFN-α产生的免疫调节多核苷酸的例子包括但不局限于，5’-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO：27)，5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’(SEQ ID NO：17)，5’-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：28)，5’-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO：29)，5’-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO：30)，5’-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ I DNO：31)，5’-TCGTBGAACGTTCGAGATG-3’(SEQ ID NO：32)，5’-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO：33)，5’-TCGTCGGAAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO：34)，5’-TCGTBGAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO：35)，和5’-TCGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：36)，其中B＝5-溴胞嘧啶。
如本领域技术人员所能理解的，本发明还提供了本发明组合物在制备用于本文所述方法的药物中的用途，包括调节免疫反应、治疗Th2型免疫反应相关疾病以及增加或刺激个体内至少一种Th1型细胞因子。
本发明免疫调节组合物的给予导致IFN-α水平增加、缓解和稳定了对IFN-α反应的疾病的一种或多种症状、和/或预防或减缓了疾病进展(例如减少或消除了额外的病灶或症状)。本发明方法可以与构成该疾病标准护理的其它治疗方法(例如对于病毒感染给予抗病毒剂)联用。
本发明还提供了减少患IgE相关疾病的个体内IgE水平、尤其是血清水平的方法，该方法是给予该个体有效量的颗粒组合物。在这些方法中，免疫调节颗粒组合物可以单独给予(例如没有抗原)或和诸如变应原等抗原一起给予。IgE的减少导致IgE相关疾病的一种或多种症状缓解。这些症状包括诸如鼻炎、结膜炎等变态反应症状，对变应原的敏感性减少，变态反应个体体内的变态反应症状减少，或变态反应严重性减少。因此，本发明还提供了治疗个体内变态反应状态的方法。在一些实施方案中，治疗变态反应状态的方法包括给予免疫调节组合物和特定剂量的抗原。对于任何其它抗原给药，给予的抗原剂量在治疗期间可以相同、减少或增加(如在常规脱敏治疗中的那样)。
在一些实施方案中，本发明提供了刺激个体(尤其是需要增加CTL数量和/或活性的个体)的CTL产生的方法，该方法包括给予该个体有效量的免疫调节组合物，从而使CTL的产生增加。需要CTL产生增加的个体是患有通常对CTL活性有反应的疾病的那些个体。这些疾病包括，但不局限于，癌症和细胞内感染。本发明的颗粒组合物的给予导致CTL水平增加、缓解和稳定了对CTL活性反应的疾病的一种或多种症状、和/或预防或减缓了疾病进展(例如减少或消除了额外的病灶或症状)。
本发明的方法包括本文所述的任何实施方案，例如和或不和抗原一起给予颗粒组合物。
如本领域技术人员所显而易见的，本发明方法可以与颗粒组合物所给予的特定适应症的其它治疗方案联用。例如，免疫调节组合物可以和抗疟疾药物如氯喹组合给予疟疾患者，与杀利什曼原虫药物(如戊双脒和/或别嘌醇)组合来给予利什曼病患者，与抗分枝杆菌药物(如异烟肼、利福平和/或乙胺丁醇)组合给予结核病患者，或与变应原脱敏治疗结合来治疗遗传过敏性(变态反应)患者。
如本文所述，给予免疫调节组合物还可包括给予一种或多种额外的免疫治疗剂(即通过免疫系统作用和/或衍生自免疫系统的制剂)，其包括但不局限于细胞因子、佐剂和抗体(包括但不局限于抗体片段和/或衍生物和单克隆抗体、其片段和/或衍生物)。治疗性抗体例子包括癌症情况下使用的那些抗体(如抗肿瘤抗体)。这些额外的免疫治疗剂的给予适用于本文所述的所有方法。
免疫调节颗粒组合物还可以与佐剂结合在一起给药。将抗原与免疫调节颗粒组合物以及佐剂一起给药导致针对该抗原的免疫反应增强，从而使免疫反应比用含颗粒组合物和抗原的组合物所产生的免疫反应有所增强。佐剂是本领域中已知的，其包括但不局限于水包油乳剂、油包水乳剂、明矾(铝盐)、脂质体和微颗粒(包括但不局限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷。其它合适的佐剂还包括但不局限于、MF59、DETOXTM(Ribi)、鲨烯混合物(SAF-1)、胞壁酰基肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制备物、单磷酰脂质A、霉菌酸衍生物、非离子型嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚基、聚磷腈和衍生物、以及免疫刺激复合物(ISCOMs)(例如Takahashi等人(1990)Nature 344：873-875中描述的那些)、以及基于脂质的佐剂和本文描述的其它物质。佐剂还公开在美国专利No.6,406,705中。对于兽用和动物体内抗体的产生，可使用Freund’s佐剂的促有丝分裂组分(完整和不完整的部分)。
给药和免疫反应的评价
免疫调节组合物可以和如本文所述的其它药物和/或免疫原性制剂和/或免疫刺激剂一同给予，可以和生理上可接受的载体混合给予(因此本发明包括这些组合物)。因此，免疫调节组合物可以和其它免疫治疗剂(包括但不局限于细胞因子、佐剂和抗体)一同给予。
和所有免疫原性组合物一样，免疫调节颗粒组合物的免疫学有效量和给药方法可根据个体、待治疗的疾病以及本领域技术人员知道的其它因素而异。所考虑的因素包括所给予的抗原的抗原性，免疫调节组合物是否和佐剂、输送分子和/或抗原一同给予或共价相连或以其它方式相连、给药途径以及给予的免疫次数。这些因素是本领域技术人员已知的，本领域技术人员无需过多试验就能作这些决定。合适的剂量范围是提供所需的免疫反应调节(例如刺激IFN-γ和/或IFN-α)的剂量。当需要针对抗原的免疫反应时，合适的剂量范围是提供对抗原的所需免疫反应调节的剂量范围。剂量通常用给予患者的IMC的量而不是整个颗粒组合物的总给药量来确定。颗粒组合物的有用的剂量范围(以输送的IMC的量计)例如在大约下列范围内：1至500μg/kg、100至400μg/kg、200至300μg/kg、1至100μg/kg、100至200μg/kg、300至400μg/kg、400至500μg/kg。给予每位患者的绝对量取决于药物学性质如生物利用率、清除速率和给药途径。
具体的颗粒组合物的有效量和给药方法根据个体患者、所需结果和/或疾病类型、疾病阶段以及本领域技术人员知道的其它因素而异。特定用途中的给药途径对于本领域技术人员而言是显而易见的。给药途径包括但不局限于局部、真皮、经皮、经粘膜、表皮、肠胃外、肠胃以及鼻咽和肺(包括透支气管和透过肺泡)给药。合适的剂量范围是提供足量颗粒组合物以获得通过血液水平测得的约1-10μM组织浓度的剂量。给予每位患者的绝对量取决于药物学性质如生物利用率、清除速率和给药途径。
如本文所述，APC以及含有高浓度APC的组织是免疫调节颗粒组合物的较佳的靶。因此较佳的是将颗粒组合物给予存在较高浓度APC的哺乳动物皮肤和/或粘膜。
本发明提供了适合局部施用的免疫调节颗粒组合物制剂，其包括但不局限于生理上可接受的植入物、软膏、乳剂、清洗剂和凝胶。局部给药靠例如其中含有分散的输送系统的敷料或绷带、将输送系统直接给予切口或敞开的伤口、或通过能导向感兴趣部位的透皮给药装置来实现。其中含有分散的免疫调节颗粒组合物的乳剂、清洗剂、凝胶或软膏适合用作局部用软膏或伤口填充剂。
较佳的皮肤给药途径是侵入性最低的那些途径。在这些方式中，较佳的是透皮传递、表皮给药和皮下注射。在这些方式中，对于皮内组织所预期的较高APC浓度，表皮给药是较佳的。
透皮给药可通过施用乳剂、清洗剂、凝胶等而实现，能使免疫调节颗粒组合物渗入皮肤并进入血流，但是由于颗粒的大小，透皮给药应和擦皮法或涉及皮肤完整性的其它技术结合施用。适合透皮给药的组合物包括但不局限于药学上可接受的悬浮液、油、乳剂和软膏，其可直接施加在皮肤上或是掺入诸如透皮装置(所谓的“贴剂”)的保护性载体中。合适的乳剂、软膏等的例子可在例如Physician’s Desk Reference中找到。
该方法所用的典型贴剂产品是General Medical Company of Los Angeles的以LECTRO PATCH为商标的产品。该产品用电学方法维持存贮器的电极处于中性pH，能适合提供不同浓度的剂量以便连续和/或定期给药。贴剂的制备和使用应根据LECTRO PATCH产品所附的生产商印制的说明书来进行，这些说明书纳入本文作为参考。其它闭塞性贴剂系统也是合适的。
对于透皮传递，低频超声输送也是合适的方法。Mitragotri等人(1995)Science269：850-853。低频超声频率(约1MHz)的施加可以总体控制治疗组合物(包括高分子量组合物)的输送。
表皮给药基本上涉及用机械或化学方法充分刺激表皮最外层以引起对该刺激的免疫反应。具体而言，该刺激应当充足以将APC吸引至刺激部位。
典型的机械刺激装置采用了多个直径非常窄的短齿，其可用来刺激皮肤和吸引APC至刺激部位，以吸收从齿端传递的颗粒组合物。例如，Pasteur Merieux of Lyon，France生产的MONO-VACC旧结核菌素测试仪含有适合导入免疫调节颗粒组合物的装置。
该装置(在美国由Connaught Laboratories，Inc.of Swiftwater，PA经销)由一端有注射器活塞、另一端有齿盘的塑料容器组成。齿盘上有多个直径小的长度刚好擦破最外层表皮细胞的齿。MONO-VACC药盒中的每个齿上涂布了旧结核菌素；在本发明中，每个针上涂布了免疫调节颗粒组合物的药物组合物。该装置宜按照该装置产品内包括的生产商的书面说明书来使用。还可用于该实施方案的类似装置是目前用来进行变态反应测试的那些装置。
表皮给予免疫调节组合物的另一合适方法是采用能刺激最外层表皮细胞的化学物质，从而激发了足以吸引APC至该区域的免疫反应。一个例子是角质水解剂，例如Noxema Corporation以商品名NAIR出售的外用脱毛膏中用的水杨酸。该方法还可用来实现粘膜内的上皮给药。化学刺激剂还可与机械刺激结合起来应用(例如，如果用涂布了化学刺激物的MONO-VACC齿装置，会发生这种情况)。颗粒组合物可悬浮于另含化学刺激物的载体内或与其一同给药。
肠胃外给药途径包括但不局限于用电子(离子电渗疗法)或直接注射(如直接注射入中央静脉、静脉内、肌内、腹膜内、真皮内或皮下注射)。适用于肠胃外给药的免疫调节颗粒组合物制剂通常配制在USP水或注射用水中，其还可包含pH缓冲剂、盐填充剂、防腐剂和其它药学上可接受的赋形剂。用于肠胃外注射的免疫调节组合物可配制在药学上可接受的无菌等渗溶液如盐水和注射用磷酸缓冲盐水中。
肠胃给药途径包括但不局限于吞食和直肠给药。本发明包括适合肠胃道给药的免疫调节颗粒组合物制剂，其包括但不局限于，药学上可接受的可吞食的粉末、丸剂或液体，以及用于直肠给药的栓剂。对于本领域技术人员显而易见的是，丸剂或栓剂还包含药学上可接受的固体(如淀粉)以便为组合物提供填充剂。
鼻咽和肺给药用可通过吸入法来实现，其包括鼻内、透过支气管和透过肺泡输送途径。本发明包括适合通过吸入给药的免疫调节颗粒组合物制剂，其包括但不局限于形成气溶胶的悬浮液以及用于干粉吸入输送系统的粉末形式。适合吸入给药的装置包括但不局限于喷雾器、蒸发器、喷雾吸入器以及干粉吸入输送装置。
如本领域中所熟知的，用于本文所述给药途径的溶液或悬浮液可包括一种或多种下列组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂；抗菌药如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的试剂如氯化钠或葡聚糖。pH可用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节。肠胃外制剂可以装在安瓿、一次性注射器或多个玻璃或塑料制成的单剂小瓶内。
如本领域中所熟知的，适合可注射用的药物组合物包括无菌水溶液或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。如本领域技术人员所理解的，无菌粉末通过在给药前与合适的载体混合来重建。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，应当具有很容易注射的流动性。它应在生产和储存条件下稳定，必须对诸如细菌和真菌等微生物污染作用进行防腐。载体可以是溶剂和分散介质，其例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇液体等)及其合适的混合物。微生物作用的预防可用各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。较佳的是该组合物中包括了等渗剂如糖类、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)，可使可注射组合物的吸收延长。
如本领域所熟知的，可将所需量的活性化合物以及上述一种组分或诸组分的组合按需掺入合适溶剂中然后过滤除菌，从而制得无菌的可注射溶液。分散液通常是通过将活性化合物掺入含有基础分散介质以及上述其它组分的无菌载体中来制得的。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末情况下，较佳的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而从已经过无菌过滤的溶液产生活性组分和任何其它所需的组分的粉末。
可通过选择输送途径来调节引发的免疫反应。例如，当经肌内或表皮(基因枪)途径给予流感病毒载体时，产生的IgG滴度和CTL活性相同。然而，肌肉接种主要产生IgG2a，而表皮途径主要产生IgG1。Pertmer等人(1996)J.Virol.70：6119-6125。因此，本领域技术人员能利用本发明的免疫调节多核苷酸的给药途径不同而引发免疫原性的细微差别。
上述组合物和给药方法意图描述但不限制本发明免疫调节组合物制剂的给药方法。产生各种组合物和装置的方法是本领域技术人员力所能及的，在此不再详细描述。
针对颗粒组合物的免疫反应可用本领域已知的任何方法来分析(定量的和定性方法)，其包括但不局限于测定抗原特异性抗体的产生(包括测定特异性抗体亚类)、特异性淋巴细胞群(CD4+T细胞，NK细胞或CTLs)的激活，细胞因子(例如IFN-γ，IFN-α，IL-2，IL-4，IL-5，IL-10或IL-12)的产生和/或组胺的释放。测定特异性抗体反应的方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，这些方法是本领域熟知的。测定特定类型淋巴细胞(如CD4+T细胞)数量的方法可以用荧光激活的细胞分拣术(FACS)来实现。细胞毒性和CTL试验可按照Raz等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9519-9523以及Cho等人(2000)的方法进行。细胞因子浓度可用例如EILSA法测定。评价针对免疫原的免疫反应的这些和其它试验是本领域熟知的。例如参见，Selected Methods in CellularImmunology(1980)Mishell和Shiigi编，W.H.Freeman and Co。
较佳的是，刺激(即引发和/或增强)了Th1型反应。根据本发明，Th1型免疫反应的刺激可通过在体内或活体外测定经免疫调节颗粒组合物处理的细胞的细胞因子产生并与未经颗粒组合物处理的情况相比来确定。测定细胞产生细胞因子的方法包括本文所述的且本领域已知的那些方法。对颗粒组合物处理的反应中产生的细胞因子的类型表示了细胞的免疫反应偏向Th1型还是Th2型。本文所用的术语“偏向Th1型”细胞因子产生指，在刺激剂存在下与Th1型免疫反应相关的细胞因子产生比没有刺激时此类细胞因子的产生有可测的增加。这些Th1型偏向的细胞因子包括，但不局限于，IL-2、IL-12、IFN-γ和IFN-α。相反，“Th2型偏向的细胞因子”指与Th2型免疫反应相关的那些细胞因子，包括但不局限于IL-4，IL-5和IL-13。可用于确定颗粒组合物活性的细胞包括免疫系统的细胞、分离自宿主和/或细胞系的原代细胞，较佳的是APC和淋巴细胞，更佳的是巨噬细胞和T细胞。
经免疫调节颗粒组合物处理的宿主中的Th1型免疫反应的刺激还可用本领域已知的任何方法来测定，这些方法包括但不局限于：(1)任选地与接触过抗原的、或与抗原接触过并受攻击的、经对照处理而未用颗粒组合物处理的情况相比，抗原攻击之前和之后测得的IL-4或IL-5水平减少；或经免疫调节颗粒组合物处理的宿主中的IL-4或IL-5检测水平较低；(2)与接触抗原的、或与抗原接触并受攻击的、经对照处理而未用颗粒组合物处理的情况相比，抗原攻击之前和之后测得的IL-12、IL-18和/或IFN(α，β或γ)水平增加；或经免疫调节颗粒组合物处理的宿主中的IL-12、IL-18和/或IFN(α，β或γ)检测水平较高；(3)与经对照而未经颗粒组合物处理的情况相比，经免疫调节颗粒组合物处理的宿主中有“Th1型偏向”的抗体产生；和/或(4)与接触抗原的、或与抗原接触并受攻击的、经对照处理而未用颗粒组合物处理的情况相比，抗原攻击之前和之后测得的抗原特异性IgE水平减少；或经免疫调节颗粒组合物处理的宿主中的抗原特异性IgE检测水平较低甚至没有。可通过用本文所述的或本领域已知的方法测定体内或活体外APC和/或淋巴细胞(较佳的是巨噬细胞和/或T细胞)产生的细胞因子进行此类各种测定。这些测定中的一些可以是用本文所述或本领域已知的方法来测定抗原特异性抗体的类别和/或亚类。
对免疫调节颗粒组合物处理反应而产生的抗原特异性抗体的类别和/或亚类表示了细胞免疫反应偏向Th1型还是Th2型。本文所用的术语“Th1型偏向”的抗体产生指与Th1型免疫反应相关的抗体(即Th1相关抗体)产生有可测的增加。可以测得有一种或多种Th1相关抗体。这些Th1型偏向抗体的例如包括，但不局限于，人IgG1和/或IgG3(例如参见Widhe等人(1998)Scand.J.Immunol.47：575-581以及de Martino等人(1999)Ann.Allergy Asthma Immunol.83：160-164)和小鼠IgG2a。相反，“Th2型偏向抗体”指与Th2型免疫反应相关的那些抗体，其包括但不局限于人IgG2，IgG4和/或IgE(例如参见Widhe等人(1998)和de Martino等人(1999))以及小鼠IgG1和/或IgE。
由免疫调节颗粒组合物的给予而诱导产生的Th1型偏向的细胞因子增强了细胞免疫反应(例如NK细胞、细胞毒性杀伤细胞、Th1辅助和记忆细胞所进行的细胞免疫反应)。这些反应能特别有利地用于抗病毒、真菌、原生动物、寄生虫、细菌、变态反应疾病和哮喘以及肿瘤的保护性或治疗性疫苗接种。
在某些实施方案中，Th2反应被抑制(减少)。Th2反应的抑制可通过例如Th2相关细胞因子(如IL-4和IL-5)水平的减少、Th2相关抗体水平减少、IgE减少以及对变应原反应的组胺释放减少来确定。
药盒
本发明提供了药盒。在某些实施方案中，本发明的药盒通常包含一个或多个含有本文所述任一免疫调节颗粒组合物的容器。或者，该药盒可包含一个或多个含有本发明组合物的组分的容器。该实施方案的配置中包括一个容器有IMC/稳定剂混合物、一个容器有阳离子缩合剂的药盒，以及一个容器有IMC、一个容器有稳定剂、一个容器有阳离子缩合剂的药盒。该药盒还进一步包含一组合适的关于将颗粒组合物用于本文所述任何方法(例如免疫调节、缓解感染性疾病的一种或多种症状、增加IFN-γ水平、增加IFN-α水平、或缓解IgE相关疾病)的说明(通常是书面说明)。包含组合物组分的容器的药盒方案通常包括根据本文所述方法制备该组合物的说明。除了本发明的组合物和/或该组合物的组分外，该药盒方案还可包括根据本文所述方法制备组合物的说明，以及将免疫调节组合物用于本文所述任何方法的说明。
该药盒可包含包装在任何方便的、合适的包装内的免疫调节颗粒组合物。例如，如果颗粒组合物是干制剂(如冷冻冻干的或干粉)，通常采用了具有弹性塞子的小瓶。这样，通过弹性塞子注入液体可以容易地重悬该免疫调节颗粒组合物。具有没有弹性的可除去的封闭件(如密封的玻璃)或弹性塞子的安瓿是最常用于颗粒组合物的液体制剂的，但是也可使用类似于“血液袋”的柔软的包装。还打算使用的是用于和特定装置(如吸入器、经鼻给药装置(如雾化器)或灌输装置(如微型泵))结合的包装。
关于免疫调节颗粒组合物的用途的说明书通常包括对于预期的用法的剂量、给药方案以及给药途径的信息。免疫调节颗粒组合物的容器可以单位剂量、散装(例如多剂包装)或亚单位剂量。本发明药盒中提供的说明书通常是在标记或包装插入物(例如包括在药盒中的纸张)上的书面说明，但是机器可读的说明(例如磁盘或光学存储盘上的说明)也是可以接受的。
在一些实施方案中，药盒还包括抗原(或一种或多种抗原)，它可以包装或不包装在免疫调节颗粒组合物的同一容器(制剂)内。抗原在本文中已有描述。
提供下列实施例是为了描述而非限制本发明。
实施例
实施例1
用颗粒制剂免疫调节人细胞，用白蛋白作为稳定剂
将多粘菌素B(PMXB)，多粘菌素E(PMXE，也称为粘杆菌素)，以及两性霉素B(AMTB)以及免疫调节多核苷酸混合在含血清培养基中(其中有稳定剂白蛋白)，以产生颗粒组合物。用测定人外周血液淋巴细胞的干扰素(IFN)α和γ产生的试验(“hPBMC”试验)测试制剂的免疫调节活性。IMC(“+ISS”)具有序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)，阴性对照寡核苷酸(“-ISS”)具有序列5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO：26)。两个寡核苷酸均是全部修饰的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。
用肝素化注射器通过静脉穿刺从志愿者收集外周血液。将血液成层于
Figure C03819493D00661
(Amersham Pharmacia Biotech)垫上并离心。收集位于
Figure C03819493D00662
界面的PBMC，然后用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将细胞以2×106细胞/毫升重悬并培育在24或48孔板内RPMI完全培养基(RPMI 1640，含10％热灭活人AB型血清加上50单位/毫升青霉素、50微克/毫升链霉素、300微克/毫升谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1×MEM非必需氨基酸(NEAA))中。
将寡核苷酸(+ISS或-ISS)直接加入孔内至20μg/ml，将PMXB直接加入孔内至100μg/ml，制得颗粒组合物。细胞在测试样品存在下培育24小时，然后从各孔收集无细胞培养液，测定IFN-γ和IFN-α的浓度。IFN-γ和IFN-α用购自BioSource International，Inc.的CYTOSCREENTM ELISA药盒根据生产商说明书测定。在hPBMC试验中，不同供血者的IFN-γ本底水平可以不同，甚至可以有明显差别。然而，其它细胞因子如IFN-α一般表现为稳定的活性模式，而且在未刺激条件下通常显示低本底水平。
在白蛋白存在下PMXB和IMC的组合导致IFN-α和IFN-γ的分泌相对于颗粒组合物单用IMC或单用-ISS有显著提高(p<0.01，p<0.001)。这一结果是特别不寻常的，因为PMXB本身没有免疫调节活性。结果归纳在表2中。
表2
Figure C03819493D00681
进行另一实验以测试作为阳离子缩合剂的两性霉素B。将IMC(+ISS)与PMXB(100μg/ml终浓度)或AMTB(10μg/ml终浓度)混合在培育孔内含血清培养基(其提供稳定的剂白蛋白)中，在hPBMC试验中测试。和PMXB一样，AMTB本身没有活性，但是其导致免疫调节活性比单用+ISS增加。结果归纳在表3中。
表3
Figure C03819493D00691
在hPBMC试验中还测试了采用多粘菌素B(一种与PMXB密切相关的化合物)作为阳离子缩合剂的颗粒组合物。该颗粒制剂用以下方法预先制得：(a)O/S+C：将寡核苷酸和稳定剂(人血清白蛋白HAS)或聚乙二醇山梨糖醇酐单油酸盐(
Figure C03819493D00692
 80)混合，然后将寡核苷酸/HAS混合物与阳离子缩合剂(PMXE或PMXB)混合；或(b)O/C+S：将寡核苷酸与阳离子缩合剂混合，然后与稳定剂合并。制剂中组分的终浓度为：1rng/mL IMC，5mg/mL PMX，以及20mg/mL HSA或0.4％(v/v)
Figure C03819493D00693
 80。使用前使制剂在室温下(约22℃)静置一天。在加入培养物之前，通过漩涡振荡使容器底部沉淀的重悬。
将样品加入培养物中至寡核苷酸终浓度为20微克/毫升(多粘菌素对照为100微克/毫升多粘菌素)。结果归纳在表4中。
表4
Figure C03819493D00701
实施例2
用颗粒组合物免疫调节人细胞，用非离子型洗涤剂作为稳定剂
在hPBMC试验中测试用聚氧乙烯洗涤剂作为稳定剂制得的颗粒组合物。另外，还测试了掺入脂肪酸的组合物。
将免疫调节寡核苷酸+ISS与聚乙二醇山梨糖醇酐单油酸盐(
Figure C03819493D00702
 80)混合，然后与PMXB形成颗粒组合物。在hPBMC系统(如实施例1所述)中试验前，使制备物静置7天。制剂中组分终浓度为1mg/mL IMC，5mg/mL PMX，以及20mg/mL HSA或0.1％-0.4％(v/v)
Figure C03819493D00703
 80。使用前使制剂在室温下(约22℃)静置一天。在加入培养物之前，通过漩涡振荡使容器底部沉淀的重悬。
将样品加入培养物中至寡核苷酸终浓度为20微克/毫升(多粘菌素对照为100微克/毫升多粘菌素)，如实施例1所述用hPBMC试验测试。所有颗粒组合物，包括试验前静置7天的那些颗粒组合物，都具有活性。结果归纳在表5中。
表5
 
样品           时间      IFN-γ(pg/ml)          IFN-α(pg/ml)供血者  供血者  平均   供血者  供血者  平均198      199    值      198     199     值
培养基               1        7       4      173     126     150+ISS                 10       167     88     224     277     250-ISS                 5        18      12     151     279     215PMXB/+ISS/HS  3小时  353     939      646    1447    632     1040APMXB/+ISS/    3小时  406     1054     730   1814     790     13020.2％ 吐温 80PMXB/+ISS/    3小时  457     877      667   1617     822     12190.3％ 吐温 80PMXB/+ISS/    3小时  425     729      577   1746     749     12470.4％ 吐温 80PMXB/+ISS/HS  1天    360     776      568   1286     456     871APMXB/+ISS/    1天    394     824      609   1719     1207    14630.1％ 吐温 80PMXB/+ISS/    4天    590     300      445   901      130     5150.1％ 吐温 80PMXB/+ISS/HS  7天    4000    1455     2727  1529     613     1071A
进行另一实验，测试另一聚氧乙烯非离子型洗涤剂(
Figure C03819493D00711
 85)作为稳定剂和包含脂肪酸(油酸)的组合物。另外，一个样品在试验前用2.7微米滤膜过滤。
将免疫调节寡核苷酸+ISS与聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸盐(
Figure C03819493D00712
 85)混合，然后与PMXB混合形成颗粒组合物。制剂中组分的终浓度为1mg/mL IMC，5mg/mL PMX，以及0.4％(v/v) 85+0.4％油酸或20mg/mL HSA。使用前使制剂在室温下(约22℃)静置一天。试验前使制剂静置12天，使用前重新悬浮。
将样品加入培养物中至寡核苷酸终浓度为20微克/毫升(多粘菌素对照为100微克/毫升多粘菌素)，如实施例1所述用hPBMC试验测试。掺入了聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸盐(
Figure C03819493D00721
 85)(有或没有油酸)作为稳定剂的组合物有活性，即便是在用2.7微米滤膜过滤之后。结果归纳在表6中。
表6
Figure C03819493D00722
实施例3
颗粒组合物内的大小分布
用以下方法制得颗粒组合物：将寡核苷酸+ISS(2mg/mL)与预先混合的0.4％(v/v)聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸盐与0.4％(v/v)油酸的组合混合，然后加入PMXB至5mg/mL。使所得悬浮液在室温下静置过夜。取出上清后直接使用(Supe1)或用2.7μm滤膜过滤(Whatman GF/D，GMF prefilter；Supe 2)。将沉淀物重悬于等体积PBS中。
用Malvern Mastersizer仪器进行激光散射测定三种样品每一种的等份中的颗粒大小，在用0.1N氢氧化钠使颗粒解离后用大小排阻层析测定+ISS浓度。用实施例1所述的hPBMC试验测定免疫调节活性。
Supe1 含有直径约为0.1-10微米的颗粒，其中+ISS为0.53毫克/毫升。Supe2含有直径约为0.1-1微米的颗粒，其中+ISS为0.3毫克/毫升。沉淀含有直径范围在约0.1-90内的颗粒(大多数的直径为20-90微米)，其中+ISS为0.95毫克/毫升。所有三种样品在hPBMC试验中有活性，但是沉淀的活性最低。hPBMC试验的结果归纳在表7中。
表7
Figure C03819493D00731
实施例4
用掺入各种免疫调节多核苷酸的颗粒组合物免疫调节人细胞
将一组IMC掺入颗粒组合物中，在hPBMC试验中测试免疫调节活性。该组IMC列于表8(寡核苷酸骨架是硫代磷酸酯，除非另有所述；较少的情况下碱基通过磷酸二酯键连接，用“ds”表示双链).
表8
 
名称          序列                                    SEQ ID NO
+ISS          5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’          1-ISS          5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’          26+ISS(O/S)     5’-TGActgtgaacgttcgAGATGA-3’         4020-pG(O/S)    5’-GGtgcatcgatgcagGGGGG-3’           37CIC<sub>br</sub>-HEG     (5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-AACGTTC-3’CIC-HEG       5’-TCGTCG-HEG-AACGTT-HEG-AGATGAT-3’CIC-C<sub>3</sub>        5’-TCGTCGA-C3-ACGTTCG-C3-AGATGAT-3’ds+ISS(P＝O)  5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’         1+ISS(P＝O)    5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’         116<sub>TCG</sub>         5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’                1714T<sub>CG</sub>         5’-TCGTCGAACGTTCG-3’                  1812<sub>TCG</sub>         5’-TCGTCGAACGTT-3’                    1910<sub>TCG</sub>         5’-TCGAACGTTC-3’                      208<sub>TCG</sub>          5’-TCGTCGAT-3’7<sub>TCG</sub>          5’-TCGTCGA-3’TCG<sub>2</sub>          5’-TCGTCG-3’5<sub>TCG</sub>          5’-TCGTT-3’
用以下方法制备颗粒制剂：首先制备1毫克/毫升寡核苷酸，0.4％ TWEEN
Figure C03819493D0074141657QIETU
85，0.4％油酸溶液，然后使该溶液中有5毫克/毫升PMXB。试验前使制剂在室温下静置24小时。
对制剂进行漩涡振荡以使沉降的沉淀物重新悬浮，然后加入培养物中至寡核苷酸终浓度为20μg/ml(对于多粘菌素对照为100μg/ml多粘菌素)，用如实施例1所述的hPBMC试验测试。结果归纳在表9中。
表9
实施例5
多粘菌素结构域和ISS活性的增强
PMXB有两个主要结构域：(1)含有5个带正电荷氨基酸残基的环状肽以及(2)N末端亲脂性脂肪酰基衍生物。为了确定IMC活性增强是否需要一个或两个结构域，测试多粘菌素家族的两个衍生物的增强IMC的能力。测试的衍生物是缺少聚阳离子结构域的粘杆菌素甲磺酸酯(CMS)，以及缺少亲脂性结构域的多粘菌素B九肽(PMXB-9)。
用20μg/ml IMC寡核苷酸(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ IDNO：1)或20μg/ml-ISS寡核苷酸(5’-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3’(SEQ IDNO：38)，阴性对照)在有或没有100μg/ml PMXB，粘杆菌素(CLN)，CMS，或PMXB-9下刺激来自6位供血者的PBMC24小时。对于这些试验，在含有人血清白蛋白的PBMC细胞培养物中分别加入ISS和多粘菌素。结果显示在表10中。
表10
Figure C03819493D00771
如表10所示，尽管CMS和PMXB-9都增强了IMC的IFN-γ/α-刺激活性，但是CMS和PMXB-9表现出的IFN-γ/α-增强活性显著低于PMXB或CLN。这些数据表明多粘菌素分子中的聚阳离子结构域和亲脂结构域都是多粘菌素最佳IMC增强活性所必需的。
实施例6
多粘菌素颗粒制剂和ISS活性
在人PBMC中，IMC刺激诱导了熟知的和特异性的基因活化模式(包括细胞因子、趋化因子和抗病毒因子)。检查了PMXB增强IMC活性期间的这种模式。用有或没有PMXB的IMC刺激4位供血者的人PBMX4-10小时。测试两种不同的IMC：(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)和(5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’(SEQ ID NO：39)。对于这些试验，在含有人血清白蛋白的PBMC细胞培养物中分别加入ISS和多粘菌素。为了评价基因表达，从细胞悬浮液分离的RNA合成cDNA，用
Figure C03819493D00781
技术对RNA定量测定。在这些时间点评价下列基因的表达：IFN-γ和IFN-α，干扰素可诱导的蛋白-10(IP-10)，IFN-γ诱导的单核因子(MIG)，2，5-寡腺苷酸合成酶(2，5-OAS)以及干扰素刺激基因-54K(ISG-54K)。这些结果显示在表11中。
表11
通过10小时的刺激，PMXB明显增强了IMC SEQ ID NO：1诱导各种基因(包括IFN-γ和IFN-α、趋化因子如IP-10和MIG以及抗病毒剂2，5-OAS和ISG-54K)表达的能力。IMC SEQ ID NO：39显示出比IMC SEQ ID NO：1加速的基因诱导动力学，因此选择较早的时间点来观察PMXB的增强作用。在4小时时，PMXB显著增强了IMCSEQ ID NO：39的转录诱导活性(类似于10小时时的IMC SEQ ID NO：1)。因此，PMXB似乎从量上增加了基因活化的IMC转导信号，但不引起性质上的改变。
实施例7
IMC颗粒制剂增强浆细胞状(plasmacytoind)树突细胞的IFN-α产生
用胞内染色试验和FACS分析检查人PBMC浆细胞状(plasmacytoind)树突细胞的IFN-α产生。这些试验用20μg/mlIMC寡核苷酸5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)或5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’(SEQ ID NO：39)或20μg/ml-ISS寡核苷酸(5’-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3’(SEQ ID NO：38)，阴性对照)进行。对于这些试验，在含人血清白蛋白的PBMC细胞培养物中分别加入IMC或-ISS。
人PBMC用20μg/mL IMC或-ISS(有或没有100μg/mL PMXB)刺激6小时，最后两小时还存在布雷菲德菌素A(防止高尔基体释放新合成的蛋白质的试剂)。6小时后，用荧光标记的PDC标记物、FITC标记的抗BCDA-2以及PE标记的抗-IFN-α对细胞染色。对标记的细胞进行FACS分析。用2种不同的IMC进行试验，双染色细胞群(BCDA-2+，IFN-α+)在总PBMC中的百分数列于表12中。
表12
Figure C03819493D00801
如表12所示，当存在PMBX下用两种IMC处理PBMC时，双染色细胞的百分数显著增加，但是在PMXB存在下用-ISS寡核苷酸处理则没有。该结果表明在IMC/PMXB制剂存在下观察到的PBMC产生IFN-α的增强衍生自PDC。另外，在BCDA-2-(非-PDC)细胞组分中没有观察到可检测的IFN-α产生。
实施例8
用颗粒组合物诱导人细胞的天然杀伤细胞活性
天然杀伤(NK)细胞的裂解活性被免疫调节多核苷酸激活。NK细胞通过浆细胞状树突细胞(PDC)传递的信号被IMC间接激活。该信号的确切性质还未被鉴定，但是IFN-α似乎在该信号传导中起了主要作用。
测试IMC颗粒制剂的NK细胞刺激活性。用10μg/mL IMC(“+ISS”)5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO：1)(有或没有100μg/mL PMXB)刺激两位供血者的PBMC 48小时。然后，测试PMXB对于作为靶细胞的51Cr标记的K562细胞的裂解活性。对照是：单独培育K562细胞，用Triton裂解K562细胞，以及用未处理的PBMC细胞刺激K562细胞。通过测定释放到培养基中的51Cr来测定靶细胞裂解的程度。PMXB的存在增加了单用IMC刺激的NK细胞裂解活性。结果归纳在表13中。
表13
Figure C03819493D00811
实施例9
颗粒组合物在小鼠体内的免疫调节作用
测定小鼠对乙肝表面抗原(HBsAg)以及IMC(“+ISS”)颗粒制剂或空白+ISS的免疫应答反应。IMC(“+ISS”)具有序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQID NO：1)，它是完全修饰的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。
用以下方法制得颗粒制剂：首先制备1毫克/毫升寡核苷酸，0.4％ 
Figure C03819493D00821
 85，0.4％油酸盐溶液，或1毫克/毫升寡核苷酸，20毫克/毫升HSA溶液，然后使该溶液中的PMXB为5毫克/毫升。使用前使制剂在室温下静置24小时。注射前将HBsAg加入制剂中。将单独HBsAg以及HBsAg加+ISS作为对照。
将小鼠(BALB/c)分成10个一组，在第0周和第2周通过肌内注射给予测试制品(5μg+ISS和1μg HBsAg)。在第2周和第4周通过尾部取血获得血清样品。所有小鼠在第6周处死。
用ELISA测定血清样品的IgG1和IgG2a滴度。接受颗粒制剂的小鼠显示出明显较高的IgG2a滴度，表明是Th1应答反应。第2周和第4周的抗体滴度(截断OD值时的样品稀释度的倒数)以滴度±标准偏差的形式归纳在表14中。
表14
Figure C03819493D00822
分离得到处死小鼠脾脏的脾细胞，分别测试抗原刺激的细胞因子释放或肽刺激的细胞裂解活性。
细胞因子释放用以下方法测定：将每组10只动物的细胞培育在96孔平底板内RPMI 1640加10％ FCS中(5×105脾细胞/孔)。在5μg/mL HBsAg、单独培养基(阴性对照)或PMA/离子霉素(阳性对照)存在下培养细胞4天。收集培养液并测定IFN-γ和IL-5水平。经任一免疫调节制剂处理的动物脾细胞显示出IFN-γ释放增加和IL-5释放减少。结果归纳在表15。
表15
将每组5只动物的脾细胞重悬于RPMI 1640加10％ FCS(3×107细胞/孔)中，在有或没有1微克/毫升的肽IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO：41)(乙肝病毒CTL表位)下培育4天。洗涤细胞并稀释至4×106细胞/毫升，转移到抗体包被的ELISPOT平板上，然后培育5-7小时。培育后，用去离子水裂解细胞，与抗-IL-4或抗-IFN-γ抗体反应，给阳性细胞评分(斑点形成单位，SFU)。用该颗粒制剂处理的动物脾细胞有增加数量的IFN-γ阳性细胞，且产生IFN-γ的细胞：产生IL-4的细胞的比例增加。结果归纳在表16中(表示成阳性细胞/105细胞)。
表16
Figure C03819493D00832
将每组其余5只动物的脾细胞悬浮在15毫升的RPMI 1640加10％ FCS中。将12毫升的悬浮液分在12孔板的6个孔内。将其余的细胞悬浮液与1微克/毫升CTL肽IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO：41)混合，用三倍体积的5.33％大鼠T-Stim稀释，然后均分到已接种的但未刺激的细胞中。培育培养物4天，用2％大鼠T-Stim洗涤，重新涂板接种，然后再培育2天。测丁该方法所产生的针对有Cr51的MHC匹配的细胞或Cr51以及CTL肽IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO：41)的效应细胞。经+ISS(在溶液中或在颗粒制剂中)加上HBsAg处理的动物细胞显示出杀死70％以上的靶细胞。结果归纳在表17中。
表17
Figure C03819493D00841
实施例10
用颗粒组合物免疫调节小鼠肺细胞
测定小鼠肺细胞中对免疫调节制剂反应的各种基因的调节。
用以下方法制备颗粒制剂：首先，制备含1毫克/毫升+ISS，0.4％ 
Figure C03819493D00842
 85，0.4％油酸盐的溶液或20毫克/毫升HSA溶液，然后使该溶液中有5毫克/毫升PMXB。使制剂在室温下静置24小时，然后用10kDa膜透析。通过鼻内灌输给予轻度麻醉小鼠(每组5只小鼠)颗粒组合物和单独+ISS(50μL剂量)。给药后6小时处死动物，用外科手术取出肺组织，通过对肺组织匀浆制得细胞悬浮液。从分离自细胞悬浮液的RNA合成cDNA，用
Figure C03819493D00843
技术对RNA定量。颗粒制剂诱导了大多数受测基因显著增加。结果归纳在表18。
表18
Figure C03819493D00851
Figure C03819493D00861
实施例11
颗粒制剂和灵长动物体内的HBsAg抗体反应
测定狒狒对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)结合PMXB/+ISS/Tween/油酸盐(Tween)颗粒制剂的免疫反应。颗粒制剂用以下方法制得：首先制备1毫克/毫升寡核苷酸、0.4％ 
Figure C03819493D00862
 85、0.4％油酸盐溶液，然后使溶液中PMXB为5毫克/毫升。在给药前使制剂在室温下静置24小时。注射前将HBsAg(20μg)加入制剂中。用单用HBsAg和HBsAg与+ISS作为对照。
在第0周和第8周用HBsAg(20μg，n＝5)，HBsAg(20μg)+ISS(SEQ ID NO：1)(1000μg，n＝5)，或HBsAg 20μg+吐温制剂(1000μg+ISS(SEQ ID NO：1)，n＝10)给每组5-10只动物进行肌内免疫。各免疫的两周后，对狒狒取血，收集血清样品。
用Abbott Laboratories的AUSAB酶免疫试验对来自血清样品的HBsAg特异性抗体反应定量。在人体内，10mIU/毫升的滴度被认为有保护力。结果归纳在表19中(每组的几何平均值(geomean)±SE)。
表19
 
免疫组 第一次免疫后抗-HBsAg(mIU/毫升) 第2次免疫后抗-HBsAg(mIU/毫升)
单用HBsAg(20μg) 0±2 4±24
HBsAg(20μg)++ISS(1000μg) 8±6 260±3,939
HBsAg(20μg)+吐温制剂(1000μg+ISS) *26±269 *797±1,326
*p<0.05，与单用HbsAg相比，用Kruskal-Wallis测试
在第一次和第二次免疫后，经HBsAg和吐温制剂免疫的狒狒诱导出统计学上高于单用HBsAg免疫的动物的HBsAg特异性抗体反应。该数据表明，除了前面所示的增强小鼠内免疫反应外，颗粒吐温制剂还增强了灵长动物体内的免疫反应。
实施例12
免疫调节组合物的冻干
用以下方法制备一批10mL的免疫调节组合物：将0.4mL 10％油酸(在水中)，4mL 1％吐温85(在水中)，1mL 20毫克/毫升+ISS(SEQ ID NO：1)和3.6mlDulbecco经修饰的磷酸酯缓冲盐水混合。充分混合后，边振荡混合边缓慢加入1mL50毫克/毫升PMXB硫酸盐。将816mg蔗糖溶解在8mL悬浮液中，使其静置过夜。通过漩涡振荡重新悬浮颗粒，将材料分成2毫升等份。将小管浸在干冰/乙醇中使两个等份冻结。一个等份在LABCONCO Freezone 4.5冷冻干燥机中约0.06mBar压力下冻干。在重新悬浮于去离子水中之前将样品室温保存2周。重建组合物的分析结果表明悬浮液中的颗粒大小分布与未经冻干的0时的对照样品相等。
实施例13
对冻干的颗粒制剂的抗体应答反应
测定小鼠对HBsAg结合冻干的吐温(PMX/+ISS/Tween/油酸盐)颗粒制剂的免疫反应。用1μg剂量的单独HBsAg、HBsAg与1或5μg+ISS(SEQ ID NO：1)的混合物，或HBsAg与实施例12所述的冻干的(lyoTween)制剂(但有1或5μg+ISS寡核苷酸(SEQID NO：1))对每组10BALB/c小鼠真皮内免疫。动物以2周的间隔接受两次免疫。每次免疫的两周后，小鼠取血，收集血清样品。
用ELISA测试血清样品的HBsAg-特异性IgG1和IgG2a反应。小鼠的Th1反应诱导了IgG2a亚类。抗体滴度归纳在表20中(每组的平均滴度±SD)。
表20
Figure C03819493D0088142128QIETU
*p<0.01，**p<0.001，与单用HbsAg相比，用Kruskal-Wallis测试
Figure C03819493D0088142221QIETU
p<0.05，
Figure C03819493D0088142225QIETU
p<0.001，与HBsAg+ISS相比，用Kruskal-Wallis测试
与经单用HBsAg免疫的动物相比，接受HBsAg+冻干吐温制剂的小鼠第一和第二次免疫后的IgG1、尤其是IgG2a滴度显著增加，这表明冻干的吐温制剂具有与非冻干吐温制剂相同的增强免疫反应的能力。
序列表
<110>戴纳伐克斯技术股份有限公司(Dynavax Technologies Corporation)
     G.冯内斯特
     S.特克
<120>免疫调节组合物，其制备方法和使用方法
<130>377882001940
<140>PCT/US03/25415
<141>2003-08-12
<150>60/402,968
<151>2002-08-12
<160>41
<170>PastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>1
Figure C03819493D00891
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>2
Figure C03819493D00892
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>3
Figure C03819493D00893
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>4
Figure C03819493D00901
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>5
Figure C03819493D00902
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>6
Figure C03819493D00903
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>7
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)..(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>8
<210>9
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(6)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>9
Figure C03819493D00911
<210>10
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>10
Figure C03819493D00912
<210>11
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>11
Figure C03819493D00913
<210>12
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>12
<210>13
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>13
Figure C03819493D00921
<210>14
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>14
Figure C03819493D00922
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>15
Figure C03819493D00923
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>16
Figure C03819493D00924
<210>17
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>17
Figure C03819493D00925
<210>18
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>18
Figure C03819493D00926
<210>19
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>19
Figure C03819493D00931
<210>20
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>20
Figure C03819493D00932
<210>21
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>1
<223>x＝t，g，c or b b＝5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>2
<223>x＝t，g，a，或u
<221>变异
<222>3
<223>X＝t，a，或c
<221>变异
<222>6
<223>X＝t，9，或u
<400>21
Figure C03819493D00933
<210>22
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>多核苷酸
<400>22
Figure C03819493D00934
<210>23
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>多核苷酸
<400>23
Figure C03819493D00941
<210>24
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>1
<223>x＝t，g，C，或b b＝5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>2
<223>x＝t，g，a，或u
<221>变异
<222>4
<223>x＝t，a，或c
<221>变异
<222>5
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<221>变异
<222>7
<223>x＝t，9，或u
<400>24
Figure C03819493D00942
<210>25
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>25
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>无活性对照化合物
<400>26
Figure C03819493D00951
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫调节多核苷酸
<400>27
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫调节多核苷酸
<400>28
Figure C03819493D00953
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫调节多核苷酸
<400>29
Figure C03819493D00954
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫调节多核苷酸
<400>30
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫调节多核苷酸
<400>31
<210>32
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>32
Figure C03819493D00962
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫调节多核苷酸
<400>33
Figure C03819493D00963
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>34
Figure C03819493D00964
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>35
Figure C03819493D00965
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>变异
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>36
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>37
Figure C03819493D00972
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ISS寡核苷酸
<400>38
Figure C03819493D00973
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>39
Figure C03819493D00974
<210>40
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>40
Figure C03819493D00975
<210>41
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CTL肽
<400>41

Claims (35)

1.一种免疫调节组合物，它包含免疫调节颗粒，所述颗粒组合物包含阳离子缩合剂、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫调节化合物以及非离子型洗涤剂，所述阳离子缩合剂选自：多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S、多粘菌素T、环杆菌素A、环杆菌素B、环杆菌素C、环杆菌素D、环杆菌素E、环杆菌素F、八肽素、两性霉素B、辛酰基-KFFKFFKFF、酰基KALA、辛酰基-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA、多粘菌素B九肽、杀菌肽A、杀菌肽B、杀菌肽P1、KFFKFFKFF、KALA、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA、十六烷基三甲基溴化铵，苄基-二甲基-溴化铵、十六烷基-溴化吡啶鎓、十六烷基溴化咪唑鎓、聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子缩合剂选自多粘菌素、环杆菌素、八肽素或两性霉素。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述阳离子缩合剂是多粘菌素。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述阳离子缩合剂是多粘菌素B。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述非离子型洗涤剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐洗涤剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐洗涤剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒组合物进一步包含脂肪酸或所述脂肪酸的盐。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述脂肪酸的盐是油酸的盐。
9.如权利要求1所述的免疫调节组合物，其中所述免疫调节颗粒在水性悬浮液中。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述阳离子缩合剂选自多粘菌素、环杆菌素、八肽素和两性霉素。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述阳离子缩合剂是多粘菌素。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述阳离子缩合剂是多粘菌素B。
13.根据权利要求9所述的组合物，其中所述非离子型洗涤剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐洗涤剂。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐洗涤剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯。
15.根据权利要求9所述的组合物，其中所述颗粒组合物进一步包含脂肪酸或所述脂肪酸的盐。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述脂肪酸的盐是油酸的盐。
17.根据权利要求9所述的组合物，它还包含抗原。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述抗原选自变应原和感染因子相关抗原。
19.一种制备颗粒悬浮液的方法，该方法包括：
(a)将包含序列5′-CG-3′的免疫调节化合物IMC和非离子型洗涤剂混合，从而形成了IMC/非离子型洗涤剂混合物，
(b)将阳离子缩合剂和所述IMC/非离子型洗涤剂混合物混合，所述阳离子缩合剂选自：多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S、多粘菌素T、环杆菌素A、环杆菌素B、环杆菌素C、环杆菌素D、环杆菌素E、环杆菌素F、八肽素、两性霉素B、辛酰基-KFFKFFKFF、酰基KALA、辛酰基-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA、多粘菌素B九肽、杀菌肽A、杀菌肽B、杀菌肽P1、KFFKFFKFF、KALA、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA、十六烷基三甲基溴化铵，苄基-二甲基-溴化铵、十六烷基-溴化吡啶鎓、十六烷基溴化咪唑鎓、聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺，然后
(c)收集颗粒悬浮液。
20.免疫调节组合物在制备用于调节个体内免疫反应的药物中的应用，所述组合物包含在水性悬浮液中的免疫调节颗粒组合物，所述免疫调节颗粒组合物是通过混合阳离子缩合剂、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫调节化合物以及非离子型洗涤剂而制得的，所述阳离子缩合剂选自：多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S、多粘菌素T、环杆菌素A、环杆菌素B、环杆菌素C、环杆菌素D、环杆菌素E、环杆菌素F、八肽素、两性霉素B、辛酰基-KFFKFFKFF、酰基KALA、辛酰基-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA、多粘菌素B九肽、杀菌肽A、杀菌肽B、杀菌肽P1、KFFKFFKFF、KALA、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA、十六烷基三甲基溴化铵，苄基-二甲基-溴化铵、十六烷基-溴化吡啶鎓、十六烷基溴化咪唑鎓、聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺。
21.一种免疫调节组合物，它包含免疫调节颗粒，所述颗粒组合物包含多粘菌素、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫调节化合物IMC和稳定剂，所述稳定剂选自蛋白质、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸，其中所述稳定剂不是牛血清蛋白。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述非离子型洗涤剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐洗涤剂。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐洗涤剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯。
24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述多粘菌素是多粘菌素B。
25.根据权利要求21所述的组合物，其中所述颗粒组合物进一步包含脂肪酸或所述脂肪酸的盐。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述脂肪酸的盐是油酸的盐。
27.根据权利要求21所述的组合物，其中所述IMC包含核苷酸序列5’-TCG-3’。
28.根据权利要求21所述的组合物，其中所述IMC包含核苷酸序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶-3’。
29.根据权利要求21所述的组合物，其中所述IMC包含至少14核苷酸。
30.一种药物组合物，它包含：
免疫调节颗粒的水性悬浮液，所述颗粒包含多粘菌素、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫调节化合物和稳定剂，所述稳定剂选自蛋白质、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸，其中所述稳定剂不是牛血清蛋白质。
31.一种制备颗粒悬浮液的方法，该方法包括：
(a)将包含序列5′-CG-3′的免疫调节化合物IMC和稳定剂混合，从而形成IMC/稳定剂混合物，所述稳定剂选自蛋白质、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸，
(b)将多粘菌素和所述IMC/稳定剂混合物混合，然后
(c)收集颗粒悬浮液。
32.免疫调节组合物在制备用于调节个体内免疫反应的药物中的应用，所述组合物包含水性悬浮液中的免疫调节颗粒组合物，所述免疫调节颗粒组合物是通过混合多粘菌素、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫调节化合物和稳定剂而制得的，所述稳定剂选自蛋白质、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸。
33.一种免疫调节组合物，它包含免疫调节颗粒，所述颗粒组合物包含阳离子缩合剂、包含序列5′-CG-3′的免疫调节多核苷酸、抗原和稳定活性制剂，所述稳定活性制剂选自蛋白质、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸，所述阳离子缩合剂选自：多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S、多粘菌素T、环杆菌素A、环杆菌素B、环杆菌素C、环杆菌素D、环杆菌素E、环杆菌素F、八肽素、两性霉素B、辛酰基-KFFKFFKFF、酰基KALA、辛酰基-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA、多粘菌素B九肽、杀菌肽A、杀菌肽B、杀菌肽P1、KFFKFFKFF、KALA、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA、十六烷基三甲基溴化铵，苄基-二甲基-溴化铵、十六烷基-溴化吡啶鎓、十六烷基溴化咪唑鎓、聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺。
34.一种药物组合物，它包含：
抗原；以及
免疫调节颗粒的水性悬浮液，所述颗粒包含阳离子缩合剂、包含序列5′-CG-3′的免疫调节多核苷酸和稳定剂，所述稳定剂选自蛋白质、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸，所述阳离子缩合剂选自：多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S、多粘菌素T、环杆菌素A、环杆菌素B、环杆菌素C、环杆菌素D、环杆菌素E、环杆菌素F、八肽素、两性霉素B、辛酰基-KFFKFFKFF、酰基KALA、辛酰基-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA、多粘菌素B九肽、杀菌肽A、杀菌肽B、杀菌肽P1、KFFKFFKFF、KALA、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA、十六烷基三甲基溴化铵，苄基-二甲基-溴化铵、十六烷基-溴化吡啶鎓、十六烷基溴化咪唑鎓、聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺。
35.免疫调节组合物在制备用于调节个体内免疫反应的药物中的应用，其中所述组合物包含在水性悬浮液中的免疫调节颗粒组合物和抗原，所述免疫调节颗粒组合物是通过混合阳离子缩合剂、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫调节多核苷酸和稳定剂而制得的，所述稳定剂选自蛋白质、非离子型洗涤剂、聚合物型表面活性剂、阳离子型洗涤剂、阴离子型洗涤剂和脂肪酸，所述阳离子缩合剂选自：多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S、多粘菌素T、环杆菌素A、环杆菌素B、环杆菌素C、环杆菌素D、环杆菌素E、环杆菌素F、八肽素、两性霉素B、辛酰基-KFFKFFKFF、酰基KALA、辛酰基-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA、多粘菌素B九肽、杀菌肽A、杀菌肽B、杀菌肽P1、KFFKFFKFF、KALA、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA、十六烷基三甲基溴化铵，苄基-二甲基-溴化铵、十六烷基-溴化吡啶鎓、十六烷基溴化咪唑鎓、聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺。
CNB038194937A 2002-08-12 2003-08-12 免疫调节组合物,其制备方法和使用方法 Expired - Fee Related CN100471486C (zh)

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