DE60036950T2

DE60036950T2 - Zusammensetzungen zur stimulation der zytokin sekretion und zur induktion einer immunantwort

Info

Publication number: DE60036950T2
Application number: DE60036950T
Authority: DE
Inventors: Sean C. Vancouver SEMPLE; Troy O. North Vancouver BC HARASYM; Sandra K. North Vancouver KLIMUK; Ljiljiana D. Vancouver KOJIC; Jonathan L. Oakville BRAMSON; Barbara Vancouver MUI; Michael J. Vancouver HOPE
Original assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-28
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2020-08-29
Also published as: CN100368020C; MXPA02002107A; IL148359A0; WO2001015726A3; HUP0202327A3; HUP0202327A2; JP2003509341A; CZ20021029A3; EP1212085B1; CN1501811A; CA2382611A1; AU6813900A; DE60036950D1; ATE376838T1; EP1212085A2; PL354879A1; KR100737980B1; WO2001015726A2; BR0013834A; AU780535B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die hierin beschriebene Erfindung betrifft Zusammensetzungen von Nukleinsäuren, die mit Lipiden formuliert sind, sowie deren Methoden zur Verwendung zur Induzierung einer Immunantwort in einem Säuger. Bestimmte Zusammensetzungen umfassen zusätzliche Komponenten, wie Antigene, zusätzliche therapeutische Agenzien und/oder andere Komponenten, aber diese zusätzlichen Komponenten sind nicht notwendig für alle Anwendungen.
Seit Mitte der 80er Jahre ist es bekannt, dass Nukleinsäuren, wie andere Makromoleküle, als biologische Antwortmodifizierer agieren und Immunantworten in Säugetieren nach in vivo Verabreichung induzieren können (Tokunaga et al., 1984; Shimada et al., 1985; Mashiba et al., 1988; Yamamoto et al., 1988; Phipps et al., 1988). Etliche Veröffentlichungen in den früheren 90er Jahren stellten fest, dass die Stimulation einer Immunantwort von den Merkmalen der verwendeten Nukleinsäure abhängig ist. Wichtige Merkmale umfassen die Anwesenheit von sekundären Strukturpalindromen (Yamamoto 1992a) und die Chemie der Nukleinsäure (d. h. der Methylierungsstatus der C Nukleotide – abhängig vom bakteriellen oder Säugetierursprung der DNA (Messing et al. 1991; Yamamoto 1992a) oder die Chemie der internukleotiden Kopplung, wie bei Thiophosphaten (Pisetsky und Reich 1993)); sowie spezifische Effekte der Nukleotidsequenz, wie beispielsweise Poly dG und CpG Motive (Tokunaga et al. 1992; Yamamoto 1992b, McIntyre, KW et al. 1993; Pisetsky und Reich, 1993; Yamamoto et al. 1994; Krieg et al. 1995).
Der Wirkungsmechanismus dieser immunstimulierenden Sequenzen (ebenso genannt immunstimulierende Sequenzen oder „ISS") wird als unterschiedlich zu den „Antisens"- oder „Genexpression"-Mechanismen, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, angesehen. Dies resultiert in signifikant unterschiedlichen möglichen Verwendungen für diese Nukleinsäuren. Eine Vielfalt solcher potentieller Verwendungen werden bei Pisetsky DS. 1996 beschrieben und andere sind im Stand der Technik bekannt. Diese umfassen die Verwendung einer freien Form ISS als Immunadjuvanz, als Impfstoffe in Kombination mit einer Vielfalt von Antigenen (siehe PCT-Veröffentlichung WO 98/40100 für Davis, H. L. et al.) und in Kombination mit anderen bioaktiven Agenzien. Methoden zur Verhinderung von immunstimulierenden Effekten wurden ebenfalls vorgeschlagen.
Es ist höchst erstrebenswert, die Erfindung von ISS weiter zu untersuchen und therapeutische Produkte, die diese verwenden, zu generieren. Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, Zusammensetzungen lipidformulierter Nukleinsäuren und ihre Methoden zur Verwendung zur Induzierung einer Immunantwort in einem Säugetier bereitzustellen. Es ist ebenfalls ein Gegenstand Lipid-Nukleinsäure-Zusammensetzungen, welche zusätzliche Komponenten, wie beispielsweise Antigene, zusätzliche therapeutische Agenzien und/oder andere Komponenten sowie Methoden ihrer Verwendung bereitzustellen.
Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren in Lipidträgern enthalten, sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise beschreibt die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 98/51278 Lipid-Antisens-Nukleinsäurezusammensetzungen, in welcher eine Lipidmischungen, ein protonierbares Lipid und ein Aggregations-limitierendes Lipid umfassen, um Partikel herzustellen, welche die Nukleinsäure vollständig einkapselt. Es hat sich gezeigt, dass diese Zusammensetzungen therapeutisch effektiv sind, beispielsweise zur Reduktion einer Tumorgröße, wenn komplementäre Antisens-Nukleinsäure verwendet wird, um Nukleinsäuresequenzen in Zielzellen zu codieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Lipid-Nukleinsäurepartikel bereitgestellt werden können, die therapeutische Vorteile haben, selbst wenn die Nukleinsäure nicht komplementär ist zu den in den Zielzellen zu codierenden Sequenzen. Dementsprechend wurde gefunden, dass Lipid-Nukleinsäurepartikel, umfassend solche, die nicht-sequenzspezifische Oligodeoxynukleotide enthalten, verwendet werden können, um Cytokinsekretion zu stimulieren, und dementsprechend die Gesamtimmunantwort eines behandelte Säugetiers zu erhöhen. Des weiteren kann die Immunantwort auf spezifische Zielantigene durch Verabreichung eines antigenen Moleküls in Verbindung mit Lipidpartikeln, enthaltend nicht-sequenzspezifische Oligodeoxynukleotide induziert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, welches therapeutische Vorteile für ein Säugetier, umfassend einen Menschen, durch die Zubereitung eines Lipid-Nukleinsäurepartikels, umfassend eine Nukleinsäure, die vollständig in einer Lipidformulierung verkapselt ist bietet, wobei die Lipidformulierung ein kationisches Lipid umfasst; und Verabreichung des Lipid-Nukleinsäurepartikels an ein Säugetier. In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Nukleinsäure, die in dem Lipid-Nukleinsäurepartikel umfasst ist, eine, die nicht mit Sequenzspezifität an bestimmte Zellen bindet, die aber nichtsdestotrotz, wenn in Kombination mit dem Lipidpartikel verabreicht, effektiv ist, um die Stimulierung der Cytokinsituation hervorzurufen. In einer zweiten Ausgestaltung der Erfindung ist ein antigenes Molekül kombiniert mit dem Lipid-Nukleinsäurepartikel, um eine Immunantwort spezifisch zu einem Zielantigen zu induzieren.
Die Nukleinsäure, die in dem Lipid-Nukleinsäurepartikel umfasst ist, kann ein Phosphodiester (d. h. ein Oligodeoxynukleotid, bestehend aus Nukleotidresten, verbunden durch Phosphodiester) oder eine modifizierte Nukleinsäure sein, welche Thiophosphate oder andere modifizierte Kopplungen umfasst, und am geeignetsten kann sie eine sein, welche nicht-komplementär zu dem menschlichen Genom ist, so dass sie eine Immunstimulation in einer Weise hervorruft, die unabhängig von üblichen Basen-Paarungsinteraktionen zwischen der Nukleinsäure und Nukleinsäuren des behandelten Säugetiers ist. Die Nukleinsäure kann geeigneterweise insbesondere ein immunstimulierendes Motiv, wie beispielsweise ein CpG-Motiv, oder eine immunstimulierende Palindromsequenz enthalten.
Das kationische Lipid, das in dem Nukleinsäurepartikel umfasst ist, kann in geeigneter Weise ausgewählt werden aus DODAP, DMDMA, DOTAP, DC-Chol, DDAB, DODAC, DMRIE, DOSPA und DOGS. Das Lipidpartikel kann geeigneterweise zusätzlich ein modifiziertes Aggregations-limitierendes Lipid, wie beispielsweise ein PEG-Lipid, ein PAO-Lipid oder ein Gangliosid enthalten.
Kurze Zusammenfassung der Zeichnungen
1A–C zeigen Zirkulationslevel der PEG-Liposomen bei wiederholter Verabreichung immunkompetente Balb/c-Mäuse (A), und immungeschwächte Balb/c-nackte (B) und Balb/c-SCID-Rag2-Mäuse (C).
2A und B zeigen Einflüsse der Nukleinsäuresequenz (A) und der Struktur (B) auf die Elimination von SALP (PEG-CerC₂₀).
3 zeigt den Einfluss der DNA zum Lipidverhältnis auf Liposomenwiedergewinnung.
4 zeigt den Einfluss des Verabreichungsschemas auf den Beginn der schnellen Eliminierungsantwort.
5A und B veranschaulichen die Rolle des PEG-Lipids in der schnellen Elimina- tion von Liposomen-enthaltenden ODN.
6 zeigt die Ergebnisse von Cross-over-Studien.
7A und B zeigen die Akkumulation von AS4200 in soliden Tumoren.
8A und 8B illustrieren die erhöhte Potenz von c-myc/TCS gegenüber freien cmyc und den Einfluss des Antisens/Lipid-Verhältnisses.
9 zeigt, dass verkapselte Phosphodiester ODN (INX-6298) eine verbesserte Wirksamkeit in murinen B16-Myelomazellen verglichen mit freien INX-6298 zeigt.
10 zeigt die Wirksamkeit des 15mer INX-6298 in DoHH2 humanen Lymphomzellen in SCID-Rag2-Mäusen.
11A und B veranschaulichen die Dosisantwort von freiem und AS4200 INX-6295 in i. v. DoHH2.
12 zeigt Variationen im Milzgewicht von Mäusen, die mit verschiedenen c-myc und Lipidformulierungen behandelt wurden.
13 zeigt die Mitogenese von verschiedenen ODN im in vitro Splenocyt-Proliferationsassay.
14 zeigt, dass die mitogene Kontrolle ODN INX-4420 eine in vivo Aktivität in subkutanen B16-Myelomazellen ähnlich zu LR-3280 zeigt.
15 zeigt, dass die Mitverkapselung von c-myc und einem üblichen Wirkstoff (Doxorubicin) in einem einzelnen Liposom Tumorwachstum inhibiert.
16 veranschaulicht die Immunogenität von AS4204 und die Umkehr bei Verwendung von mitverkapselten Doxorubicin.
17 zeigt die Mitogenität von INX-6295 und INX-6300.
18A zeigen eine Erhöhung an mononuclearen Zellen und der natürlichen Killeraktivität in der Leber auf die wiederholte Verabreichung von INXC-6295.
19A und B zeigen eine Erhöhung in NK1.1+/TCR-Zellen in der Leber auf INX-6295/SALP-Behandlung.
20 zeigt den Verlust cytolytischer Aktivität der HMNC bei beigen Mäusen auf INX-6295/SALP-Behandlung.
21 zeigt die Erhöhung der HMNC auf Verabreichung freier oder verkapselter PS ODN.
22A und B zeigen die Erhöhung an NK1.1+/TCR-Zellen in der Leber auf SALP-Behandlung.
23A–C zeigen die Aktivierung natürlicher Killerzellen innerhalb der HMNC-Population auf Verabreichung von freiem und verkapseltem PS ODN.
24A–C zeigen Transfektionsprofile von Lipoplexen, enthaltend entweder DODAC, DOTAP oder DOTMA.
25 zeigt den Level der zellulären Infiltration in dem Peritoneum auf Lipoplexverabreichung.
26A–C zeigen Lipoplex-induzierte Entzündungen, assoziiert mit erhöhter Produktion von IFN-γ.
27 zeigt Lipoplex-induzierte Aktivierung von NK-Zellen.
28A–D zeigen Serumcytokine, die durch freie und liposomale c-myc PS ODN induziert werden.
29A–D zeigen Serumcytokine, die durch freie und liposomale c-myc PS ODN induziert werden.
30A–D zeigen Ergebnisse eines Vergleichtests zur Cytokinsekretion durch PO und PS ODN.
31A und B zeigen die zwei Phasen der IFN-Induktion.
32A und B zeigen Level des Serum IL-12 zu einer Zeit, die zur zweiten Phase der IFN-Induktion korrespondiert.
33 zeigt den Effekt der ODN-Dosis auf die Serumcytokininduktion.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im weitesten Sinne betrifft die hierin beschriebene Erfindung Zusammensetzungen Lipid-formulierter Nukleinsäuren und deren Methoden zur Verwendung zur Stimulie rung von Cytokinsekretion und Induzierung einer Immunantwort auf ein Zielantigen in einem Säuger. Bestimmte Zusammensetzungen verwenden zusätzliche Komponenten, beispielsweise wie Antigene, zusätzliche therapeutische Agenzien und/oder andere Komponenten, aber diese zusätzlichen Komponenten sind nicht für alle Anwendungen notwendig.
Wie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, bezieht sich der Begriff „Stimulation der Cytokinsekretion" auf eine Erhöhung der Menge eines oder mehrerer Cytokine, die durch einen Organismus, dem die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verabreicht wurden, als proximales Ergebnis einer solchen Verabreichung sezerniert werden.
Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich der Begriff „Induzierung einer Immunantwort" entweder auf die Generierung einer initialen Immunantwort oder die Verstärkung einer bereits vorhandenen Immunantwort auf ein Zielantigen.
A. Lipid-Nukleinsäurezusammensetzungen
A.1 Nukleinsäuren
Jede der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfasst eine Nukleinsäure. Jede Nukleinsäure kann verwendet werden, aber üblicherweise werden große Doppelstrang-Plasmid-DNA (500–50000 bp) oder kurze, Einzelstrangoligonukleotide (manchmal ODN oder Oligodeoxynukleotide genannt) zwischen 8–50 nt verwendet. Die StandardNukleinsäure umfasst Phosphodiester-Kopplungen zwischen Nukleotiden, aber diese Kopplungen können jeglicher chemischer Natur sein, umfassend Thiophosphate, Amidphosphate etc. Zahlreiche andere chemische Modifikationen der Basen, Zucker oder Kopplungsreste sind ebenfalls verwendbar. Basen können methyliert oder unmethyliert sein. Bevorzugte Nukleinsäurechemien sind polyanionische, um mit den bevorzugten Herstellungsverfahren, die unten beschrieben werden, zu kooperieren. Nukleotidsequenzen können komplementär zu der Patienten/Subjekt-mRNA sein, wie beispielsweise Antisensnukleotide, oder sie können fremden Ursprungs oder nicht komplementär sein (was bedeutet, dass sie nicht spezifisch auf das Patienten-Subjektgenom hybridisiert sind). Sequenzen können beispielsweise als Gensequen zen, die zu geeigneten Promotoren oder Expressionselementen, im allgemeinen Teil eines größeren Plasmidkonstrukts, dargestellt werden. Die Sequenzen können Immun-Stimulationssequenzen („ISS"), wie beispielsweise bestimmte Palindrome, sein, die zu sekundären Haarnadel-Strukturen führen (siehe Yamamoto S., et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072–4076), oder CpG Motive (siehe unten), oder andere bekannte ISS-Merkmale (wie beispielsweise Multi-G-Domänen, siehe WO 96/11266 ); oder sie können Nicht-ISS-Sequenzen sein, oder sie können immun-neutralisierende Motive sein, welche die Aktivität von CpG-Motiven unterdrücken. Manche ISS-, Nicht-ISS- und neutralisierende Motive sind im Stand der Technik gut bekannt.
ISS, bekannt als CpG Motive, sind unmethylierte Cytidin-Guanosin-Dinukleotide innerhalb eines spezifischen Musters flankierender Basen (Kreig, A. M. et al. (1995) Nature 374: 546–549). Siehe ebenfalls PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 96/02555 ; PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 98/18810 ; PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 98/40100 ; U.S.-Patent Nr. 5,663,153 ; U.S.-Patent Nr. 5,723,335 . Der Basenkontext der CpG Motive ist offensichtlich ausschlaggebend für die ISS-Aktivität, da viele CpG Motive nicht immunstimulierend wirken. Die dramatischsten Effekte der immunstimulierenden Eigenschaften einer bestimmten DNA-Sequenz kommen im Allgemeinen durch den Austausch der zwei Basen, die direkt die CpG-Dinukleotide (auf der 5'- und 3'-Seite) flankieren. Ein Einfachaustausch kann sogar ein ISS-Motiv zu einem Nicht-ISS-Motiv konvertieren. Weiterhin könnten nacheinander geschaltete CpG-Dinukleotide, CCG-Trinukleotide oder CGG-Trinukleotide alleine oder in Kombination neutralisierende Motive sein, die die immunstimulierenden Effekte der CpG-Motive blockieren (Krieg, AM (1999) J. Gene Med. 1: 56–63).
ISS-, Nicht-ISS- und neutralisierende Motivsequenzen können Organismus-spezifisch sein. Die immunstimulierende Kapazität einer Sequenz in einem Organismus kann durch einfache Experimente zum Vergleich der fraglichen Sequenz mit anderen Adjuvanzien oder durch Messung der Aktivierung des Wirts-Abwehr-Mechanismen, Induktion von Immunsystemkomponenten etc., alle gut bekannt im Stand der Technik, bestimmt werden. Eine Nicht-ISS-Sequenz stimuliert das Immunsystem nicht oder induziert keine Immunantwort, wenn sie in freier Form einem nativen Säugetier verabreicht wird.
A.2 Lipide und andere Komponenten der Partikel
Neben Nukleinsäuren verwenden erfindungsgemäße Zusammensetzungen Lipide und können andere Komponenten ebenfalls verwenden.
Der Begriff „Lipid" bezieht sich auf eine Gruppe organischer Verbindungen, die Fettsäureester darstellen, und diese werden dadurch charakterisiert, dass sie in Wasser unlöslich, aber in vielen organischen Lösungsmitteln löslich sind. Sie werden üblicherweise in zumindest drei Klassen unterteilt: (1) „einfache Lipide", welche Fette und Öle sowie Wachse umfassen; (2) „Lipidverbindungen", welche Phospholipide und Glycolipide umfassen; und (3) „derivatisierte Lipide", wie beispielsweise Steroide und Verbindungen, die durch Lipidmanipulation erhalten werden. Eine breite Auswahl an Lipiden kann erfindungsgemäß verwendet werden, einige dieser werden unten beschrieben.
Der Begriff „geladenes Lipid" bezieht sich auf eine Lipidspezies, die entweder eine kationische Ladung oder eine negative Ladung hat, oder welche ein Zwitterion ist, keine netto-neutrale Ladung hat und üblicherweise einen Bezug auf den pH-Wert der Lösung, in welcher das Lipid gefunden wird, erfordert.
Bei einem physiologischen pH umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, kationisch geladenen Lipide N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid („DODAC"); N-(2,3-Dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid („DOTMA"); N,N-Distearyl-N,N-dimethylammoniumbromid („DDAB"); N-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid („DOTAP"); 3β-(N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl)cholesterol („DC-Chol") und N-(1,2-Dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid („DMRIE"). Zusätzlich ist eine Anzahl an kommerziellen Zubereitungen kationischer Lipide erhältlich, welche für die vorliegende Erfindung verwendet werden können. Diese umfassen beispielsweise Lipofectin^TM (kommerziell erhältliche kationische Liposomen umfassend DOTMA und 1,2-Dioleyl-sn-3-phosphoethanolamin („DOPE"), von GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USA); Lipofectamin^TM (kommerziell erhältliche kationische Liposomen, umfassend N-(1-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N-(2-(spermincarboxamid)ethyl)-N,N-dimethylammoniumtrifluoracetat („DOSPA") und DOPE von GIBCO/BRL); und Transfectam^TM (kommerziell erhältliche kationische Lipide, umfassend Dioctadecylamidoglycylcarboxyspermin („DOGS") in Ethanol von Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA).
Manche kationisch geladenen Lipide sind titrierbar, d. h., dass sie einen pKa am oder nahe des physiologischen pH-Wertes haben, mit der signifikanten Konsequenz für diese Erfindung, dass sie stark kationisch in milden sauren Bedingungen und schwach (oder gar nicht) kationisch bei einem physiologischen pH-Wert sind. Solche kationisch geladenen Lipide umfassen, sind aber darauf nicht beschränkt, N-(2,3-Dioleyloxy)propyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid („DODMA") und 1,2-Dioleyl-3-dimethylammoniumpropan („DODAP"). DMDMA ist ebenfalls verwendbar als titrierbares kationisches Lipid.
Bei physiologischem pH umfassen anionisch geladene Lipide, sind aber nicht darauf beschränkt, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phospholipidsäure, Diphosphatglycerol, Polyethylenglycol-phosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidylglycerol, Dioleylphosphatidylglycerol, Dilauryloylphosphatidylglycerol, Dipalmitodylphosphatidylglycerol, Distearyloylphosphatidylglycerol, Dimyristoyl-phosphorhaltige Säure, Dipalmitoyl-phosphorhaltige Säure, Dimyristoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin, Phosphatidylserin aus Gehirn und Ähnliches.
Manche anionisch geladenen Lipide können titrierbar sein, d. h., dass sie einen pKa bei oder nahe des physiologischen pH haben, mit der signifikanten Konsequenz für die Erfindung, dass sie stark anionisch in milden basischen Bedingungen und schwach (oder gar nicht) anionisch bei physiologischen pH-Werten sind. Solche anionisch geladenen Lipide können durch einen Fachmann auf Basis der hierin beschriebenen Prinzipien identifiziert werden.
Der Begriff „neutrales Lipid" bezieht sich auf eine Anzahl von Lipidspezien, welche entweder in einer ungeladenen oder neutralen zwitterionischen Form bei einem physiologischen pH-Wert existieren. Solche Lipide umfassen beispielsweise Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramid, Sphingomyelin, Cephalin, Cholesterol, Cerebrosiside und Diacylglycerole.
Bestimmte bevorzugte Lipidformulierungen, die erfindungsgemäß verwendet werden, umfassen Aggregations-verhindernde Verbindungen, wie beispielsweise PEG-Lipide oder Polyaminoligomerlipide (beispielsweise ein ATTA-Lipid) und andere sterische Barrieren oder „verdeckte"-Lipide, Detergenzien und Ähnliches. Solche Lipide werden in U.S.-Patent Nrn. 4,320,121 für Sears, 5,820,873 für Choi et al., 5,885,613 für Holland et al., WO 98/51278 (Erfinder Semele et al.) und U.S.-Patentanmeldungs-Nr. 09/218988 in Bezug auf Polyamidoligomere beschrieben, wobei diese durch Bezug hierein inkorporiert sind. Diese Lipide und Detergenzienverbindungen verhindern Prezipitation und Aggregation von Formulierungen, enthaltend entgegengesetzt geladene Lipide und therapeutische Agenzien. Diese Lipide können ebenfalls verwendet werden, um die Zirkulationsdauer in vivo zu verbessern (siehe Klibanov et al. (1990) FERS Letters, 268 (1): 235–237) oder sie können ausgewählt werden, um in vivo schnell aus der Formulierung ausgetauscht zu werden (siehe U.S.-Patent Nr. 5,885,613 ).
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausgestaltung verwendet austauschbare sterische Barrierelipide, wie in U.S.-Patent Nr. 5,820,873 ; 5,885,613 und U.S.-Patentanmeldungs-Nr. 09/094540 und 09/218988, übertragen auf den Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung und durch Bezug hierauf inkorporiert, beschrieben. Austauschbare sterische Barrierelipide, wie beispielsweise PEG₂₀₀₀-CerC 14 und AT-TA8-CerC 14 sind sterische Barrierelipide, welche schnell aus der äußeren Molekularschicht eines Lipidpartikels nach Verabreichung an ein Subjekt/Patient wechseln. Jedes dieser Lipide hat eine charakteristische Rate, bei welcher es aus einem Partikel ausgetauscht wird, abhängig von einer Anzahl von Faktoren, umfassend Acylkettenlänge, Sättigungsgrad, Größe des sterischen Barriererestes, Membranzusammensetzung und Serumzusammensetzung etc. Solche Lipide sind nützlich in der Verhinderung der Aggregation während der Partikelbildung und ihr beschleunigter Austritt aus dem Partikel nach Verabreichung bringt Vorteile, wie beispielsweise programmierbare Fusogenität und Partikeldestabilisierungsaktivität, wie in den oben notierten Patenteingaben beschrieben.
Manche Lipidpartikelformulierungen können Zielreste verwenden, die entworfen sind, um die Lokalisierung von Liposomen an bestimmten Zielzellen oder bestimmtem Zielgewebe zu begünstigen. Zielreste können während der Formulierung oder nach der Formulierung mit der äußeren molekularen Doppelschicht der Lipidpartikel assoziiert sein (d. h. durch direkte Konjugation, hydrophobe Interaktion oder in anderer Weise). Diese Methoden sind im Stand der Technik gut bekannt. Manche Lipidpartikelformunlierungen können zusätzlich fusogene Polymere, wie beispielsweise PEAA, Hämaglutinin, andere Lipopeptid (siehe U.S.-Patentanmeldungen 08/835,281 und 60/083,294, alle durch Bezug hierauf inkorporiert) oder andere Merkmale, die zur in vivo und/oder intrazellulären Beförderung nützlich sind, verwenden.
A.3 Andere Wirkstoffkomponenten
Manche erfindungsgemäße bevorzugten Ausgestaltungen umfassen zusätzlich andere Wirkstoffe oder bioaktive Agenzien. Diese zusätzlichen Komponenten können direkten zusätzlichen therapeutischen Nutzen oder zusätzlichen immunstimulierenden Nutzen bringen. In den unten beschriebenen Beispielen wird Doxorubicin (Hydroxydaunorubicin), ein wohlbekanntes chemotherapeutisches Agens, mit der Nukleinsäure in erfindungsgemäßen Partikeln co-verkapselt. Andere Wirkstoffe oder bioaktive Agenzien können ähnlich verwendet werden, abhängig von der erstrebten Anwendung der Erfindung. Cytotoxische Agenzien umfassen alle Komponenten mit Zelltötungsfähigkeit, umfassend ohne Beschränkung Cyclophosphamid, Dicarbazin, Taxane, Camptothecine, Vincristin und andere Vincaalkaloide, Cisplatin. Andere spezifische Beispiele sind RITUXIN^TM (Rituximab) zur Behandlung des Non-Hodgkin-Lymphoms. Antibakterielle Agenzien, wie beispielsweise Ciprofloxacin, können nützlich sein. Kurz gefasst können alle im Stand der Technik bekannten bioaktiven Agenzien in Lipidpartikel inkorporiert werden und sind potentielle Kandidaten als zusätzliche Komponenten.
In einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung werden die Wirkstoffe oder anderen bioaktiven Agenzien in geeigneter Weise in Assoziation mit dem Lipid-Nukleinsäurepartikel bereitgestellt. Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich der Begriff „in Assoziation" auf Co-Verkapselung des Wirkstoffs oder bioaktiven Agens mit der Nukleinsäure innerhalb des Lumens oder des intralaminaren Raumes eines Lipidpartikels, angeordnet innerhalb oder teilweise innerhalb der Lipidmembran oder gebunden (kovalent oder ionisch) an das Äußere des Lipidpartikels.
Als eine Alternative zur Assoziation von Wirkstoffen oder bioaktiven Agenzien mit dem Lipidpartikel können erfindungsgemäße Zusammensetzungen Wirkstoffe oder bioaktive Agenzien umfassen, die nicht mit dem Lipid-Nukleinsäurepartikel assoziiert sind. Solche Wirkstoffe oder bioaktive Agenzien können in separaten Lipidträgern enthalten sein. Beispielsweise kann liposomales Vincristin (OncoTCS^TM) verwendet werden.
A.4 Vakzin-Komponenten
Die Erfindung zeigt hierin, dass erfindungsgemäße Zusammensetzungen ein starke humorale Antwort auf ein PEG-Lipid, bei einer Verbindung, die normalerweise nicht-immunogen oder wenig immunogen ist, verursacht. Bestimmte erfindungsgemäße Ausgestaltungen verwenden andere Antigenmoleküle als Teil von Vakzin-Zusammensetzungen. Die Antigenmoleküle können Antigene sein, die inhärent immunogen sind, oder sie können nicht-immunogene oder wenig immunogene Antigene sein. Diese Antigene umfassen fremde oder homologe Antigene und umfassen HBA-Hepatitis-B-Antigen (rekombinant oder in anderer Weise); andere Hepatitis-Peptide; HIV-Proteine, GP120 und GP160; Mycoplasmazellwandlipide; jedes Tumor-assoziierte Antigen; karzinoembryonales Antigen (CEA); andere embryonale Peptide, exprimiert als Tumor-spezifische Antigene; Bakterienzellwandglycolipide; Ganglioside (GM2, GM3); Mycobacteriumglycolipide; PGL-1; Ag85B; TBGL; Gonococcus-lip-Oligosaccharidepitop 2C7 aus Neisseria gonorrhoeae; Lewis(y); Globo-H; Tn; TF; STn; PorA; TspA oder virale Glycolipide/Glycoproteine und Oberflächenproteine; und Ähnliches.
Das Antigenmolekül kann in der Form eines Peptidantigens sein oder es kann eine Nukleinsäure sein, die ein antigenes Peptid in einer Form, die zur Expression in dem behandelten Säugetier und zur Präsentation des Immunsystems geeignet ist, codieren. Das Antigen kann ebenfalls ein Glycolipid oder ein Glycopeptid sein. In jedem Fall kann das Antigen ein komplettes Antigen sein oder es kann ein Fragment eines kompletten Antigens, umfassend zumindest ein therapeutisch relevantes Epitop sein. Wie in dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich der Begriff „therapeutisch relevantes Epitop" auf Epitope, für welche der Anstieg einer Immunantwort gegen die Epitope einen therapeutischen Nutzen bringt. Demzufolge würde dieser Begriff Fragmente ausschließen, welche hoch immunogen sein können, aber welche keine Immunantwort bezogen auf das komplette Antigen oder den antigenen Ursprung (beispielsweise ein Bakterium) hervorrufen. Kombinationsantigene umfassen viele Epitope des gleichen Zielantigens oder Epitope von zwei oder mehreren unterschiedlichen Zielantigenen (polytope Vakzine). Im letzteren Fall können die Antigene des gleichen oder unterschiedlichen Typs (beispielsweise Peptid + Peptid, Glycolipid + Peptid, Glycolipid + Glycolipid) sein.
Die erfindungsgemäße Vakzin-Zusammensetzung umfasst ein Lipid-Nukleinsäurepartikel und ein antigenes Molekül. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausgestaltung ist das antigene Molekül mit dem Lipid-Nukleinsäurepartikel assoziiert.
Es ist erwähnenswert, dass die erfindungsgemäßen Vakzine durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht werden können. Dies reduziert manche Herstellungsauflagen, was erstrebenswert ist, wenn die Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung zubereitet wird. Insbesondere können größere (150–300 nm) Lipidpartikel verwendet werden, was das Erfordernis eines kostenintensiven Extrusionsschrittes eliminieren oder reduzieren kann. Da die Partikel nicht zirkulieren müssen, kann die Auswahl der Lipidkomponenten zusätzlich zugunsten von weniger teuren Materialien verschoben werden. Beispielsweise kann die Menge an Chol reduziert werden, DSPC kann mit anderen weniger rigiden Materialien ausgetauscht werden, wie beispielsweise DOPC oder DMPC, und PEG-Lipide können mit weniger teuren PEG-Acylketten ausgetauscht werden.
B. Herstellung der Zusammensetzungen
B.1 Herstellung
Herstellung und Zubereitung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können durch jede Technik ausgeführt werden, aber am meisten bevorzugt sind die Ethanoldialyse oder Detergenziendialysemethoden, die in den folgenden Publikationen und Patentanmeldungen detailliert beschrieben wurden, wobei alle durch Bezugnahme hierein inkorporiert sind: U.S.-Patent Nr.5,705,385 , U.S.-Patentanmeldungs-Nr. 08/660,025; 09/140,476; 08/484,282; 08/856,374; 09/078,954; 09/078,955; 60/143,978; und PCT-Veröffentlichungs-Nrn. Wo 96/40964 und WO 98/51278 .
Diese Methoden ermöglichen die Herstellung der Lipid-Nukleinsäurepartikel in einem kleinen und im großen Maßstab und generieren Partikel mit exzellenten pharmazeutischen Eigenschaften (beschrieben in C.2, unten). Bestimmte spezifische Ausgestaltungen dieser Techniken werden in den Beispielen unten dargestellt.
Zusätzlich zu den Detergenziendialyse- und Ethanoldialysetechniken können klassische Liposom-Herstellungstechniken, obgleich mit größeren Schwierigkeiten, verwendet werden, um erfindungsgemäße Partikel zu generieren. Traditionelle Techniken passiver Beladung, aktiver Beladung (durch pH-Gradienten), Lipidfilm-Rehydrierung, Extrusion/Größenbestimmung, Dehydrierung etc. werden anderswo im Stand der Technik, umfassend die oben notierten Patentdokumente, reichlich dargestellt.
Die klassischen Techniken werden wahrscheinlich verwendet, wenn zusätzlich übliche therapeutische Agenzien in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zugegeben werden. Die Beladung tertiärer oder quartärer Amine, enthaltend cytotoxische Verbindungen, wie beispielsweise Doxorubicin, Daunorubicin, Vincaalkaloide, wie beispielsweise Vincristin und Vinblastin, können nach Formulierung der Lipid-Nukleinsäurepartikel erreicht werden. Der Innenraum des Partikels wird gewöhnlich den niedrigen pH-Wert von 4,2 des originalen Formulierungsprozederes beibehalten. Einfache Zugabe des therapeutischen Agens in einer neutralen Pufferlösung zu einer neutralisierten Partikelmischung, wie aus dem Stand der Technik gut bekannt, reicht aus, um die Partikel zu beladen.
Erfindungsgemäße Vakzin-Zusammensetzungen können durch Zugabe des schwachen Antigens, zu welchem die Antwort erstrebt wird, während des Formulierungsprozesses oder durch Nach-Formulierungsmanipulationen, hergestellt werden. Mittel zur Inkorporierung von Antigenen umfassen: 1. Passive Verkapselung während des Formulierungsverfahrens (d. h. Einbringen in die ODN-Lösung); 2. Für Glycolipide und andere antigene Lipide Inkorporierung in eine Ethanolmischung von Lipiden und Formulierung gemäß bevorzugter Protokolle; 3. Post-Insertion (d. h. Antigenlipid kann in gebildete Vesikel durch Inkubierung der Vesikel mit Antigen-Lipidmicellen zugegeben werden); und 4. Post-Kopplung, in welcher ein Lipid mit einem Kopplungsrest in das formulierte Partikel umfasst wird und der Linker nach Formulierung aktiviert wird, um das gewünschte Antigen zu koppeln. Standardkopplungs- und Cross-Linking-Methoden sind im Stand der Technik bekannt. Eine alternative Zubereitung inkorporiert das Antigen in ein Lipidpartikel, welches keine Nukleinsäure enthält, und diese Partikel werden mit Lipid-Nukleinsäurepartikeln vor Verabreichung an den Patienten gemischt.
6.2 Charakterisierung erfindungsgemäßer Zusammensetzungen
Unbeschadet der verwendeten Techniken zu ihrer Herstellung haben die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen folgende bevorzugte Eigenschaften.
Die erfindungsgemäßen Lipid-Nukleinsäurepartikel umfassen außen eine Lipidmembran (im Allgemeinen eine Phospholipid-Doppelschicht), welche einen inneren Raum vollständig verkapselt. Diese Partikel, ebenfalls manchmal hierin Lipidmembranvesikel genannt, sind kleine Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 50–200 nm, vorzugsweise 60–130 nm. Am meisten bevorzugt zur intravenösen Verabreichung sind Partikel, die eine relativ gleichförmige Größe haben, wobei 95% der Partikel innerhalb 30 nm des Durchschnitts sind. Die Nukleinsäure und anderen bioaktiven Agenzien sind in dem Innenraum enthalten oder mit einer inneren Oberfläche der Verkapselungsmembran assoziiert.
„Vollständig verkapselt" bedeutet, dass die Nukleinsäure in den Partikel nicht-signifikant nach Exposition in dem Serum oder einem Nuclease-Assay, der die DNA signifikant degradieren würde, degradiert. In einem vollständig verkapselten System degradiert vorzugsweise weniger als 25% der Nukleinsäurepartikel in einer Behandlung, die normalerweise zu 100% als freie Nukleinsäure degradieren würde, weiter bevorzugt degradieren weniger als 10% und am meisten bevorzugt weniger als 5% der Nukleinsäurepartikel. Alternativ kann vollständige Verkapselung mittels eines Oligreen^TM-Assays bestimmt werden. Vollständig verkapselt deutet darauf hin ebenfalls, dass die Partikel Serum-stabil sind, d. h., dass sie nicht schnell in ihre Teilkomponenten nach in vivo Verabreichung zerfallen.
Diese Charakteristiken unterscheiden die erfindungsgemäßen Schlüsselpartikel von Lipid-Nukleinsäureaggregaten (ebenfalls bekannt als kationische Komplexe oder Lipoplexe), wie beispielsweise DOTMA/DOPE (LIPOFECTIN^TM) Formulierungen. Diese Aggregate sind üblicherweise, im Durchmesser, viel größer (> 200 nm), sie können nicht vollständig einer Nucleaseverdauung standhalten und sie zerfallen üblicherweise nach in vivo Verabreichung. Formulierungen eines kationischen Lipid-Nukleinsäureaggregats mit schwachen Antigenen, wie oben beschrieben, können geeignete Vakzine für lokale und regionale Anwendungen darstellen, wie beispielsweise eine intra-muskuläre, intra-peritoneale und intra-thekale Verabreichung.
Die erfindungsgemäßen Partikel können über eine große Bandbreite des Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnisses formuliert werden. Wie hierin verwendet, bedeutet „Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis" die Menge der therapeutischen Nukleinsäure (d. h. die Menge der Nukleinsäure, die verkapselt ist und welche nicht schnell nach Exposition im Blut degradiert) in einem definierten Volumen der Zubereitung, geteilt durch die Menge des Lipids in dem gleichen Volumen. Dies kann auf einer Mol-zu-Mol-Basis oder auf einer Gewicht-zu-Gewicht-Basis oder auf einer Gewicht-zu-Mol-Basis bestimmt werden. Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis bestimmt die Lipiddosis, die mit einer gegebenen Nukleinsäuredosis assoziiert ist; es wird angemerkt, dass das höchstmögliche Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis nicht immer die höchstpotente Formulierung bildet. Erfindungsgemäße Partikel sind nützlich im Bereich von 0,001 bis 0,45 (Gew.-%) Wirkstoff-zu-Lipid-Verhältnis.
Vakzin-Zubereitungen sind anderen erfindungsgemäßen Partikeln ähnlich, mit der Ausnahme, dass sie das schwache Antigen assoziiert (entweder kovalent oder nicht-kovalent) mit dem Partikel haben.
C. Verwendungen von Lipid-Nukleinsäurezusammensetzungen
Im weitesten Sinne betrifft die hierin beschriebene Erfindung Zusammensetzungen Lipid-formulierter Nukleinsäuren und deren Methoden zur Verwendung zur Induzierung einer Immunantwort in einem Säugetier. Es gibt etliche außergewöhnliche und überraschende Vorteile der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik, der immunstimulierende Nukleinsäuren verwendet, umfassend:

1. Im Vergleich zu freien Formulierungen von Nukleinsäuren liefern die verwendeten Lipid-Formulierungen die Nukleinsäuren zu unterschiedlichen Zellen und Immunsystemkomponenten und präsentieren diese in einer unterschiedlichen Art diesen Zellen und Komponenten, demzufolge erbringen sie signifikant unterschiedliche und verbesserte Immunantworten, manche dieser werden in den Beispielen unten illustriert;
2. Verglichen mit freien Formulierungen von Nukleinsäuren erfordern Lipid-Formulierungen signifikant niedrigere Mengen eines Oligonukleotids, um eine Immunantwort zu erreichen, demzufolge werden die Kosten und mögliche Toxizitäten reduziert;
3. Lipid-Formulierungen können Phosphodiesteroligonukleotide zur Verwendung zur Immunstimulierung befördern, eine chemische Natur, welche nicht in freier Form befördert werden kann.
4. Lipid-Formulierungen können normale Nicht-ISS-Nukleinsäuren in ISS-Nukleinsäuren konvertieren, demzufolge kreieren sie eine neue Klasse von ISS.
5. Eine stärker potente Vakzine kann in liposomalen Formulierungen von Nukleinsäuren generiert werden, da schwache Immungene, zu welchen eine Immunantwort erstrebt wird, direkt und inhärent mit der Formulierung assoziiert werden kann, demzufolge führen sie zu unterschiedlichen und verbesserten Immunantworten der Immunogene im Gegensatz zum einfachen Mischen von Adjuvanzien und Immunogenen (wie in PCT-Veröffentlichung WO 98/40100 gefunden, Erfinder: Davis et al.);
6. Durch Verwendung von Lipid-Formulierungen, welche bekannt sind für den Erhalt direkter „Antisens"-Effekte mit Nukleinsäuren geeignet zu sein (siehe U.S.-Patent Nr. 5,705,385 , U.S.-Patentanmeldungs-Nr. 08/660,025; 09/140,476; 08/484,282; 08/856,374; 09/078,954; 09/078,955; 60/143,978 und PCT-Veröffentlichungs-Nrn. WO 96/40964 und WO 98/51278 , welche durch Bezug hierauf inkorporiert sind), können erfindungsgemäße Formulierungen in einer synergistischen Immunantwort und Antisens-Effekten resultieren, welche sich vereinigen bei Behandlung von Erkrankungen.
7. Co-Verabreichung von Lipid-Formulierungen, enthaltend Nukleinsäuren und ein cytotoxisches Agens, wie beispielsweise Doxorubicin, kann in einer synergistischen Immunantwort und cytotoxischen Effekten, welche sich vereinigen, um Erkrankungen zu behandeln, resultieren.
8. Lipid-Formulierungen von Nukleinsäuren haben in in vivo Modellen therapeutische Wirksamkeit gezeigt, welche nicht auf die freie Form von ISS-Nukleinsäuren antworten.

Jede dieser Vorteile wird in ein oder mehreren Beispielen veranschaulicht, die unten dargestellt werden.
„Immunstimulation” oder „Induzierung einer Immunantwort" wird breit charakterisiert als eine direkte oder indirekte Antwort auf eine Immunsystemzelle oder Komponente zu einer Intervention. Diese Antworten können auf unterschiedliche Arten gemessen werden, umfassend Aktivierung, Proliferation oder Differenzierung von Immunsystemzellen (B-Zellen, T-Zellen, dendritische Zellen, APCs, Makrophagen, NK-Zellen, NKT-Zellen etc.), hochregulierte oder herunterregulierte Expression von Markern, Cytokine, Interferon, IgM- und IgG-Ausschüttung im Serum, Splenomegalie (umfassend erhöhte Milzzellanzahl), Hyperplasie und gemischte zelluläre Infiltrate in verschiedene Organe. Viele weitere Antworten und viele andere Immunsystemzellen und Komponenten sind im Stand der Technik bekannt. Die Stimulation oder Antwort kann ferner auf angeborene Immunsystemzellen oder erworbene Immunsystemzellen (beispielsweise wie durch Vakzine enthaltene normale schwache Antigene) gerichtet sein. Immunstimulation ist unterscheidbar auf einer mechanistischen Basis von anderen potentiellen Effekten von Nukleinsäuren, wie beispielsweise eines direkten Antisens-Effekts (durch Hybridisierung mit mRNA) oder Genexpression (wie bei Plasmiden), aber, im Ergebnis, ist die erstrebte Konsequenz der therapeutischen Wirksamkeit nicht notwendigerweise unterscheidbar.
D. Indikationen, Verabreichung und Dosierungen
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Methoden sind u. a. zur Verwendung bei jedem Patient oder Organismus indiziert, der einen Bedarf zur Immunsystemstimulierung hat. Dies kann die meisten medizinischen Felder umfassen, wie beispielsweise Onkologie, Entzündungen, Arthritis und Rheumatologie, Immunschwächeerkrankungen etc. Ein Fachmann kann geeignete Indikationen auswählen, um die Wirksamkeit auf Basis der hierin beschriebenen Offenbarung zu testen. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Methoden verwendet, um Neoplasie (jedes plastische Zellwachstum, welches pathologisch oder potentiell pathologisch ist), wie beispielsweise die Neoplasie, die in den Beispielen unten beschrieben wird, zu behandeln.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können durch jede Methode, umfassend in vivo oder ex vivo Methoden, an ein Subjekt/Patient verabreicht werden. In vivo Methoden können lokale, regionale oder systemische Applikationen umfassen. In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die Zusammensetzungen intravenös verabreicht, so dass die Partikel einen Zugang zu B-Zellen, Makrophagen oder Splenocyten in einem Patient finden, und/oder die Partikel Lymphocytenproliferation stimulieren, was in einer Sekretion von IL-6, IL-12, IFN-γ oder IgM in dem Patienten resultiert.
Ein Fachmann weiß, wie er mögliche Toxizitäten der Formulierungen, wie beispielsweise komplementäre Aktivierung, Koagulation, renale Toxizitäten, Leberenzymassays etc., identifizieren kann. Solche Toxizitäten können unterschiedlich zwischen den Organismen sein. In den Beispielen unten wird von Toxizitäten berichtet, wenn sie identifiziert wurden; keine Toxizitäten wurden in Nagetieren bis zu einer Lipiddosis von 600 mg/kg beobachtet (außer, dass sie bei wiederholten Dosierungssituationen identifiziert wurden).
Pharmazeutische Zubereitungen und Zusammensetzungen setzen gewöhnlich zusätzliche Träger ein, um die Beförderungsmodalitäten zu verbessern oder zu unterstützen. Typischerweise werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einem physiologisch-akzeptablen Träger, wie beispielsweise normaler Saline oder Phosphatpuffer, ausgewählt gemäß Standards in pharmazeutischer Praxis, verabreicht. Andere geeignete Träger umfassen Wasser, 0,9% Saline, 0,3% Glycin und Ähnliches, wie Glycoproteine zur Erhöhung der Stabilität, so z. B. Albumin, Lipoprotein, Globulin etc.
Dosierungen von Lipid-Nukleinsäurepartikeln hängen von der gewünschten Lipiddosierung, der gewünschten Nukleinsäuredosierung und des Wirkstoff:Lipid-Verhältnisses der Zusammensetzung ab. Eine typische Dosierung für Säugetiere liegt zwischen 0,5 mg/kg und 300 mg/kg. Eine große Menge Lipid wird sofort durch die RES-Zellen (wie beispielsweise Kupfferzellen der Leber) nach Verabreichung geklärt, demzufolge ist eine minimale Lipiddosis erforderlich, um das RES zu sättigen und zu ermöglichen, dass die Partikel zirkulieren. Dosierungen von Nukleinsäuren liegen vorzugsweise zwischen 0,01 mg/kg und 60 mg/kg. Ein Säugetier wird typischerweise eine Formulierung mit einem Wirkstoff:Lipid-Verhältnis von 0,01:0,25 erhalten und wird deshalb 100 mg/kg Lipid und 1–25 mg/kg Nukleinsäure erhalten. Dosierungen für Primaten werden typischerweise bei 5–5 mg/kg Lipid und 0,005–15 mg/kg ODN betragen. Ein Fachmann kann geeignete Dosierungen, basierend auf der hierin bereitgestellten Information auswählen.
E. Beispiele:
Materialien & Methoden
Oligodeoxynukleotide („ODN") und Plasmid-DNA. Die Bezeichnungen der 5'- und 3'-Sequenzen der ODN (mit bekannten Beschreibungen enthalten in der Parenthese) und Plasmid, die in diesen Studien verwendet wurden, sind folgende:
hICAM oder INX-2302 (3' nicht-translatierte Region eines menschlichen ICAM-1 mRNA) (PO & PS);
mICAM oder INX-3082 (3' nicht-translatierte Region eines murinen ICAM-1 mRNA) (PO & PS);
EGFR (humane epidermale Wachstumsfaktor mRNA, Rezeptortranslationsterminations-Kodonregion);
c-myc oder INX-6295 (Initiationskodonregion einer humanen/Mäuse-c-myc-Protoonkogen mRNA) (PS und methylierte PS)
c-myc oder INX-3280 oder LR-3280 (Initiationskodonregion einer humanen/Mäuse-c-myc-Protoonkogen mRNA) (PS);
c-myc oder INX-6298 (Initiationskodonregion einer humanen/Mäuse-c-myc-Protoonkogen mRNA) (PO & PS);
c-mycC oder INX-6300 (Nicht-ISS-Kontrolle ähnlich zur Zusammensetzung von INX-6295
LR-4420 (ISS-Kontrolle ähnlich zur Zusammensetzung von INX-6295
LR-3001 oder INX-3001 (hybridisiert zur c-myc mRNA);
IGF-1R oder INX-4437 (hybridisiert zu IGF-1R mRNA);
INX-6299 (Kontrolle PO für INX-6298)
INX-8997 (Kontrolle enthaltend 3 CpG-Motive) (PO & PS)
Plasmid-DNA, die verwendet wurde, war das Luciferase-Expressionsplasmid, pCMVluc18, (ebenfalls genannt pCMVLuc). Plasmid wurde in E. coli hergestellt, isoliert und gereinigt, wie vorstehend beschrieben (Wheeler, H. H., Palmer, L. Ossanlou, M., MacLachlan I., Graham, R. W., Zhang, Y. P., Hope, M. J., Scherer, P., & Cullis, P. R. (1999) Gene Ther. 6, 271–281). (Siehe ebenfalls Mortimer, I., Tam P., MacLachlan I., Graham R. W., Saravolac, E. G., Joshi P. B., Cationic lipid mediated transfection of cells in culture requires mitotic activity. Gene Ther, 1999; 6: 403–411).
Phosphodiester (PO) und Thiophosphat (PS) und ODN wurden von Hybridon Specialty Products bezogen (Milford, MA) oder wurden bei Inex Pharmaceuticals (Burnaby, BC, Kanada) synthetisiert. Methyliertes ODN wurde mittels Standardtechniken bei Inex Pharmaceuticals (USA), Inc. (Hayward, CA) hergestellt. Die Backbone-Zusammensetzung wurde mittels ³¹P-NMR bestätigt. Alle ODN wurden spezifisch auf Endotoxine analysiert und enthielten weniger als 0,05 EU/mg.
Beispiel 1
Die Reihe an Beispielen illustriert u. a., dass sterisch-stabilisierte Liposomen enthaltend Polyethylenglycol-Lipid-Konjugate immunogen wirken, wenn die Liposomen Nukleinsäure enthalten und identifizieren die Verwendungen solcher Zusammensetzungen.
Chemikalien und Lipide. DSPC (1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phosphocholin) und Polyethylenglycol-konjugiertes Diasterylphosphatidylethanolamin (PEG₂₀₀₀-DSPE) wurden von Avanti Polar Lipids (Pelham, AL) oder Northern Lipids (Vancouver, BC, Kanada) bezogen. Cholesterol (CH) wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. 1,2-Dioleyl-3-N,N-dimethylammoniumpropan (DODAP) wurde durch Dr. Steven Ansell (Inex Pharmaceuticals Corp.) synthetisiert oder alternativ von Avanti Polar Lipids (nur DODAP) bezogen. 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycol)succinyl)-2-N-myristylsphingosin (PEG-CerC₁₄) und 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycopsuccinyl)-2-N-arachidylsphingosin (PEG-CerC₂₀) wurde durch Dr. Zhao Wang (Inex Pharmaceuticals Corp.) synthetisiert. [³H]-Cholesterylhexadecylether (CHE) wurde von Dupont NEN (Boston, MA) erhalten. Alle Lipide waren > 99% rein. Alle Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Verkapselung von ODN & Plasmid. Stabilisierte Antisens-Lipid-Partikel (SALP), zusammengesetzt aus DSPC:CH:DODAP:PEG-CerC₁₄ (manchmal genannt AS4200) oder DSPC:CH:DODAP:PET-CerC₂₀ (manchmal genannt AS4204) und verkapseltes PS ODN wurden wie in der Ursprungspatentanmeldung der vorliegenden Patentanmeldung beschrieben, nämlich U.S.-Patentanmeldungs-Nrn. 08/856,374, 09/078,954, 09/078,955 und PCT-Veröffentlichung WO 98/51278 , alle übertragen auf den Rechtsnachfolger der vorliegenden Patentanmeldung und durch Bezug hierauf inkorporiert, zubereitet. Typischerweise wird 1000 mg Gesamt-/Lipid in 100 ml Ethanol gelöst. Eine Lösung, enthaltend das ODN, wurde in einer separaten Flasche durch Lösung von 200 mg (basiert auf A₂₆₀) in 60 ml einer 300 mM Citronensäure mit pH-Wert von 4,0 zubereitet. Die Lipidlösung wurde zu der ODN-Lösung tropfenweise durch eine 26-G-Nadel während konstantem Rührens zugegeben. Die Mischung wurde 10mal durch zwei aufeinandergestapelte, 80-nm-Polycarbonatfilter (Poretics) unter Verwendung eines Thermobarrel-Extruders (Lipex Biomembranes, Vancouver, BC, Kanada) bei Aufrechterhaltung von 65°C durchgeleitet. Der Citratpuffer wurde mit 20 Volumen eines 20 mM PBS/145 mM NaCl unter Verwendung einer Tangential-Fließ-Vorrichtung mit 100000 M. W. Cut-off ausgetauscht. Dieser Schritt entfernt überschüssiges Ethanol und unverkapseltes ODN und generiert eine isotonische Lösung, die kompatibel zur in vivo Verabreichung ist. Die SALP-Zubereitung wurde unter Verwendung des Tangential-Flusses konzentriert und auf 1,5 mg/ml ODN eingestellt, durch eine 0,22-μM-Membran Filter-sterilisiert und bei 4°C gelagert. Der durchschnittliche Durchmesser und die Größenverteilung von SALP wurde unter Verwendung eines NICOMP Modell 370 Sub-Mikropartikelgrößenanalysierer bestimmt und lag typischerweise bei 110 ± 30 nm. Wo Formulierungen erforderlich waren, die ein niedrigeres Oligonukleotid:Lipid-Gewichtsverhältnis erforderten, wurde die ODN-Konzentration der Eingangslösung auf das entsprechende Verhältnis reduziert, um die Partikel, wie weiter in der Ursprungssache der vorliegenden Anmeldung beschrieben, zu generieren. Zur Verabreichung wurden alternativ manche Proben auf HEPES-gepufferte Saline (HBS), pH-Wert von 7,50 eingestellt und für ein Minimum von 12 Stunden dialysiert, um den externen Citratpuffer mit HBS auszutauschen. Die Mehrzahl des DODAP in der äußeren Doppelschicht wird dadurch neutral und wird so jedes oberflächengebundene Antisens freilassen. Zusätzlich nicht-verkapseltes Antisens kann ggf. von AS4200/4 mittels DEAE-Sepharosechromatographie entfernt werden. Für PO-ODN und Plasmid-Formulierungen wird als Eingangspuffer 20 mM Citrat mit pH-Wert von 4,0 verwendet. Plasmid-Formulierungen wurden nicht extrudiert, was in ~200 nm Partikeln resultiert. ODN, verkapselt in AS4200- oder AS4204-Formulierungen, werden hierin manchmal mit dem ODN-Namen in Bezug genommen, wobei INX zu INXC (d. h. INXC-6295) abgeändert wird.
Kontrollformulierungen wurden gemäß Standardliposommethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, zubereitet: DSPC:CH- und DSPC:CH:PEG₂₀₀₀-DSPE-Vesikel wurden aus trockenen Lipidfilmen durch wässrige Hydrierung in HBS (20 mM Hepes, 145 mM NaCl, pH-Wert 7,4) gemäß der Hope et al. (41) Methode zubereitet. In ähnlicher Weise wurde die ODN-Verkapselung durch Hydrierung von 100 mg Lipid mit 100 mg ODN in 1,0 ml HBS, gefolgt von fünf von Einfrieren-Auftau-Zyklen und Extrusion durch zwei aufeinandergesteckte 100-nm-Filter erreicht. [³H]-CHE, ein nicht-austauschbarer, nicht-metabolisierbarer Lipidmarker, wurde in alle Vesikelzusammensetzungen inkorporiert, um Lipidlevel im Blut zu überwachen (42). Die resultierenden Partikel waren ungefähr 110–140 nm im Durchmesser, wie durch die quasi-elastische Lichtstreuung unter Verwendung eines NICOMP Submicro-Partikelanalysierers (Modell 370) beurteilt. Verkapselungseffizienzen für diesen Prozess lagen typischerweise bei kleiner als 10%. Nicht-verkapseltes ODN wurde von der Zubereitung durch Anionen-Austausch-Chromatographie unter Verwendung einer DEAE-Sepharose-CL-6B entfernt. Freies Oligonukleotid wird in HBS gelöst und auf die erforderliche Dosis durch A₂₆₀ (durch die Annahme, dass 35 μg/ml gibt und A₂₆₀ auf 1,0) eingestellt. Wo Doxorubicin mit Oligonukleotid co-verkapselt wird, wird das in dem Partikel enthaltene Oligonukleotid zuerst gemäß dieser Methoden zubereitet, dann wird Doxorubicin in das Partikel bis zur gewünschten Konzentration unter Verwendung von Standard-pH-Ladungstechniken beladen. Doxorubicin-Blockadeexperimente wurden unter Verwendung von DSPC/Chol-verkapselter Doxorubicin (~10 mg/Lipid/kg und 0,05 bis 0,2 mg Dox/kg) Zubereitung mittels pH-Beladung und Verabreichung bei Mäusen 24 Stunden vor Injektion von AS4204 durchgeführt.
Mäuse. Weibliche, 7–8 Wochen alte ICR-, C57BL/6- und Balb/c-Mäuse wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) erhalten. Balb/c+nu/nu+ und Balb/c-SCID- Rag2-Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten und bei Pathogen-freien Bedingungen gehalten. Alle Tiere wurden für mindestens eine Woche vor Verwendung unter Quarantäne gehalten. Alle Prozeduren, umfassend Tiere, wurden gemäß der Richtlinien, errichtet durch das kanadische Konzil für Tierpflege, durchgeführt.
Dosierungen: Mäuse wurden für die Studie alle zwei Tage Dosen-verabreicht (7 oder 10 Dosen insgesamt, wie indiziert), außer es wurde Anderes indiziert. Verabreichungen der Testproben und Kontrollen wurden via intravenöser Endader-Injektionen (Injektionsvolumen: 200 μl) injiziert. Falls nicht anders indiziert, wurde die Lipiddosierung für diese Formulierungen auf 100 mg/kg/Dosis eingestellt. In Experimenten, wo unterschiedliche Wirkstoff:Lipid-Verhältnisse eingesetzt werden, wurde die Lipiddosis für alle Formulierungen auf 80 mg/kg/Dosis eingestellt. Proben wurden vor Injektion gefiltert (0,22 μm). Externer Puffer ist HBS (20 mM Hepes, 145 mM NaCl, pH-Wert 7,45).
Liposomenelimination aus der Zirkulation. Zur Bestimmung der Liposomenelimination aus dem Blut (ebenfalls hierin genannt „Liposomenwiedergewinnung im Blut"), erhielten Mäuse eine einzelne intravenöse Dosis via der lateralen Endader von leeren Liposomen (50 mg/kg Lipid) oder Liposomen-verkapselten ODN (50 mg/kg Lipid und 20 mg/kg ODN, wenn nicht anders notiert), enthaltend ~1 μCi/Maus von [³H]-CHE. Wenn nicht anders notiert, wurden die Dosen wöchentlich verabreicht. Blut (25 μl) wurde 1 Std. nach Injektion durch Einkerbung der Endader unter Verwendung eines sterilen Skalpells gesammelt und in 200 μl 5%iger EDTA in einem Glasszintillationsfläschchen platziert. Das Blut wurde dann verdaut (Solvable^TM, Packard), entfärbt und auf Radioaktivität unter Verwendung von Standardflüssigszintillationstechniken gemäß Herstelleranweisungen analysiert. Das Verfahren zur Einkerbung der Endader erreichte sehr ähnliche Resultate zur Gruppe an Mäusen, bei denen Blut durch Herzpunktur gesammelt wurde, aber es war geeigneter, da alle Daten von der gleichen Gruppe an Tieren gesammelt wurden.
1A–C zeigen Zirkulationslevel von PEG-Liposomen auf wiederholte Verabreichung in immun-kompetenten Balb/c-Mäusen (1A) und immungeschwächten Balb/c-nackten- (1B) und Balb/c-SCID-Rag2-Mäusen (1C). Mäuse wurden intravenös (i. v.) mit leeren DSPC:CH:PEG₂₀₀₀-DSPE-Liposomen (a), DSPC:CH:PEG₂₀₀₀-DSPE-Liposomen, enthaltend hICAM PS ODN (b), leeren SALP (PEG-CerC₂₀, c) oder SALP (PEG-CerC₂₀, d), enthaltend hICAM ODN, injiziert. Lipiddosierungen lagen bei 50 mg/kg. Das ODN/Lipid-Verhältnis für das DSPC:CH:PEG₂₀₀₀ und SALP (PEG-CerC₂₀) war jeweils 0,05 und 0,20. Injektionen wurden wöchentlich verabreicht, und die Zirkulationslevel wurden 1 Std. nach Injektion durch das Lipidlabel [³H]-CHE überwacht. Die Balken stellen die erste (offene Balken), zweite (Backslash), dritte (Forward-Slash) und vierte (Cross-hatched) Injektion dar. Alle Balken stellen das Mittel und die Standardabweichung von 8 Mäusen dar. Wie in den „a"- und „c"-Spalten widergespiegelt, wurden keine Unterschiede in der Elimination von leeren PEG-Lipid-enthaltenden Vesikeln gegenüber einigen Verabreichungen, unabhängig vom Immunstatus des Tiers, beobachtet. Überraschenderweise wurde aber eine schnelle Elimination (< 20% der injizierten Dosis verblieb im Blut nach 1 Std.) von ODN-enthaltenden Vesikeln, folgend auf die zweite und nachfolgenden Injektionen, beobachtet. Dieser Effekt wurde begleitet durch ausgeprägte Morbidität und resultierte in manchen Fällen im Tod der Tiere innerhalb 30 Minuten post-Injektion. Diese schnelle Elimination wurde ebenfalls in T-Zell-defizienten Balb/c-nackten Mäusen beobachtet, aber nicht in B-Zell- und T-Zell-defizienten Balb/c-SCID-Rag2-Mäusen, was begründet, das die Antwort von der Anwesenheit von B-Zellen und Immunglobulin abhängt.
2A und B zeigen den Einfluss von Nukleinsäuresequenz (A) und Struktur (B) auf die Elimination von SALP (PEG-CerC₂₀). Mäuse wurden i. v. SALP (PEG-CerC₂₀), enthaltend PS ODN verschiedener Nukleinsäuresequenzen injiziert (2A). Phosphodiester (PO) hICAM ODN und bakterielle Plasmid-DNA wurde ebenfalls evaluiert (2B). Die Lipiddosis wurde auf 50 mg/kg eingestellt und das ODN/Lipid-Verhältnis lag für jede Formulierung bei ~0,20. Injektionen wurden wöchentlich verabreicht, und die Zirkulationslevel bei 1 Std. Nach-Injektion wurde durch das Lipidlabel [³H]-CHE überwacht. Die Balken und Anzahl der Tiere werden wie in der Legende zu 1A–C gekennzeichnet. Das gesamte verkapselte PS ODN in SALP (PEG-CerC20) induzierte nachfolgend auf die i. v. Verabreichung Krankheit und wurde schnell bei wiederholter Verabreichung von der Zirkulation entfernt. Dieses wurde unabhängig vom ISS (hICAM, c-myc, c-mycC) oder Nicht-ISS (d. h. mICAM, EGFR) Status des ODN beobachtet. 2B zeigt, dass sich eine schnelle Elimination der Partikel aus dem Blut unabhängig davon ergibt, ob die verkapselte Nukleinsäure PS, PO oder Plasmid war (wöchentliche Injektionen, überwacht 1 Std. nach Injektion).
3 zeigt die Beziehung zwischen DNA zu Lipidverhältnis und Liposomenwiedergewinnung. Mäusen wurde i. v. SALP (PEG-CerC₂₀), enthaltend hICAM PS ODN, und mit verschiedenen ODN/Lipid-Verhältnissen injiziert. Die Lipiddosis wurde auf 50 mg/kg/Dosis eingestellt. Injektionen wurden wöchentlich verabreicht und die Zirkulationslevel bei 1 Std. post-Injektionen wurden durch das Lipidlabel [³H]-CHE überwacht. Die Balken und Anzahl der Tiere werden wie in der Legende zu 1A–C gekennzeichnet. Wie dargestellt, zeigen die Ergebnisse, dass Partikel, enthaltend ein Wirkstoff:Lipid-Gewichtsverhältnis von größer als 0,040, die schnelle Clearance-Antwort induzieren, während Partikel mit 0,040 oder weniger bei wiederholter Injektion keiner Clearance ausgesetzt sind. Diese Ergebnisse deuten an, dass das Immunsystem eine Grenzmenge (oder Konzentration) an Nukleinsäure erkennt, bevor die Clearance-Antwort ergeht. Ebenso sind Partikel kleiner 0,040 (g/g) geeignet zum Erhalt direkter Antisens-Effekte und werden die schnelle Clearance-Antwort bei wiederholter Verabreichung in der AS4204-(lange Zirkulation)-Formulierung umgehen.
4 zeigt den Einfluss des Verabreichungsschemas bei Beginn der schnellen Eliminationsantwort. Mäusen wurde i. v. SLAP (PEG-CerC₂₀), enthaltend hICAM PS ODN, mit verschiedenen Dosierungsplänen injiziert: täglich (O), alle 2 Tage (•), alle 3 Tage (⎕) und wöchentlich (∎). Die Lipiddosis wurde auf 50 mg/kg/Dosis eingestellt und die Zirkulationslevel bei 1 Std. post-Injektionen wurden durch das Lipidlabel [³H]-CHE überwacht. Die Symbole stellen das Mittel und die Standardabweichung von 8 Mäusen dar. D:L-Verhältnisse der Partikel liegen überhalb der induzierenden Level für den Clearance-Grenzwert. Wie in 4 gezeigt, werden zumindest 5 Tage für eine schnelle Clearance-Antwort Kapazität benötigt, um in einer Maus, unabhängig davon, wie oft die SALP verabreicht wurden (täglich, alle 2, 3 oder 7 Tage), zu entwickeln. Bei täglichen Injektionen steigen die Plasmalevel der zirkulierenden Träger über die ersten 3 Injektionen an. Dies war nicht überraschend auf Basis, dass 30–40% einer gegebenen Dosis von PEG-beschichteten Liposomen in der Zirkulation bei 24 Std. Postinjektion verbleibt. Dieser Anstieg wurde aber gefolgt durch einen dramatischen Abfall der Zirkulationslevel bei nachfolgenden Dosen. In allen Dosierungsplänen wurde eine schnelle Elimination nachfolgender Dosen 4–6 Tage nach Anfangsdosis beobachtet. Diese Ergebnisse begründen, dass Immunsystemkomponenten, die die Clearance-Antwort begründen, dass Immunsystemkomponenten nach Anstieg bis zur Clearance-Antwort nach Initialdosis abgesättigt sind und dass Verarbeitung und Generierung eine Clearance-Antwort ungefähr 5–6 Tage dauert, unabhängig von der Anzahl der zwi schenzeitlichen Dosierungen. Dies deutet darauf hin, dass eine humorale (Ab) Antwort generiert wurde.
5A und B veranschaulichen die Rolle des PEG-Lipides in der schnellen Elimination von Liposomen, enthaltend ODN. In einem ersten Experiment, über das in 5A berichtet wird, werden Mäusen i. v. leere SALP (PEG-CerC₂₀, a), SALP (PEG-CerC₂₀, b), leere SALP (PEG-CerC₁₄, c), SALP (PEG-CerC₁₄, d), leere DSPC:CH-Liposomen (e) oder DSPC:CH, enthaltend hICAM PS ODN (f) injiziert. Die Lipiddosis wurde auf 50 mg/kg/Dosis eingestellt, und die Zirkulationslevel wurden 1 Std. post-Injektion mit dem Lipidlabel [³H]-CHE überwacht. Die Balken und die Anzahl der Tiere werden gemäß der Legende zu 1 gekennzeichnet. In einem zweiten Experiment, über das in 5B berichtet wird, wurde der Zeitraum zum Austausch von PEG-CerC₂₀, (•) und PEG-CerC₁₄ (O) durch die Bestimmung des Verhältnis von [³H]-PEG-Ceramide zu [¹⁴C]-CHE in dem Mäuseplasma über 24 Std. evaluiert. Die Symbole stellen das Mittel und die Standardabweichung von 6 Mäusen dar.
PEG-CerC14 hat einen kürzeren Acylketten-Lipid-Anker als PEG-CerC20 und tritt deshalb schneller aus der Doppelschicht aus (t_1/2 in vivo = ~3 Min vs. > 24 Std.). Wenn PEG-CerC14 in erfindungsgemäßen Partikeln verwendet wird, wird im Vergleich zu CerC20, enthaltend SALP (Spalte b), keine schnelle Clearance-Antwort nach wiederholter Verabreichung detektiert (Spalten c & d). Da weder leere noch ODN-tragende DSPC:CH-Vesikel, noch PEG-CerC14-Formulierungen Unterschiede aufweisen, schließen wir, dass die Anwesenheit und Retention von PEG-Lipid in der äußeren Einzelschicht der Vesikel kritisch für die Entwicklung der schnellen Clearance-Anwort ist.
6 zeigt die Ergebnisse von Cross-over-Studien, die durchgeführt wurden, nachdem ODN-enthaltende PEG-CerC20 SALP vorher dreimal wöchentlich injiziert wurden und eine Clearance-Antwort initiierten. Mäusen wurde i. v. SALP (PEG-CerC₂₀) für insgesamt 4-wöchentliche Injektionen injiziert, was in einem Eliminationsprofil resultierte, das ähnlich der in 1A–C beobachteten war. Bei der finalen Injektion erhielten die Mäuse entweder SALP (PEG-CerC₂₀), leere SALP (PEG-CerC₂₀), leere DSPC:CH:PEG₂₀₀₀-DSPE-Vesikel, leere SALP (PEG-CerC₁₄) oder leere DSPC:CH-Liposomen. Bei jedem Beispiel wurde die Lipiddosis auf 50 mg/kg/Dosis eingestellt und die Zirkulationslevel bei 1 Std. post-Injektion durch das Lipidlabel [³H]-CHE über wacht. Jeder Balken stellt das Mittel und die Standardabweichung von 8 Mäusen dar. Die vierte Verabreichung zeigt, dass die Clearance-Antwort exklusiv auf solche Partikel gerichtet war, wo PEG-Lipid in der äußeren Lipid-Einfachschicht enthalten war, unabhängig davon, ob sie ODN trugen. Dementsprechend werden PEG-CerC20- und PEG-DSPE-Formulierungen unabhängig von dem ODN-Status gecleart, wobei Nicht-PEG-Lipidformulierungen (wie beispielsweise DSPC:CH) oder austauschbare PEG-Lipidformulierungen (wie beispielsweise PEG-CerC14) nicht gecleart werden. Das lässt schließen, dass die Clearance-Antwort nicht von dem (internen) ODN-Status des Partikels abhängt, sobald es gelernt hat, das vormals schwache Immunogen auf der äußeren Oberfläche des Partikels zu erkennen. Dieses Ergebnis deutet an, dass eine breite Varietät synthetischer liposomaler Vakzine gemäß dieser Erfindung generiert werden könnte, welche schwache Immunogene auf der äußeren Oberfläche der Partikel umfassen. Das Vakzin würde zuerst in dem ODN-enthaltenden Format verabreicht werden und anschließende Anregung des Patienten durch ein Pathogen würde unabhängig von dem ODN-Status des Pathogens erkannt werden.
Beispiel 2
Die Reihe der Beispiele veranschaulicht weitere Antworten auf immunstimulierende Lipid-Nukleinsäurepartikel. Diese Methoden verwenden Materialien und Methoden aus Beispiel 1 mit folgenden Änderungen.
Die folgenden Mäusestämme wurden für diese Studien verwendet: ICR, Balb/c, Balb/c nackt, Balb/c SCID-Rag2, C57BL/6. Alle sind kommerziell erhältlich von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN) oder Taconic Farms (Germantown, NY).
Die Tumormodelle wurden in diesen Mäusen wie folgt begründet.
B16/BL5 murines Melanom. Zellen [NCl-Katalog B 16BI-6] wurden in Kultur in MEM-Medium unter Zugabe von 10% FBS gehalten. Am Tag 0 der Studie wurden 3 × 10⁵ Zellen subkutan (s. c.) in die dorsale Flanke (Injektionsvolumen: 50 μl) von C57BL/6 weiblichen Mäusen (20–23 g) injiziert. Typischerweise wurden 15% Extramäusen so nicht-spheroidale Tumore injiziert oder Mäusen, in welchen keine Tumore beobachtet wurden, konnten von der Studie ausgeschlossen werden. Tumore wurden über eine Periode von 5–7 Tagen vor den initialen Behandlungen mit den Testpro ben/Kontrollen und randomisierten Gruppen wachsengelassen. Die Behandlung begann, wenn Tumore 50–100 mm³ waren.
DoHH2 humenes follikuläres Lymphom. DoHH2-Zellen (eine Non-Hodgkin's-B-Zelllymphom-Zelllinie, beschrieben in Luin-Nelemans HC., et al. (1991) Leukemia 5 (3) 221–224), werden in Kultur in RPMI 1640 Medium mit 10% FBS erhalten. Am Tag 0 der Studie wurden 5 × 10⁶ Zellen intravenös (i. v.; Injektionsvolumen 200 μl HBSS) in SCID/Rag-2 weibliche Mäuse (20–23 g) injiziert. Tumore wurden für eine Periode von 3 Tagen vor initialen Behandlungen mit den Testproben/Kontrollen wachsengelassen. Am Tag 3 wurden Mäuse vor den Verabreichungen randomisiert gruppiert.
Lewis-Lunge. Murine Lewis-Lungenkarzinomzellen (ATCC # CRL-1642) wurden im MEM-Medium mit 10% FBS wachsengelassen. Am Tag 0 der Studie wurden 3 × 10⁵ Zellen subkutan (s. c.) in das Dorsum injiziert (Injektionsvolumen: 100 μl). Tumore wurden für eine Periode von 3 Tagen vor initialen Behandlung mit den Testproben/Kontrollen wachsengelassen. Primäres Tumorvolumen wurde unter Verwendung von Zangen gemessen.
NG Melanom. Ein humanes primäres Melanom [NG, Clark's Level V], erhalten aus der Biopsie von einem Patienten in der chirurgischen Abteilung des Regina Elena Krebsinstituts (Rom, Italien), wurde, wie in Leonett, C. et al. (1996), J. Nat. Canc. Inst. 88(7) 419–429) dargestellt, verwendet CD-1 männliche nackte (nu/nu) Mäuse, 6–8 Wochen alt, wurden mit einer Zellsuspension von 2,5 × 10⁶ NG-Zellen in die Hinterbeinmuskeln injiziert. Eine Tumormasse von ~70 mg wurde in allen Mäusen am Tag 4 nach Implantation gefunden. Alle Experimente wurden durchgeführt zwischen der fünften und achten Passage des NG-Tumors in nackten Mäusen.
Stärke/Wirksamkeits-Endpunkte. Ergebnisse, die hierin als „Anstieg in Tumorgröße (oder Volumen)" beschrieben wurden, wurden wie folgt gemessen: Primäres Tumorvolumen wurde unter Verwendung von Zangen gemessen. Länge (mm), Breite (mm) und Höhe (mm) wurden alle zwei Tage (an Nicht-Injektionstagen) für die Dauer der Studie gemessen. Tumorvolumen wurden auf Basis der Formel kalkuliert: Tumorvolumen (mm3) = (π/6)(L × W × H)
Mäuse wurden terminiert (durch CO₂-Inhalation oder zervikaler Dislokation, vorgeschaltet durch allgemeine Anästhesie), wenn Tumorvolumen 10% des Körpergewichts oder die ersten Zeichen von Ulzerierung erreicht haben.
„Tumorgewichtsinhibition" („TWI%") wird als das mittlere Tumorgewicht behandelter Gruppen, geteilt durch das mittlere Tumorgewicht der Kontrollgruppen, minus 1 mal 100 kalkuliert. „Tumorwachstumsverzögerung" („T-C") wird als mittlere Zeit in Tagen für die behandelten (T) Gruppen berechnet, um ein beliebig bestimmtes Tumorgewicht (d. h. 250 mg) zu erreichen, minus der mittleren Zeit in Tagen für die Kontroll-(C)-Gruppe, um die gleiche Größe zu erreichen.
„Überleben" oder „% Überleben” wird auf der Basis der Anzahl der Tiere in der initialen Testgruppe berechnet. Gemäß der Richtlinien des kanadischen Konzils für Tierpflege wurde Tod nicht als Endpunkt verwendet. Anstelle dessen wurden Tiere täglich beobachtet und bei den ersten Zeichen von Morbidität und Sterblichkeit, welche sich für diese Modelle typischerweise als Paralyse der hinteren Extremitäten manifestierte, euthanisiert. Bei Euthanasie wurde der Tod des Tieres am folgenden Tag aufgenommen. Andere Endpunkte:
IgM- und IgG-Produktion/Clearance: IgM- und IgG-Antikörper, die als eine Immunantwort auf Zubereitungen generiert wurden, wurden durch geeignete ELISA-Assays von Blutproben, die von Mausen gesammelt wurden, gemessen.
Tumorakkumulation: Um die Tumorakkumulation von ODN zu überwachen, wurden Tiere intravenös (200 μl) mit [³H]-gelabelten ODN, entweder frei oder in stabilisierten Antisens-Lipidpartikeln (SALP) verkapselt, injiziert. [14C]-Cholesterylhexadecylether wurde in SALP als ein nicht-austauschbarer, nicht-metabolisierbarer Lipidmarker inkorporiert, um das Schicksal des Überbringersystems zu überwachen. Zu verschiedenen Zeiten wurden Mäuse euthanasiert, und die Tumore wurden operativ entfernt, gewogen und in Fast Prep Tubes platziert. PBS (500 μl) wurde zu jeder Tube zugegeben, und die Proben wurden für 3 × 8 Sekunden unter Verwendung einer Bio 101 Fast Prep FP120 Vorrichtung (Savant) homogenisiert. Aliquots (100–200 μl) des Tumorhomogenisats wurden dann in 500 μl eines Gewebslösungsvermittlers (Solvable^TM, Packard) platziert und gemäß Herstellerinstruktion verdaut und dekoloriert. Die resultierenden Proben wurden zu 5,0 ml Pico-Fluor40^TM Szintillisationscocktail zugegeben und wurden auf die Gesamtradioaktivität unter Verwendung von Standardflüssigszintillisationsmethoden analysiert. Resultate wurden als μg ODN Äquivalente/g Gewebe dargestellt.
In vitro Splenocytproliferationsassay. Die Mitogenizität von ODNs, die in diesen Studien verwendet wurden, wurden durch Messung der Stimulation der Splenocytproliferation in vitro evaluiert. Splenocytsuspensionen wurden zubereitet durch behutsames Trennen der Milz in cRPMI unter Verwendung von geeisten Enden zweier Glasträger. Aliquots von 100:1 einer frisch zubereiteten Splenocytsuspension (5 × 10⁶ Zellen/ml in kompletten RPMI) wurden zu dreifachen Wells von 96-Well-Platten, enthaltend ein gleiches Volumen kompletter RPMI mit einer 2fachen Konzentration ODN (d. h. 12,5, 25,0, 50,0 oder 100,0 mg/ml ODN in kompletten RPMI). 24 Std. später wurde 1:Ci von [³H]-Thymidin (NEN Life Science Products, Boston, MA, USA) zu jedem Well zugegeben, und die Kulturen wurden für weitere 48 Std. inkubiert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden Zellen auf Glasfiltern geerntet, und die Quantität der inkorporierten Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Beta-Szintillationszählers gemessen. Geeignete Kontrollen (Mitogene: ConA und LPS oder Medium alleine) wurden auf jeder Platte umfasst. [³H]-Thymidin-Inkorporation wurde als die mittlere DPMS ± SEM dargestellt.
7A und B zeigen, dass die AS4200-Formulierung in bestimmten soliden Tumoren akkumuliert. AS4200-Formulierungen wurden intravenös zum Zeitpunkt 0 verabreicht. Mäuse wurden an bestimmten Zeitpunkten geopfert und Tumore entfernt. ODN-Akkumulation wurde gemessen. In Lewis-Lungentumoren (7B) akkumulierten sie zu einem viel höheren Grad als freies ODN (5–10% einer Dosierung vs. 1% einer Dosierung), während sie in B16-Tumoren (7A) ungefähr zur gleichen Menge wie freies ODN (1–3% der Dosierung) akkumulierten. ODN-Akkumulation wurde durch das Mikromilieu dieser Tumore beeinflusst und wahrscheinlich durch die Phase der Tumorentwicklung.
8A und B zeigen, dass AS4200 die Stärke von ODN stark erhöht. Behandlungen (Lipiddosis = 100 mg/kg, D/L-Verhältnis von 0,18 oder 0,005) wurden alle zwei Tage für 7 Tage mit Start an Tag 5 nach Tumorimplantation (gekennzeichnet durch Sternchen) verabreicht. „c-myc" = INX-6295. Tumor = B16 murines Melanom. In der AS4200-Formulierung (8A) stellt eine ODN-Dosierung von 0,5 mg/kg den gleichen Effekt wie eine Dosierung von 18 mg/kg ODN bereit. Dies steht im Gegensatz zu dem freien ODN (8B), wo 0,5 mg/kg keine signifikanten Effekte im Vergleich zur HBS-Kontrolle bereitstellte.
9 zeigt, dass INX-6298, ein exklusives Phosphodiester-ODN, Tumorwachstum inhibiert, wenn es in den TCS (AS4200) verkapselt wurde, aber jedoch nicht, wenn in freier Form befördert. Tumorvolumen wurde am Tag 21 nach Tumorimplantation gemessen.
Tabelle 1 zeigt Ergebnisse, die die Wirksamkeit von ODN-Formulierungen in NG humanen metastasierenden Melanommodell zeigen. Mäuse wurden mit 2,5 × 10⁶ Zellen in hintere Beinmuskeln injiziert, um eine ODN-Dosis von 0,5 mg/Maus/Tag (–20 mg/kg/Tag) für 8 aufeinanderfolgende Tage (= 1 Zyklus) bereitzustellen. Es gab ein 7-tägiges Intervall zwischen Zyklen und es wurden insgesamt drei Zyklen durchgeführt.

Das ODN:Lipid-Verhältnis = 0,20 g/g, Tumorgewichtsinhibitionen (TWI%) wurden am Ende jedes Zyklus berechnet. Tumorwachstumsverzögerung (T-C) ist die mittlere Zeit (in Tagen) für behandelte und Kontrolltumore, um die gleiche Größe zu erreichen.

Tabelle 1
Probe	TWI% 1. Zyklus	TWI% 2. Zyklus	TWI% 3. Zyklus	T-C (Tage)	% Reduktion an Lungenmetastasen	% Anstieg an Lebensspanne
LR-3280	37	41	50	8	24	28
INX-6295	39	43	49	8	28	30
INX-6300	13	4	9	1	0	12
INX-6295 AS4200	53	55	63	16	72	49
INX-6300 AS4200	23	20	26	3	10	14

10 stellt die Überlebenskurve von SCID-Rag2-Mäusen dar, die DoHH2-Tumore tragen und alle 2 Tage über 10 Tage mit Beginn am 4. Tag nach Tumorinokulation mit verschiedenen Formulierungen von c-myc oder Kontroll-ODN behandelt werden. Mäuse erhielten eine i. v. Injektion von 1 × 10⁶. Überleben wurde für 150 Tage überwacht. Jede Gruppe bestand aus 5–6 Mäusen. Es war ziemlich außergewöhnlich, dass eine AS4200-Formulierung von PO-ODN 6298 im Wesentlichen den Tumor heilte (n = 5 – 6 Mäuse). Die PS-Kontrolle (6299) AS4200 zeigt einen signifikanten Überlebensanstieg gegenüber freiem ODN.
11A zeigt die Dosisantwort zu freiem und AS4200 INX-6295 in i/v/DoHH2-Mäusen. Ein konstantes D/L-Verhältnis (initial hohes D/L, 0,20) wurde für die AS4200-Formulierungen verwendet. Alle 2 Tage über 10 Tage wurde dosiert. Die Dosen jeder Agenzien wurden durch Verdünnung in HBS mit einem pH-Wert von 7,6 erhalten. Lipiddosen variierten (50 und 20 mg/kg). Wie gezeigt, resultiert eine Behandlung mit AS4200 INX-6295 in einer viel größeren Überlebensrate von DoHH2-Mäusen im Vergleich zur freien Form des Wirkstoffs. Die freie Form des Wirkstoffs stellt keine statistische Verbesserung gegenüber der HBS-Kontrollen in diesem Modell bei dieser Dosierung (5 mg/kg) dar. Zusätzlich und ziemlich überraschend ist, dass ein signifikanter, jedoch kleinerer Nutzen von AS4200/INX-6300 bei 5 mg/kg erhalten wird. INX-6300 trägt keine ISS-Sequenzen und es wurde nicht erwartet, dass ihre Verwendung jeglichen Überlebensvorteil bereitstellt. (Siehe unten zur weiteren Charakterisierung von INX-6300). Der Überlebensvorteil, der AS4004-Formulierungen zugeschrieben wird, wird der Tatsache zugeschrieben, dass diese Mäuse B-Zellen-defizient sind und deshalb keine schnelle Clearance-Antwort generieren. Die B-Zellen sind deshalb verantwortlich für den Clearance-Effekt, aber nicht notwendigerweise für den Behandlungseffekt/den Überlebensvorteil durch die Behandlung. Tatsächlich scheint es, dass der lange Zirkulationseffekt von einer AS4002-Formulierung den Überlebensvorteil der Behandlung gegenüber AS4200 verstärkt.
11B zeigt ähnliche Resultate bei unterschiedlichen Dosierungslevel, d. h. dass Lipiddosierungen zwischen 100 und 20 mg/kg variierten. Wie gezeigt, wurde ebenfalls gefunden, dass bei höheren (10 mg/kg) Dosierungen Behandlungsvorteile auftreten.
Manche Dosierungen von LR-3280 (c-myc), die i. v. verabreicht wurden, zeigten, dass Splenomegalie in vivo induziert wurde, was in größeren Milzen von Mäusen in Antwort auf manche der erfindungsgemäßen Partikel widergespiegelt wurde.
12 zeigt, dass Lipid selbst (600 mg/kg) keine Splenomegalie induzierte, freies c-myc (LR-3280) (125 mg/kg) induzierte eine milde Splenomegalie und AS4200-verkapseltes LR-3280 induzierte Splenomegalie bei hohen Dosen (> 200 mg/kg Lipid und 42 mg/kg ODN), jedoch nicht unter 20 mg/kg Lipid und 4,2 mg/kg ODN. Die Lipidverkapselten Dosen induzierten eine signifikant höhere Milzvergrößerung als freies ODN.
13 zeigt die Mitogenizität verschiedener freier ODN und Kontrollen bei in vitro Splenocyten. Alle PS ODN zeigten einen Hintergrundstimulierungseffekt, aber der größte Effekt wird bei den ISS-enthaltenden Sequenzen gefunden. Dieser Effekt ist gleich oder größer als mitogenen LPS und ConA, die Standard und sehr bekannt sind. PO-ODN zeigen keinen Effekt, wahrscheinlich, da sie in dem Serumpuffer degradieren. Nicht gezeigt werden die Ergebnisse des methylierten INX-6295, welche eine viel geringere Mitogenizität im Vergleich zu unmethyliertem INX-6295 zeigten, obwohl ihre Aktivität nicht komplett eliminiert wurde, bleiben sie zu anderen PS-ODN vergleichbar.
Die Mitogenizität von LR-4420 wurde weiter erforscht, da ihre Aktivität in der 13 resultiert. In 14 kann gesehen werden, dass eine Dosis von 10 mg/kg, freiem LR-4420 gleiche oder verbesserte Tumor-inhibierende Effekte gegenüber freiem LR-3280 hat. (Siehe ebenfalls 7 zur relativen Aktivität von freien und AS4200-Formulierungen von LR-3280).
Doxorubicin und c-myc ODN wurden in AS4200-Liposomen co-verkapselt. 15 fasst die Ergebnisse zusammen (Mengen von Doxorubicin in „Q" in mg/kg. AS4200 umfasst ODN, L4200 ist Lipid-verkapseltes Doxorubicin ohne ODN. In dieser Figur enthält AS4200 INX-6295). Ergebnisse zeigen, dass am Tag 21 AS4200 (15 mg/kg) co-verkapselt mit Doxorubicin (2 mg/kg) eine überraschende und statistisch signifikante Verbesserung gegenüber separat verabreichten Formulierungen bereitstellt. Im Weiteren verbessert ein Anstieg des Doxorubicins in der AS4200 auf 10 mg/kg nicht die Antwort, obwohl verkapseltes Doxorubicin alleine bei 10 mg/kg die gleiche Antwort bereitstellt. Diese Ergebnisse indizieren eine komplexe Interaktion von Zellen, und Antworten können in der Kombinationstherapie, die durch die erfindungsgemäßen Partikel bereitgestellt wird, stattfinden. Es ist möglich, dass die gesteigerte Dosis von Doxorubicin einen gegenteiligen Effekt auf das ODN hat.
Um zu bestimmen, ob die Leber-RES, insbesondere Kupffer-Zellen, in der Clearance-Antwort involviert sind, wurde eine Kupffer-Zellinhibition via RES-Blockade durchgeführt. Dies wurde bewerkstelligt durch die Verabreichung einer niedrigen Dosis verkapselten Doxorubicins (ausreichend um mature Kupffer-Zellen zu töten) 24 Std. vor Verabreichung von AS4204. Ferner wurde co-verkapseltes Doxorubicin in AS4204 bei initialen Doxorubicin/Lipid-Verhältnissen von 0,2, 0,1, 0,05 und 0,01 wöchentlich ver abreicht, um die korrespondierende in vivo Antwort zu evaluieren. Lipidwiedergewinnung (% der initialen Konzentration) im Blut wird in 16 dargestellt. Es ist evident, dass Blockade mit DSPC/Chol-Doxorubicin keinen Effekt auf Inhibierung der Zirkulationselimination hat, da weniger als 5% des initial verabreichten Lipids nach der zweiten und nachfolgenden Injektionen in der Zirkulation vorhanden war. Co-Verkapselung von Doxorubicin in AS4204 bei initialen Verhältnissen von 0,2 und 0,1 resultierte jedoch in einer Erhaltung der Zirkulationslevel nach drei nachfolgenden Injektionen zu mehr als 75% der initial verabreichten Formulierungen. Der Grenzwert zur Inhibierung der Zirkulationselimination erscheint deshalb zwischen 0,1 und 0,05 zu liegen. Diese Ergebnisse deuten an, dass Kupfferzellen nicht allein verantwortlich für die Clearance-Antwort sind und dass andere Zellen, welche durch die Co-Verabreichung von Doxorubicin größer als 0,05 behindert werden, größtenteils verantwortlich sind. Diese anderen Zellen können B-Zellen sein oder können Zellen sein, die B-Zellen aktivieren, oder sie können peripherale Immunsystemzellen sein, wie beispielsweise Tumor-assoziierte Makrophagen etc.
Beispiel 3
Die Reihen von Beispielen charakterisieren, dass manche der Immunantworten durch die Verabreichung von erfindungsgemäßen Lipid-Nukleinsäurepartikeln generiert werden. Alle Methoden und Materialien waren identisch zu denen aus Beispielen 1 und 2, wobei die Änderungen angezeigt werden. Diese Beispiele zeigen unerwartete Qualitäten von SALP-Formulierungen, welche zum therapeutischen Nutzen ausgebeutet werden können.
Zelllinien und Mäusestämme. YAC-1-Zellen wurden in cRPMI (RPMI 1640, 10% FCS, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Streptomycin, 100 μg/ml Penicillin) kultiviert. Alle Gewebskulturmedienreagenzien wurden von GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, USA) erworben und FALCON Plastikware wurde von Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) erworben. Weibliche C57B1/6-Mäuse wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN, USA) erhalten. Weibliche C57BL/6J-Lystbg-JI+(beige) Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) erhalten. Es sollte notiert werden, dass, wenn beige Mäuse verwendet wurden, die Wildtyp-Kontrolle C57B1/6J ebenfalls von Jackson erhalten wurde.
Ernten von hepatischen mononuklearen Zellen (HMNCs). Mäuse wurden durch eine Überdosis Anästhetikum [3,2% (V/V) Ketamin/0,8% (V/V) Xylazin] euthanisiert. Die Tiere wurden dann über das linke Atrium mit 6 ml Hank's Balanced Salzlösung (HBSS), auf 37°C vorgewärmt, perfundiert, gefolgt von 6 ml 0,25%iger Collagenase IV (Sigma, St. Louis, MO, USA) in HBSS (ebenfalls vorgewärmt). Gefolgt von einer 15-minütigen Verdauungsperiode wurde die Leber entfernt, kurz per Hand in eine 100-mm-Petrischale, enthaltend 5 ml eiskaltes RPMI 1640 mit zugegebenen 5% FCS (RPMI-5%), dispergiert und in eine 50 ml konische Tube, enthaltend 20 ml RPMI-5% insgesamt, auf Eis transferiert. Die Leber wurde dann mechanisch durch Durchführung der Verdauungsprodukte durch ein 100-μm-Stahlnetz dispergiert. Hepatocyten wurden von der Suspension durch eine 3-minütige Zentrifugation bei 600 rpm entfernt. Die übriggebliebenen Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1300 rpm für 5 Minuten pelletiert und einmal mit HBSS gewaschen. Hepatische mononukleare Zellen wurden durch Resuspendierung des Zellpellet in 30% Percoll (Amersham Pharmacia Biotech; Baie d'Urfe, PQ, Kanada) in PBS und Zentrifugation bei 2000 rpm für 10 Minuten isoliert. Das Perkoll wurde behutsam entfernt und das Zellpellet wurde zweimal mit 10 ml HBSS gewaschen und in einem Endvolumen von 2 ml cRPMI resuspendiert. Routinemäßig erzielte dieses Verfahren 2–3 × 10⁶ mononukleare Zellen aus der Leber von einer 8–10 Wochen alten C57B1/6-Maus.
Chrom-Release-Assay. Um die NK-Aktivität in den mononuklearen Zellzubereitungen zu messen, wurden Zellsuspensionen auf ihre Fähigkeit ⁵¹Cr gelabelte NK-Zielzellen (YAC-1), wie bei Bramson et al., (1996) beschrieben, zu lysieren, getestet. Kurz gefasst wurden YAC-1-Zellen mit ⁵¹Cr durch Inkubation mit 10⁶ Zellen in 50 μCi von ⁵¹Cr (NEN Life Science Products; Boston, MA, USA) für 1 Std. bei 37°C gelabelt. Die gelabelten YAC-1-Zellen wurden in cRPMI bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml resuspendiert, und 50 μl Aliquots der YAC-1-Suspension wurden mit verschiedenen Anzahlen peritonealen Extrudatzellen in U-förmigen 96-Well-Platten gemischt, um Effektor:Ziel-Verhältnisse von 90:1, 30:1 und 10:1 zu erzielen. Die Platten wurden bei 37°C, 5% CO₂ für 4–6 Std. inkubiert. Auf die Inkubationsperiode folgend wurden 100 μl des Kulturüberstandes von jedem Well zur Szintillationszählung entfernt.
FACS-Analyse. Die Oberflächenexpression von NK 1.1 und T-Zell-Rezeptor (TOT) β-Ketten auf mononuklearen Zellzubereitungen wurde durch 2-Farbenflusscytometrieanalyse unter Verwendung der folgenden Antikörper bestimmt: PE-konjugiertes Anti-NK 1.1 (Klon PK136), FITC-konjugiertes Anti-TCTβ (Klon H57-597), PE-konjugiertes Maus-IgG_2a, κ-Isotypkontrolle (Klon G155-178) und FITC-konjugiertes Hamster-IgG, Gruppe 2, λ-Isotypkontrolle (Klon Ha4/8). Alle Antikörper wurden von Pharmingen (Mississauga, ON) erhalten. Die Prozentanzahl von einfach und doppelt positiven Zellen in der Population wurde unter Verwendung des CellQuest Softwarepakets (Becton-Dickinson, San Jose, CA) berechnet. Die absolute Anzahl von NK- und NKT-Zellen wurde durch Subtraktion der Prozentanzahl der nicht-spezifisch gefärbten Zellen von der Prozentanzahl der positiv gefärbten Zellen und Multiplikation mit der Gesamtzellzahl bestimmt.
Statistische Analyse. Alle Daten werden als Mittel ± SEM dargestellt und unter Verwendung des zwei-tailed Student's t-Tests verglichen. Statistik wurde unter Verwendung von Statvie 512- für Macintosh (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA) berechnet.
17 zeigt, dass in einem Mitogenizitätsassay von INX-6295 (CpG enthaltend) und INX-6300 (CpG abwesend) InX-6295 zumindest viermal mehr mitogen ist. Nichtsdestotrotz besitzt INX-6300 eine stimulierende Aktivität im Vergleich zum Medium alleine, das mit Berichten darüber, dass das PS-Rückgrat selbst ein mitogenes Agens ist, konsistent ist. Native Splenocyten wurden in vitro mit gestaffelten Mengen freiem PS ODN (6,25 μg/ml bis 25 μg/ml) inkubiert. Die Kulturen wurden mit ³H-Thymidin gepulst und 72 Std. später geerntet. Jeder Punkt stellt das Mittel der ³H-Thymidin-Inkorporation ± SEM 3 separater Kulturen dar. Diese Figur stellt eines von zwei Experimenten dar, die dreifach durchgeführt wurden, dar, geschlossene Quadrate, freies INX-6295; geschlossene Kreise, freies INX-6300.
C57B1/6-Mäuse erhielten eine (6295 X 1), zwei (6295 X 2) oder drei (6295 X 3) intravenöse Injektionen mit INX-8295/SALP (15 mg/kg ODN; 48 Std. zwischen den Injektionen) oder 3 intravenöse Injektionen mit PBS (48 Std. zwischen den Injektionen). Hepatische mononukleare Zellen (HMNC) wurden 24 Stunden folgend auf die finale Injektion geerntet. 18A zeigt die Gesamtzahl von HMNC. Jeder Balken stellt das Mittel von + MNC + SEM von 6–25 Mäusen dar. 18B zeigt die lytische Aktivität von HMNC gegen YAC-1-Zellen. Jeder Punkt stellt das Mittel der% spezifischer Lyse ± SEM von 3 separaten HMNC-Populationen. Die Figur stellt eines von zwei Experimenten, die dreifach durchgeführt wurden, dar. Quadrate, 3 Injektionen mit INX- 6295/SALP; Diamanten, 2 Injektionen mit INX-6295/SALP; Dreiecke, 1 Injektion mit INX-6295/SALP, Kreise, 3 Injektionen mit PBS. ***, p < 0,0001; **, p < 0,01. Wie in 18A wiedergegeben, resultieren drei wiederholte Injektionen mit INXC-6295 in einem linearen Anstieg mononuklearer Zellen und natürlicher Killeraktivität in der Leber. Splenomegalie wurde nach der zweiten und dritten Verabreichung von INXC-6295, bestimmt über das Milzgewicht, beobachtet, jedoch gab es keinen Anstieg in der Splenocytenanzahl (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass Anstiege in der Zellzahl nicht verantwortlich sind für die Vergrößerung. 18B zeigt, dass cytolytische Aktivität von HMNC-Populationen, wie gemessen durch YAC-1 Chrom-Release-Assays, nach INXC-6295-Behandlung anstieg. Die Ähnlichkeit des Anstiegs zwischen der Lysekurve und den HMNC-Populationen, die nach zweiter und dritter Verabreichung von INXC-6295 geerntet wurden, deutet an, dass die gleichen Effektorzellen in beiden Proben enthalten sind. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass NK-Aktivität innerhalb der Milz nach folgenden Verabreichungen von INCX-6295 anstieg, wenn auch zu einem geringeren Ausmaß als die HMNCs.
Gruppen von 3 C57B1/6-Mäusen erhielten 2 intravenöse Injektionen mit INX-6295/SALP (15 mg/kg ODN; 48 Std. zwischen den Injektionen) oder PBS (48 Std. zwischen den Injektionen). Hepatische mononukleare Zellen (HMNC) wurden 24 Std. nach der finalen Injektion geerntet. Gleiche Zellanzahlen wurden von drei Proben gepoolt und Oberflächenexpression von NK1.1 und TCRβ-Kette wurden durch Flusscytometrie gemessen. 19A zeigt die Gesamtzahl von NK1.1-/TCR-Zellen in dem HMNC-Pool. Jeder Balken stellt die mittlere Zellzahl + SEM von 5–6 Experimenten dar. 19B zeigt die Gesamtzahl von NK 1.1+/TCR+ Zellen in dem HMNC-Pool. Jeder Balken stellt die mittlere Zellzahl + SEM von 5 – 6 Experimenten dar. ***, p < 0,0001; N. S., nicht signifikant. Es gibt einen Anstieg in NK1.1+/TCT-Zellen in der Leber, wie gezeigt, folgend auf die INX-6295/SALP-Behandlung. Da die YAC-1-Zellen sensitiv sowohl gegenüber NK- und NCT-vermittelter Lyse sind, war es nicht klar anhand des groben Release-Assays, welche Population verantwortlich war. Es gab folgend auf die INXC-6295-Behandlung keinen signifikanten Anstieg in NKT-Zellen. Im Gegensatz hierzu gab es nachfolgend auf die INXC-6295-Behandlung einen fünffachen Anstieg in hepatischen NK-Zellen. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die Zellpopulation, die verantwortlich für den Anstieg lytischer Aktivität, beobachtet auf die Verabreichung von INXC-6295, die NK-Zelle ist.
Gruppen von 3 C57B1/6J-Mäusen (Wildtyp) und 3 C57BL/6J-Lyst^bg-j/+ (beige) erhielten 2 intravenöse Injektionen mit INX-6295/SALP (15 mg/kg ODN; 48 Std. zwischen den Injektionen) oder PBS (48 Std. zwischen den Injektionen). Hepatische mononukleare Zellen (HMNC) wurden 24 Std. nach der finalen Injektion geerntet. HMNC wurden auf lytische Aktivität gegen YAC-1-Zellen getestet. Die Ergebnisse werden in 21 gezeigt, wobei jeder Punkt die mittlere prozentspezifische Lyse ± SEM von 3 separaten HMNC-Populationen darstellt. Geschlossene Quadrate, 2 Injektionen mit INX-6295/SALP, Wildtypmäuse; geschlossene Diamanten, 2 Injektionen mit PBS, Wildtypmäuse; offene Quadrate, 2 Injektionen mit INX-6295/SALP, beige Mäuse; offene Diamanten, 2 Injektionen mit PBS, beige Mäuse. Wie in 21 gezeigt, fehlt es an cytolytischer Aktivität folgend auf INX-6295/SALP-Behandlung bei den HMNC beiger Mäuse (NK-Zell- und B-Zell-defizient). Während INXC-6295 eine starke lytische Aktivität in Wildtypmäusen induziert, wurde nur eine schwache lytische Aktivität in beigen Mäusen bei der gleichen Behandlung beobachtet. Dies deutet an, dass NK-Zellen durch die erfindungsgemäßen Partikel spezifisch aktiviert werden. Die schwache lytische Aktivität in beigen Mäusen kann immer noch einer ineffizienten Suppression der NK-Aktivität in Mäusen zugeordnet werden oder es kann Beweis für eine geringe Komponente einer NKT-Zellaktivität sein. Beige Mäuse, die Tumoren tragen, zeigen ebenfalls keine Behandlungsantwort oder Wirksamkeit von INXC-6295, was andeutet, dass die NK-Zell- und B-Zell-Antworten Schlüsselzellen sind, die durch die erfindungsgemäßen Partikel aktiviert werden.
C57B1/6-Mäuse erhielten 2 intravenöse Injektionen mit INX-6295/SALP, INX-6300/SALP, freiem INX-6295, freiem INX-6300 (15 mg/kg ODN; 48 Std. zwischen den Injektionen), Lipid alleine oder PBS (48 Stunden zwischen den Injektionen). HMNC wurden 24 Std. nach der finalen Injektion geerntet. Die Ergebnisse werden in 22 dargestellt, wobei jeder Balken die mittlere HMNC + SEM von 8–25 Mäusen darstellt. *** p = 0,0001; N. S., nicht signifikant. Wie gezeigt, gibt es einen Anstieg an HMNC, folgend auf die Verabreichung von freiem und verkapseltem PS-ODN. Verabreichung von freien INX-6295 produzierte einen Anstieg an HMNC ähnlich zu dem, der für AS4200-Formulierung von INX-6295 beobachtet wurde. INX-6300 in AS4200 jedoch generierte nur eine kleine Expansion an HMNCs im Vergleich zu PBS, während freies INX-6300 keinen Anstieg induzierte.
Gruppen von 3 C57B1/6-Mäusen erhielten 3 intravenöse Injektionen mit INX-6295/SALP, INX-6300/SALP, freiem INX-6295, freiem INX-6300 (15 mg/kg ODN; 48 Std. zwischen den Injektionen), Lipid alleine oder PBS (48 Std. zwischen den Injektionen). HMNC wurden 24 Std. nach der finalen Injektion geerntet. Gleiche Zellzahl wurde von Dreifachproben gepoolt und Oberflächenexpression von NK1.1 und die TCRβ-Kette wurde durch Flusscytometrie bestimmt. 22A zeigt die Gesamtanzahl von NK1.1+/TCR-Zellen in dem HMNC-Pool. Jeder Balken stellt die mittlere Zellzahl + SEM von 3–6 Experimenten dar. 22B zeigt die Gesamtzahl an NK1.1+/TCR+ Zellen in dem HMNC-Pool. Jeder Balken stellt die mittlere Zellzahl von SEM von 3–6 Experimenten dar. ***, p < 0,0001; N. S., nicht signifikant. Wie gezeigt, gibt es einen Anstieg in NK1.1+/TCR-Zellen in der Leber, folgend auf SALP-Behandlung. NK-Zellexpansion wird ebenso folgend auf die Behandlung mit freiem oder verkapseltem INX-6295 gefunden und zu einem reduzierten (nicht signifikanten) Ausmaß mit INXC-6300. Keine der Behandlungen produzierte signifikante Änderungen in dem NKT-Kompartiment.
Gruppen an 3 C57B1/6-Mäusen erhielten 2 intravenöse Injektionen mit INX-6205/SALP, INX-6300/SALP, freiem INX-6295, freiem INX-6300 (15 mg/kg ODN; 48 Std. zwischen den Injektionen) oder PBS (48 Std. zwischen den Injektionen) an Tagen 0 und 2. Hepatische mononukleare Zellen (HMNC) wurden an Tag 3, 24 Std. nach der finalen Injektion geerntet. HMNC wurde auf lytische Aktivität gegenüber YAC-1-Zellen getestet. Die Ergebnisse werden in 23A–C gezeigt, wobei jeder Punkt die mittlere prozentspezifische Lyse ± SEM von 3 separaten HMNC-Populationen darstellt. Jeder Graph stellt 2–3 Experimente dreifach durchgeführt dar. Geschlossene Quadrate, 2 Injektionen mit freiem INX-6295; geschlossene Diamanten, 2 Injektionen mit freiem INX-6300; offene Quadrate, 2 Injektionen mit INX-6295/SALP; offene Diamanten, 2 Injektionen mit INX-6390/SALP; offene Kreise, 2 Injektionen mit PBS. Wie gezeigt, gibt es eine Aktivierung von natürlichen Killerzellen innerhalb der HMNC-Population, folgend auf die Verabreichung von freiem und verkapseltem PS ODN. Intravenöse SALP-Verabreichung kann Leber-NK-Zellen in Abwesenheit eines ISS-Motivs aktivieren. 23A zeigt, dass sowohl freies als auch verkapseltes INX-6295 ähnliche Aktivierung von Leber-NK-Zellen unterstützt. Überraschenderweise produziert INX-6300/SALP fast soviel lytische Aktivität wie INXC-6295, was andeutet, dass SALP-(oder AS4200)-Formulierungen mit einer Nicht-ISS-Sequenz typische ISS-Antworten produzieren kann. Dies begründet eine neue Klasse an ISS-Motiven, wel che Immunantworten in freier Form nicht aktivieren, aber anstelle dessen abhängig sind von der Lipid-Partikelverkapselung, um eine Immunantwort zu produzieren.
Zusammengefasst zeigt dieses Beispiel, dass Immunaktivierung durch INX-6300/SALP, aber nicht mit entweder dem ODN oder Lipid alleine, einen zusätzlichen Weg zur Immunstimulierung unabhängig vom ISS-Motiv oder DoppelstrangNukleinsäure darstellt. Es sollte jedoch notiert werden, dass, während die NK-Zellen, die durch INX-6300/SALP (es fehlt ein ISS-Motiv) lytische Aktivität aufwiesen, die ähnlich zu denen sind, die durch INX-6295/SALP (enthaltend ein ISS-Motiv) stimuliert sind, Expansion der NK-Zellen nur beobachtet wurde, wenn die ODN-Beladung ein ISS-Motiv enthielt. Dies deutet an, dass die NK-Zellen multiple Signale zur Aktivierung lytischer Aktivität und Proliferation erfordern oder dass die Signale vermittelt durch INX-6300/SALP stark genug sind, um Cytotoxizität zu aktivieren, aber zu schwach sind, um Expansion zu vermitteln. Modifikationen der SALP-Formulierung unter Verwendung stimulatorischer Lipide, wie z. B. α-Galactoseceramid, können den zusätzlichen Stimulus bereitstellen, um Expansion und Aktivierung von Leber-NK-Zellen und möglicherweise NKT-Zellen zu vermitteln.
Beispiel 4
Die Reihe an Beispielen illustriert die Fähigkeit bestimmter kationischer Lipid:DNA-Komplexe (nicht-verkapselte Systeme oder Lipoplexe) Immunantworten zu generieren und dementsprechend eine funktionale Unterstützung zur Krebsgentherapie bereitzustellen.
Reagenzien. DODAC (N,N-Dioleyl-N,N-dimethylammoniumchlorid) und DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) wurden durch Dr. Steven Ansell (Inex Pharmaceuticals, Vancouver, BC, Kanada) zubereitet. DOTAP (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) und DOPE (1,2-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) erhalten. Actinomycin D und N-(1-Naphthyl)ethylendiamin, Sulfanilamid wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) erworben.
Zellkultur. MCA207 (murines Fibrosarkom) (bereitgestellt durch S. Rosenberg, National Cancer Institute, Frederick/Bethesda, MD), SKOV-3 (humanes ovarielles Karzi nom, ATCC#HTB-77), LS180 (humanes kolorektales Karzinom) und WEHI13VAR (ATCC#CRL-2148) wurden in cRPMI [RPMI 1640, 10% FCS, 50 μM 3-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Streptomycin, 100 μg/ml Penicillin] kultiviert. Alle Gewebskulturmedienreagenzien wurden von GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, USA) erworben und FALCON Plastikware wurde von Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) erworben.
Herstellung von LUVs. Lipidfilme wurden durch Lyophilisation von Lipidlösungen, zusammengesetzt aus 10 mg/ml Lipid, in 100% Ethanol zubereitet. Die Lipide wurden in Wasser bei einer finalen Konzentration von 40 mM Lipid resuspendiert. Die solubilisierten Liposome wurden dann 10 mal durch einen 100-nm-Carbonatmembran extrudiert, um große unilamellare Vesikel [Large Unilamellar Vesicles] (LUVs) zu generieren, und wurden bei 4°C gelagert. Die LUVs, die in diesen Studien verwendet wurden, waren zusammengesetzt aus einem molaren Verhältnis von 1:1 von kationischem Lipid (DODAC, DOTMA oder DOTAP) und DOPE.
Lipoplexbildung. LUV/DNA-Komplexe (welche „nicht-vollständig verkapselte Systeme" im Rahmen dieser Beschreibung darstellen), wurden bei einem Ladungsverhältnis von +3 zubereitet. Eine Lösung, die pCMVluc18 bei einer finalen Konzentration von 500 μg/ml in 5% Glucose enthält, wurde zubereitet. Die DNA-Lösung wurde tropfenweise zu einer Lösung, enthaltend 9,0 mM DODAC:DOPE (1:1) LUVs in 5% Glucose während Vortexung zugegeben. Die Komplexe werden dann für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Lipoplexe werden vor jeder Verwendung frisch zubereitet.
Luciferase- und Protein-Assays. Luciferase-Assays werden unter Verwendung des Luciferase-Assay-Systemkits (Promega; Madison, WI, USA) wie vorstehend beschrieben (12) durchgeführt. Zelluläre Lysate wurden auf den Proteingehalt unter Verwendung der Bicinchoninic Acid kolorimetrischen Methode (Pierce Chemical Co.; Rockford, IL, USA) entsprechend des Herstellerprotokolls geassayt.
Murine Peritonitis. Weibliche C57B1/6-Mäuse (Harlan Sprague Dawley; Indianapolis, IN, USA) erhielten eine intraperitoneale Injektion mit LUVs oder Lipoplexen in 200 μl 5% Glucose (Lipiddosis = 60 mg/kg). An bestimmten Zeitpunkten wurden die Mäuse durch Asphyxiation mit CO₂ euthanisiert und peritoneale Exsudatzellen wurden durch Spülung mit 5 ml eiskalter Hank's Balanced Salzlösung (HBSS) wiedergewonnen. Die Konzentration der Zellen in der Spülung wurde unter Verwendung eines Zellzählers (Coulter Diagnostics; Hialeah, Fla., USA) quantifiziert, und die Zellen wurden zweimal mit HBSS gewaschen. Nach der finalen Waschung wurde das Zellpellet in cRPMI resuspendiert.
NK Assay. Um die NK-Aktivität zu messen, wurden peritoneale Exsudatzellen auf ihre Fähigkeit getestet ⁵¹Cr-gelabelte YAC-1-Zellen, wie in Bramson et al. (13) beschrieben, zu lysieren. Eine lytische Einheit (LU) entspricht der Anzahl Exsudatzellen, die erforderlich ist, um 30% spezifische Lyse von 5000 YAC-1-Zellen herzustellen.
TNF-α-Bioassay. Der TNF-α-Bioassay wurde wie bei Khabar et al. (14) beschrieben mit der folgenden Modifikation durchgeführt: Am Ende der Assayperiode wurden 100 μl des Überstandes von jedem Well entfernt, 20 μl einer MTS-Lösung (Zell-Titer 96 Aqueous Non-radioactive Cell Proliferation Assay; Promega, WI, USA) wurde zu jedem Well zugegeben und die Platten wurden für weitere 1,5 Std. inkubiert. Das Absorptionsvermögen der Lösung in jedem Well wurde bei 490 nm gemessen. Die Konzentration von TNF-α in den experimentellen Wells wurde durch Vergleich mit rekombinanten Standards berechnet. Routinemäßig war dieser Assay auf 15 pg/ml rekombinanten Standard sensitiv.
Cytokine ELISAs. IFNγ (Endogen; Wobum, MA, USA) und IL-12p70 (Pharmingen; San Diego, CA, USA) Levels wurden unter Verwendung eines spezifischen ELISA, wie bei dem Hersteller beschrieben, gemessen.
Stickstoffmonoxid-(NO)-Releaseassay. Aliquots von 5 × 10⁵ peritonealen Exsudatzellen wurden auf 24 Wellplatten transferiert. Die Zellen wurden dann für 24 Std. im Medium +/– 10 ng/ml LPS in einem Gesamtvolumen von 1 ml inkubiert. Auf die Inkubationsperiode wurde die Konzentration von Nitraten in dem Überstand unter Verwendung des Griess-Assay bestimmt. Ein 100 μl Aliquot des Kulturmediums wurde mit 100 μl Griess-Reagenz [gleiche Volumen von Griess-Reagenz A (0,1% N-(1-Naphthyl)ethylendiamin) und Griess-Reagenz B (1% Sulfanilamid in 5% Phosphorsäure)] in einer Flach-Boden-96-Wellplatte gemischt. Die Absorptionsfähigkeit in jedem Well wurde dann bei 570 nm gemessen. Nitratkonzentration wurde unter Verwendung einer Standardkurve im Bereich von 1 mM bis 1,6 μM bestimmt.
Zellen wurden über Nacht mit 0,25 μg/ml DNA im Komplex mit 100 nm LUVs, zusammengesetzt aus einem molaren Verhältnis von 1:1 eines kationischen Lipids und DOPE, inkubiert. Die Zellen wurden dann lysiert und auf Luciferase-Expression, wie im „Materialien und Methoden"-Teil beschrieben, geassayt. Die Ergebnisse werden in 24A–C gezeigt. Drei Tumorzelllinien wurden in diesem Experiment verwendet: murines Fibrosarkom MCA207 (24A), humanes ovarielles Karzinom SKOV-3 (24B) und humanes kolorektales Karzinom LS 180 (24C). Diese Daten spiegeln ein von drei individuellen Experimenten wider. Jeder Balken stellt das Mittel RLU von 4 replikaten Transfektionen + s. e. m. dar. Die Transfektionsprofile von Lipoplexen, enthaltend entweder DODAC, DOTAP oder DOTMA, veranschaulichen, dass unterschiedliche kationische Lipide unterschiedliche Transfektionsfähigkeiten haben und dass unterschiedliche Tumorzelllinien auf diese unterschiedlich antworten. Dies deutet an, dass erfindungsgemäße Partikel unterschiedliche kationische Lipide, abhängig von der Indikation (Tumortyp), welcher behandelt wird, verwenden können.
C57B1/6-Mäuse werden mit 50 μg DNA im Komplex mit LUVs, zusammengesetzt aus einem molaren Verhältnis von 1:1 kationisches Lipid und DOPE, inokuliert. Peritoneale Exsudatzellen wurden an Tagen 0, 1, 3 und 5 geerntet. Die Ergebnisse werden in 25 gezeigt, welche die Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten mit 4 – 6 Tieren pro Gruppe repräsentiert. Jeder Punkt repräsentiert das mittlere zelluläre Infiltrat in der Spülung von 8–12 Mäusen ± s. e. m. Wie gezeigt, steigt die zelluläre Rate in dem Peritoneum auf die Lipoplex-Verabreichung an, aber DOTAP-Lipoplexe gingen auf fast normale Level ab Tag 5 zurück.
C57B1/6-Mäuse wurden mit 50 μg DNA im Komplex mit LUVs, zusammengesetzt aus einem molaren Verhältnis von 1:1 kationischem Lipid und DOPE inokuliert. Die peritonealen Exsudate wurden durch Spülung am Tag 1, 3 und 5 geerntet. 26A–C zeigen Ergebnisse von zwei unabhängigen Experimenten mit 4–6 Tieren pro Gruppe unter Verwendung von DODAC (26A), DOTAP (26B) und DOTMA (26F), als das kationische Lipid. Jeder Punkt stellt die mittlere IFN-γ-Konzentration in den Spülungen von 8–12 Mäusen + s. e. m. dar. Wie gezeigt, antworten die Cytokin-IFN-γ-Level unterschiedlich auf die Behandlung mit unterschiedlichen kationischen Gebieten. Es gab keine detektierbare Antwort für TNF-α oder L-12 in diesen Assays.
C57B1/6-Mäuse wurden mit 50 μg DNA im Komplex mit LUVs, zusammengesetzt aus einem molaren Verhältnis von 1:1 kationischem Lipid und DOPE, inokuliert. Die peritonealen Exsudate wurden durch Spülung am Tag 1, 3 und 5 geerntet und auf Cytogenizität mit ⁵¹Cr-gelabelten YAC-1-Zellen getestet. 27 zeigt die Ergebnisse eines von zwei unabhängigen Experimenten mit 4–6 Tieren pro Gruppe. Jeder Punkt stellt die mittleren lytischen Einheiten innerhalb der Spülungen von 4–6 Mäusen ± s. e. m. dar. Wie gezeigt, induziert Lipoplex die Aktivierung von NK-Zellen parallel zur Akkumulation des zellulären Infiltrats in diesen Experimenten. DODAC- und DOTMA-Lipoplexe lösten einen progressiven Anstieg der NK-Aktivität über eine Periode von 5 Tagen aus, während die DOTAP-Lipoplexe eine NK-Aktivität mit einem Peak an Tag 3 induzierten, der im Wesentlichen bis Tag 5 erhalten blieb. Es gab ebenfalls einen Anstieg an aktivierten Makrophagen innerhalb der peritonealen Höhle über den Verlauf der inflammatorischen Antwort (Ergebnisse nicht gezeigt).
Zusammengefasst deuten die Ergebnisse an, dass, da inflammatorische Signale erforderlich sind, um eine angemessene Maturation und Funktion dendritischer Zellen zu erhalten, die inflammatorische Antwort, welche auf die Lipoplex-Verabreichung folgt, den Effekt der Tumor-abgeleiteten Cytokine umkehren kann. Da im Weiteren ebenfalls beobachtet wurde, dass Lipoplex-Verabreichung zu einem lokalen Anstieg der NK-Aktivität führt und NK-Zellen gezeigt haben, dass sie spontan Tumorzellen lysieren, dass die kombinierten Effekte der Lipoplex-Verabreichung zu einer Tumormikroumgebung wahrscheinlich die Ursache für die günstige Behandlungsantwort sind.
Beispiel 5
Die Reihe der Experimente wurde bestimmt, um die Induktion für Serumcytokine auf die Verabreichung von Lipid-verkapselten ISS-Oligodeoxynukleotiden zu erforschen.
Materialien und Methoden
Distearylphosphatidylcholin (DSPC) und 1,2-Diolyl-3-N,N-dimethylammoniumpropan (DODAP) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) erworben, während Cholesterol von Sigma (St. Louis, MO, USA) war. 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylenglycolsuccinyl-2-N-myristylsphigosin (PEG-CerC₁₄) wurde von Dr. Zhao Wang (Inex Pharmaceutical Corp.) synthetisiert. Die verwendeten ODN- Sequenzen umfassen das 15-mer-c-myc-ODN komplementär zu der Startkodonsequenz des humanen/Mäuse c-myc Protoonkogens mRNA (5'-AACGTTGAGGGGCAT-3') (SEQ ID Nr. 5), eine 16-mer-Version desselben ODN (5'-TAACGTTGAGGGGCAT-3') (SEQ ID Nr. 4) und die ICAM-1-ODN (ISIS 3082) komplementär zu der 3'-nicht-translatierten Region der ICAM-1 mRNA (5'-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3') (SEQ ID Nr. 2). Die c-myc-ODNs waren von Lynx Therapeutics (Hayward, CA, USA), während ISIS 3082 von Boston Biosystems, Inc. (Redford, MA, USA) erworben wurden. Weibliche, 6 Wochen alte ICR-Mäuse wurden von Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN, USA) erhalten und wurden für mindestens eine Woche vor Verwendung in Quarantäne gegeben.
SALP. SALP, zusammengesetzt aus DSPC:Cholesterol: DODAP:PEG-CerC14 (20:45:25:10, molares Verhältnis) und verkapseltes PS ODN wurde, wie vorstehend beschrieben (Sample et al., 1999), zubereitet. Für PS ODN wurde 300 mM Citratpuffer verwendet, um das ODN zu lösen, während 20 mM Citrat, mit pH-Wert von 4,0 für PO ODN, enthaltend SALP, verwendet wurde. Kurz gefasst. wurde die Lipidmischung in Ethanol gelöst und zu dem ODN (3,33 mg/ml) Citratpuffer (40% finale Ethanolkonzentration) zugegeben. Die resultierende Vesikelmischung wurde 5mal gefroren und wieder aufgetaut und durch 2 aufeinandergestapelte 100 nm Porengrößenfilter unter Verwendung eines Extruders (Northern Lipids, Van, BC, Kan.) extrudiert. Die Vesikel wurden für 2 Stunden gegen Citratpuffer dialysiert, um das Ethanol zu entfernen, dann über Nacht in 500fachem Volumen von HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH-Wert von 7,5), um das DODAP auf der äußerenen Einfachschicht zu neutralisieren. Nicht-verkapseltes ODN wurde aus der Zubereitung durch Anionen-Austausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Sepharose, CL6-B entfernt. Das ODN-zu-Lipid-Verhältnis wurde auf Basis der ODN-Quantifizierung durch A260 und der Lipidgehalt durch einen Phosphat-Assay (Fiske & Subbarow, 1925) auf der Annahme, dass die Lipidmischung aus 20 Mol-% DSPC bestand, berechnet. Da das Phosphat an dem ODN-Rückgrad mit der Lipidanalyse interferieren würde, wurden Proben einem Bligh & Dyer (1995) ausgesetzt, gefolgt von 3 Wasser-Methanol-Waschungen, um das ODN zu entfernen, Das ODN-zu-Lipid-Verhältnis lag typischerweise bei 0,15–0,20 (Gew./Gew.). Vesikelgrößen, die durch quasi-elastische Lichtstreuung unter Verwendung eines NICOMP-Submicron-Partikelsichters (Modell 370) bestimmt wurden, lagen ungefähr bei 120 nm.
Serumisolation. ICR-Mäuse (7 Wochen alt am Anfang des Experiments) wurden intravenös mit 0,2 ml einer Probe in HBS injiziert. Zu verschiedenen Zeiten wurden die Mäuse durch eine terminale Dosis eines Anästhetikums (3,2% (V/V) Ketamin/0,8% (V/V) Xylazin) getötet, und Blut wurde in Vakuumtuben, enthaltend EDTA, gesammelt. Das Blut wurde zentrifugiert (2000 × g für 10 Minuten bei 4°C), um die Blutzellen zu pelletieren und das Serum zu isolieren und bei –20°C bis zum Assay einzufrieren.
ELISA. Serumgehalte von IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-γ, MCP-1 und TNF-α wurden unter Verwendung von kommerziellen ELISA-Kits (PharMingen, San Diego, CA, USA) bestimmt.
Das immunstimulatorische CpG-ODN, das in diesem Beispiel verwendet wurde, ist ein Antisens-ODN, ausgewählt um komplementär zur Startkodonregion des murinen und humanen c-myc Protoonkogens zu sein. Sowohl die 15-mer- als auch 16-mer-Version dieses ODN zeigten Aktivität gegen eine Anzahl menschlicher und muriner Tumoren in vitro und in vivo (Leonetti et al, 1996; Citro et al., 1998; Harsym et al., Manuskript in Arbeit). Beide ODNs (wobei das 16-mer identisch zu dem 15-mer ist, mit der Ausnahme eines extra Thymidins am 5'-Ende) enthalten jedoch ein bekanntes stimulatorisches CpG-Motiv. 5'-(T)AACGTT-3', (Ballas et al., 1996). Die Kontroll-ODN-Sequenz, die in dieser Studie verwendet wurde, ist ISIS 3082, ein 20-mer-Antisens-ODN komplementär zu der 3'-nicht-translatierten Region der murinen ICAM-1 mRNA. Im Gegensatz zu dem c-myc ODN enthält ISIS 3082 kein CpG-Motiv und ist in vitro nicht immunogen (Boggs et al., 1997).
Eine Immunantwort auf freies PS-ODN wurde bereits in Bezug auf angestiegene Serumcytokine beobachtet. ICR-Mäuse, die mit einer i. p. Injektionen freiem PS-ODN (50 mg/kg) behandelt wurden, haben erhöhte Level an IL-12, IL-6, MIP-β und MCP-1, während IFN-γ, IL-10, IL-2 und IL-4 nicht verändert waren (Zhao et al., 1997). Um den Effekt der SALP-Verkapselung zu evaluieren, führten wir eine ähnliche Studie zur Charakterisierung der Serumcytokinlevel in ICR-Mäusen durch und injizierten i. v. 20 mg/kg des 16-mer c-myc PS-ODN entweder in freier oder verkapselter Form (SALP c-myc PS-ODN) oder mit leeren SALP-Vesikeln. Die Serumcytokinlevel, die über einen Zeitraum von 24 Std. charakterisiert wurden, umfassten solche, welche Th1/Th2-Antworten (IL-12, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10), MCP-1 (ein Makrophagenchemokin) und TNF-α (ein Inflammationsmediator) beeinflussten. Unter den Th1/Th2-assoziierten Cytokinen sind L1-12 und IFN-γ starke Promotoren der Th1-Antworten, während IL-4 und IL-10 die Th2-Antworten fördern. Es wurde gefunden, dass Injektionen mit freien c-myc PS ODN einen signifikanten Anstieg an IL-12 zwischen 2 bis 24 Std. nach Injektion, mit einer Peak-Expression (20fachem Anstieg im Vergleich zu unbehandelten Mäusen) bei 4 Std. (28B) induzieren. MCP-1 (28C) und IL-10 (29B) war schwach 2–3fach verstärkt, während keine signifikanten Unterschiede in IL-6 28A), IFN-γ (1D), IL-2 (29A), IL-4 (29C) und TNF-α (29D) Level gesehen wurden.
Eine Verkapselung von c-myc PS ODN in einem Liposom verstärkte die Mitogenizität des ODN. Ähnlich zu freiem c-myc PS ODN wurden IL-12-Level > 2 Std. nach Injektion von SALP c-myc PS ODN mit einer Peak-Expression nach 4 Std. (28B) schwach verstärkt. Die Level des IL-12, die mit SALP c-myc PS ODN induziert wurden, lagen 50fach über der Grundlinie oder waren 2,5fach höher als bei freiem c-myc PS ODN. Serumlevel von IL-6 (1000fach), MCP-1 (400fach) und IFN-γ (20fach) wurden ebenfalls mit einer Peak-Expression nach 4 Std. für IL-6 und MCP-1 sowie nach 8 Std. für IFN-y (28A–D) stark verstärkt. TNF-α (29D) und IL-10 (29B) Level waren im Vergleich zu unbehandelten Mäusen etwas erhöht, während IL-2- und IL-4-Level nicht beeinflusst wurden. Der Effekt von leeren SALP wurde ebenfalls erforscht. Ein initialer Anstieg an IL-6 wurde 1 Std. nach Injektion gesehen, welcher nach 3 Std. auf die Basislinie zurückging (28A). MCP-1- und IL-12-Level waren ebenso etwas induziert, aber wie bei IL-6 war der Effekt besonders gering im Vergleich zu SALP c-myc PS ODN (29A–D). IFN-γ-Expression war unverändert. Demnach beruhte die Induktion der Cytokinserumlevel durch SALP c-myc PS ODN nicht auf einem additiven Effekt des freien ODNs und des Lipidträgers.
Effekt des ODN-Rückgrats auf die Serumcytokininduktion
PO ODNs, die linear sind und einen Einzelstrang haben, werden durch Serumnucleasen (Fisher et al., 1993) schnell degradiert und sind demzufolge im Vergleich zu den stabileren Thiophosphat ODNs in freier Form (Boggs et al., 1997) nicht so immunogen. Verkapselung des ODN würde jedoch diese vor Degradierung während der Zirkulation schützen. Sofern sich das Immunsystem entwickeln würde, bakterielle DNA, enthaltend CpG-Motive, zu erkennen, dann könnte erwartet werden, dass ein ODN mit einem normalen Phosphodiester-Rückgrat schneller erkannt wird und demzufolge im Vergleich zu einem ODN, enthaltend ein chemisch-modifiziertes Thiophosphat-Rückgrat, stimulatorischer sein. Demzufolge war es von Interesse, die Immunogenität der SALP-Formulierungen, enthaltend PS und PO ODN zu vergleichen. Aufgrund von Bereitstellungsschwierigkeiten wurde das 15-mer PO c-myc ODN in diesem Experiment verwendet, während das 16-mer c-myc ODN, welches ein extra Thymidin am 5'-Ende enthält, als das PS-ODN verwendet wurde. Das bekannte immunstimulatorische Sequenzmotiv ist für beide ODNs das gleiche und es wurde gezeigt, dass die indizierten Serumcytokinlevel in einem Kontrollexperiment bei Vergleich der Serumcytokinlevel induziert durch SALP, enthaltend das 16-mer PO oder 16-mer c-myc PS ODN, die gleichen sind. Über einen 7-Tage-Zeitraum wurden keine signifikanten Unterschiede gefunden. Als eine zusätzliche experimentelle Anmerkung haben wir beobachtet, dass zwischen Experimenten ein zweifacher Unterschied in gemessenen Serumcytokinlevels mit den gleichen Proben beobachtet werden kann. Obwohl SALP c-myc PS ODN (16-mer) in dem folgenden Experiment (30A–D) sowie dem, das in 28A–D gezeigt wurde, verwendet wurde, wurden 23 ± 2 μg/ml von IL-12 nach 4 Std. in dem ersten Experiment, aber nur 10 ± 1 in der nachfolgenden Studie nachgewiesen. Die Schwankungen lagen nicht an Unterschieden in SALP-Zubereitungen (Daten nicht gezeigt), aber können aus Umgebungsbedingungen oder genetischen Schwankungen zwischen unterschiedlichen Chargen der ICR-Mäuse entstehen. Wiederholte Experimente zeigen jedoch an, dass die beobachteten Vergleichsunterschiede zwischen unterschiedlichen Probentypen relativ ungeändert erhalten bleiben.
In der Studie, die in 30A–D gezeigt wird, werden ICR-Mäuse mit 20 mg/kg SALP c-myc PS ODN (16-mer), SALP c-myc PO ODN (15-mer) oder freien c-myc PO ODN (15-mer) injiziert und Serumcytokinlevel wurden über einen Zeitraum von 8 Tagen gemessen. In Mäusen, die mit SALP c-myc PS ODN injiziert wurden, wurde ein Anstieg an IL-6, IL-12, MCP-1 und IFN-γ Serumlevels wie zuvor (28A–D) mit einem Peak nach 4 Std. für IL-6 (30A), für IL-12 (30B) und für MOP-1 (30C) und nach 8 Std. für IFN-γ (30D) festgestellt. Mäuse, die mit SALP c-myc PO ODN injiziert wurden, zeigten ebenfalls eine maximale Serumcytokininduktion nach ungefähr 4 oder 8 Std., wobei jedoch die Level des exprimierten Cytokins größer war. Serumcytokinlevel von MOP-1 wurden 1,4fach erhöht, während ein 2–4facher Anstieg für IL-12, IFN-γ und IL-6 beobachtet wurde (3). Keine feststellbare Ver änderung im Serumcytokinlevel wurden in Mäusen, die mit freiem c-myc PO ODN injiziert wurden, wie aufgrund der schnellen Degradierung der Phosphodiester-ODN in der Zirkulation erwartet, beobachtet.
Ein zweiter großer Unterschied zwischen dem Effekt von Thiophosphat und Phosphodiester-ODN-enthaltenen SALP wurde festgestellt, wenn man die IFN-γ Level nach 24 Std. anschaut. In Mäusen, die mit SALP c-myc PS ODN injiziert wurden, trat ein Peak in IFN-γ Levels nach 8 Std., wie vorstehend angedeutet, auf, aber eine zweite breite Induktionsphase wurde zwischen 2 und 7 Tagen, mit einem Peak ungefähr nach 5 Tagen (31A) gesehen. SALP c-myc PO ODN, was einen höheren Level an IFN-γ nach 8 Std. induzierte, resultierte ebenfalls in einem zweiten IFN-γ Peak, der ungefähr nach 6 Tagen begann (31B). Die exprimierte Menge lag jedoch signifikant niedriger im Vergleich zu der, die durch SALP c-myc PS ODN induziert wurde. Der Unterschied in IFN-γ Levels, induziert durch Thiophosphat und Phosphodiester ODN-enthaltenden SALPs, könnte andeuten, dass die zweite IFN-γ Phase abhängig von der Anwesenheit von nicht-degradiertem ODN ist. Es wurde identifiziert, das IFN-γ, das durch Polynukleotide induziert wird, von NK-Zellen in vivo in Antwort auf IL-12 Freisetzung von Makrophagen sekretiert wird (Chase et al., 1997). Wenn die Serum IL-12 Level jedoch analysiert wurden, wurde eine zweite L-12 Induktionsphase nicht offenkundig. Ein sehr kleiner Anstieg an IL-12 wurde zwischen 3 und 5 Tagen (72–120 Std.) mit SALP c-myc PS ODN (32A) und nach 7 Tagen (168 Std.) mit SALP c-myc PO ODN (32B) gesehen. Die gepunktete Linie in 5 stellt IL-12 Level in HBS-injizierten Mäusen dar. Eine Erklärung für die Unterschiede in relativen IL-12 und IFN-γ Levels bei den zwei Induktionsphasen besteht darin, dass in der späteren Phase mehr NK-Zellen anwesend sind (Bramson et al., eingereicht) und dementsprechend der Effekt von IL-12 amplifiziert werden könnte. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die Freisetzung von IL-12, die möglicherweise von maturierenden dendritischen Zellen entsteht, lokalisiert wird. Immature dendritische Zellen würden nach Aufnahme des SALP/ODN aktiviert werden und zu Gebieten innerhalb der Lymphdrainageknoten, die reich an T-Zellen sind, transluziert werden, IL-12 freisetzend, und T-Zellen und NK-Zellen stimulieren, um IFN-γ herzustellen. Freies c-myc PS ODN induzierte ebenfalls eine zweite Phase an IFN-γ Expression, jedoch wurde eine höhere (> 40 mg/kg) Dosis benötigt, um einen messbaren (zweifach überhalb der Basislinie) Unterschied zu erreichen, während freies c-myc PO ODN keinen Effekt hatte (Daten nicht gezeigt).
Keine signifikanten Anstiege in IL-6 und MOP-1 Level wurden über da, was mit dem Schwanzende des initialen 4-Stunden-Peaks (28 und 30) über einen Zeitraum von 7 Tagen assoziiert war, festgestellt. Zusätzlich wurde keine Änderung in IL-2, IL-4, IL-10 oder TNF-α Level festgestellt.
ODN Sequenzabhängigkeit
Es wurde gefunden, dass die Anwesenheit von ODN in der SALP-Formulierung einen adaptiven immunogenen Effekt in Bezug auf die Induzierung der Erkennung und der Clearance von Vesikeln, enthaltend Polyethylen-konjugierte Lipide, nach wiederholten Injektionen hat (Sample et al., eingereicht). Die beobachtete Antwort war jedoch unabhängig von der ODN-Sequenz sowie ob ein PS- oder PO-ODN verwendet wurde. Demzufolge erforschten wir den Effekt der ODN-Sequenz und des Rückgrats in den SALP in Bezug auf den induzierten Cytokinlevel. Zwei ODN-Sequenzen wurden verglichen, das c-myc ODN und das nicht oder nur schwach immunstimulatorische ISIS 3082.
Mäuse wurden mit 20 mg/kg SALP c-myc PO ODN (15-mer), SALP ISIS 3082 PO ODN oder freiem ISIS 3082 PO ODN behandelt und Serum IL-6, IL-12, MCP-1 und IFN-γ Level wurden über 7 Tage gemessen. Die Kinetiken der Serumcytokininduktion waren ähnlich zu dem, das vorher beobachtet wurde, mit einer Peak-Expression nach 4 Std. für IL-6, MCP-1 und IL-12 und nach 8 und nach 120 Std. für IFN-γ. Die Serumcytokinkonzentrationen an diesen Zeitpunkten werden in Tabelle 1 zusammen mit Ergebnissen der vorherigen zwei Studien (28 und 29) tabelliert. Serumlevel für IL-6, MCP-1, IL-12 und IFN-γ waren 2–10fach niedriger in Mäusen, die mit SALP ISIS 3082 (PO) im Vergleich zu SALP c-myc PO ODN behandelt wurden. Ein ähnlicher Effekt wird gesehen, wenn die PS-Version der ODNs verglichen werden. SALP c-myc PS ODN induzierte eine 10–2000fach höhere Expression der obigen Cytokine im Vergleich zu SALP, enthaltend ISIS PS ODN.
Effekt der Dosierung auf die Cytokin-Induktion
Um die relativen Level der Cytokin-Induktion, vermittelt durch SALP, zu charakterisieren, führten wir eine Dosistitrationsstudie mit SALP c-myc PS ODN (15-mer), SALP c-myc PO ODN (15-mer), freiem c-myc PS ODN (15-mer) und freiem c-myc PO ODN (15-mer) durch. Mäuse wurden jeweils mit 2–20 oder 10–60 mg/kg des SALP oder freien ODNs injiziert und Serumlevel wurden von IL-6, IL-12, MCP-1 und IFN-γ gemessen. Eine typische Dosistitration für IL-12 gezeigt, deutet an, dass sogar bei 60 mg/kg des freien c-myc PS ODN die IL-6, IL-12, MCP-1 und IFN-γ Level nicht den gleichen Level verglichen zu 5 mg/kg SALP c-myc PS ODN oder SALP c-myc PO ODN erreichten (33).
Die Ergebnisse dieser Experimente veranschaulichen, dass ODN verkapselt in einem Lipidträger eine erhöhte Immunogenizität hat. Die erhöhte Immunogenizität von SALP im Vergleich zu freiem ODN kann teilweise darauf beruhen, dass ODN verstärkt stabil ist und die Bioverteilung von Makrophagen erhöht ist. Das vorher Gesagte kann die beobachtete höhere Cytokinexpression mit verkapseltem c-myc PO ODN im Vergleich zu freiem PO-ODN, welches schnell durch Serumnucleasen degradiert wird, begründen. Mit dem PS-ODN, das verstärkt Nuclease-resistent ist, kann eine erhöhte ODN-Verteilung zu den Makrophagen wahrscheinlich zur verstärkten Immunogenizität des SALP im Vergleich zu freiem PS-ODN beitragen. Verkapselte PO-ODN war ebenfalls immunstimulatorischer als das korrespondierende SALP PS ODN, was vielleicht widerspiegelt, dass die Mustererkennung der Rezeptoren für CpG-Nukleotide, welche erwartet wird, eine stärkere Affinität für natürliche PO-Rückgrate hat.
ISIS 3082 PO ODN, das kein CpG-Sequenzmotiv enthält, stimuliert ebenfalls Cytokinexpression, wenn es in einem SALP verabreicht wird. Es ist unklar, ob der Effekt auf dem ODN (nicht-CpG ODNs können sowohl dendritische Zellen (Jakob et al., 1998) als auch B-Zellen (Davis et al., 1998; Monteith et al., 1997) in vitro stimulieren, es werden jedoch höhere Konzentrationen erforderlich) oder auf der Lipid/ODN-Kombination und nicht einfach dem ODN alleine beruht. Liposomen, enthaltend Proteinantigene, tendieren dazu Th1-Typantworten zu verstärken, wie es entweder bei den Cytokinen (IFN-γ) oder Antikörper-Isotyp (IgG2a) Induktion augenscheinlich wird, sogar wenn das Antigen allein eine Th2-ausgerichtete Antwort hat (Afrin & Ali, 1998; Krishnan et al., 200; Sehra et al., 1998). Auf dem zellulären Level ändern liposomale Proteinpartikel die intrazellulären Austauschmuster sowohl des Lipids und Proteins in APCs, so dass Antigene ebenfalls in den MHC-Klasse-I-Weg eintreten (Rao & Alving, 2000). Sowohl die Th1-biased Antwort als auch Assoziation mit MHC-Klasse-1-Molekülen sind klassische Antworten auf intrazelluläre Pathogene, wie beispielsweise Viren. Ein ähnlicher Effekt kann mit Liposomen, enthaltend PolyNukleinsäuren, auftreten, welche als Viren-ähnliche Partikel erkannt werden können.
Die Induktion von IL-12 durch sowohl freies als auch verkapseltes c-myc PS ODN deutet an, dass eine Th1-Typantwort induziert wird. Ferner wurden IFN-γ, IL-6 und MCP-1 stark hochreguliert, wenn ODNs in einen SALP, verglichen zur freien Form, verabreicht wurde (Tabelle 2). Demzufolge verstärkt SALP in signifikanter Weise eine Immunantwort, aber es scheint, dass sie nicht den Typ oder die Kinetik der Cytokine, die durch ODNs induziert werden, ändern (siehe Zhao et al., 1997; Klinman et al., 1996). Die relative Expression der induzierten Cytokine wird jedoch geändert. Beispielsweise erhöht SALP die IL-12-Expression nur 2–3fach im Vergleich zu freiem c-myc PS ODN, während IFN-γ-Expression tausendfach verstärkt wurde (Tabelle 3). Dies liegt nicht einfach nur an amplifizierten Effekten von IL-12 auf die Downstream-Expression von IFN-γ, da SALP ISIS 3082 einen niedrigeren Level an IL-12 nach 4 Std. im Vergleich zu freiem c-myc PS induzierte, jedoch > 1000fach die Expression von IFN-γ nach 8 Stunden stimulierte.
Von den vier Cytokinen, die in der Antwort auf SALP stark hochreguliert wurden, sind IL-12 und IFN-γ dafür bekannt, wichtig und essentiell in Antitumor-Effekten (Dow et al., 1999) auf CpG ODNs zu sein und Schutz vor infektiösen Agenzien zu bieten (Walker et al., 1999; Krieg et al., 1998; Schwartz et al., 1999; Zimmermann et al., 1998). Es wurde gezeigt, dass die maximale Induktion für IFN-γ bei 8 Std. für DNA/Lipidpartikel ähnlich der Ergebnisse in dieser Studie lag (Dow et al., 1999; Whitmore et al., 1999). SALP PO ODN induzierte ein höheres Level an IFN-γ-Expression als SALP PS ODN zu diesem früheren Zeitpunkt, jedoch wenn wir den Zeitraum über 7 Tage ausdehnten, beobachteten wir eine zweite, breitere IFN-γ-Induktionsphase, die nach ~5 Tagen auftrat (31). Dieser zweite IFN-γ-Peak ist am größten für SALP PS ODN, aber signifikant kleiner für PO ODN-enthaltende SALP, was andeutet, das die Anwesenheit eines intakten ODNs erforderlich ist. Die Abwesenheit einer korrespondierenden hohen Serum IL-12-Expression vor diesem zweiten IFN-γ Peak deutet an, dass das Im munsystem geändert oder geprimt wurde, möglicherweise durch Expansion von NK-Zellen (Bramson et al., 2000) oder Maturation dendritischer Zellen (Lipford, 1998). IFN-γ ist in der Aktivierung von Makrophagen und NK-Zellen, der Inhibierung der Tumor-Angiogenese sowie der Modulierung der adaptiven Immunantwort durch Induktion einer Umschaltung des Antikörperisotyps involviert. IL-12 zusammen mit IFN-γ unterstützen die Th1-Antworten. Dieses Cytokin weist anti-metastatische und anti-angiogene Eigenschaften auf und verursacht eine intensive Tumorinfiltration bei Makrophagen. IL-12 wird ferner in klinischen Versuchen als ein Antikrebsagens verwendet, da es Wachstum inhibieren kann und Regression von immungeneren Tumoren verursacht (Golab & Zagozdzon, 1999).
Die Expression von MCP-1, die durch eine Vielzahl von Zellen, umfassend Endothel- und glatte Muskelzellen, hergestellt werden kann (Graves & Valente, 1991), unterstreicht die Einbeziehung von Monocyten und Makrophagen. Zusätzlich zu ihren chemotaktischen Effekten kann MCP-1 ebenfalls Kontakt-abhängige Tumorzelllyse durch eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen an Makrophagen induzieren (Shinohara et al., 2000). IL-6, das von B-Zellen und Makrophagen in Antwort auf CpG ODNs in vitro (Verweis) freigesetzt wird, ist in der Stimulation von B-Zell-Differentiation und Induktion von akuten Phaseproteinen involviert.
Im Gegensatz zum Unterschied in der Cytokininduktion, die in dieser Studie gesehen wird, wurde eine Abhängigkeit von der ODN-Sequenz und Rückgrat mit SALP vorher nicht beschrieben, wobei für SALP gefunden wurde, dass es Immunwiedererkennung und nachfolgende Clearance von PEG-Lipid enthaltenden Vesikeln induziert. Es kann auf verschiedenen Gründen beruhen. Es ist möglich, dass unterschiedliche Anti-PEG-Antikörpertiter durch die unterschiedlichen ODN-enthaltende SALPs hergestellt wurden, aber es war in den gemessenen Vesikel-Clearanceraten nicht nachweisbar. Alternativ kann die Entwicklung der adaptiven Antwort nicht als sensitiv auf die ODNs im Vergleich zu der initialen immanenten Antwort angesehen werden. Beispielsweise kann das Primingsignal, das zur Unterstützung einer adaptiven Immunantwort benötigt wird, lediglich ein Grenzwertsignal erfordern, um B-Zell-Differentiation und Proliferation zu unterstützen, während das ODN eher einen direkteren Effekt auf Makrophagen hat.

Die hierin berichteten Ergebnisse deuten an, dass Verkapselung von ODNs in einem liposomalen Vesikel, wie beispielsweise SALP, die ODN Immunogenizität stark erhöht, was das Ergebnis einer reinen Antisens-Aktivität sogar mit einem relativ nicht-immunogenen ODN, wie beispielsweise ISIS 3082, verkompliziert. Diese Ergebnisse unterstützen jedoch die mögliche Verwendung von SALP in Immuntherapie. Freie CpG ODNs werden bereits als Adjuvanzien für Protein-basierte Vakzine (Verweis) und als Agenzien zum Schutz vor Infektionen (Verweis) und in der Antikrebstherapie (Verweis) eingesetzt. Der potentielle Nutzen, der mit CpG ODNs gesehen wird, ist ihre Fähigkeit, eine Th1-Bias-adjuvante Antwort zu stimulieren, welche, wie in dieser Studie nachgewiesen, signifikant durch SALP verstärkt werden kann. Der immunstimulatorische Effekt von SALP könnte den Nutzen in der Aktivierung von Tumor-assoziierten Makrophagen, um tumorizidal zu werden, belegen, ein Ansatz, der zurzeit mit an einem anderen Immunmodulator, Muramyldipeptid (Fidler et al., 1997; Worth et al., 1999) verwendet wird. Ferner kann Immunstimulation die toxischen Nebeneffekte von Antikrebswirkstoffen, wie beispielsweise Doxorubicin, durch die Induktion von Cytokinen, die zur Verhinderung von Apoptose normaler Zellen benötigt werden, reduzieren (Killion et al., 1996; Shinohara et al., 1998). Aus einem adjuvanten Gesichtspunkt würden Liposomen das Antigen und CpG ODN co-lokalisieren, ein Effekt, der möglicherweise die humorale Antwort verstärkt. Studien, welche die adjuvanten Qualitäten von SALP mit anderen üblichen Adjuvanzien, wie beispielsweise Monophosphoryllipid A, Aluminiumsalzen und Freund's Adjuvans vergleichen, dauern zurzeit an. Tabelle 2

Vergleich der Serumcytokinlevel, die durch verschiedene ODN-Formulierungen induziert wurden
	IL-6 (pg/ml) 4 Std.	MCP-1 (μg/ml) 4 Std.	IL-12 (μg/ml) 4 Std.	IFN-γ (pg/ml) 8 Std.	IFN-γ (pg/ml) 120 Std.
freie c-myc PS	0 ± 5	2 ± 1	7 ± 2	80 ± 6	130 ± 10
c-myc PO	50 ± 10	0 ± 0	0 ± 1	101 ± 7	47 ± 5
ISIS 3082 PS	0 ± 2	0 ± 0	1 ± 0	43 ± 3	64 ± 2
ISIS 3082 PO	30 ± 10	2 ± 2	1 ± 1	110 ± 10	40 ± 1
SALP c-myc PS	900 ± 200	36 ± 6	12 ± 3	1700 ± 400	2200 ± 400
c-myc PO	3100 ± 600	51 ± 6	36 ± 5	5000 ± 2000	260 ± 40
ISIS 3082 PS	0 ± 3	0 ± 0	2 ± 1	60 ± 10	80 ± 10
ISIS 3082 PO	400 ± 100	7 ± 2	3 ± 2	2300 ± 500	34 ± 2
HBS	60 ± 80	0 ± 0	1 ± 1	100 ± 50	100 ± 50

Die bereitgestellten Beispiele illustrieren bestimmte Ausgestaltungen der Erfindung. In einer allgemeineren Bedeutung jedoch umfasst die Erfindung Zusammensetzungen und Methoden zur Bereitstellung therapeutischer Vorteile für Säugetiersubjekte (umfassend Menschen) unter Verwendung solcher Zusammensetzungen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind in der Form, dass sie ein Lipidmembranvesikel umfassen; und eine Nukleinsäure, die vollständig innerhalb des Vesikels verkapselt ist. Wo Stimulation einer Antwort auf ein bestimmtes Antigen erstrebt wird, kann die Zusammensetzung ebenfalls das Antigen mit dem Vesikel inkorporieren, beispielsweise via einer Assoziation an die äußeren Oberfläche des Vesikels.
Bevorzugte Zusammensetzungen sind solche, in welchen die Nukleinsäure größer als 4 Gew.-% der Zusammensetzung hat.
Die Nukleinsäure in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann geeigneterweise Nukleinsäuren, die nicht-komplementär dem Genom des behandelten Säuger sind, und welche Immunstimulation durch einen Mechanismus bereitstellen, der nicht von einer komplementären Basen-Paarungsinteraktion mit Nukleinsäuren des Säugers abhängen. Solche Nukleinsäuren enthalten häufig eine immunstimulierende Sequenz, wie beispielsweise ein CpG-Motiv oder ein immunstimulierendes Palindrom.
Die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendeten Nukleinsäuren können Nukleinsäuren sein, die keine Immunantwort induzieren, wenn sie in freier Form zu nativen Säugern verabreicht werden, oder welche eine Immunantwort auf eine immunstimulierende Sequenz von Nukleotiden unterdrücken, wenn in freier Form zu nativen Säugern verabreicht.
Die Nukleinsäuren können ausschließlich Phosphodiester-Internukleotidkopplungen haben oder können in einer Weise modifiziert sein, dass sie eine Vielzahl an Phosphodiester-Internukleotidkopplungen in Kombination mit modifizierten Internukleotidkopplungen aufweisen. Die Nukleinsäuren können ebenfalls ausschließlich modifizierte Kopplungen enthalten oder eine Vielzahl an modifizierten Kopplungen. Beispielsweise kann die Nukleinsäure ausschließlich Thiophosphat-Internukleotidkopplungen oder eine Vielzahl an Thiophosphat-Internukleotidkopplungen enthalten.
Das kationische Lipid, das in Formulierung der Zusammensetzung verwendet wird, wird geeigneterweise ausgewählt aus DODAP, DODMA, DMDMA, DOTAP, DC-Chol, DDAB, DODAC, DMRIE, DOSPA und DOGS. Zusätzlich umfasst die Lipidformulierung vorzugsweise eine Aggregations-verhindernde Verbindung, wie beispielsweise ein PEG-Lipid, ein PAO-Lipid oder ein Gangliosid.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in verschiedenen Methoden verwendet werden, um therapeutischen Nutzen für Säuger, umfassend Menschen, durch die Verwendung eines Lipid-Nukleinsäurepartikels, umfassend eine Nukleinsäure, die vollständig in einer Lipidformulierung, umfassend ein kationisches Lipid, verkapselt ist, in der Herstellung eines Medikaments bereitstellen. Demzufolge können die Zusammensetzungen verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Säuger zu induzieren, um B-Zellen in einem Säuger zu aktivieren oder um Neoplasien in einem Säuger mit einer Neoplasie zu behandeln, mittels einer Methode, umfassend die Schritte der Zubereitung eine Lipid-Nukleinsäurepartikels, umfassend eine Nukleinsäure, die vollständig in einer Lipidformulierung verkapselt ist, wobei die Lipidformulierung ein kationisches Lipid umfasst; und Verabreichung des Lipid-Nukleinsäurepartikels an den Säuger
Wenn ein Antigen in der Zusammensetzung umfasst ist, stellt die Erfindung eine Methode zur Induzierung einer Immunantwort auf das Antigen bereit, umfassend die Zubereitung eines Partikel, umfassend ein Lipidmembranvesikel, umfassend eine Nukleinsäure, die vollständig innerhalb des Vesikels verkapselt ist, und ein Antigen, auf das eine Immunantwort gewünscht ist, assoziiert mit einer externen Oberfläche des Vesikels, und Verabreichung der Partikel an das zu behandelnde Säugetiersubjekt.
Eine besondere Anwendung der Erfindung ist die Behandlung von Lymphomen. Demzufolge stellt die Erfindung eine Methode zur Behandlung eines Lymphoms bereit, umfassend Verabreichung an ein Subjekt/Patient mit einem Lymphom eines Oligonukleotids, enthaltend eine Vielzahl an Phosphodiester-Internukleotidkopplungen, vollständig in einem Lipidmembranversikel verkapselt, bei einer Dosis von 0,0075–75 mg/kg Oligonukleotid. In einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung ist das Oligonukleotid 1, das eine immunstimulierende Sequenz enthält.
Wie in den Beispielen oben nachgewiesen, erlaubt die Verwendung eines Lipidträgers in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine wesentlichen Reduktion in der Menge des benötigten Oligonukieotids, um die erwünschte Stimulation des Immunsystems zu erreichen. In manchen Fällen wird dies in der Tat dadurch widergespiegelt, dass ein Oligonukleotid, das keine ersichtliche Aktivität in der freien Form hat, zur Stimulation einer Immunantwort verwendet werden kann, wenn es in Lipid-verkapselter Form bereitgestellt wird. In anderen Fällen wird dies durch den Umstand widergespiegelt, dass die Menge des ODNs, die notwendig ist, um den gleichen Level an Antwort zu erreichen, mit einer niedrigeren Dosierung an ODN erreicht wird. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung in der Durchführung einer Methode zur Verwendung einer effektiven Oligonukleotidmenge, um eine Immunantwort in einem Säuger zu stimulieren, eine Verbesserung dar, umfassend vollständig verkapseltes Oligonukleotid in einem Lipidvesikel und Verabreichung von weniger als 20% der effektiven Oligonukleotidmenge an ein Säugetiersubjekt, wobei eine erwünschte Immunantwort in diesem Säugetiersubjekt erhalten wird.
Sequenzliste

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Oligodeoxynucleotid umfasst, das vollständig in einem Lipidpartikel verkapselt ist, welches ein kationisches Lipid, ein neutrales Lipid und eine Verbindung umfasst, welche eine Aggregation verhindert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Stimulation einer Cytokin Sekretion in einem Säugetier.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodexynucleotid ein nicht-sequenzspezifisches Oligodeoxynucleotid ist.
Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxynucleotid zumindest ein CpG Motiv umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxynucleotid keine detektierbare immunstimulatorische Aktivität in dem Säugetier in Abwesenheit des Lipidpartikels hat.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxinucleotid aus Deoxinucleotidresten besteht, die über Phosphodiester-Brücken verbunden sind.
Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Lipid ausgewählt ist aus DODAP, DODMA, DMDMA, DOTAP, DC-Chol, DDAB, DODAC, DMRIE, DOSPA und DOGS.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung, welche die Aggregation verhindert, ein Lipid ist, das eine austauschbare sterische Barriere bildet.
Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid, das die sterische Barriere bildet, ein PEG-Lipid oder ein PAO-Lipid ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das neutrale Lipid DSPC oder Cholesterol ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxynucleotid und die Lipidkomponenten des Partikels in einem Gewichtsverhältnis von 0,001 bis 0,45 vorliegen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipidpartikel einen mittleren Durchmesser von 50 bis 200 Nanometer haben.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung weiter ein Antigenmolekül umfasst, das ausgewählt ist aus Polypeptiden umfassend zumindest ein Epitop eines Targetantigens und Nucleinsäuren, die zumindest ein Epitop des Targetantigens kodieren, und dass die Zusammensetzung zur Herstellung einer Medizin zur Stimulierung einer Cytokin Sekretion und zur Immunantwort auf das Targetantigen verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen-Molekül mit dem Lipidpartikel assoziiert ist.
Zusammensetzung zur Stimulierung einer Cytokin Sekretion und/oder einer Imunantwort in einem Säugetier, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung ein Oligodeoxynucleotid umfasst, das vollständig in einem Lipidpartikel verkapselt ist, wobei das Lipidpartikel ein kationisches Lipid, ein neutrales Lipid und eine Verbindung umfasst, die Aggregation verhindert, wobei das Oligodeoxynucletid ein nicht-sequenzspezifisches Oligonucleotid ist und/oder wobei die Zusammensetzung weiter ein Antigen-Molekül umfasst, das ausgewählt ist aus Polypeptiden, die zumindest ein Epitop eines Targetantigens des Säugetiers und Nucleinsäuren, die zumindest ein Epitop des Targetantigens kodieren, umfassen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxynucleotid zumindest ein CpG-Motiv umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxynucleotid aus Deoxynucleo-tidresten besteht, die durch Phosphodiester- Brücken verbunden sind.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 , dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Lipid ausgewählt ist aus DODAP, DODMA, DMDMA, DOTAP, DC-Chol, DDAB, DODAC, DMRIE, DOSPA und DOGS.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung, welche die Aggregation verhindert, ein Lipid ist, das eine austauschbare sterische Barriere bildet.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid, das eine austauschbare sterische Barriere bildet, ein PEG-Lipid oder ein PAO-Lipid ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das neutrale Lipid DSPC und/oder Cholesterol ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxynucleotid und die Lipidkomponenten des Partikels in einem Gewichtsverhältnis von 0,001 bis 0,45 vorhanden sind.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 50 bis 200 Nanometern haben.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen-Molekül mit dem Lipidpartikel assoziiert ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligodeoxynucleotid keine detektierbare immunstimulatorische Aktivität in dem Säugetier in Abwesenheit des Lipidpartikels hat.