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CN109863170A - 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子 - Google Patents

具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体以及其他含Fc结构域分子。

Description

具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc 结构域分子
序列表
本专利申请包含经由EFS-Web提交的序列表，其全部内容全文以引用方式并入本文。2017年6月26日创建的ASCII文本文件命名为JBI5094WOPCT_ST25.txt，并且大小为205千字节。
技术领域
本发明涉及具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体以及其他含Fc结构域分子。
背景技术
对适于实现期望治疗反应目的的抗体及其他含Fc结构域分子工程化包括用于调节例如抗体效应子功能、半衰期和稳定性的Fc结构域工程化方法。此外，对于某些类型的分子，诸如结合肿瘤坏死因子(TNFR)超家族成员的抗体，工程化方法已被开发成用于诱导激动作用以刺激其抗肿瘤免疫效应。
需要附加的工程化方法来调节抗体及其他含有Fc结构域的治疗性构建体的Fc结构域介导的功能。
发明内容
本发明提供一种分离的工程化抗肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员抗体，其中当相比于亲本野生型抗体时，所述抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
本发明还提供一种包含T437R突变的分离的工程化抗TNFR超家族成员抗体。
本发明还提供一种包含T437R/K248E突变的分离的工程化抗TNFR超家族成员抗体。
本发明还提供一种包含T437R/K338A突变的分离的工程化抗TNFR超家族成员抗体。
本发明还提供一种包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还提供一种增强受试者中抗TNFR超家族成员抗体的激动活性的方法，所述方法包括提供抗TNFR超家族成员抗体；将T437R突变、K248E突变、K338A突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变引入该抗体中，以生成特异性结合TNFR超家族成员的工程化抗体；以及将工程化抗体施用于受试者。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将特异性结合TNFR超家族成员的抗体施用于受试者足以治疗癌症的时间，当相比于亲本野生型抗体时，所述特异性结合TNFR超家族成员的抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
本发明还提供一种在Fc结构域中包含T437R突变的分离的含Fc结构域分子。
本发明还提供一种在Fc结构域中包含K338A突变的分离的含Fc结构域分子。
本发明还提供一种在Fc结构域中包含T437R/K248E突变的分离的含Fc结构域分子。
本发明还提供一种在Fc结构域中包含T437R/K338A突变的分离的含Fc结构域分子。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码在Fc结构域中包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变的含Fc结构域分子。
本发明还提供一种编码SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的Fc结构域的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种包含SEQ ID NO:75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或86的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明还提供一种包含本发明的多核苷酸的分离的载体。
本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明还提供一种制备本发明的含Fc结构域分子的方法，所述方法包括在其中表达含Fc结构域分子的条件中培养本发明的宿主细胞，并且分离含Fc结构域分子。
本发明还提供一种分离的抗肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员抗体在治疗癌症中的用途，当相比于亲本野生型抗体时，超家族成员抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
本发明还提供一种分离的抗肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员抗体在制造用于治疗癌症的药剂中的用途，该抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
附图说明
图1示出在与指示出相应CH2结构域碰撞的多聚体模型内的CH3结构域的对准之后，来源于人IgG1Fc(蛋白质数据库入口(Protein Data Bank entry)3AVE)的晶体结构的两个半部Fc分子(黑色和浅灰色)。
图2A示出单独突变的抗体OX4020E5IgG1K248E、OX4020E5IgG1T437R、OX4020E5IgG1K338A在溶液中的激动活性，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图2B示出单独突变的抗体OX4020E5IgG1K248E、OX4020E5IgG1T437R、OX4020E5IgG1K338A与Daudi细胞交联时的激动活性，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图2C示出双突变抗体OX4020E5IgG1T437R/K248E、OX4020E5IgG1T437R/K338A和OX4020E5IgG1K248E/K338A相对于OX4020E5IgG1T437R和OX4020E5IgG1在溶液中的激动活性，激动作用估计为相对于OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图2D示出，在与Daudi细胞交联时，OX4020E5IgG1T437R/K248E的激动活性有所增强，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图2E示出，在与Daudi细胞交联时，OX4020E5IgG1T437R/K338A的激动活性有所增强，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图2F示出，在与Daudi细胞交联时，OX4020E5IgG1的激动活性有所增强，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图2G示出，在与Daudi细胞交联时，OX4020E5IgG1T437R的激动活性有所增强，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图3A示出OX40SF2IgG1T437R、OX40SF2IgG1T437R/K248E、OX40SF2IgG1T437R/K338A和OX40SF2IgG1在溶液中的激动活性，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图3B示出，在与Daudi细胞交联时，OX40SF2IgG1T437R的激动活性有所增强，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图3C示出，在与Daudi细胞交联时，OX40SF2IgG1T437R/K248E的激动活性有所增强，激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图4A示出，OX40SF2IgG1T437R的激动活性通过以FcγRIIB依赖性方式交联而进一步增强。该增强被抗FcγRIIB抗体2B6阻断。激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图4B示出，OX40SF2IgG1T437R/K248E的激动活性通过以FcγRIIB依赖性方式交联而进一步增强。该增强被抗FcγRIIB抗体2B6阻断。激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图5示出OX40SF2IgG1、OX40SF2IgG1E345R、OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E的获自NanoBRETTM PPI测定的校正生物发光共振能量转移(BRET)比，表示在表达OX40的细胞表面的抗体多聚化程度。OX40SF2IgG1T437R/K248E和OX40SF2IgG1E345R示出10ng/mL至1000ng/mL范围浓度内提高的校正NanoBRET比，指示出细胞表面的抗体结合。OX40SF2IgG1和OX40SF2IgG1T437R的校正NanoBRET比处于背景水平。n＝缀合于Nanoluc的抗体。h＝缀合于Halotag的抗体。
图6示出，T437R/K248E突变挽救Fc沉默抗体OX40SF2IgG2sigma和OX40SF2IgG4PAA上的激动作用。激动作用估计为相对于1μg/mL OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。
图7示出，当相比于OX40SF2IgG1时，OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E介导ADCC具有提高的效能。Y轴指示相对于不含抗体的样品，ADCC活性的激活倍数。
图8示出，当相比于OX40SF2IgG1时，OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E以相当的水平介导ADCP。Y轴指示所杀伤细胞的百分比(％)。
图9A示出，当相比于OX40SF2IgG1时，OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E具有增强的CDC。Y轴指示细胞毒性百分比(％)。
图9B示出，当相比于OX40SF2IgG2sigma时，OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E介导ADCP具有提高的效能。Y轴指示杀伤的细胞百分比(％)。
图10示出给予所示抗体的Tg32半合子小鼠的PK特征。数据归一化为曲线的线性(β)期的第一时间，并且表示为2mg/kg体重的推注剂量之后剂量的最大浓度％。3组的第14天和第21天的血清浓度由于水平低于可检出范围而未示出。各数据点表示每组5只动物的平均值±标准误差。
图11示出给予所示抗体的Tg32纯合SCID小鼠的PK特征。半衰期值t1/2如下估计：OX40SF2IgG1T437R，t1/2＝9.5±0.7天；OX40SF2IgG1T437R/K248E，t1/2＝8.3±0.5天；OX40SF2IgG1，t1/2＝9.2±0.6天。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
“抗肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员抗体”或“抗TNFR超家族成员抗体”是指特异性结合TNFR超家族成员的抗体。
“TNFR超家族成员”包括属于TNFR超家族的受体，包括表1中所示的受体，包括TNFR的天然存在的变体。TNFR通常表示为I型跨膜蛋白并且在其胞外结构域中包含一至六个富半胱氨酸结构域。信号转导作为TNFR三聚物发生。每者TNFR的一种同种型的氨基酸序列示于表1。特定TNFR的配体也示于表1。
表1：
SEQ ID NO:1
MGLSTVPDLLLPLVLLELLVGIYPSGVIGLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIENVKGTEDSGTTVLLPLVIFFGLCLLSLLFIGLMYRYQRWKSKLYSIVCGKSTPEKEGELEGTTTKPLAPNPSFSPTPGFTPTLGFSPVPSSTFTSSSTYTPGDCPNFAAPRREVAPPYQGADPILATALASDPIPNPLQKWEDSAHKPQSLDTDDPATLYAVVENVPPLRWKEFVRRLGLSDHEIDRLELQNGRCLREAQYSMLATWRRRTPRREATLELLGRVLRDMDLLGCLEDIEEALCGPAALPPAPSLLR
SEQ ID NO:2
MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDFALPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQREAKVPHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS
SEQ ID NO:3
MLGLRPPLLALVGLLSLGCVLSQECTKFKVSSCRECIESGPGCTWCQKLNFTGPGDPDSIRCDTRPQLLMRGCAADDIMDPTSLAETQEDHNGGQKQLSPQKVTLYLRPGQAAAFNVTFRRAKGYPIDLYYLMDLSYSMLDDLRNVKKLGGDLLRALNEITESGRIGFGSFVDKTVLPFVNTHPDKLRNPCPNKEKECQPPFAFRHVLKLTNNSNQFQTEVGKQLISGNLDAPEGGLDAMMQVAACPEEIGWRNVTRLLVFATDDGFHFAGDGKLGAILTPNDGRCHLEDNLYKRSNEFDYPSVGQLAHKLAENNIQPIFAVTSRMVKTYEKLTEIIPKSAVGELSEDSSNVVQLIKNAYNKLSSRVFLDHNALPDTLKVTYDSFCSNGVTHRNQPRGDCDGVQINVPITFQVKVTATECIQEQSFVIRALGFTDIVTVQVLPQCECRCRDQSRDRSLCHGKGFLECGICRCDTGYIGKNCECQTQGRSSQELEGSCRKDNNSIICSGLGDCVCGQCLCHTSDVPGKLIYGQYCECDTINCERYNGQVCGGPGRGLCFCGKCRCHPGFEGSACQCERTTEGCLNPRRVECSGRGRCRCNVCECHSGYQLPLCQECPGCPSPCGKYISCAECLKFEKGPFGKNCSAACPGLQLSNNPVKGRTCKERDSEGCWVAYTLEQQDGMDRYLIYVDESRECVAGPNIAAIVGGTVAGIVLIGILLL
VIWKALIHLSDLREYRRFEKEKLKSQWNNDNPLFKSATTTVMNPKFAES
SEQ ID NO:4
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:5
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
SEQ ID NO:6
MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKTCRKHRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLSKYITTIAGVMTLSQVKGFVRKNGVNEAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKKANLCTLAEKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV
SEQ ID NO:7
MRALEGPGLSLLCLVLALPALLPVPAVRGVAETPTYPWRDAETGERLVRLLQALRVARMPGLERSVRERFLPVH
SEQ ID NO:8
MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
SEQ ID NO:9
MRVLLAALGLLFLGALRAFPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGKSEQ IDNO:10
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:11
MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRIEPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVVGVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHPGACNRCTEGVGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMCRKCSRGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHNIWVILVVTLVVPLLLVAVLIVCCCIGSGCGGDPKCMDRVCFWRLGLLRGPGAEDNAHNEILSNADSLSTFVSEQQMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEAEGSQRRRLLVPANGADPTETLMLFFDKFANIVPFDSWDQLMRQLDLTKNEIDVVRAGTAGPGDALYAMLMKWVNKTGRNASIHTLLDALERMEERHAREKIQDLLVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE
SEQ ID NO:12
MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGPRVPKTLVLVVAAVLLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCISCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFREEDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGTKHSGEVPAVEETVTSSPGTPASPCSLSGIIIGVTVAAVVLIVAVFVCKSLLWKKVLPYLKGICSGGGGDPERVDRSSQRPGAEDNVLNEIVSILQPTQVPEQEMEVQEPAEPTGVNMLSPGESEHLLEPAEAERSQRRRLLVPANEGDPTETLRQCFDDFADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLYTMLIKWVNKTGRDASVHTLLDALETLGERLAKQKIEDHLLSSGKFMYLEGNADSAMS
SEQ ID NO:13
MARIPKTLKFVVVIVAVLLPVLAYSATTARQEEVPQQTVAPQQQRHSFKGEECPAGSHRSEHTGACNPCTEGVDYTNASNNEPSCFPCTVCKSDQKHKSSCTMTRDTVCQCKEGTFRNENSPEMCRKCSRCPSGEVQVSNCTSWDDIQCVEEFGANATVETPAAEETMNTSPGTPAPAAEETMNTSPGTPAPAAEETMTTSPGTPAPAAEETMTTSPGTPAPAAEETMITSPGTPASSHYLSCTIVGIIVLIVLLIVFV
SEQ ID NO:14
MGLWGQSVPTASSARAGRYPGARTASGTRPWLLDPKILKFVVFIVAVLLPVRVDSATIPRQDEVPQQTVAPQQQRRSLKEEECPAGSHRSEYTGACNPCTEGVDYTIASNNLPSCLLCTVCKSGQTNKSSCTTTRDTVCQCEKGSFQDKNSPEMCRTCRTGCPRGMVKVSNCTPRSDIKCKNESAASSTGKTPAAEETVTTILGMLASPYHYLIIIVVLVIILAVVVVGFSCRKKFISYLKGICSGGGGGPERVHRVLFRRRSCPSRVPGAEDNARNETLSNRYLQPTQVSEQEIQGQELAELTGVTVESPEEPQRLLEQAEAEGCQRRRLLVPVNDADSADISTLLDASATLEEGHAKETIQDQLVGSEKLFYEEDEAGSATSCL
SEQ ID NO:15
MAPRARRRRPLFALLLLCALLARLQVALQIAPPCTSEKHYEHLGRCCNKCEPGKYMSSKCTTTSDSVCLPCGPDEYLDSWNEEDKCLLHKVCDTGKALVAVVAGNSTTPRRCACTAGYHWSQDCECCRRNTECAPGLGAQHPLQLNKDTVCKPCLAGYFSDAFSSTDKCRPWTNCTFLGKRVEHHGTEKSDAVCSSSLPARKPPNEPHVYLPGLIILLLFASVALVAAIIFGVCYRKKGKALTANLWHWINEACGRLSGDKESSGDSCVSTHTANFGQQGACEGVLLLTLEEKTFPEDMCYPDQGGVCQGTCVGGGPYAQGEDARMLSLVSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMSSENYLQKEVDSGHCPHWAASPSPNWADVCTGCRNPPGEDCEPLVGSPKRGPLPQCAYGMGLPPEEEASRTEARDQPEDGADGRLPSSARAGAGSGSSPGGQSPASGNVTGNSNSTFISSGQVMNFKGDIIVVYVSQTSQEGAAAAAEPMGRPVQEETLARRDSFAGNGPRFPDPCGGPEGLREPEKASRPVQEQGGAKA
SEQ ID NO:16
MNNLLCCALVFLDISIKWTTQETFPPKYLHYDEETSHQLLCDKCPPGTYLKQHCTAKWKTVCAPCPDHYYTDSWHTSDECLYCSPVCKELQYVKQECNRTHNRVCECKEGRYLEIEFCLKHRSCPPGFGVVQAGTPERNTVCKRCPDGFFSNETSSKAPCRKHTNCSVFGLLLTQKGNATHDNICSGNSESTQKCGIDVTLCEEAFFRFAVPTKFTPNWLSVLVDNLPGTKVNAESVERIKRQHSSQEQTFQLLKLWKHQNKDQDIVKKIIQDIDLCENSVQRHIGHANLTFEQLRSLMESLPGKKVGAEDIEKTIKACKPSDQILKLLSLWRIKNGDQDTLKGLMHALKHSKTYHFPKTVTQSLKKTIRFLHSFTMYKLYQKLFLEMIGNQVQSVKISCL
SEQ ID NO:17
MARGSLRRLLRLLVLGLWLALLRSVAGEQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAAAPPAPFRLLWPILGGALSLTFVLGLLSGFLVWRRCRRREKFTTPIEETGGEGCPAVALIQ
SEQ ID NO:18
MSGLGRSRRGGRSRVDQEERFPQGLWTGVAMRSCPEEQYWDPLLGTCMSCKTICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASICGQHPKQCAYFCENKLRSPVNLPPELRRQRSGEVENNSDNSGRYQGLEHRGSEASPALPGLKLSADQVALVYSTLGLCLCAVLCCFLVAVACFLKKRGDPCSCQPRSRPRQSPAKSSQDHAMEAGSPVSTSPEPVETCSFCFPECRAPTQESAVTPGTPDPTCAGRWGCHTRTTVLQPCPHIPDSGLGIVCVPAQEGGPGASEQID NO:19
MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDGDKDAPEPLDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTAGPEQQ
SEQ ID NO:20
MEPPGDWGPPPWRSTPKTDVLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDEYPVGSECCPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSKCLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCGCSPGHFCIVQDGDHCAACRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQHQTKCSWLVTKAGAGTSSSHWVWWFLSGSLVIVIVCSTVGLIICVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH
SEQ ID NO:21
MGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNSCKQNKQGANSRPVNQTPPPEGEKLHSDSGISVDSQSLHDQQPHTQTASGQALKGDGGLYSSLPPAKREEVEKLLNGSAGDTWRHLAGELGYQPEHIDSFTHEACPVRALLASWATQDSATLDALLAALRRIQRADLVESLCSESTATSPV
SEQ ID NO:22
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR
SEQ ID NO:23
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWVSEQ ID NO:24
MALKVLLEQEKTFFTLLVLLGYLSCKVTCESGDCRQQEFRDRSGNCVPCNQCGPGMELSKECGFGYGEDAQCVTCRLHRFKEDWGFQKCKPCLDCAVVNRFQKANCSATSDAICGDCLPGFYRKTKLVGFQDMECVPCGDPPPPYEPHCASKVNLVKIASTASSPRDTALAAVICSALATVLLALLILCVIYCKRQFMEKKPSWSLRSQDIQYNGSELSCFDRPQLHEYAHRACCQCRRDSVQTCGPVRLLPSMCCEEACSPNPATLGCGVHSAASLQARNAGPAGEMVPTFFGSLTQSICGEFSDAWPLMQNPMGGDNISFCDSYPELTGEDIHSLNPELESSTSLDSNSSQDLVGGAVPVQSHSENFTAATDLSRYNNTLVESASTQDALTMRSQLDQESGAVIHPATQTSLQVRQRLGSL
SEQ ID NO:25
MGTSPSSSTALASCSRIARRATATMIAGSLLLLGFLSTTTAQPEQKASNLIGTYRHVDRATGQVLTCDKCPAGTYVSEHCTNTSLRVCSSCPVGTFTRHENGIEKCHDCSQPCPWPMIEKLPCAALTDRECTCPPGMFQSNATCAPHTVCPVGWGVRKKGTETEDVRCKQCARGTFSDVPSSVMKCKAYTDCLSQNLVVIKPGTKETDNVCGTLPSFSSSTSPSPGTAIFPRPEHMETHEVPSSTYVPKGMNSTESNSSASVRPKVLSSIQEGTVPDNTSSARGKEDVNKTLPNLQVVNHQQGPHHRHILKLLPSMEATGGEKSSTPIKGPKRGHPRQNLHKHFDINEHLPWMIVLFLLLVLVVIVVCSIRKSSRTLKKGPRQDPSAIVEKAGLKKSMTPTQNREKWIYYCNGHGIDILKLVAAQVGSQWKDIYQFLCNASEREVAAFSNGYTADHERAYAALQHWTIRGPEASLAQLISALRQHRRNDVVEKIRGLMEDTTQLETDKLALPMSPSPLSPSPIPSPNAKLENSALLTVEPSPQDKNKGFFVDESEPLLRCDSTSSGSSALSRNGSFITKEKKDTVLRQVRLDPCDLQPIFDDMLHFLNPEELRVIEEIPQAEDKLDRLFEIIGVKSQEASQTLLDSVYSHLPDLL
SEQ ID NO:26
MEQRPRGCAAVAAALLLVLLGARAQGGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLVCPQDTFLAWENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECQVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMFWVQVLLAGLVVPLLLGATLTYTYRHCWPHKPLVTADEAGMEALTPPPATHLSPLDSAHTLLAPPDSSEKICTVQLVGNSWTPGYPETQEALCPQVTWSWDQLPSRALGPAAAPTLSPESPAGSPAMMLQPGPQLYDVMDAVPARRWKEFVRTLGLREAEIEAVEVEIGRFRDQQYEMLKRWRQQQPAGLGAVYAALERMGLDGCVEDLRSRLQRGP
SEQ ID NO:27
MDCQENEYWDQWGRCVTCQRCGPGQELSKDCGYGEGGDAYCTACPPRRYKSSWGHHRCQSCITCAVINRVQKVNCTATSNAVCGDCLPRFYRKTRIGGLQDQECIPCTKQTPTSEVQCAFQLSLVEADTPTVPPQEATLVALVSSLLVVFTLAFLGLFFLYCKQFFNRHCQRGGLLQFEADKTAKEESLFPVPPSKETSAESQVSENIFQTQPLNPILEDDCSSTSGFPTQESFTMASCTSESHSHWVHSPIECTELDLQKFSSSASYTGAETLGGNTVESTGDRLELNVPFEVPSP
SEQ ID NO:28
MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
SEQ ID NO:29
MGALGLEGRGGRLQGRGSLLLAVAGATSLVTLLLAVPITVLAVLALVPQDQGGLVTETADPGAQAQQGLGFQKLPEEEPETDLSPGLPAAHLIGAPLKGQGLGWETTKEQAFLTSGTQFSDAEGLALPQDGLYYLYCLVGYRGRAPPGGGDPQGRSVTLRSSLYRAGGAYGPGTPELLLEGAETVTPVLDPARRQGYGPLWYTSVGFGGLVQLRRGERVYVNISHPDMVDFARGKTFFGAVMVG
SEQ ID NO:30
MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
SEQ ID NO:31
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
SEQ ID NO:32
MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQRRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVAHLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL
SEQ ID NO:33
MEESVVRPSVFVVDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGLGLLLLLMGAGLAVQGWFLLQLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV
SEQ ID NO:34
MAEDLGLSFGETASVEMLPEHGSCRPKARSSSARWALTCCLVLLPFLAGLTTYLLVSQLRAQGEACVQFQALKGQEFAPSHQQVYAPLRADGDKPRAHLTVVRQTPTQHFKNQFPALHWEHELGLAFTKNRMNYTNKFLLIPESGDYFIYSQVTFRGMTSECSEIRQAGRPNKPDSITVVITKVTDSYPEPTQLLMGTKSVCEVGSNWFQPIYLGAMFSLQEGDKLMVNVSDISLVDYTKEDKTFFGAFLL
SEQ ID NO:35
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP
SEQ ID NO:36
MPKRSCPFADVAPLQLKVRVSQRELSRGVCAERYSQEVFEKTKRLLFLGAQAYLDHVWDEGCAVVHLPESPKPGPTGAPRAARGQMLIGPDGRLIRSLGQASEADPSGVASIACSSCVRAVDGKAVCGQCERALCGQCVRTCWGCGSVACTLCGLVDCSDMYEKVLCTSCAMFET
SEQ ID NO:37
MDPGLQQALNGMAPPGDTAMHVPAGSVASHLGTTSRSYFYLTTATLALCLVFTVATIMVLVVQRTDSIPNSPDNVPLKGGNCSEDLLCILKRAPFKKSWAYLQVAKHLNKTKLSWNKDGILHGVRYQDGNLVIQFPGLYFIICQLQFLVQCPNNSVDLKLELLINKHIKKQALVTVCESGMQTKHVYQNLSQFLLDYLQVNTTISVNVDTFQYIDTSTFPLENVLSIFLYSNSD
SEQ ID NO:38
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
SEQ ID NO:39
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
SEQ ID NO:40
MRRASRDYTKYLRGSEEMGGGPGAPHEGPLHAPPPPAPHQPPAASRSMFVALLGLGLGQVVCSVALFFYFRAQMDPNRISEDGTHCIYRILRLHENADFQDTTLESQDTKLIPDSCRRIKQAFQGAVQKELQHIVGSQHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDID
SEQ ID NO:41
MAARRSQRRRGRRGEPGTALLVPLALGLGLALACLGLLLAVVSLGSRASLSAQEPAQEELVAEEDQDPSELNPQTEESQDPAPFLNRLVRPRRSAPKGRKTRARRAIAAHYEVHPRPGQDGAQAGVDGTVSGWEEARINSSSPLRYNRQIGEFIVTRAGLYYLYCQVHFDEGKAVYLKLDLLVDGVLALRCLEEFSATAASSLGPQLRLCQVSGLLALRPGSSLRIRTLPWAHLKAAPFLTYFGLFQVH
SEQ ID NO:42
MPASSPFLLAPKGPPGNMGGPVREPALSVALWLSWGAALGAVACAMALLTQQTELQSLRREVSRLQGTGGPSQNGEGYPWQSLPEQSSDALEAWENGERSRKRRAVLTQKQKKQHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID NO:43
MDDSTEREQSRLTSCLKKREEMKLKECVSILPRKESPSVRSSKDGKLLAATLLLALLSCCLTVVSFYQVAALQGDLASLRAELQGHHAEKLPAGAGAPKAGLEEAPAVTAGLKIFEPPAPGEGNSSQNSRNKRAVQGPEETVTQDCLQLIADSETPTIQKGSYTFVPWLLSFKRGSALEEKENKILVKETGYFFIYGQVLYTDKTYAMGHLIQRKKVHVFGDELSLVTLFRCIQNMPETLPNNSCYSAGIAKLEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFGALKLL
SEQ ID NO:44
MESMAVATDGGERPGVPAGSGLSASQRRAELRRRKLLMNSEQRINRIMGFHRPGSGAEEESQTKSKQQDSDKLNSLSVPSVSKRVVLGDSVSTGTTDQQGGVAEVKGTQLGDKLDSFIKPPECSSDVNLELRQRNRGDLTADSVQRGSRHGLEQYLSRFEEAMKLRKQLISEKPSQEDGNTTEEFDSFRIFRLVGCALLALGVRAFVCKYLSIFAPFLTLQLAYMGLYKYFPKSEKKIKTTVLTAALLLSGIPAEVINRSMDTYSKMGEVFTDLCVYFFTFIFCHELLDYWGSEVP
SEQ ID NO:45
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA
SEQ ID NO:46
MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
SEQ ID NO:47
MSILFYVIFLAYLRGIQGNNMDQRSLPEDSLNSLIIKLIQADILKNKLSKQMVDVKENYQSTLPKAEAPREPERGGPAKSAFQPVIAMDTELLRQQRRYNSPRVLLSDSTPLEPPPLYLMEDYVGSPVVANRTSRRKRYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRT
SEQ ID NO:48
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
SEQ ID NO:49
GHTANKPCLAKFELLTSKWQMTSRKPPCVNSLPEGKLKILQDGLYLIYGQVAPSTAYKGVAPFAVQLRKNEAMLQTLTSNSTIYDVGGTYEFHAGDIIDLIFDDEHQVLKNNTYWGIVLLANLFIS
SEQ ID NO:50
MGYPEVERRELLPAAAPRERGSQGCGCGGAPARAGEGNSCLLFLGFFGLSLALHLLTLCCYLELRSELRRERGAESRLGGSGTPGTSGTLSSLGGLDPDSPITSHLGQPSPKQQPLEPGEAALHSDSQDGHQMALLNFFFPDEKPYSEEESRRVRRNKRSKSNEGADGPVKNKKKGKKAGPPGPNGPPGPPGPPGPQGPPGIPGIPGIPGTTVMGPPGPPGPPGPQGPPGLQGPSGAADKAGTRENQPAVVHLQGQGSAIQVKNDLSGGVLNDWSRITMNPKVFKLHPRSGELEVLVDGTYFIYSQVYYINFTDFASYEVVVDEKPFLQCTRSIETGKTNYNTCYTAGVCLLKARQKIAVKMVHADISINMSKHTTFFGAIRLGEAPAS
“特异性结合”或“特异性地结合”或“结合”是指抗TNFR超家族成员抗体以比针对其他抗原更高的亲和力结合特定TNFR超家族成员或特定TNFR超家族成员内的表位。通常，当结合的平衡解离常数(KD)为约1×10-8M或更小，例如约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小、或者约1×10-12M或更小时(通常该KD为该抗体结合至非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)的KD的至少百分之一)，抗体“特异性结合”。可使用标准程序来测量KD。然而，特异性结合特定TNFR超家族成员或特定TNFR超家族成员内的表位的抗TNFR超家族成员抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee,chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(common marmoset,marmoset))的相同抗原具有交叉反应性。虽然单特异性抗体特异性结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体特异性结合两个不同的抗原或两个不同的表位。
“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗体片段，双特异性或多特异性抗体，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体分子”包含由二硫键互连的两条重链(HC)与两条轻链(LC)以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链均由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。VH和VL区可进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，间插有框架区(FR)。各个VH和VL由三个CDR和四个FR片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
“互补决定区(CDR)”为抗体中的“抗原结合位点”。使用不同术语来定义CDR：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu等人(1970)J Exp Med 132:211-50)(Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)的“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的在结构上高变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia等人(1987)J Mol Biol 196:901-17)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描绘(delineation)之间的对应性在(Lefranc等人(2003)Dev Comp Immunol 27:55-77)中有所描述。除非另有明确地说明，本文所用的术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括由任何上述方法(Kabat、Chothia或IMGT)定义的CDR。
免疫球蛋白可根据重链恒定区氨基酸序列被指定为五种主要种类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。基于其恒定区的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
“抗体片段”是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重链抗原结合位点和/或轻链抗原结合位点，诸如重链互补决定区(HCDR)1、2和3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和3，重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH结构域或一个VL结构域组成的结构域抗体(dAb)。VH和VL域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在VH和VL域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，VH/VL域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双价抗体；例如在国际专利公布WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中有所描述。
“单克隆抗体”是指在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成的抗体群，除了可能的熟知改变诸如从抗体重链中除去C末端赖氨酸，或者归因于氨基酸的翻译后修饰的改变诸如甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺之外。单克隆抗体通常特异性结合一个抗原表位，而双特异性或多特异性单克隆抗体特异性结合两个或更多个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，或者是单价的、二价的或多价的。术语“单克隆抗体”中包括双特异性抗体。
“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或抗体片段(例如，抗TNFR超家族成员抗体基本上不含特异性结合抗TNFR超家族成员之外的抗原的抗体)。“分离抗体”涵盖分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点均来源于人起源的序列并且被最优化成在施用于人受试者时具有最小限度的免疫应答。如果抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人起源的序列。
如果人抗体的可变区来源于使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区或轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。在与人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因进行比较时，“人抗体”可包含由于用来获得抗体的系统和人免疫球蛋白基因座之间的差异，引入体细胞突变或者在框架或抗原结合位点中特意引入置换或两者所引起的氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含源于人框架序列分析的共有框架序列，例如(Knappik等人(2000)JMol Biol 296:57-86)中所述；或结合到噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3，例如(Shi等人(2010)J Mol Biol 397:385-96)和国际专利公布No.WO2009/085462中所述。
来源于人免疫球蛋白序列的人抗体可使用系统诸如噬菌体展示结合合成的CDR和/或合成的框架来生成，或者可对其进行体外诱变以改善抗体特性，从而得到不由体内整套人抗体种系表达的抗体。
“人抗体”的定义中不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
“重组体”是指以重组手段制备、表达、创建或分离的抗体及其它蛋白质。
“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。抗体“表位”取决于用来鉴定表位的方法。
“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus,cyno)、黑猩猩(Pantroglodytes)(chimpanzee,chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(common marmoset,marmoset))的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个抗原之间所共享的表位。
“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或同一抗原内的两个或更多个不同表位的抗体。
“载体”是指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有元件诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记物，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统，例如细胞、病毒、动物、植物、以及利用能够复制载体的生物组分的重组生物系统中的复制或保持。载体多核苷酸可为单链或双链DNA或RNA分子、cDNA或这些分子的杂合分子。
“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
“多核苷酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其它等同共价化学物的合成分子。cDNA是合成多核苷酸的典型示例。
“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其它地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。
“价”是指在分子中存在对于抗原为特异性的结合位点的指定数目。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别是指在分子中存在对于抗原为特异性的一个、两个、四个和六个结合位点。
“激动剂”是指诱导抗体所结合的TNFR超家族成员的至少一种生物活性的抗体，所述生物活性是由TNFR超家族成员的天然配体诱导产生的。示例性激动活性包括体外测定中NFκB-诱导型启动子的控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)产生的诱导；由DC上提高的CD80、CD83、CD86和HLA-DR表面表达所评估的树突状细胞(DC)分化的诱导；由B细胞增殖或B细胞上提高的CD23、CD80、CD83、CD86和HLA-DR表面表达所评估的B细胞的活化；由通过从先前暴露于抗原的患者分离的PBMC产生的干扰素-γ(IFN-γ)所评估的抗原特异性T细胞回忆应答的诱导；以及CD4+或CD8+T细胞增殖的诱导。激动活性(例如激动作用)可为交联依赖性或不依赖于抗体交联。
“增强的激动活性”或“增强的激动作用”是指当通过抗TNFR超家族成员抗体诱导NFκB-诱导型启动子的控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)产生来测量激动活性时，当相比于亲本野生型抗体时，工程化抗TNFR超家族成员抗体激动作用有所改善。当工程化抗体在1μg/mL抗体浓度下按交联依赖性或非依赖性方式以相比于野生型亲本抗体时高至少20％的水平诱导SEAP产生时，其具有“增强的激动活性”。
“交联”是指通过结合FcγR(例如FcγRIIB顺式或反式)的抗体诱导，抗TNFR超家族成员抗体在表达TNFR超家族成员的细胞上高级多聚化，并随后诱导TNFR激动活性。交联可在体外通过使用抗人F(ab’)2作为交联剂，或表达的FcγRIIB的细胞如Raji细胞来进行评价。
“不依赖于抗体交联的激动活性”意指在不存在表达FcγR(例如FcγRIIB)的Raji细胞情况下，如实施例3所述的HEK-BlueTM报告测定法中抗体在溶液中诱导SEAP产生。
“含Fc结构域分子”是指具有至少一个免疫球蛋白CH2和CH3结构域的单体、二聚体或异二聚体蛋白质。示例性含Fc结构域分子为包含TNFR配体的胞外结构域(诸如连接于Fc结构域的表1所示的那些)的融合蛋白。
“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
除非另有明确说明，否则在整个说明书中，抗体恒定区中的氨基酸残基根据EU索引编号，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中有所描述。
本文使用如表2中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
表2：
氨基酸 三字母代码 单字母代码
丙氨酸 Ala A
精氨酸 Arg R
天冬酰胺 Asn N
天冬氨酸 阿司匹林 D
半胱氨酸 Cys C
谷氨酸 Gln E
谷氨酰胺 Glu Q
甘氨酸 Gly G
组氨酸 His H
异亮氨酸 Ile I
亮氨酸 Leu L
赖氨酸 Lys K
甲硫氨酸 Met M
苯丙氨酸 Phe F
脯氨酸 Pro P
丝氨酸 Ser S
苏氨酸 Thr T
色氨酸 Trp W
酪氨酸 Tyr Y
缬氨酸 Val V
物质的组成
本发明提供具有增强的激动活性和任选增强的效应子功能的工程化抗肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员抗体，以及使用和制备该抗体的方法。本发明至少部分地基于如下认同：在抗TNFR超家族成员抗体的Fc区中引入特定突变导致了具有增强的激动作用且任选地具有增强的效应子功能的工程化抗体。
本发明提供工程化抗肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员抗体，其中当相比于亲本野生型抗体时，超家族成员抗体包含T437R突变，任选地还包含K248E突变或K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
本发明提供工程化抗肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员抗体，其中当相比于亲本野生型抗体时，超家族成员抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:63的重链恒定区(HC)。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:64的重链恒定区(HC)。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:65的重链恒定区(HC)。
SEQ ID NO:63(具有T437R突变的IgG1抗体)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYRQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:64(具有T437R/K248E突变的IgG1抗体)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPEDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYRQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:65(具有T437R/K338A突变的IgG1抗体)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISAAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYRQKSLSLSPGK
在一些实施方案中，当相比于亲本野生型抗体时，抗体具有增强的激动活性。
在一些实施方案中，通过测量抗体诱导的在Hek-293细胞产生的NFκB-诱导型启动子控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)的产生来测量激动活性。
T437R突变增强了工程化抗TNFR超家族成员抗体的激动活性。
T437R/K248E突变增强了工程化抗TNFR超家族成员抗体的激动活性。
T437R/K338A突变增强了工程化抗TNFR超家族成员抗体的激动活性。
在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在一些实施方案中，抗体介导抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
在一些实施方案中，抗体介导CDC。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234F/L235E/D265A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含H268Q/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体是IgG4同种型，并且当相比于野生型IgG4时包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体具有不依赖于抗体交联的激动活性，其中激动活性通过测量抗体诱导的在Hek-293细胞产生的NFκB-诱导型启动子控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)的产生进行测量。
在一些实施方案中，本发明的抗TNFR超家族成员抗体具有不依赖于FcγR-介导的抗体交联的激动活性。因此，本发明的抗体就其激动活性而言可以不取决于生物利用度和肿瘤微环境中表达FcγR的细胞的密度，并且可在缺乏足够FcγR细胞浸润的环境中诱导TNFR信号转导。
本发明的抗TNFR超家族成员抗体可展示出小于天然配体的激动水平，并因此可提供改善的安全特性。
在一些实施方案中，TNFR超家族成员为肿瘤坏死因子受体1(SEQ ID NO:1)、肿瘤坏死因子受体2(SEQ ID NO:2)、淋巴毒素β受体(SEQ ID NO:3)、OX40(SEQ ID NO:4)、CD40(SEQ ID NO:5)、Fas受体(SEQ ID NO:6)、诱饵受体3(SEQ ID NO:7)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD30(SEQ ID NO:9)、CD137(SEQ ID NO:10)、死亡受体4(SEQ ID NO:11)、死亡受体5(SEQID NO:12)、诱饵受体1(SEQ ID NO:13)、诱饵受体2(SEQ ID NO:14)、RANK(SEQ ID NO:15)、骨保护素(SEQ ID NO:16)、TWEAK受体(SEQ ID NO:17)、TACI(SEQ ID NO:18)、BAFF受体(SEQ ID NO:19)、疱疹病毒侵入介体(SEQ ID NO:20)、神经生长因子受体(SEQ ID NO:21)、B细胞成熟抗原(SEQ ID NO:22)、GITR(SEQ ID NO:23)、TROY(SEQ ID NO:24)、死亡受体6(SEQ ID NO:25)、死亡受体3(SEQ ID NO:26)或外异蛋白A2受体(SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，TNFR超家族成员为OX40(SEQ ID NO:4)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD40(SEQ ID NO:5)、CD137(SEQ ID NO:10)或GITR(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方案中，TNFR超家族成员为OX40(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，TNFR超家族成员为CD27(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，TNFR超家族成员为CD40(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，TNFR超家族成员为CD137(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，TNFR超家族成员为GITR(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变。
在一些实施方案中，抗TNFR超家族成员抗体包含SEQ ID NO:63的恒定区。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且介导ADCC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变且为IgG1同种型并且介导ADCC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且介导ADCP。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变且为IgG1同种型并且介导ADCP。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且介导CDC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变且为IgG1同种型并且介导CDC。
致力于通过引入S267E/L328F突变(Chu等人(2008)Mol Immunol 45:3926-33)或E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(Mimoto等人(2013)Protein EngDes Sel26:589-98)来增强抗TNFR超家族成员抗体的激动活性的已报告过的Fc工程化导致抗体丧失ADCC。与Chu和Mimoto所述的抗体相反，包含T437R突变的本发明IgG1抗体可用于期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。示例性的此类情况是表达GITR和/或OX-40的Treg细胞在肿瘤微环境中耗尽以提高抗肿瘤免疫性。
在一些实施方案中，包含T437R突变的本发明抗体还可包含减小或消除抗体Fc介导的效应子功能的第二突变。包含T437R突变和减小或消除抗体Fc介导的效应子功能的第二突变的本发明抗体可因此用于不期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。示例性的此类情况是采用抗CD40或抗CD27抗体进行的治疗性治疗。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234F/L235E/D265A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG1同种型，并且当相比于野生型IgG1时还包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗TNFR超家族成员抗体包含SEQ ID NO:66的恒定区。
SEQ ID NO:66：具有T437R的IgG1sigma
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeAAgASsvflfppkpKdtlmisrtpevtcvvvdvsAedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpSSiektiskakgqprepqvytlppsrEeMtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhyRqkslslspgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗TNFR超家族成员抗体包含SEQ ID NO:67的恒定区。
SEQ ID NO:67：具有T437R的IgG2sigma
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappAaASsvflfppkpKdtlmisrtpevtcvvvdvsAedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvLhqdwlngkeykckvsnkglpSSiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhyRqkslslspgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG2同种型，并且当相比于野生型IgG2时还包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
包含T437R突变和L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变的本发明抗体保留了它们的交联非依赖性激动活性，但是不能介导ADCC。具有T437R突变和L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变的抗体可因此用于不期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含H268Q/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A突变。
包含T437R突变和S228P/F234A/L235A突变的本发明抗体保留了它们的交联非依赖性激动活性，但是不能介导ADCC。具有T437R突变和S228P/F234A/L235A突变的抗体可因此用于不期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且为IgG4同种型，并且当相比于野生型IgG4时还包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗TNFR超家族成员抗体包含SEQ ID NO:68的恒定区。
SEQ ID NO:68：具有T437R的IgG4PAA
ASTKGPsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpKdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhyRqkslslslgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且具有不依赖于抗体交联的激动活性，其中激动活性通过测量抗体诱导的在Hek-293细胞产生的NFκB-诱导型启动子控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)的产生进行测量。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且结合TNFR超家族成员肿瘤坏死因子受体1(SEQ ID NO:1)、肿瘤坏死因子受体2(SEQ ID NO:2)、淋巴毒素β受体(SEQ ID NO:3)、OX40(SEQ ID NO:4)、CD40(SEQ ID NO:5)、Fas受体(SEQ ID NO:6)、诱饵受体3(SEQ ID NO:7)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD30(SEQ ID NO:9)、CD137(SEQ ID NO:10)、死亡受体4(SEQ IDNO:11)、死亡受体5(SEQ ID NO:12)、诱饵受体1(SEQ ID NO:13)、诱饵受体2(SEQ ID NO:14)、RANK(SEQ ID NO:15)、骨保护素(SEQ ID NO:16)、TWEAK受体(SEQ ID NO:17)、TACI(SEQ ID NO:18)、BAFF受体(SEQ ID NO:19)、疱疹病毒侵入介体(SEQ ID NO:20)、神经生长因子受体(SEQ ID NO:21)、B细胞成熟抗原(SEQ ID NO:22)、GITR(SEQ ID NO:23)、TROY(SEQ ID NO:24)、死亡受体6(SEQ ID NO:25)、死亡受体3(SEQ ID NO:26)或外异蛋白A2受体(SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且结合TNFR超家族成员OX40(SEQ IDNO:4)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD40(SEQ ID NO:5)、CD137(SEQ ID NO:10)或GITR(SEQ IDNO:23)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且结合TNFR超家族成员OX40(SEQ IDNO:4)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且结合TNFR超家族成员CD27(SEQ IDNO:8)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且结合TNFR超家族成员CD40(SEQ IDNO:5)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且结合TNFR超家族成员CD137(SEQ IDNO:10)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R突变并且结合TNFR超家族成员GITR(SEQ IDNO:23)。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)(例如肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗结直肠癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或去势难治性前列腺癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗头颈部的鳞状细胞癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，并且在下列带有编号的实施方案中的每一者中的一些实施方案中，实体瘤为泌尿生殖系统癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
包含T437R突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:64的HC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且介导ADCC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变且为IgG1同种型并且介导ADCC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且介导ADCP。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变且为IgG1同种型并且介导ADCP。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且介导CDC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变且为IgG1同种型并且介导CDC。
致力于通过引入S267E/L328F突变(Chu等人(2008)Mol Immunol 45:3926-33)或E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(Mimoto等人(2013)Protein EngDes Sel26:589-98)来增强抗TNFR超家族成员抗体的激动活性的已报告过的Fc工程化导致抗体丧失ADCC。与Chu和Mimoto所述的抗体相反，包含T437R/K248E突变的本发明IgG1抗体可用于期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。示例性的此类情况是表达GITR和/或OX-40的Treg细胞在肿瘤微环境中耗尽以提高抗肿瘤免疫效应。
在一些实施方案中，包含T437R/K248E突变的本发明抗体还可包含减小或消除抗体Fc介导的效应子功能的第二突变。包含T437R/K248E突变和减小或消除抗体Fc介导的效应子功能的第二突变的本发明抗体可因此用于不期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。示例性的此类情况是采用抗CD40或抗CD27抗体进行的治疗性治疗。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234F/L235E/D265A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG1同种型，并且当相比于野生型IgG1时还包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗TNFR超家族成员抗体包含SEQ ID NO:69的恒定区。
SEQ ID NO:69：具有T437R/K248E的IgG1sigma
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeAAgASsvflfppkpEdtlmisrtpevtcvvvdvsAedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpSSiektiskakgqprepqvytlppsrEeMtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhyRqkslslspgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG2同种型，并且当相比于野生型IgG2时还包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗TNFR超家族成员抗体包含SEQ ID NO:70的恒定区。
SEQ ID NO:70：具有T437R/K248E的IgG2sigma
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappAaASsvflfppkpEdtlmisrtpevtcvvvdvsAedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvLhqdwlngkeykckvsnkglpSSiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhyRqkslslspgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含H268Q/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG4同种型，并且当相比于野生型IgG4时还包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗TNFR超家族成员抗体包含SEQ ID NO:71的恒定区。
SEQ ID NO:71：具有T437R/K248E的IgG4PAA
ASTKGPsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpEdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhyRqkslslslgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且为IgG4同种型，并且当相比于野生型IgG4时包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且具有不依赖于抗体交联的激动活性，其中激动活性通过测量抗体诱导的在Hek-293细胞产生的NFκB-诱导型启动子控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)的产生进行测量。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且结合TNFR超家族成员肿瘤坏死因子受体1(SEQ ID NO:1)、肿瘤坏死因子受体2(SEQ ID NO:2)、淋巴毒素β受体(SEQ IDNO:3)、OX40(SEQ ID NO:4)、CD40(SEQ ID NO:5)、Fas受体(SEQ ID NO:6)、诱饵受体3(SEQID NO:7)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD30(SEQ ID NO:9)、CD137(SEQ ID NO:10)、死亡受体4(SEQ ID NO:11)、死亡受体5(SEQ ID NO:12)、诱饵受体1(SEQ ID NO:13)、诱饵受体2(SEQID NO:14)、RANK(SEQ ID NO:15)、骨保护素(SEQ ID NO:16)、TWEAK受体(SEQ ID NO:17)、TACI(SEQ ID NO:18)、BAFF受体(SEQ ID NO:19)、疱疹病毒侵入介体(SEQ ID NO:20)、神经生长因子受体(SEQ ID NO:21)、B细胞成熟抗原(SEQ ID NO:22)、GITR(SEQ ID NO:23)、TROY(SEQ ID NO:24)、死亡受体6(SEQ ID NO:25)、死亡受体3(SEQ ID NO:26)或外异蛋白A2受体(SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且结合TNFR超家族成员OX40(SEQ ID NO:4)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD40(SEQ ID NO:5)、CD137(SEQ ID NO:10)或GITR(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且结合TNFR超家族成员OX40(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且结合TNFR超家族成员CD27(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且结合TNFR超家族成员CD40(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且结合TNFR超家族成员CD137(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K248E突变并且结合TNFR超家族成员GITR(SEQ ID NO:23)。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)(例如肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗结直肠癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或去势难治性前列腺癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗头颈部的鳞状细胞癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，并且在下列带有编号的实施方案中的每一者中的一些实施方案中，实体瘤为泌尿生殖系统癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
包含T437R/K248E突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:65的HC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且介导ADCC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变且为IgG1同种型并且介导ADCC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且介导ADCP。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变且为IgG1同种型并且介导ADCP。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且介导CDC。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变且为IgG1同种型并且介导CDC。
致力于通过引入S267E/L328F突变(Chu等人(2008)Mol Immunol 45:3926-33)或E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(Mimoto等人(2013)Protein EngDes Sel26:589-98)来增强抗TNFR超家族成员抗体的激动活性的已报告过的Fc工程化导致抗体丧失ADCC。与Chu和Mimoto所述的抗体相反，包含T437R/K338A突变的本发明IgG1抗体可用于期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。示例性的此类情况是表达GITR和/或OX-40的Treg细胞在肿瘤微环境中耗尽以提高抗肿瘤免疫性。
在一些实施方案中，包含T437R/K338A突变的本发明抗体还可包含减小或消除抗体Fc介导的效应子功能的第二突变。包含T437R/K338A突变和减小或消除抗体Fc介导的效应子功能的第二突变的本发明抗体可因此用于不期望表达TNFR的细胞耗尽的情况。示例性的此类情况是采用抗CD40或抗CD27抗体进行的治疗性治疗。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234F/L235E/D265A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含K214T/E233P/L234V/L235A/G236-缺失/A327G/P331A/D365E/L358M突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG1同种型，当相比于野生型IgG1时任选地还包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG1同种型，并且当相比于野生型IgG1时还包含L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:72的HC。
SEQ ID NO:72：具有T437R/K338A的IgG1sigma
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeAAgASsvflfppkpKdtlmisrtpevtcvvvdvsAedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpSSiektisAakgqprepqvytlppsrEeMtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhyRqkslslspgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:73的HC。
SEQ ID NO:73：具有T437R/K338A的IgG2sigma
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappAaASsvflfppkpKdtlmisrtpevtcvvvdvsAedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvLhqdwlngkeykckvsnkglpSSiektisAtkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhyRqkslslspgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG2同种型，并且当相比于野生型IgG2时还包含V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含V234A/G237A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG2同种型，当相比于野生型IgG2时任选地还包含H268Q/V309L/A330S/P331S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG3同种型。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A/G236-缺失/G237A/P238S突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG4同种型，当相比于野生型IgG4时任选地还包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:74的HC。
SEQ ID NO:74：具有T437R/K338A的IgG4PAA
ASTKGPsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpKdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisAakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhyRqkslslslgk
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG4同种型，并且当相比于野生型IgG4时还包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且为IgG4同种型，并且当相比于野生型IgG4时包含S228P/F234A/L235A突变。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且具有不依赖于抗体交联的激动活性，其中激动活性通过测量抗体诱导的在Hek-293细胞产生的NFκB-诱导型启动子控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)的产生进行测量。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且结合TNFR超家族成员肿瘤坏死因子受体1(SEQ ID NO:1)、肿瘤坏死因子受体2(SEQ ID NO:2)、淋巴毒素β受体(SEQ IDNO:3)、OX40(SEQ ID NO:4)、CD40(SEQ ID NO:5)、Fas受体(SEQ ID NO:6)、诱饵受体3(SEQID NO:7)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD30(SEQ ID NO:9)、CD137(SEQ ID NO:10)、死亡受体4(SEQ ID NO:11)、死亡受体5(SEQ ID NO:12)、诱饵受体1(SEQ ID NO:13)、诱饵受体2(SEQID NO:14)、RANK(SEQ ID NO:15)、骨保护素(SEQ ID NO:16)、TWEAK受体(SEQ ID NO:17)、TACI(SEQ ID NO:18)、BAFF受体(SEQ ID NO:19)、疱疹病毒侵入介体(SEQ ID NO:20)、神经生长因子受体(SEQ ID NO:21)、B细胞成熟抗原(SEQ ID NO:22)、GITR(SEQ ID NO:23)、TROY(SEQ ID NO:24)、死亡受体6(SEQ ID NO:25)、死亡受体3(SEQ ID NO:26)或外异蛋白A2受体(SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且结合TNFR超家族成员OX40(SEQ ID NO:4)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD40(SEQ ID NO:5)、CD137(SEQ ID NO:10)或GITR(SEQ ID NO:23)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且结合TNFR超家族成员OX40(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且结合TNFR超家族成员CD27(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且结合TNFR超家族成员CD40(SEQ ID NO:5)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且结合TNFR超家族成员CD137(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，抗体包含T437R/K338A突变并且结合TNFR超家族成员GITR(SEQ ID NO:23)。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗实体瘤。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗黑色素瘤。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗非鳞状NSCLC。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗肺腺癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗肾细胞癌(RCC)(例如肾透明细胞癌或肾乳头状细胞癌)或其转移性病变。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗间皮瘤。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗鼻咽癌(NPC)。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗结直肠癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗前列腺癌或去势难治性前列腺癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃部癌症。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗卵巢癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗胃癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗肝癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗胰腺癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗甲状腺癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗头颈部的鳞状细胞癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗食道癌或胃肠道癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗乳腺癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗输卵管癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗脑癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗尿道癌。
在本文所述的本发明的一些实施方案中，并且在下列带有编号的实施方案中的每一者中的一些实施方案中，实体瘤为泌尿生殖系统癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗子宫内膜异位症。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗宫颈癌。
包含T437R/K338A突变的抗体适用于治疗，例如治疗癌症的转移性病变。
“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是诱导细胞死亡的机制，该机制依赖于抗体包被靶细胞与具有裂解活性的效应细胞(诸如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)经由效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)发生的相互作用。例如，NK细胞表达FcγRIIIA，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIIIA。因为效应细胞通过分泌膜孔形成蛋白和蛋白酶而具有活性，抗体包被靶细胞诸如表达TNFR的细胞发生死亡。为评估本发明抗体的ADCC活性，可将抗体与免疫效应细胞联合加入到表达抗体所结合的靶标的细胞中，该免疫效应细胞可被抗原抗体复合物激活，从而使靶细胞发生细胞裂解。根据从裂解的细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然胞内蛋白)来检测细胞裂解。用于此类测定法的示例性效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。在示例性测定中，可以按1个靶细胞与50个效应细胞的比率使用靶细胞。将靶细胞用BATDA(PerkinElmer)在37℃预标记20分钟，洗涤两次并重悬浮于DMEM、10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺(均来自Invitrogen)中。组合靶(1×104细胞)和效应细胞(0.5×106细胞)，并且将100μl细胞加入96孔U形底部板的孔中。在具有或不具有测试抗体情况下添加另外100μl。将板以200g离心3分钟，在37℃温育2小时，随后再次以200g离心3分钟。从每个孔中取出总共20μl的上清液，然后加入200μl基于DELPHIA Europium的试剂(PerkinElmer)并测定细胞溶解。使数据针对使用0.67％(w/v)Triton X-100(SigmaAldrich)的最大细胞毒性和通过在不存在任何抗体的情况下来自靶细胞的BATDA自发释放测定的最小对照标准化。另选地，ADCC活性可通过在受体的活化导致如本文所述的荧光素酶报告基因表达的报告基因测定中评价FcγRIIIA的活化进行评估。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”(“ADCP”)是指通过吞噬细胞(诸如巨噬细胞或树突状细胞)的内化作用消除抗体包被的靶细胞的机制。ADCP可通过如下方式评估：使用单核细胞来源的巨噬细胞作为效应细胞，并使用表达抗体所结合的靶标的Daudi细胞(CCL-213TM)或者B细胞白血病或淋巴瘤或肿瘤细胞作为被工程化为表达GFP或另一种标记分子的靶细胞。效应细胞与靶细胞的比例可为例如4:1。可在含或不含测试抗体的情况下，将效应细胞与靶细胞一起温育4小时。在温育后，可使用细胞消化液(accutase)分离细胞。可使用偶联至荧光标记的抗-CD11b抗体和抗-CD14抗体鉴定巨噬细胞，并且可使用标准方法基于CD11+CD14+巨噬细胞中的GFP荧光％确定吞噬百分比。
本发明抗体的效应子功能例如ADCC、ADCP和/或CDC可如下进一步增强：将附加突变引入抗体Fc中，这样使抗体与活化Fcγ受体(FcγR)或补体的结合提高。
可被突变以增加本发明的抗体与活化FcγR的结合和/或增强抗体效应子功能的Fc位置是例如描述于美国专利6,737,056；美国专利公布No.2015/0259434，Shields等人(Shields等人(2001)J Biol Chem 276:6591-604)(Lazar等人(2006)Proc Natl Acad SciU S A 103:4005-10)(Stavenhagen等人(2007)Cancer Res 67:8882-90)(Richards等人(2008)Mol Cancer Ther 7:2517-27)(Diebolder等人(2014)Science 343:1260-3)中的那些，并且包括位置236、239、243、256、290、292、298、300、305、312、326、330、332、333、334、360、339、378、396或430(残基根据EU索引进行编号)。可单独地或组合进行的示例性突变为G236A、S239D、F243L、T256A、K290A、R292P、S298A、Y300L、V305L、K326A、A330K、I332E、E333A、K334A、A339T和P396L突变。导致ADCC或ADCP增大的抗体的示例性组合突变为IgG1上的S239D/I332E、S298A/E333A/K334A、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L和G236A/S239D/I332E突变。
可被突变以增强本发明的抗体CDC的Fc位置是描述于例如国际专利申请WO2014/108198；(Idusogie等人(2001)J Immunol 166:2571-5)和(Moore等人(2010)MAbs 2:181-9)中的那些，并且包括位置267、268、324、326、333、345和430。可单独地或组合进行的示例性突变为S267E、H268F、S324T、K326A、K326W、E333A、E430S、E430F和E430T突变。导致CDC增大的抗体的示例性组合突变为IgG1上的K326A/E333A、K326W/E333A、H268F/S324T、S267E/H268F、S267E/S324T和S267E/H268F/S324T突变。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应域结合并激活补体成分C1q，C1q继而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活也可导致补体成分沉积在靶细胞表面上，这些补体成分通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)来促进ADCC。可例如通过如下方式测量细胞的CDC：将Daudi细胞以1×105个细胞/孔(50μL/孔)接种到RPMI-B(补充有1％BSA的RPMI)中，将50μL测试抗体以0-100μg/ml之间的最终浓度加入到孔中，将反应在室温下温育15分钟，将11μl的混合人血清加入到孔中，然后将反应在37℃下温育45分钟。可使用标准方法在FACS测定法中检测碘化丙啶染色细胞％作为裂解细胞百分比(％)。
本发明抗体诱导ADCC的能力也可通过工程化其低聚糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大部分聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接到Fc区的双分枝复合物型低聚糖去除核心岩藻糖，可经由改善的FcγRIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用如下所报告的不同方法来实现，从而导致带有双触角复合型Fc低聚糖的相对高脱岩藻糖基化抗体成功地表达：诸如控制培养物重量克分子渗透浓度(Konno等人(2012)Cytotechnology 64:249-65)、应用变体CHO系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人(2002)J Biol Chem 277:26733-40)、应用变体CHO系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人(2010)MAbs 2:405-15)、应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人(2003)J Biol Chem 278:3466-73)、引入特异性针对α1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人(2004)Biotechnol Bioeng 88:901-8)、或共表达β-1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷II或有效α-甘露糖苷I抑制剂即几夫碱(Ferrara等人(2006)Biotechnol Bioeng 93:851-61；Ferrara等人(2006)J Biol Chem281:5032-6)。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含增强抗体的ADCC、ADCP和/或CDC的第二突变。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含选自以下的增强抗体的ADCC、ADCP和/或CDC的第二突变：G236A突变、S239D突变、F243L突变、T256A突变、K290A突变、R292P突变、S298A突变、Y300L突变、V305L突变、K326A突变、A330K突变、I332E突变、E333A突变、K334A突变、A339T突变、P396L突变、S267E突变、H268F突变、S324T突变、K326A突变、K326W突变、E333A突变、E430S突变、E430F突变和E430T突变。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含选自以下的增强抗体的ADCC、ADCP和/或CDC的第二突变：S239D/I332E突变、S298A/E333A/K334A突变、F243L/R292P/Y300L突变、F243L/R292P/Y300L/P396L突变、F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L突变、G236A/S239D/I332E突变、K326A/E333A突变、K326W/E333A突变、H268F/S324T突变、S267E/H268F突变、S267E/S324T突变和S267E/H268F/S324T突变。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有岩藻糖含量为约0％至约15％(例如15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％)的双分枝聚糖结构。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有岩藻糖含量为约50％、40％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的双分枝聚糖结构。
“岩藻糖含量”意指Asn297处糖链内的岩藻糖单糖的量。岩藻糖的相对量为含岩藻糖的结构相对于所有糖结构的百分比。这些可通过多种方法进行表征和定量，例如：1)使用经N-糖苷酶F处理的样本(例如，复合结构、混合结构及低聚甘露糖结构和高甘露糖结构)的MALDI-TOF，如国际专利公布No.WO2008/077546所述；2)通过酶促释放Asn297聚糖，随后衍生化并通过具有荧光检测的HPLC(UPLC)和/或HPLC-MS(UPLC-MS)进行检测/定量；3)在用或不用Endo S或其它酶处理Asn297聚糖的情况下，对天然或还原后的mAb进行完整蛋白分析，所述其它酶在第一GlcNAc单糖和第二GlcNAc单糖之间进行裂解，留下连接至第一GlcNAc的岩藻糖；4)通过酶消化(例如，胰蛋白酶或肽链内切酶Lys-C)将mAb消化为成分肽，随后通过HPLC-MS(UPLC-MS)进行分离、检测和定量；或5)用PNGase F在Asn 297处进行特异性酶促去糖基化，从而将mAb低聚糖与mAb蛋白分离。可通过各种互补技术对释放的低聚糖进行荧光团标记、分离并鉴定，这些技术允许：采用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法，通过比较实验质量与理论质量来对聚糖结构进行精细表征；通过离子交换HPLC(GlycoSep C)确定唾液酸化程度；通过正相HPLC(GlycoSep N)，根据亲水性标准分离和定量低聚糖形式；以及通过高效毛细管电泳激光诱导荧光(HPCE-LIF)分离和定量低聚糖。
“低岩藻糖”或“低岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量为约0％至15％。
“正常岩藻糖”或“正常岩藻糖含量”是指抗体的岩藻糖含量大约高于50％，通常大约高于60％、70％、80％或高于85％。
在不期望效应子功能的情况中，本发明的抗体可被进一步工程化成在抗体Fc区中引入至少一个突变，所述突变降低抗体与活化Fcγ受体(FcγR)的结合并且/或者降低Fc效应子功能，诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP)。
可被突变以降低抗体与活化FcγR结合并随后降低效应子功能的Fc位置是描述于例如(Shields等人(2001)J Biol Chem 276:6591-604)；国际专利公开No.WO2011/066501；美国专利No.6,737,056和5,624,821；(Xu等人(2000)Cell Immunol200:16-26)；(Alegre等人(1994)Transplantation 57:1537-43)A；(Bolt等人(1993)Eur J Immunol 23:403-11)；(Cole等人(1999)Transplantation 68:563-71)；(Rother等人(2007)Nat Biotechnol 25:1256-64)；(Ghevaert等人(2008)J Clin Invest 118:2929-38)；(An等人(2009)MAbs 1:572-9)中的那些，并且包括位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331和365。可单独地或组合进行的示例性突变为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S突变。可用于降低ADCC的示例性组合突变为IgG1上的L234A/L235A、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的F234A/L235A、IgG4上的S228P/F234A/L235A、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A、IgG2上的V234A/G237A、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的S267E/L328F、IgG1上的L234F/L235E/D265A、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、以及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。还可使用杂合IgG2/4Fc域，例如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。
S228P突变可在IgG4抗体中进行，以增强IgG4稳定性。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含选自以下的第二突变：K214T突变、E233P突变、L234V突变、L234A突变、G236缺失、V234A突变、F234A突变、L235A突变、G237A突变、P238A突变、P238S突变、D265A突变、S267E突变、H268A突变、H268Q突变、Q268A突变、N297A突变、A327Q突变、P329A突变、D270A突变、Q295A突变、V309L突变、A327S突变、L328F突变、A330S突变和P331S突变，其中残基根据EU索引进行编号。
本发明的抗体还可通过引入附加Fc突变而被进一步工程化，以进一步调节抗体半衰期，诸如在例如(Dall'Acqua等人(2006)J Biol Chem 281:23514-24)；(Zalevsky等人(2010)Nat Biotechnol 28:157-9)；(Hinton等人(2004)J Biol Chem 279:6213-6)；(Hinton等人(2006)J Immunol 176:346-56)；(Shields等人(2001)J Biol Chem 276:6591-604)；(Petkova等人(2006)Int Immunol 18:1759-69)；(Datta-Mannan等人(2007)Drug Metab Dispos 35:86-94)；(Vaccaro等人(2005)Nat Biotechnol 23:1283-8)；(Yeung等人(2010)Cancer Res 70:3269-77)和(Kim等人(1999)Eur JImmunol 29:2819-25)中所述的那些，并且包括位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434和435。可单独地或组合进行的示例性突变为T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R突变。可用于增长抗体半衰期的示例性单独或组合突变为M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A突变。可用于缩短抗体半衰期的示例性单独或组合突变为H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A和H435R突变。
还包含保守修饰的本发明抗体在本发明的范围之内。
“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有保守修饰的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。保守置换是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可以用丙氨酸来置换，如此前对于丙氨酸扫描诱变所述。对本发明的抗体的氨基酸置换可通过已知的方法进行，例如通过PCR诱变进行。另选地，可例如使用随机(NNK)或非随机密码子(例如DVK密码子，其编码11个氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp))来产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。
本发明的抗体可通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(例如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂质化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可在体内或体外进行。例如，本发明的抗体可以与聚乙二醇缀合(聚乙二醇化)以改善其药代动力学性质。缀合可通过本领域技术人员已知的技术来实施。已经证实治疗性抗体与PEG的共轭增强药效学而不干扰功能。
可经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其它所需生物学或生物物理学特性的本发明的抗体在本发明的范围之内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，(2)对HC和LC配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的H键网络；以及(5)其他分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(DSC)测量的热转变中间点(Tm)。一般来讲，蛋白质的Tm与其稳定性相关联并且与其对溶液中的解折叠和变性以及依赖于该蛋白质解折叠倾向的降解过程的易感性成反向相关。大量的研究已经发现了通过DSC以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其他方法测量的物理稳定性之间的相关性(Maa等人(1996)Int.J.Pharm.140:155-68；Remmele等人(1997)Pharm.Res.15:200-8；Gupta等人(2003)AAPS PharmSci.5E8:2003；Bedu-Addo等人(2004)Pharm.Res.21:1353-61；Zhang等人(2004)J.Pharm.Sci.93:3076-89)。制剂研究提示，Fab Tm对相应mAb的长期物理稳定性有影响。
可通过在血流中内源性循环羧肽酶从注射的抗体中移除C-末端赖氨酸(CTL)(Cai等人(2011)Biotechnol Bioeng 108:404-12)。在制备期间，可通过控制细胞外Zn2+、EDTA或EDTA–Fe3+的浓度，将CTL移除控制到小于最大水平，如美国专利公开US20140273092中有所描述。抗体中的CTL含量可使用已知方法测定。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有约10％至约90％、约20％至约80％、约40％至约70％、约55％至约70％、或约60％的C-末端赖氨酸含量。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有约0％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的C-末端赖氨酸含量。
产生本发明抗体的方法
将野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4序列用作模板，利用标准克隆和表达技术产生具有工程化Fc结构域的本发明抗体。例如，可实施定点诱变或PCR介导的诱变以在抗体Fc中引入突变，并且可使用本文所述的方法来评价对抗体结合FcγR、激动活性或其他感兴趣的特性的影响。
可从头产生抗TNFR超家族成员抗体的VH和VL结构域。
例如，杂交瘤方法(Kohler等人(1975)Nature 256:495-7)能够被用来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用人TNFR或TNFR的胞外域来免疫小鼠或其他宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(AcademicPress,1986))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。
可使用各种宿主动物来产生本发明的抗TNFR超家族成员抗体。例如，可使用Balb/c小鼠来产生小鼠抗人TNFR超家族成员抗体。可使用各种技术来人源化由Balb/c小鼠和其它非人动物制备的抗体，从而产生更类似人的序列。
包括选择人受体框架的示例性人源化技术是已知的，并且包括CDR接枝(美国专利5,225,539)、SDR接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(Padlan,(1991)Mol Immunol 28:489-98)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公布2010/0261620)、人框架改型(美国专利8,748,356)或超人源化(美国专利7,709,226)。在这些方法中，亲本抗体的CDR被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于CDR长度的相似性、或规范结构同一性、或它们的组合进行选择。
可通过如下过程进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公开WO1090/007861和WO1992/22653中所述的技术，引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过在任何CDR处引入变体例如来改善抗体的亲和力。
基因组中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因动物(诸如小鼠或大鼠)可用于生成抗目标蛋白质的人抗体，这在例如美国专利6,150,584、国际专利公布WO99/45962、国际专利公开No.WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478和WO1990/04036；(Lonberg等人(1994)Nature 368:856-9)；(Green等人(1994)Nat Genet 7:13-21)；(Lonberg等人(1995)Int Rev Immunol 13:65-93)；(Bruggemann等人(1991)Eur J Immunol 21:1323-6)中有所描述。可破坏此类动物中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入动物的基因组中。可邀请诸如Regeneron(http://_www_regeneron_com)、HarbourAntibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)和Ablexis(http://_www_ablexis_com)等公司使用上述技术以提供抗所选抗原的人抗体。
人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如Fab、单链抗体(scFv)或者未配对或配对抗体可变区。可例如用噬菌体pIX外壳蛋白从将抗体重链和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出本发明的抗体，如(Shi等人(2010)J Mol Biol 397:385-96)和国际专利公布WO09/085462中所述。可从文库中筛选结合到人和/或cyno TNFR的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆裂解物中分离Fab，并将其表达为全长IgG。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法描述于例如：美国专利5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,427,908、5,580,717、5,969,108、6,172,197、5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
本发明的抗TNFR超家族成员抗体的VH/VL区也可获自现有的抗TNFR超家族受体抗体。
美国专利No.US8133983、美国专利No.US7960515、美国专利公布No.US2013/0280275、国际专利公布WO2013/028231和美国专利公布No.US2014/0377284中所述的抗OX40抗体的VH和VL区能够被用来工程化本发明的抗体。另外，可使用抗OX40抗体MEDI-6469、BMS-986178、MOXR-0916、MEDI-6383、MEDI-0562、PF-04518600或GSK-3174998的VH/VL区。可用于产生本发明的工程化抗OX40抗体的示例性VH和VL区是：
SEQ ID NO:51(US2014/0377284中所述抗体SF2的VH)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWIGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:52(US2014/0377284中所述抗体SF2的VL)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:53(US2014/0377284中所述12H3VH1VL1的VH)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWMGGIYPNNGGSTYNQNFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:54(US2014/0377284中所述12H3VH1VL1的VL)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:55(US2014/0377284中所述20E5VH3VL2的VH)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:56(US2014/0377284中所述20E5VH3VL2的VL)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK
可用于工程化本发明的抗体的抗CD40抗体的VH和VL区是分别在美国专利7,288,251(抗体21.4.1)和美国专利8,303,955中所述的CP-870,893和人源化S2C6的那些，以及国际专利公布WO2001/056603、WO2001/083755、WO2013/034904和WO2014/070934中所述的抗-CD40抗体。可用于产生本发明的工程化抗CD40抗体的示例性VH和VL区是：
SEQ ID NO:57(M9抗体的VH)
QLQLQESGPGLVKPSEILSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGNIYYRGDTYYSPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCAKGFRFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:58(M9抗体的VL)
QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSNNLVFGGGTKLTVL
能够被用来工程化本发明抗体的抗GITR抗体的VH和VL区是美国专利No.7,812,135、8,591,886和7,618,632，或国际专利公布WO2011/028683、WO2013/039954、WO2005/007190和WO2007/133822中所述的那些。
能够被用来工程化本发明抗体的抗CD27抗体的VH和VL区是美国专利No.US9169325和国际专利公布No.US20130183316中所述的那些。
能够被用来工程化本发明抗体的抗CD137抗体的VH和VL区是美国专利No.US7288638、US8716452和US8821867中所述的那些。
工程化成全长双特异性抗体的本发明抗体在本发明的范围之内。
“全长抗体”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(HC)由公知的重链可变结构域和重链恒定结构域VH、CH1、铰链、CH2和CH3构成。全长抗体轻链(LC)由公知的轻链可变结构域和轻链恒定结构域VL和CL构成。全长抗体可以在一条或两条重链中缺少C-端赖氨酸(K)。
全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。“Fab臂”或“半分子”是指特异性地结合抗原的一个重链-轻链对。
Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位，即TNFR上的表位和第二抗原上的表位。
“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
本发明的抗TNFR超家族成员抗体可使用钮扣(Genentech)、CrossMAbs(Roche)和静电匹配(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y(Genentech)、Strand Exchange工程化Domain body(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)工程化成双特异性形式。
在钮扣策略(参见，例如国际公布No.WO 2006/028936)中，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3置换对表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
除利用“钮扣”策略促进Fab壁交换之外，在CrossMAb技术中，半臂之一具有交换的CH1和CL域，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。
可使用其他交换策略如下产生全长双特异性抗体：在双特异性抗体的一个或两个臂中，在重链与轻链之间或重链之内交换可变域或恒定域、或这两种域。这些交换包括例如VH-CH1与VL-CL、VH与VL、CH3与CL以及CH3与CH1，如在国际专利公布WO2009/080254、WO2009/080251、WO2009/018386和WO2009/080252中有所描述。
还可使用其他策略，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在第二CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化来产生双特异性抗体，如美国专利公布No.US2010/0015133；美国专利公布No.US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637或美国专利公布No.US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布No.US2013/0195849中所述。
LUZ-Y技术可用于产生双特异性抗体。在该技术中，将亮氨酸拉链加入CH3域的C末端，以驱动由亲本单克隆抗体装配异源二聚体，该亲本单克隆抗体经后纯化移除，如(Wranik等人(2012)J Biol Chem 287:43331-9)中所述。
SEEDbody技术可用于产生双特异性抗体。SEEDbodies在其恒定域中具有所选择的经IgA残基取代的IgG残基，以促进异源二聚化，如在美国专利US20070287170中有所描述。
根据国际专利公布No.WO2011/131746(DuoBody technology)所述的方法，双特异性抗体可在无细胞环境中，通过在两个单特异性同源二聚抗体的CH3区域中导入非对称突变并由两个亲本单特异性同源二聚抗体在还原条件下形成双特异性异源二聚抗体而体外生成，该还原条件允许二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
抗体结构域和位置编号为人们所熟知。“非对称”是指抗体的两条独立重链中的两个CH3结构域内的不同置换。IgG1CH3区通常由IgG1上的残基341-446构成(残基根据EU索引进行编号)。
本发明的抗体可被工程为各种公知的抗体形式。
含Fc结构域分子
本发明还提供在Fc结构域中包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变的分离的含Fc结构域分子。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R突变。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K248E突变。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K338A突变。
在一些实施方案中，Fc结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在一些实施方案中，Fc结构域为IgG1同种型。
在一些实施方案中，Fc结构域为IgG2同种型。
在一些实施方案中，Fc结构域为IgG3同种型。
在一些实施方案中，Fc结构域为IgG4同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R突变并且为IgG1同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R突变并且为IgG2同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R突变并且为IgG3同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R突变并且为IgG4同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K248E突变并且为IgG1同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K248E突变并且为IgG2同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K248E突变并且为IgG3同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K248E突变并且为IgG4同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K338A突变并且为IgG1同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K338A突变并且为IgG2同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K338A突变并且为IgG3同种型。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子包含T437R/K338A突变并且为IgG4同种型。
哺乳动物IgG重链的恒定区序列在序列中指定为CH1-铰链-CH2-CH3。IgG的“铰链”、“铰链区”或“铰链结构域”通常定义为根据EU索引包括Glu216且在人IgG1的Pro230处终止，但在功能上，链的弹性部分可视为包括称为上和下铰链区的另外残基，例如从Glu216至Gly237，并且下铰链称为FcγR结合通常所归属的Fc区的残基233至239。通过放置第一个和最后一个半胱氨酸残基形成重链间S-S键，其他IgG同种型的铰链区可与IgG1序列进行比对。尽管如根据EU索引编号的，边界可轻微不同，但CH1结构域与VH结构域相邻，并且氨基末端与免疫球蛋白重链分子的铰链区相邻，并且包括免疫球蛋白重链的第一个(大多数是氨基末端)恒定区，例如约EU位置118-215。Fc结构域从氨基酸231延伸到氨基酸447；CH2结构域是从约Ala231到Lys340或Gly341，并且CH3是从约Gly341或Gln342到Lys447。CH1区的IgG重链恒定区的残基在Lys处终止。含Fc结构域分子至少包含抗体恒定区的CH2和CH3结构域，并因此至少包含IgG重链恒定区约Ala231至Lys447的区域。含Fc结构域分子可任选地包含铰链区的至少一部分。
示例性含Fc结构域分子为至少包含偶联于异源蛋白质或蛋白质的一部分，诸如肽、细胞因子、趋化因子、或膜蛋白的胞外结构域(例如TNFR配体的胞外结构域，诸如表1所列的那些)的抗体恒定区的CH2和CH3结构域的异源融合蛋白。
本发明的含Fc结构域分子可通过标准分子生物学技术制备。
本发明还提供编码本发明的含Fc结构域分子的分离的多核苷酸。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:75的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:76的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:77的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:78的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:79的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:80的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:81的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:82的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:83的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:84的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:85的多核苷酸序列。
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:86的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:75编码IgG1 T437R的cDNA
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SEQ ID NO:78编码IgG1sigma T437R的cDNA
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SEQ ID NO:79编码IgG1sigma T437R/K248E的cDNA
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SEQ ID NO:81编码IgG2sigma T437R的cDNA
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本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:75的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:76的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:77的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:78的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:79的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:80的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:81的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:82的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:83的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:84的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:85的多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，其包含SEQ ID NO:86的多核苷酸。
本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。
本发明还提供一种制备本发明的含Fc结构域分子的方法，所述方法包括在其中表达含Fc结构域分子的条件中培养本发明的宿主细胞，并且分离含Fc结构域分子。
在一些实施方案中，含Fc结构域分子为抗体。
药物组合物/施用
本发明还提供包含本发明的抗体或含Fc结构域分子以及药学上可接受的载体的药物组合物。对于治疗性用途，可将本发明的抗体或含Fc结构域分子制备为药物组合物，其含有有效量的抗体或含Fc结构域分子作为药学上可接受的载体中的活性成分。“载体”是指本发明抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体或含Fc结构域分子的浓度可从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15或20％改变，且可根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的媒介物和制剂在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版，Troy,D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing，第691-1092页(特别参见第958-989页)中有所描述。
用于本发明的抗体或含Fc结构域分子的治疗性用途的施用模式可以是将抗体递送至宿主的任何合适途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部，经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)，使用片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒形式的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中；或技术人员所理解的本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：瘤内、胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。
本发明的抗体或含Fc结构域分子可通过任何合适的途径施用给受试者，例如通过静脉内(i.v.)输注或弹丸式注射以非肠道方式、以肌肉内方式或皮下方式或腹膜内方式。可在例如15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟或240分钟内，或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时内给予静脉内输注。
向受试者给予的剂量足以缓解或至少部分地遏止正在治疗的疾病(“治疗有效量”)，并且有时可为0.005mg/kg至约100mg/kg，例如约0.05mg/kg至约30mg/kg，或约5mg/kg至约25mg/kg，或约4mg/kg，约8mg/kg，约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg，但可甚至更高，例如约15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
也可以给予固定的单位剂量，例如50mg、100mg、200mg、500mg或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500mg/m2、400mg/m2、300mg/m2、250mg/m2、200mg/m2或100mg/m2。通常可施用介于1和8次之间(例如，1、2、3、4、5、6、7或8次)的剂量来治疗患者，但可给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次的剂量。
可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用本发明的抗体或含Fc结构域分子。也可以重复治疗过程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。例如，本发明的抗体或含Fc结构域分子可通过静脉内输注以8mg/kg或以16mg/kg按一周的时间间隔施用8周，接着以8mg/kg或以16mg/kg按每两周一次的方式再施用16周，然后以8mg/kg或以16mg/kg按每四周一次的方式施用。
例如，本发明的方法中的抗体或含Fc结构域分子可在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者另选地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或其任何组合，使用单次剂量或者每24、12、8、6、4或2小时一次的分次剂量或其任何组合，以约0.1-100mg/kg的量作为日剂量提供，诸如0.5mg/kg/天、0.9mg/kg/天、1.0mg/kg/天、1.1mg/kg/天、1.5mg/kg/天、2mg/kg/天、3mg/kg/天、4mg/kg/天、5mg/kg/天、6mg/kg/天、7mg/kg/天、8mg/kg/天、9mg/kg/天、10mg/kg/天、11mg/kg/天、12mg/kg/天、13mg/kg/天、14mg/kg/天、15mg/kg/天、16mg/kg/天、17mg/kg/天、18mg/kg/天、19mg/kg/天、20mg/kg/天、21mg/kg/天、22mg/kg/天、23mg/kg/天、24mg/kg/天、25mg/kg/天、26mg/kg/天、27mg/kg/天、28mg/kg/天、29mg/kg/天、30mg/kg/天、40mg/kg/天、45mg/kg/天、50mg/kg/天、60mg/kg/天、70mg/kg/天、80mg/kg/天、90mg/kg/天或100mg/kg/天。
本发明的方法中的抗体或含Fc结构域分子也可预防性地施用，以降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发作和/或在癌症缓解后降低复发的风险。
本发明的抗体或含Fc结构域分子可冻干以便于储存，使用之前可在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。
方法和用途
本发明的抗体或含Fc结构域分子具有在体外和体内进行诊断，以及治疗和预防的用途。例如，本发明的抗体可被施用于体外或离体培养的细胞，或者待治疗的受试者，预防和/或诊断各种疾病，诸如癌症和感染性疾病。
本发明提供一种增强受试者中抗TNFR超家族成员抗体的激动活性的方法，所述方法包括提供抗TNFR超家族成员抗体；将T437R突变、K248E突变、K338A突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变引入该抗体中，以生成特异性结合TNFR超家族成员的工程化抗体；以及将工程化抗体施用于受试者。
本发明还提供一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将特异性结合TNFR超家族成员的抗体施用于受试者足以治疗癌症的时间，该特异性结合TNFR超家族成员的抗体包含T437R突变、K248E突变、T437R/K338A突变或T437R/K248E。
在本发明的方法中，抗体介导ADCC。
在本发明的方法中，抗体介导ADCP。
在本发明的方法中，抗体介导CDC。
在本发明的一些方法中，抗体增强了不依赖于抗体交联的抗TNFR超家族成员的激动活性，其中激动活性通过测量抗体诱导的在Hek-293细胞产生的NFκB-诱导型启动子控制下表达的分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)的产生进行测量。
在本发明的方法中，抗体任选地还包含减小ADCC的第二突变。
在本发明的方法中，受试者患有病毒性感染。
在本发明的方法中，受试者患有癌症。
在本发明的方法中，癌症为实体瘤。
在本发明的方法中，实体瘤为黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、结直肠癌、前列腺癌、去势难治性前列腺癌、胃部癌症、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌或癌症的转移性病变。
在本发明的方法中，TNFR为肿瘤坏死因子受体1(SEQ ID NO:1)、肿瘤坏死因子受体2(SEQ ID NO:2)、淋巴毒素β受体(SEQ ID NO:3)、OX40(SEQ ID NO:4)、CD40(SEQ ID NO:5)、Fas受体(SEQ ID NO:6)、诱饵受体3(SEQ ID NO:7)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD30(SEQ IDNO:9)、CD137(SEQ ID NO:10)、死亡受体4(SEQ ID NO:11)、死亡受体5(SEQ ID NO:12)、诱饵受体1(SEQ ID NO:13)、诱饵受体2(SEQ ID NO:14)、RANK(SEQ ID NO:15)、骨保护素(SEQID NO:16)、TWEAK受体(SEQ ID NO:17)、TACI(SEQ ID NO:18)、BAFF受体(SEQ ID NO:19)、疱疹病毒侵入介体(SEQ ID NO:20)、神经生长因子受体(SEQ ID NO:21)、B细胞成熟抗原(SEQ ID NO:22)、GITR(SEQ ID NO:23)、TROY(SEQ ID NO:24)、死亡受体6(SEQ ID NO:25)、死亡受体3(SEQ ID NO:26)或外异蛋白A2受体(SEQ ID NO:27)。
在本发明的方法中，TNFR为OX40(SEQ ID NO:4)、CD27(SEQ ID NO:8)、CD40(SEQID NO:5)、CD137(SEQ ID NO:10)或GITR(SEQ ID NO:23)。
在本发明的方法中，TNFR是OX40(SEQ ID NO:4)。
在本发明的方法中，TNFR是CD27(SEQ ID NO:8)。
在本发明的方法中，TNFR是CD40(SEQ ID NO:5)。
在本发明的方法中，TNFR是CD137(SEQ ID NO:10)。
在本发明的方法中，TNFR是GITR(SEQ ID NO:23)。
许多TNFR超家族成员及它们的配体被认为是癌症疗法的靶标，包括TNFR1/2/TNF-α、CD70/CD27、CD137/4-1BB、OX40/OX40L、CD40/CD40L、GITR/GITRL，并且靶向TNFR超家族成员的几种激动抗体诸如抗CD40、抗OX-40、抗GITR、抗CD27、抗CD137抗体正处于各种实体瘤以及血红素恶性肿瘤诸如非霍奇金淋巴瘤和B细胞恶性肿瘤的临床开发当中。可以预期性能改善的本发明的抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗CD27、抗CD137及其他抗TNFR超家族成员抗体就它们任选地结合效应子功能的增强的激动活性而言将在治疗学上有效地治疗各种癌症，包括实体瘤。
虽然已经概括地描述了本发明，但是本发明的实施方案还将在以下实施例中进一步公开，以下实施例不应理解为限制权利要求的范围。
实施例1改善抗TNFR超家族成员抗体的激动活性的Fc工程化方法
针对属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的免疫刺激性受体的激动抗体作为用于癌症免疫疗法的有前景药物候选而出现。最近发现了可通过增强它们的激动活性和/或效应子功能来增大抗TNFR抗体的抗肿瘤活性的几种Fc工程化方法。
刺激抗肿瘤免疫性的单克隆抗体作为一类重要的癌症治疗剂出现(Mellman等人(2011)Nature 480:480-9)(Chen等人(2013)Nat Rev Immunol 13:227-42)。靶向免疫检查点受体CTLA-4和PD-1的抗体已被批准为晚期黑素瘤、肺癌的单一疗法，并且已评价了对其他类型人癌症的治疗。除靶向抑制途径之外，针对T细胞和抗原递呈细胞上免疫刺激性受体的激动抗体还能够刺激抗肿瘤免疫力并且作为癌症免疫疗法临床开发的有前景领域而出现(Schaer等人(2014)J Immunother Cancer2:7)。
许多免疫刺激性受体属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族。在其中，OX40、CD27、4-1BB和GITR表达于效应T细胞上，并且它们的配体和激动抗体能够激活这些受体以刺激T细胞的增殖和活化(Kanamaru等人(2004)J Immunol 172:7306-14)(Gramaglia等人(1998)JImmunol 161:6510-7)(Pollok等人(1993)J Immunol 150:771-81)(Ramakrishna等人(2015)J Immunother Cancer 3:37)。CD40表达于抗原递呈细胞上，并且这些受体的激活促进肿瘤抗原更有效地呈递给活化T细胞(Khalil等人(2007)Update Cancer Ther 2:61-5)(Mangsbo等人(2015)Clin Cancer Res 21:1115-26)。许多证据表明，治疗性抗体针对这些TNF受体的激动活性对其抗肿瘤活性而言很重要(Mangsbo等人(2015)Clin Cancer Res21:1115-26)(He等人(2013)J Immunol 191:4174-83)(Wilson等人(2011)Cancer Cell19:101-13)。另一方面，几种TNFR超家族成员诸如OX40和GITR使负调节肿瘤免疫性的调节T细胞(Treg)上的表达提高。一些研究揭示，抗OX40和抗GITR抗体能够通过抗体的效应子功能来促进调节T细胞在肿瘤微环境中选择性消除(Bulliard等人(2013)J Exp Med 210:1685-93)(Bulliard等人(2014)Immunol Cell Biol 92:475-80)。对于治疗性抗OX40和抗GITR抗体的抗肿瘤活性，此类抗体介导的调节T细胞杀伤比抗体介导的效应T细胞活化更为重要。
累积的证据表明，免疫调节性抗体就其激动活性和效应子功能而言结合不同类型的Fc受体。为了激活下游信号转导途径，需要TNFR三聚化。然而，一个抗体分子通常不足以聚集足够的TNF受体；相反，抗体交联是体外测定中受体活化所需的(Morris等人(2007)MolImmunol 44:3112-21)。在小鼠中的最近研究指出，结合抑制性FcγRIIB受体对于抗体针对多个TNFR靶标(包括CD40)的激动活性至关重要(Li等人(2011)Science 333:1030-4)(White等人(2011)J Immunol 187:1754-63)、死亡受体5(DR5)(Wilson等人(2011)CancerCell 19:101-13)(Li等人(2012)Cell Cycle 11:3343-4)和CD95(Xu等人(2003)J Immunol171:562-8)。IgG Fc与FcγRIIB受体的交联可使多于一个抗体分子多聚化，其继而可促进足够的TNFR聚集以进行信号转导途径激活。另一方面，抗体效应子功能诸如ADCC和ADCP取决于与各种活化Fcγ受体的相互作用。在小鼠中的研究显示，活化Fcγ受体通过选择性消除瘤内调节T细胞而对免疫调节性抗OX40和抗GITR抗体的抗肿瘤活性有贡献(Bulliard等人(2013)J Exp Med 210:1685-93)(Bulliard等人(2014)Immunol Cell Biol 92:475-80)。
人IgG抗体与除FcγRI之外的大部分人Fc受体的亲和力较差(Guilliams等人(2014)Nat Rev Immunol 14:94-108)。为了优化用于免疫刺激性TNF受体的激动抗体的抗肿瘤活性，一种方法是工程化IgG抗体的Fc区来改善其Fcγ受体结合，特别是与FcγRIIB受体的结合。就这一点而言，Chu等人描述了具有增强的FcγRIIB结合亲和力的IgG1 Fc中的S267E/L328F突变(Chu等人(2008)Mol Immunol 45:3926-33)。被工程化具有此类突变的抗CD19抗体显示出B细胞受体介导的原代人B细胞活化的抑制得到改善。然而，进一步研究显示，此类Fc变体也与活化FcγRIIA受体的R131同种异型的结合增强(Mimoto等人(2013)Protein Eng Des Sel 26:589-98)。最近，Mimoto等人报告了IgG1 Fc中的一组六个突变(统称为V12突变)，并且FcγRIIB结合选择性地增强而并未相关的提高与FcγRIIA受体的H131或R131同种异型的结合(Mimoto等人(2013)Protein Eng Des Sel 26:589-98)。具有工程化V12突变的抗CD137激动抗体显示出依赖于FcγRIIB结合的激动活性得到大大增强。
虽然优化FcγRIIB结合为可行的方法，但此类工程化抗体的激动活性很大程度上取决于局部微环境中的FcγR表达，并且此类抗体的功效可能受限于作用的解剖学位点。如果交联FcγRIIB的目的仅在于使激动抗体的聚簇增加以用于受体活化，则我们假设可促进抗体多聚化的那些Fc突变能够增强抗体对TNF受体的激动作用而无需FcγRIIB交联。Diebolder等人报告选择性Fc突变可利于IgG抗体在结合细胞表面的靶标时形成六聚物(Diebolder等人(2014)Science 343:1260-3)。同时据报告此类IgG六聚物可大大激活补体依赖性细胞毒性(CDC)，我们认为另一种应用可以是，针对TNF受体的低聚抗体可通过促进受体聚簇来活化受体。
此文件描述了对关于抗OX40抗体的激动作用增强的不同Fc工程化方法的评价。除此之外，还评价了Fc突变对工程化抗体的ADCC和ADCP效应子功能的影响。此类研究可有助于指导设计出具有改善的抗肿瘤活性的针对OX40及其他TNF受体的工程化抗体。
实施例2鉴定促进Fc结构域多聚体结合的人IgG突变
出于鉴定可通过促进Fc介导的多聚化来增强激动活性的人IgG突变的目的，首先实施RCSB蛋白质数据库(PDB)保藏的结构的基于序列的检索(Berman等人(2000)NucleicAcids Res 28:235-42)以鉴定包含Fc结构域的那些条目。从该列表中，带着如下预期检查由属于六方晶家族的晶体所得的结构：晶体学对称性应用将产生封闭的Fc结构域的六聚物排列的一类结构，其可用作有助于鉴定促进多聚化的突变的模型。因此鉴定出对HIV-1gp120具有特异性的完整IgG1分子的晶体结构(PDB 1HZH)(Saphire等人(2001)Science293:1155-9)，其中Fc结构域被包装形成闭环构型。
Diebolder等人此前假设，类似于在结构1HZH中所观察的IgG分子的六聚物结合可能对于CDC活化很重要，并且该模型用于鉴定促进六聚化的突变(Diebolder等人(2014)Science 343:1260-3)。多聚体模型显示，稳定化分子闭环构造的大部分触点介于相邻Fc分子的CH3结构域之间。因此，如果分子如多聚体模型中所观察的那样包装，据推测促进多聚化的一种方式是使CH3表面的残基突变以优化与相邻CH3表面的相互作用。在晶体结构3AVE中存在的IgG1 Fc的CH3结构域叠置到多聚体模型的那些上时，观察到相邻Fc结构域的3AVECH2结构域的碰撞(图1)。Davies等人也提到此类碰撞，然而已提出CH2结构域AB环内的构象变化可防止此类碰撞发生(Davies等人(2014)Mol.Immunol.，62:46-53)。另选地，多聚体模型中CH2与CH3结构域之间改变的角度允许CH3结构域如所述的那样包装而无相邻分子的CH2结构域之间的碰撞。
因此，据推测通过使CH2能够更易于采用将避免空间碰撞的构象，CH2结构域相对于CH3结构域提高的柔韧性将允许Fc分子更易于装配成多聚体排列并潜在有利于促进堆积相互作用。CH2:CH3界面的突变已示出改变CH2结构域的柔韧性(Frank等人(2014)J MolBiol 426:1799-811)(Teplyakov等人(2013)Mol Immunol 56:131-9)。因此，定义促进IgG多聚化的两种类别的突变——通过优化分子内触点来增强Fc CH3:CH3间相互作用的那些，以及弱化分子内CH2:CH3界面以促进CH2结构域柔韧性增强的那些。使用程序Coot和PyMol手动检查多聚体模型，并且设计出预期通过至少一种假定机制促进多聚化的突变的列表。各种突变在抗OX40抗体20E5上工程化，并且测试其在溶液中或与Raji细胞交联的激动活性。从这些初始实验中，选择Fc突变K248E、K338A和T437R用于进一步研究。
实施例3材料和方法
抗OX40抗体的Fc工程化
将抗OX40抗体20E5VH3VL2(本文称为20E5)的VH和VL区(VH：SEQ ID NO:55，VL：SEQID NO:56)克隆到人野生型IgG1或IgG2上，并将所选的置换工程化到Fc上，以评价置换对抗体的激动活性和效应子功能的影响。所生成抗体的名称以及它们的Fc置换示于表3中。
表3：
抗体名称 同种型 Fc突变(残基根据EU索引进行编号)
OX4020E5IgG1 IgG1 野生型
OX4020E5IgG1K248E IgG1 K248E
OX4020E5IgG1T437R IgG1 T437R
OX4020E5IgG1K338A IgG1 K338A
OX4020E5IgG1T437R/K248E IgG1 T437R,K248E
OX4020E5IgG1T437R/K338A IgG1 T437R,K338A
OX4020E5IgG1K248E/K338A IgG1 K248E,K338A
OX40SF2IgG1 IgG1 野生型
OX40SF2IgG1T437R IgG1 T437R
OX40SF2IgG1T437R/K248E IgG1 T437R,K248E
OX40SF2IgG1T437R/K338A IgG1 T437R,K338A
抗体的表达和纯化
根据转染试剂盒说明书(Life Technologies)，使编码抗体重链(HC)和轻链(LC)的质粒以1:3(HC:LC)摩尔比共转染到Expi293F细胞中。在转染后五天使细胞旋转沉淀，将上清液通过0.2μm过滤器。抗体表达的滴度用Octet(ForteBio)进行定量。根据试剂盒说明书(GE Healthcare Life Sciences)，用预填装蛋白质A旋转柱进行抗体纯化。使经纯化的抗体通过渗析缓冲液交换到DPBS(pH7.2)中，并且通过280nm处的UV吸光度来测定蛋白质浓度。通过对还原型和非还原型样品实施高性能尺寸排阻色谱法(HP-SEC)和SDS-PAGE来评估质量。
NanoBRET蛋白质-蛋白质相互作用测定
将抗OX40SF2抗体的轻链的编码序列克隆到pNLF-C和pHTC halotag载体(Promega,Madison,WI)的分别具有C-末端Nanoluc和Halotag序列的框架内。将这些轻链与重链配对，以表达在轻链C-末端连接有Nanoluc或Halotag的Fc工程化SF2抗体。标准蛋白质A旋转柱用于纯化这些经修饰抗体。
为了通过NanoBRET蛋白质-蛋白质相互作用测定(Promega,Madison,WI)研究细胞表面的抗体多聚化，将0.25×105个HEK-Blue:OX40细胞接种到96孔测定板的各个孔中并于37℃培养过夜。次日，将含等浓度Nanoluc标记的抗体(供体)和Halotag标记的抗体(受体)的50μl测定培养基(Opti-MEM I低血清培养基，无酚红加4％FBS)施加于细胞。在实验孔中添加用50μl测定培养基以1:1000稀释的Halotag 618配体，并另外通过用测定培养基以1:1000稀释DMSO来设置无配体对照孔。在37℃下温育30min之后，将细胞用测定培养基洗涤两次并重悬于100μl测定培养基中。将用不含FBS的测定培养基以1:200稀释的25μl Nano-Glo底物添加至各个孔。在振荡30秒之后，通过Envision测量供体发射(460nm)和受体发射(618nm)。原始NanoBRET比值以milliBRET单位(mBU)计算为原始BRET＝618nmEm/460nmEm*1000。对于供体产生的背景或渗透的因素，校正NanoBRET比值以milliBRET单位计算为校正BRET＝原BRET实验样品–原BRET无配体对照样品，其反映出能量因蛋白质-蛋白质相互作用而从生物发光蛋白供体传递至荧光蛋白受体。
流式细胞术染色
通过ExpiFectamine293转染试剂盒(Life Technologies)，将表达编码人FcγRI(NM_000566)(SEQ ID NO:59)、FcγRIIA(NM_021642)(SEQ ID NO:60)、FcγRIIB(NM_004001)(SEQ ID NO:61)和FcγRIIIA(NM_000569)(SEQ ID NO:62)的cDNA的质粒(Origene)瞬时转染到Expi293F细胞中。在转染后48h进行流式细胞术测定。为了证实转染Fc受体的表达，将它们的特异性抗体即对于FcγRI的10.1(BD Pharmingen)、对于FcγRIIA的IV.3(StemCell Technologies)、对于FcγRIIB的2B6(自行制备)(Veri等人(2007)Immunology 121:392-404)和对于FcγRIIIA的3G8(BD Pharmingen)在流式细胞术染色中用作阳性对照。Raji细胞(ATCC:CCL-86)也用于测试抗OX40抗体与FcγRIIB受体的结合。
将2×105个细胞/孔接种到96孔板中并在BSA染色缓冲液(BD Biosciences,SanJose,USA)中于4℃封闭30min。将细胞与测试抗体在冰上于4℃一起孵育1.5h。在用BSA染色缓冲液洗涤两次之后，将细胞与R-PE标记的抗人或抗小鼠IgG二抗(JacksonImmunoresearch Laboratories)于4℃一起孵育45min。将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于150μL的含有1:200稀释的DRAQ7活/死染色剂的染色缓冲液(Cell SignalingTechnology,Danvers,USA)中。分别使用B2和B4通道，通过Miltenyi MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec,Auburn,USA)检测经染色细胞的PE和DRAQ7信号。活细胞根据DRAQ7排除法门化，并且测定所收集的至少10,000个活事件的几何平均荧光信号。使用FlowJo软件(Tree Star)分析。数据绘制成抗体浓度对数相对于平均荧光信号。用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)进行非线性回归分析并计算EC50值。
SEQ ID NO:59
MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHVLFYLAVGIMFLVNTVLWVTIRKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT
SEQ ID NO:60
MTMETQMSQNVCPRNLWLLQPLTVLLLLASADSQAAPPKAVLKLEPPWINVLQEDSVTLTCQGARSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIMLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSQKFSHLDPTFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLFSSKPVTITVQVPSMGSSSPMGIIVAVVIATAVAAIVAAVVALIYCRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQLEETNNDYETADGGYMTLNPRAPTDDDKNIYLTLPPNDHVNSNN
SEQ ID NO:61
MGILSFLPVLATESDWADCKSPQPWGHMLLWTAVLFLAPVAGTPAAPPKAVLKLEPQWINVLQEDSVTLTCRGTHSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIVLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSKKFSRSDPNFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLYSSKPVTITVQAPSSSPMGIIVAVVTGIAVAAIVAAVVALIYCRKKRISALPGYPECREMGETLPEKPANPTNPDEADKVGAENTITYSLLMHPDALEEPDDQNRI
SEQ ID NO:62
MAEGTLWQILCVSSDAQPQTFEGVKGADPPTLPPGSFLPGPVLWWGSLARLQTEKSDEVSRKGNWWVTEMGGGAGERLFTSSCLVGLVPLGLRISLVTCPLQCGIMWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
HEK-Blue NF-κB报告测定法
通过将OX40表达质粒(pUNO1-hOX40)转染到被工程化成在NF-κB诱导型启动子(IFN-β最小启动子)控制下表达分泌型胚碱性磷酸酶(SEAP)报告基因的HEK-BlueTM Null 1细胞中，建立稳定的表达人OX40的HEK-Blue报告细胞系(HEK-Blue:OX40)。对于报告测定法，将重悬于200μl培养基中的1×105个HEK-Blue:OX40细胞等分到96孔测定板的各孔中，并且添加OX40配体或抗OX40抗体。为了测试交联效应，在同一个测定孔中添加1μl的蛋白质G磁珠(Pierce)或1×105个Raji细胞。在37℃下温育过夜之后，使用Quanti-Blue检测试剂盒(Invivogen)，通过量化诱导的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因表达来评价抗体的激动活性。简而言之，将40μl细胞培养上清液与160μl Quanti-Blue试剂混合并于37℃温育直至显现适当的蓝色。使用SpectraMax微板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量650nm处的OD。抗OX40抗体的激动活性归一化为相对于1μg/mL OX40配体所诱导的活性百分比。
ADCC测定
通过如制造商(Promega)所指导的ADCC报告生物测定法来评价抗OX40抗体的ADCC活性。简而言之，使铺板于96孔板中的每孔25,000个HEK-Blue:OX40细胞与FcγRIIIA受体的活化导致荧光素酶报告基因表达的工程化效应细胞混合过夜。将抗OX40抗体添加至细胞中并于37℃温育6h。然后，添加Bio-Glo荧光素酶试剂并通过Envision定量荧光素酶信号。抗OX40抗体的ADCC活性表示为相对于未添加测试抗体而言，荧光素酶信号的激活倍数。
CDC测定
抗OX40抗体的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性通过补体介导的细胞杀伤测定进行评价。简而言之，将100,000个HEK-Blue:OX40细胞与兔子补体(Cedar Lane Labs)和测试抗OX40抗体在96孔板中一起温育一小时。通过细胞毒性检测试剂盒(Roche)定量由裂解的HEK-Blue:OX40细胞的细胞溶胶释放到上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)的活性。补体介导的细胞毒性表示为相对于TritonX-100所裂解的细胞毒性百分比。
ADCP测定
表达GFP的OX40靶细胞系通过用Turbo GFP转导颗粒(Sigma Aldrich)感染HEK-Blue:OX40细胞来建立。用嘌呤霉素选择稳定的表达GFP的细胞。使用不去除CD16的负人单核细胞富集试剂盒(negative human monocyte enrichment kit without CD16depletion)(StemCell Technologies)从PBMC(Biologics Specialty)分离人CD14+CD16+单核细胞。将分离的单核细胞铺于包含10％FBS的X-VIVO-10培养基(Lonza)中，并且通过添加25ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(R&D Systems)维持7天，从单核细胞分化出巨噬细胞。添加IFNγ(50ng/mL；R&D Systems)用于最终的24小时分化。对于ADCP测定，将1×105个细胞/孔的分化巨噬细胞与0.25×105细胞/孔的表达GFP的HEK-Blue:OX40细胞(4:1比率)在96孔U底板的200μl培养基(DMEM+10％FBS)中混合。添加测试抗体并将平板在37℃培养箱中温育24h。随后，将细胞用Accutase(Sigma)分离并重悬于BSA染色缓冲液中。将巨噬细胞用偶联Alexa Fluor 647(Invitrogen)的抗CD11b和抗CD14抗体(BD Biosciences)染色。使用Miltenyi MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec,Auburn,USA)，通过流式细胞术鉴定GFP阳性HEK-Blue:OX40靶细胞和Alexa647阳性巨噬细胞。用FlowJo软件(Tree Star)分析数据，用以下公式通过测量GFP荧光的减小来测定ADCP介导的细胞杀伤：所杀伤靶细胞的百分比＝((采用最低浓度抗体情况下GFP+，CD11b-，CD14-细胞的百分比)-(采用测试浓度抗体情况下GFP+，CD11b-，CD14-细胞的百分比))/(采用最低浓度抗体情况下GFP+，CD11b-，CD14-细胞的百分比)×100。
实施例4具有单独或组合K248E、K338A和T437R突变的抗OX40抗体的表征
抗体激动作用
最近研究指示，FcγRIIB可提供交联活性并且有利于抗TNFR超家族成员抗体的激动活性(Li等人(2012)Cell Cycle 11:3343-4)。因此，将单独和组合的突变K248E、K338A和T437R对所产生抗体OX4020E5IgG1K248E、OX4020E5IgG1T437R、OX4020E5IgG1K338A、OX4020E5IgG1T437R/K248E、OX4020E5IgG1T437R/K338A和OX4020E5IgG1K248E/K338A(如表3所示)的激动性质的影响在溶液中以及与人B类成淋巴Raji细胞交联之后进行测试，该人B类成淋巴Raji细胞在HEK-BlueTM报告测定法中主要表达FcγRIIB(Rankin等人(2006)Blood108:2384-91)。
图2A示出单独突变的抗体OX4020E5IgG1K248E、OX4020E5IgG1T437R和OX4020E5IgG1K338A在溶液中的激动活性，激动活性被估计为相对于OX40配体(OX40L)的活性百分比(％)。所有抗体在溶液中均展示激动作用。与Daudi细胞交联进一步提高激动作用，具有T437R突变的抗体展示出最高激动活性(图2B)。当相比于野生型IgG1抗体时，所有双突变抗体OX4020E5IgG1T437R/K248E、OX4020E5IgG1T437R/K338A和OX4020E5IgG1K248E/K338A在溶液中展示出增强的激动活性(图2C)。当与Daudi细胞交联时，OX4020E5IgG1T437R/K248E(图2D)和OX4020E5IgG1T437R/K338A(图2E)的激动活性显著地提高，水平比野生型抗体OX4020E5IgG1所观察的更高(图2F)。与Daudi细胞交联的OX4020E5IgG1T437R也增强该抗体的激动活性(图2G)。
第二抗OX40抗体SF2的VH/VL区(VH：SEQ ID NO:51，VL：SEQ ID NO:52)也被工程化到单独或组合突变的Fc结构域上，以产生抗体OX40SF2IgG1T437R、OX40SF2IgG1T437R/K248E和OX40SF2IgG1T437R/K338A。测试这些抗体在溶液中以及与Daudi细胞交联时的激动作用。类似于工程化20E5抗体，具有T437R或T437R/K248E和T437R/K338A突变的SF2-衍生的抗体与野生型亲本抗体相比时在溶液中具有增强的激动作用(即不依赖于交联的激动作用)(图3A)。与Daudi细胞交联增强了OX40SF2IgG1T437R(图3B)和OX40SF2IgG1T437R/K248E(图3C)的激动作用。
当抗体与Raji细胞(衍生自表达FcγRIIB的B细胞的另一种细胞系)交联时，观察到工程化抗OX40SF2抗体的激动作用增强的类似效应。交联被证实为FcγRIIB介导的，原因是抗FcγRIIB抗体2B6阻断了Raji-细胞介导的OX40SF2IgG1T437R(图4A)和OX40SF2IgG1T437R/K248E(图4B)的激动作用的增强。
抗体多聚化
通过尺寸排阻色谱法在溶液中评价工程化抗OX40 SF2抗体的聚集态。简而言之，将抗体注入到TSKgel G3SW柱(Tosoh Bioscience LLC)上并通过色谱法分析其尺寸。具有Fc突变的工程化抗体具有在约8.5分钟处洗脱的主蛋白峰(类似于具有天然IgG1 Fc的抗体)，指示出工程化抗体在溶液中的主要单体形式。一些抗体示出高分子量蛋白峰的次要级分(<5％)，其可为抗体的低聚物形式。
为了评价工程化抗体在细胞表面结合抗原时是否多聚化，在工程化抗OX40 SF2抗体上实施NanoBRET蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)测定(Promega,Madison,WI)。具有天然IgG1以及具有T437R、T437R/K248E或E345R突变的SF2抗体被进一步工程化成在轻链C末端连接有Nanoluc标记或Halotag而分别作为供体和受体。NanoBRET PPI测定通过将供体和受体抗体用于稳定表达OX40的HEK-BlueTM细胞来进行。所计算的校正NanoBRET比反映多聚化抗体的结合。
标记的抗体在报告测定法中示出与对应未标记抗体相当的功能活性，这指示轻链的标记并不影响抗体的功能特性。在NanoBRET PPI测定中，OX40SF2IgG1和OX40SF2IgG1T437R示出背景校正NanoBRET比(图5)。相比之下，具有OX40SF2IgG1T437R/K248E的SF2抗体示出10ng/mL至1000ng/mL浓度内较高的校正NanoBRET比(图5)，这指示抗体在细胞表面多聚化。
结合各种FcγR的抗体
工程化抗OX40 SF2抗体与表达于瞬时转染的Expi293F细胞的各种FcγR受体的结合通过如实施例3所述的流式细胞术进行评估。
突变T437R或K248E均不影响变体抗体与FcγRI或FcγRIIIA的结合，原因是单体OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E抗体在溶液中以相比于野生型抗体OX40SF2IgG1时类似的结合特性来结合这些受体。抗体还示出相比于OX40SF2IgG1时与FcγRIIA和FcγRIIB类似的结合效能。表4示出结合的EC50值。另外通过流式细胞术评估工程化抗OX40 SF2抗体与Raji细胞、表达FcγRIIB的B细胞系的结合。虽然FcγRIIB的表达可通过FcγRIIB抗体2B6进行检测，观察到工程化抗OX40(SF2)或OX40SF2IgG1抗体均不与Raji细胞有显著结合，这可能是由于相比于异位转染细胞而言Raji细胞中的FcγRIIB的表达较低(未示出数据)。
表4：
实施例5：工程化成效应子沉默形式的抗OX40抗体的表征
将各种抗体克隆到效应子沉默Fc同种型上，表达，纯化并根据实施例3所述的方法表征。所产生的抗体在表5中示出。
表5：
抗体聚集
通过如实施例3所述的尺寸排阻色谱法在溶液中评价工程化抗体的聚集态。工程化抗体具有在约8.5分钟处洗脱的主蛋白峰(类似于具有天然IgG1Fc的对应抗体)，指示出工程化抗体在溶液中的主要单体形式。它们中的一些(主要为IgG4PAA抗体)示出高分子量蛋白峰的次要级分(<3％)，其可为抗体的低聚物形式。
T437R/K248E突变挽救Fc效应子功能沉默抗体的激动作用
使用HEK-BlueTMNFκB报告测定法，评价OX40SF2IgG2sigma、OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E、OX40SF2IgG4PAA和OX40SF2IgG4PAA/T437R/K248E在溶液中或与Raji细胞交联的激动活性。OX40SF2IgG2sigma或OX40SF2IgG4PAA在溶液中均不具有激动活性，而OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E和OX40SF2IgG4PAA/T437R/K248E两者中的T437R/K248E突变挽救了激动作用(图6)。与Raji细胞交联至多微小地增强激动活性(未示出数据)。
实施例6：工程化抗体的效应子功能
如实施例3所述的那样评价具有T437R或T437R/K248E突变的工程化抗OX40抗体介导ADCC、ADCP和CDC的能力。
当相比于野生型抗体OX40SF2IgG1时，OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E均以改善的效能介导ADCC(图7)。突变并未挽救先前效应子沉默抗体的ADCC，原因是OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E和OX40SF2IgG4PAA/T437R/K248E两者仍然不能介导ADCC(未示出数据)。
OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E两者以与野生型OX40SF2IgG1所介导的相当水平来介导ADCP(图8)。当相比于野生型抗体OX40SF2IgG1时，OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E还以改善的效能介导CDC(图9A)。突变部分挽救先前效应子沉默抗体的ADCP，原因是相对于OX40FS2IgG2sigma所观察，OX40SF2IgG2sigmaT437R/K248E的ADCP活性在较高的浓度下有所升高(图9B)。
实施例7：Tg32半合子小鼠中具有T437R和T437R/K248E突变的抗体的药代动力学 特性
方法对十八只Tg32半合子小鼠(Jackson Labs)经尾静脉以2mg/kg剂量静脉内注射测试抗体(OX40SF2IgG1T437R，OX40SF2IgG1T437R/K248E或OX40SF2IgG1)，每组5只动物。时间点选取在注射后1小时、1天、3天、7天、14天和21天。在指定时间点从CO2麻醉的小鼠连续眶后放血，并且通过心脏穿刺终端取血(terminal bleeds)。在室温下30分钟之后，将血样以2500rpm离心15分钟并收集血清用于分析。
通过电化学发光免疫测定法测定血清样品中人IgG的浓度。将链霉抗生物素蛋白-金多阵列96孔板(Meso Scale Discovery)用50μL/孔的5μg/mL生物素酰化山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch#109-055-088)于4℃包被过夜，并且用含有0.05％Tween的Tris缓冲盐溶液洗涤。将血清样品和标准物用Starting Block(Thermo Scientific)稀释，添加至平板并在室温下摇动器上温育2小时。在摇动器上使用1.5μg/mL的Sulfo-TAG标记的小鼠抗人Fc抗体R10Z8E9维持2小时来检测结合的抗体。洗涤平板，添加读取缓冲液T(MesoScale Discovery)并在MSD Sector Imager 6000上读取平板。
为了确定PK血清样品是否具有可影响测试样品PK的显著的免疫滴度，在用相应测试物质以10μg/m在4℃下包被过夜的96孔板(Nunc Maxisorb#446612)上实施ELISA。将血清样品用1％BSA-PBS稀释并在平板上温育。使用辣根过氧化物酶缀合的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)检测捕集的抗体；然后添加OPD或TMB以用于底物显色。读取平板，并且将比缓冲液或对照血清值大三倍的分光光度计读数被视为阳性，并且表示为1:1倍稀释。
使用Prism 6.02版软件(GraphPad Software,Inc)，利用通过自然对数浓度对时间的线性回归拟合的1-期指数衰减模型来测定PK研究的消除期的最终半衰期(t1/2)计算。最小二乘非线性衰减模型通过1/拟合的浓度进行加权。消除期的半衰期计算使用式t1/2＝ln2/β来确定，其中β是通过第一剂量后起始的最小二乘回归分析拟合的线的-斜率。通过对测试组内各动物所计算的t1/2值取平均值来确定抗体的最终半衰期值。
结果
抗体的血清IgG浓度相对时间的曲线显示在半对数图上随时间推移下降(图10)。测试动物的免疫应答。给予OX40SF2IgG1T437R/K248E的小鼠在7天、14天和21天示出显著的免疫滴度(1:1000–1:14,000)。
血清水平归一化为曲线线性期的第一时间点，以强调抗体的PK特征间的差异。1h的第一时间点指示小鼠被完全给予剂量。仅使用具有三个或更多个数据点的动物，并且第7天、14天或21天具有免疫滴度的动物的值被排除在外。
结果示出相比于野生型抗体的半衰期，包含T437R突变的抗体具有较短的半衰期。各种抗体的半衰期值是：OX40SF2IgG1T437R，t1/2＝3.9±2.1天；OX40SF2IgG1 T437RK248E，t1/2＝2.4±0.8天；以及OX40SF2IgG1，t1/2＝11.3±1.1天。
概括地说，PK研究表明当相比于具有11天半衰期的野生型IgG1抗体时，OX40SF2IgG1T437和OX40SF2IgG1T437R/K248E半衰期值短3-4倍，这在小鼠研究的正常范围之内。然而，PK结果的解释由显著地影响血清IgG水平的测试动物的免疫应答构成，尤其是对于OX40SF2IgG1T437R/K248E的组。因为这些小鼠中所观察到的任何免疫应答不对应于人体中所期望的，小鼠中所观察的较短半衰期值不可反映正常人IgG循环血清半衰期。
实施例8：IgG2和IgG4同种型情形中K248E和T437R突变对抗体多聚化和激动作用的影响的结构合理化
IgG1与IgG2、IgG1与IgG3、以及IgG1与IgG4之间的序列差异经由它们的CH3结构域与多聚体模型对准而分别映射到IgG2 Fc和IgG4 Fc的晶体结构上。序列差异的位置被鉴定为结构上远离K248和T437两者位置。类似于IgG1，IgG2和IgG4Fc结构以上述方式对准导致并置的Fc结构域的CH2结构域之间碰撞，这表明这些结构域将必须相对它们观察的构象重新定向，从而使Fc结构域包装为多聚体模型。对于IgG1，假设CH2结构域中的K248与CH3结构域中的E380之间的分子内盐桥相互作用被K248E突变破坏可弱化CH2:CH3界面，从而有助于CH2结构域重新取向和多聚化。该盐桥相互作用在IgG2和IgG4的结构中是保守的；因此，K248E突变的引入将被假定为功能类似于IgG1。此外，因为多聚体模型中Fc CH3:CH3间界面处的残基在IgG1、IgG2、IgG3和IgG4间是保守的，引入到IgG2、IgG3或IgG4中的T437R突变被假定通过与相邻Fc中的E382形成盐桥相互作用来增强该界面，如对IgG1初始所假定。总而言之，K248E和T437R突变通过实验发现多聚化并且增强不依赖于IgG亚型(IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)的抗TNFR抗体的激动作用，这符合结构模型所作的观察。虽然这些突变在邻近Fc-FcRn结合界面的位置处，这些残基不直接接触FcRn(Martin等人(2001)Mol Cell 7:867-77)。
实施例9：FcRn转基因SCID小鼠中具有T437R/K248E突变的抗体的药代动力学特性
方法对于抗体PK研究，将4-8周龄的雌性Tg32纯合SCID小鼠(Stock 018441,Jackson Laboratory)经尾静脉以2mg/kg剂量静脉内注射测试抗体，每组5只动物。在指定时间点从CO2麻醉的小鼠获得连续眶后放血，并通过心脏穿刺终端取血(terminalbleeds)。在室温下30分钟之后，将血样以3,000×g离心15分钟并收集血清用于分析。PK研究由实验动物管理和使用委员会(Janssen Research&Development,LLC)批准。
使用电化学发光免疫测定法测定小鼠血清中的人IgG。将链霉抗生物素蛋白-金96孔板(Meso Scale Diagnostics)用50μL/孔的含2.5μg/mL生物素酰化山羊抗人IgG F(ab’)2抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)的Starting Block T20(ThermoScientific)于4℃包被过夜。将平板用含有0.5％Tween 20的Tris缓冲盐溶液(TBST)洗涤；将用2％牛血清白蛋白-TBST稀释的样品和标准物添加至平板并在摇动器上于室温温育2小时。用Sulfo-TAG标记的R10Z8E9即抗人Fcγ-pan抗体检测结合的抗体。洗涤平板，添加200μL MSD读取缓冲液，并且在MSD Sector Imager 6000(Meso Scale Diagnostics)上读取平板。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software)中的5参数非线性回归程序，由标准曲线确定Ab的血清浓度。
使用GraphPad Prism 6(GraphPad软件)，利用通过自然对数浓度对时间的非线性回归拟合的1-期指数衰减模型来测定PK研究的消除期(β期)的最终半衰期(t1/2)计算。消除期(β期)的半衰期使用式t1/2＝ln2/β计算，其中β是通过第1天后起始的最小二乘回归分析拟合的线的负斜率。最终抗体半衰期值是测试组内的t1/2平均值。各抗体相对于IgG1的值通过t检验进行比较，并且p值<0.05指示显著的差异。
结果
实施第二PK研究以在FcRn转基因SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠中评价OX40SF2IgG1T437R和OX40SF2IgG1T437R/K248E，所述小鼠缺乏功能性B和T淋巴细胞并因此对测试抗体具有最小限度的免疫应答。对Tg32纯合SCID小鼠(5只小鼠/组)经静脉内注射2mg/kg剂量的抗体。在注射后1小时以及1天、3天、7天、14天和21天获得各动物的连续眶后放血。制备血清并通过电化学发光免疫测定法测定人IgG的量。各抗体的平均血清浓度示于图11。对于所有样品，血清浓度在21天过程内存在线性下降并且未在测试组间观察到显著的差异(p<0.05)。半衰期值t1/2如下估计：OX40SF2IgG1T437R，t1/2＝9.5±0.7天；OX40SF2IgG1T437R/K248E，t1/2＝8.3±0.5天；OX40SF2IgG1，t1/2＝9.2±0.6天。这些数据显示工程化抗体的PK特征与具有天然IgG1Fc的抗体相当。
在该PK研究中，使用SCID小鼠显著地降低了对测试抗体的小鼠免疫应答，这与使用非SCID小鼠的先前PK研究中的结果复合。因此，SCID小鼠中所观察到的可比较PK特征将反映正常人IgG循环血清半衰期。
实施例10：工程化抗体与FcRn的结合
方法竞争性结合FcRn的体外测定
竞争性结合测定用于评估不同抗体样品与具有聚组氨酸亲和标记的重组人FcRn胞外结构域(FcRn-His6)的相对亲和力。九十六孔镀铜板(Thermo Scientific)用于捕获以5μg/mL溶于PBS的FcRn-His6，然后将平板用0.15M NaCl、0.02％ Tween 20洗涤，随后用封闭剂(0.05M MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]、0.025％牛血清白蛋白(BSA)、0.001％ Tween-20(pH6.0)、10％ chemiBLOCKER(Millipore))温育。如上洗涤平板，然后在1μg/mL固定浓度的指示抗体(生物素酰化人IgG1单克隆抗体)存在下，将用封闭剂系列稀释的竞争测试抗体添加到平板中。将平板在室温下温育1小时，如上洗涤三次，然后在室温下用1:10,000稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)温育30分钟以结合生物素酰化抗体。将平板如上洗涤五次，并且结合的链霉抗生物素蛋白-HRP通过添加具有稳定终止的TMB(3,3′,5,5′-四甲基对二氨基联苯)过氧化物酶底物(Fitzgerald Industries International)并温育4分钟进行检测。通过添加0.5M HCl终止显色。用SpectraMax Plus384读板机(Molecular Devices)在450nm波长处测定光密度。
结果
因为T437R和K248E突变均位于靠近对FcRn受体的已知结合位点处，使用体外竞争性结合测定来评价我们的变体抗体与FcRn有适当相互作用的这些突变的可能干扰。相对于OX40SF2IgG1(IC50:1.5μg/ml)，OX40SF2IgG1T437R/K248E和OX40SF2IgG1T437R均在与生物素酰化人IgG1竞争结合FcRn中表现出明显类似的效力(分别IC50:1.6μg/ml和1.1μg/ml)，这指示工程化突变对FcRn结合几乎没有乃至没有明显影响。在不存在其他潜在影响PK的影响下，该结果预测T437R和K248E突变将不对血清半衰期有显著影响。
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Claims (56)

1.一种分离的工程化抗肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员抗体，其中当相比于亲本野生型抗体时，所述抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中当相比于亲本野生型抗体时，所述抗体具有增强的激动活性。
3.根据权利要求2所述的抗体，所述抗体包含T437R突变。
4.根据权利要求3所述的抗体，所述抗体包含T437R/K248E突变。
5.根据权利要求4所述的抗体，所述抗体包含T437R/K338A突变。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体介导抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其中所述抗体介导补体依赖性细胞毒性（CDC）。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其中所述抗体还包含第二突变。
11.根据权利要求10所述的抗体，其中所述第二突变为IgG1上的L234A/L235A突变、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变、IgG4上的F234A/L235A突变、IgG4上的S228P/F234A/L235A突变、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A突变、IgG2上的V234A/G237A突变、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M突变、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S突变、IgG1上的L234F/L235E/D265A突变、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S突变、或IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S突变。
12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述第二突变为IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
13.根据权利要求11所述的抗体，其中所述第二突变为IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
14.根据权利要求11所述的抗体，其中所述第二突变为IgG4上的S228P/F234A/L235A突变。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述TNFR超家族成员为OX40（SEQ IDNO: 4）、CD27（SEQ ID NO: 8）、CD40（SEQ ID NO: 5）、CD137（SEQ ID NO: 10）或GITR（SEQID NO: 23）。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有不依赖于抗体交联的激动活性。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的重链恒定区。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
19.一种增强受试者中抗TNFR超家族成员抗体的激动活性的方法，所述方法包括提供所述抗TNFR超家族成员抗体；将T437R突变、K248E突变、K338A突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变引入所述抗体中，以生成特异性结合所述TNFR超家族成员的工程化抗体；以及将所述工程化抗体施用于所述受试者。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗体介导ADCC、ADCP或CDC。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述抗体还包含第二突变。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二突变为IgG1上的L234A/L235A突变、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变、IgG4上的F234A/L235A突变、IgG4上的S228P/F234A/L235A突变、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A突变、IgG2上的V234A/G237A突变、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M突变、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S突变、IgG1上的L234F/L235E/D265A突变、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S突变、或IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S突变。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二突变为IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二突变为IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二突变为IgG4上的S228P/F234A/L235A突变。
26.根据权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的重链恒定区。
27.根据权利要求19-26中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述实体瘤为黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）、非鳞状NSCLC、结直肠癌、前列腺癌、去势难治性前列腺癌、胃部癌症、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌或癌症的转移性病变。
30.根据权利要求19-29中任一项所述的方法，其中所述TNFR超家族成员为OX40（SEQID NO: 4）、CD27（SEQ ID NO: 8）、CD40（SEQ ID NO: 5）、CD137（SEQ ID NO: 10）或GITR（SEQ ID NO: 23）。
31.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将特异性结合TNFR超家族成员的抗体施用于所述受试者足以治疗所述癌症的时间，当相比于亲本野生型抗体时，所述特异性结合TNFR超家族成员的抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗体包含T347R突变。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗体包含T437R/K248E突变。
34.根据权利要求31所述的抗体，其中所述抗体包含T437R/K338A突变。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中当相比于所述亲本抗体时，所述抗体具有增强的激动活性。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的方法，其中所述抗体还包含第二突变。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二突变为IgG1上的L234A/L235A突变、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S突变、IgG4上的F234A/L235A突变、IgG4上的S228P/F234A/L235A突变、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A突变、IgG2上的V234A/G237A突变、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M突变、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S突变、IgG1上的L234F/L235E/D265A突变、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S突变、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S突变、或IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S突变。
38.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的重链恒定区。
39.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）、非鳞状NSCLC、结直肠癌、前列腺癌、去势难治性前列腺癌、胃部癌症、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌或癌症的转移性病变。
40.根据权利要求31-39中任一项所述的方法，其中所述TNFR家族的受体为OX40（SEQID NO: 4）、CD27（SEQ ID NO: 8）、CD40（SEQ ID NO: 5）、CD137（SEQ ID NO: 10）或GITR（SEQ ID NO: 23）。
41.一种分离的含Fc结构域分子，所述分离的含Fc结构域分子在所述Fc结构域中包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变。
42.根据权利要求41所述的含Fc结构域分子，所述含Fc结构域分子包含T437R突变。
43.根据权利要求41所述的含Fc结构域分子，所述含Fc结构域分子包含T437R/K248E突变。
44.根据权利要求41所述的含Fc结构域分子，所述含Fc结构域分子包含T437R/K338A突变。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的含Fc结构域分子，其中所述Fc结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的含Fc结构域分子，其中所述含Fc结构域分子为单克隆抗体。
47.根据权利要求41-46中任一项所述的含Fc结构域分子，所述含Fc结构域分子包含SEQ ID: 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的氨基酸序列。
48.一种分离的多核苷酸
a.编码在Fc结构域中包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变的含Fc结构域分子；
b.编码SEQ ID NO: 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74的Fc结构域；或
c.包含SEQ ID NO: 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或86的多核苷酸序列。
49.一种载体，所述载体包含根据权利要求48所述的多核苷酸。
50.根据权利要求49所述的载体，所述载体为表达载体。
51.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求49或50所述的载体。
52.一种制备根据权利要求41所述的含Fc结构域分子的方法，所述方法包括在其中表达所述含Fc结构域分子的条件中培养根据权利要求51所述的宿主细胞，并且分离所述含Fc结构域分子。
53.一种用于治疗癌症的分离的抗肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员抗体，当相比于亲本野生型抗体时，所述分离的抗肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
54.根据权利要求53所述用于治疗癌症的抗体，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）、非鳞状NSCLC、结直肠癌、前列腺癌、去势难治性前列腺癌、胃部癌症、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌或癌症的转移性病变。
55.分离的抗肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员抗体在制造用于治疗癌症的药剂中的用途，所述分离的抗肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员抗体包含T437R突变、T437R/K248E突变或T437R/K338A突变，残基根据EU索引进行编号。
56.根据权利要求35所述的用途，其中所述癌症为黑色素瘤、肺癌、鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）、非鳞状NSCLC、结直肠癌、前列腺癌、去势难治性前列腺癌、胃部癌症、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈部的鳞状细胞癌、食道癌或胃肠道癌、乳腺癌、输卵管癌、脑癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌或癌症的转移性病变。
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