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CN109789212A - 聚谷氨酸化抗叶酸剂及其用途 - Google Patents

聚谷氨酸化抗叶酸剂及其用途 Download PDF

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CN109789212A CN201780062078.8A CN201780062078A CN109789212A CN 109789212 A CN109789212 A CN 109789212A CN 201780062078 A CN201780062078 A CN 201780062078A CN 109789212 A CN109789212 A CN 109789212A
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C·尼基萨
V·M·莫约
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Abstract

本公开总体上涉及聚谷氨酸化抗叶酸剂、含有填充有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体的制剂、制备聚谷氨酸化抗叶酸剂和含脂质体的制剂的方法，以及使用聚谷氨酸化抗叶酸剂和含脂质体的制剂来治疗骨髓增生性病症(例如癌症)和免疫系统病症(例如自身免疫疾病，如类风湿性关节炎)的方法。

Description

聚谷氨酸化抗叶酸剂及其用途
相关案例
本申请基于并要求2016年8月12日在美国专利和商标局提交的美国临时专利申请no.62/374,458在35 U.S.C.§119下的优先权，所述临时专利申请的全部内容通过引用结合于此。本申请还要求2017年8月11日提交的美国申请No.15/675,695和2017年8月11日提交的美国申请No.15/675,701的优先权。每个美国申请的内容以其整体并入本文。本文提及的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。
背景技术
本公开总体上涉及L-γ聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，其包括填充有聚谷氨酸化抗叶酸剂的递送媒剂如靶向和非靶向脂质体，以及制备和使用所述组合物治疗疾病的方法，所述疾病包括过度增殖性疾病如癌症、免疫系统病症如类风湿性关节炎和感染性疾病如HIV。
叶酸对于细胞生长和组织再生是必不可少的。哺乳动物细胞不能从头合成叶酸，并依赖于三种主要叶酸摄取系统摄取的细胞外叶酸：一种还原型叶酸载体(RFC)系统；叶酸受体(FR)α和β系统；和叶酸同向转运体(PCFT)系统。靶向叶酸依赖性生物合成途径的抗叶酸剂起抗增殖剂的作用。天然存在的叶酸通过酶叶酰聚谷氨酰合成酶(FPGS)的作用以聚谷氨酸形式存在于细胞内，其可以在与叶酸底物的L-γ肽键中添加多达6个谷氨酰基。聚谷氨酸化至少有三个主要目的：(1)它促进细胞内叶酸在可以自由转运进出细胞的大量单谷氨酸池中的积累；(2)它允许选择性地细胞内保留这些相对大的阴离子分子；和(3)它极大地增强了叶酸辅因子对几种叶酸依赖性酶的亲和力，包括胸苷酸合成酶和AICAR转化酶(参见例如图2)。
抗叶酸剂是一类抗增殖剂，其在70多年前首次作为“叶酸模拟分子”细胞毒性剂开发。其基本原理是设计一类分子，这些分子可以利用生理叶酸转运机制及其在细胞分裂过程中促进DNA复制的细胞内作用模式抵消叶酸在快速复制细胞如癌细胞中的作用。具体地，设计抗叶酸剂以模拟叶酸的全身转运、生理细胞摄取(例如，通过还原型叶酸载体(RFC)和质子偶联的叶酸转运体(PCFT))和细胞内加工。抗叶酸剂在DNA和RNA合成期间特异性地起作用，在细胞周期的S期期间发挥细胞毒性作用。因此，它们对快速分裂的细胞如恶性和骨髓细胞具有更大的毒性作用。
抗叶酸剂因其抑制叶酸代谢而被广泛认可。主要的抗叶酸剂酶靶标和靶向这些酶的示例性抗叶酸剂包括：(a)二氢叶酸还原酶(DHFR)[例如，甲氨蝶呤(MTX)和普拉曲沙]，(b)胸苷酸合成酶(TS)[例如，雷替曲塞(RTX)、GW1843U和培美曲塞(PMX)]，(c)β-甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶(GARFTase)[例如，洛美曲索(LMX)、PMX]和(d)5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶(AICARFTase)[例如，PMX]。上述酶的抑制抑制了从头的核苷酸生物合成，导致嘌呤和嘧啶前体的不平衡，并使细胞不能进行准确的DNA复制，最终导致细胞死亡。因此，叶酸代谢途径的抑制剂在治疗包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤在内的过度增殖性疾病以及如类风湿性关节炎的免疫系统病症中起重要作用就不足为奇了。
上述抗叶酸剂中的每一种都通过还原叶酸载体(RFC)转运，RFC是生理pH下的主要转运系统。RFC在正常和患病细胞中普遍表达，因此这些药物具有剂量限制性毒性，这是癌症化疗的主要障碍。
培美曲塞(以商品名商业销售)是含有6-5稠合吡咯并[2,3-d]嘧啶核的抗叶酸剂，其抑制胸苷酸合成酶(TS)、甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶(GARFT)和二氢叶酸还原酶(DHFR)、参与胸苷和嘌呤核苷酸合成的叶酸依赖性酶。与甲氨蝶呤一样，培美曲塞通过RFC和膜叶酸结合蛋白转运到细胞中，其中它被叶酰聚-γ-谷氨酸合成酶聚谷氨酸化。与培美曲塞单谷氨酸相比，培美曲塞的聚谷氨酸化形式具有更大的细胞内保留并且对TS和GARFT具有更大的亲和力。培美曲塞被批准用于治疗间皮瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)。骨髓抑制通常是培美曲塞疗法的剂量限制性毒性，并且限制了该药物的临床应用。现在使用叶酸和维生素B预治疗可以改善最常见的副作用，包括骨髓抑制、疲劳和皮疹。
癌症治疗的挑战之一是向癌细胞递送细胞毒性剂，同时最小化和/或降低这些药剂对正常健康细胞的作用。为了解决抗叶酸剂在正常细胞中的毒性，WO 2016/25882描述了使用例如对许多癌细胞表达的叶酸受体具有特异性亲和力的抗体靶向癌细胞的抗叶酸剂的脂质体制剂。该制剂可以降低和/或最小化抗叶酸剂对健康细胞的作用，这意味着患者可以经历较少的副作用。
尽管使用抗叶酸剂治疗癌症和其它过度增殖性疾病方面取得了进展，但还需要另外的组合物和方法来改善功效并降低与抗叶酸剂疗法相关的剂量限制性毒性。本公开提供了满足这些需求的组合物和方法。
发明内容
本公开总体上涉及聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，其包括填充有聚谷氨酸化抗叶酸剂的递送媒剂如脂质体，以及制备和使用所述组合物治疗疾病的方法，所述疾病包括过度增殖性疾病如癌症、免疫系统病症如类风湿性关节炎和感染性疾病如HIV。本公开还涉及五谷氨酸化和六谷氨酸化抗叶酸剂组合物，其包括填充有五谷氨酸化和六谷氨酸化抗叶酸剂的递送媒剂如脂质体，以及制备和使用所述组合物治疗疾病的方法，所述疾病包括过度增殖性疾病、免疫系统病症和感染性疾病。
作为实例而非限制，本公开描述了脂质体组合物，其含有聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化和六谷氨酸化)形式的抗叶酸剂MTX、PMX、LTX、AG2034、RTX、吡曲克辛、普拉曲沙、AG2034、GW1843、氨基蝶呤和LY309887。与抗叶酸剂在其施用的单谷氨酸化状态下的细胞毒性相比，这些组合物通过提供更多细胞毒性有效负载(例如，聚谷氨酸化抗叶酸剂)的优先递送，提供了向癌细胞递送抗叶酸剂的功效和安全性的改善。本公开还提供了靶向脂质体组合物，其含有对目标靶细胞表面上表达的表位(抗原)具有特异性亲和力的靶向部分。靶向脂质体通过特异性地将聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂递送至靶细胞，进一步改善向癌细胞递送抗叶酸剂的功效和安全性。
在一些实施方案中，本公开提供了包含聚谷氨酸化抗叶酸剂(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)的组合物。在其它实施方案中，所述组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在其它实施方案中，所述组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。根据一些实施方案，聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组中的一个或多个成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，聚谷氨酸化成员是五谷氨酸化的。在其它实施方案中，聚谷氨酸化成员是六谷氨酸化的。
在一个实施方案中，所述组合物包含聚谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含五谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含六谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。
在一个实施方案中，所述组合物包含聚谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，所述组合物包含五谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，所述组合物包含六谷氨酸化PMX。
在另一个实施方案中，所述组合物包含聚谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含五谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含六谷氨酸化的MTX。
在另一个实施方案中，所述组合物包含聚谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含五谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含六谷氨酸化的RTX。
在另一个实施方案中，所述组合物包含聚谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含五谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，所述组合物包含六谷氨酸化的LTX。
在另外的实施方案中，本公开提供脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(LPA)组合物，其包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂。例如，聚谷氨酸化抗叶酸剂可以在脂质体内的HEPES缓冲溶液中。在另一个实施方案中，LPA组合物是聚乙二醇化的(PLPA)。在一些实施方案中，PLPA组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，PLPA组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，PLPA脂质体是阴离子性或中性的。在其它实施方案中，PLPA脂质体是阳离子性的。在一些实施方案中，PLPA组合物包含至少10％、至少20％或至少30％脂质体包埋的聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，PLPA脂质体的直径为20nm至200nm、30nm至175nm或50nm至150nm。在一些实施方案中，PLPA脂质体的直径为30nm至175nm或50nm至150nm。在另一个实施方案中，PLPA脂质体的直径为80nm至120nm。
在一些实施方案中，PLPA组合物包含选自由以下组成的组的聚谷氨酸化抗叶酸剂：聚谷氨酸化MTX、聚谷氨酸化PMX、聚谷氨酸化LTX、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化RTX、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化的。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化的。在一个实施方案中，PLPA组合物包含聚谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含五谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含六谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。在一个实施方案中，PLPA组合物包含聚谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含五谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含六谷氨酸化PMX。
在另一个实施方案中，PLPA组合物包含聚谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，PLPA包含五谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，PLPA包含六谷氨酸化的MTX。
在另一个实施方案中，PLPA组合物包含聚谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含五谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含六谷氨酸化的RTX。
在另一个实施方案中，PLPA组合物包含聚谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含五谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，PLPA组合物包含六谷氨酸化的LTX。
在一些实施方案中，本公开提供脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，其中脂质体是聚乙二醇化的并且包含聚谷氨酸化抗叶酸剂和与PEG和脂质体的外部中的一个或两个连接的靶向部分，并且其中靶向部分对目标靶细胞上的表面抗原具有特异性亲和力。在一些实施方案中，靶向部分是多肽。在其它实施方案中，靶向部分是抗体或抗体片段。在另外的实施方案中，靶向部分包含抗体、人源化抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体中的一种或多种。在另外的实施方案中，靶向部分对肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异性亲和力，所述抗原存在于肿瘤细胞上但在非肿瘤细胞上不存在或不可接近。在一些实施方案中，靶向部分-PLPA还包含安置在PEG和脂质体外部的至少一个上的免疫刺激剂、可检测标记物和马来酰亚胺中的一种或多种。在一些实施方案中，靶向部分-PLPA脂质体是阴离子性或中性的。在其它实施方案中，靶向部分-PLPA脂质体是阳离子性的。在一些实施方案中，靶向部分-PLPA组合物包含至少10％脂质体包埋的聚谷氨酸化抗叶酸剂。在另外的实施方案中，靶向部分-PLPA脂质体的直径为20nm至200nm。在另一个实施方案中，脂质体的直径为80nm至120nm。
在一些实施方案中，靶向部分-PLPA包含多肽靶向部分，如抗体或抗体片段，并且靶向部分以0.5x10-10至10x10-6范围内的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原，如使用BIACORE分析所测定。在其它实施方案中，靶向部分包含特异性结合叶酸受体的多肽。在一些实施方案中，由靶向部分结合的叶酸受体是选自由以下组成的组中的一种或多种叶酸受体：叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ)。
本公开还提供杀死过度增殖细胞的方法，其包括使过度增殖细胞与PLPA和/或LPA组合物接触。在一些实施方案中，过度增殖细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述方法在体内进行。在一些实施方案中，所述方法在体外进行。在其它实施方案中，癌细胞是原代细胞或来自获自/来源于选自由以下组成的组的癌症的细胞系的细胞：肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和恶性血液病。
在另外的实施方案中，本公开提供了用于治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌症风险的受试者施用有效量的脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂(LPA)组合物和/或聚乙二醇化LPA(PLPA)组合物。在一些实施方案中，施用所述方法以治疗选自由以下组成的组的癌症：肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和恶性血液病。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的一个或多个成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在其它实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，施用的组合物包含聚谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在其它实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在其它实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX。在一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的PMX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的MTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的MTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的RTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的RTX。在另外的实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的LTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的LTX。
在另外的实施方案中，本公开提供了用于治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌症风险的受试者施用有效量并且其中将脂质体任选地聚乙二醇化。在一些实施方案中，施用所述方法以治疗选自由以下组成的组的癌症：肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和恶性血液病。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的一个或多个成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在其它实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，施用的组合物包含聚谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在一些实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在一些实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的PMX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的MTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的MTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的RTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的RTX。在另外的实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的LTX。在另外的实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的LTX。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌症风险的受试者施用有效量的LPA组合物和/或聚乙二醇化LPA(PLPA)组合物，其中PLPA和/或LPA组合物还含有靶向部分，其对癌症上的表面抗原(表位)具有特异性亲和力。在其它实施方案中，本公开提供了用于治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌症风险的受试者施用脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，所述组合物包含聚谷氨酸化抗叶酸剂和对叶酸受体具有特异性结合亲和力的靶向部分，所述癌症在其表面上表达由靶向部分结合的叶酸受体。在其它实施方案中，靶向部分对叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和/或叶酸受体δ(FR-δ)具有特异性结合亲和力。
在一些实施方案中，施用所述方法以治疗选自由以下组成的组的癌症：肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和恶性血液病。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的一个或多个成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在其它实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，施用的组合物包含聚谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在一些实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在一些实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的PMX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的MTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的MTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的RTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的RTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的LTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的LTX。
在另外的实施方案中，本公开提供了用于癌症维持疗法的方法，其包括向正在进行或已经进行癌症疗法的受试者施用有效量的LPA组合物和/或PLPA组合物。
在另外的实施方案中，本公开提供了用于治疗免疫系统病症的方法，其包括向患有免疫系统病症或有患免疫系统病症的风险的受试者施用有效量的脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂组合物，所述组合物包含含有靶向部分的脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂，所述靶向部分对目标免疫细胞上的表面抗原具有特异性亲和力(并且其中脂质体任选地被聚乙二醇化)。在一些实施方案中，施用所述方法以治疗自身免疫疾病。在另一个实施方案中，施用所述方法以治疗类风湿性关节炎。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的一个或多个成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在其它实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，施用的组合物包含聚谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在一些实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在一些实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的MTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的PMX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的PMX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的RTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的RTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含五谷氨酸化形式的LTX。在另一个实施方案中，施用的组合物包含六谷氨酸化形式的LTX。
本公开还提供了向肿瘤递送聚谷氨酸化抗叶酸剂的方法，其包括：向患有肿瘤的受试者施用脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化和/或六谷氨酸化)抗叶酸剂(LPA)组合物和/或聚乙二醇化LPA(PLPA)，其包含对肿瘤上的表面抗原具有特异性结合亲和力的靶向部分，并且其中靶向-PLPA和/或靶向-LPA组合物以治疗有效剂量递送至肿瘤。
在另外的实施方案中，本公开提供了制备包含脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物的组合物的方法，所述方法包括：在溶液中形成包含脂质体组分、聚谷氨酸化抗叶酸剂的混合物；使混合物均匀化以在溶液中形成脂质体；并且处理混合物以形成含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体。
还提供了药物组合物，其包含脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化和/或六谷氨酸化)抗叶酸剂(LPA)组合物和/或聚乙二醇化LPA(PLPA)组合物，并且任选地还包含对目标靶细胞表面上的表面抗原具有特异性亲和力的靶向部分。
附图说明
图1描绘了叶酸的稳态和抗叶酸剂的细胞积累。流入和流出(抗)叶酸剂转运体。一旦进入细胞内，(抗)叶酸剂在胞质溶胶和线粒体中进行聚谷氨酸化，而在溶酶体中发生水解的反作用过程。图1改编自Gonen等人,Drug Resistance Updates 15:183–210(2012)。
图2描绘了细胞叶酸代谢及其在胞质溶胶和线粒体中的区室化。图2改编自Gonen等人,Drug Resistance Updates 15:183–210(2012)。
图3A和图3B描绘了细胞极性和组织解体的破坏，其是晚期上皮肿瘤的标志。如图3A所示，正常的单纯上皮细胞包含单层单独细胞，其显示出明显的顶端-基底极性。细胞被紧密堆积并通过顶端连接复合物彼此连接，所述顶端连接复合物分离顶端和基底外侧膜结构域。在保持极性的正常组织中，FR-α附着在远离血液循环中的叶酸并且不与血液循环中的叶酸直接接触的细胞的顶端表面。如图3B所示，高级别上皮肿瘤中的细胞显示顶端-基底极性的丧失和整体组织的解体，使FR-α与血液循环中的叶酸直接接触。
图4显示了癌症中抗叶酸抗性的潜在分子机制。图4改编自Gonen等人,DrugResistance Updates 15:183–210(2012)。
图5显示了L-γ六谷氨酸化培美曲塞的化学式。
图6显示了本公开所涵盖的示例性L-γ聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物的化学式。
图7描绘了游离培美曲塞L-γ六谷氨酸(gG6)、脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)、培美曲塞和叶酸受体α靶向抗体(FR1Ab)脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6-FR1Ab)在NCI H2342非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌亚型中的剂量反应关系。通过荧光素酶发光测量的输出是细胞活力。如图7中共同示出的，通过IC50测量，游离培美曲塞gG6似乎在抑制细胞活力方面效力最低。脂质体培美曲塞gG6和脂质体培美曲塞gG6-FR1Ab分别比游离培美曲塞的效力高7倍和40倍。
图8显示了游离培美曲塞L-γ六谷氨酸(gG6)、脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)、培美曲塞和叶酸受体α靶向抗体(FR1Ab)脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6-FR1Ab)在NCI H2342非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌亚型中的剂量反应关系，其描述为48小时治疗后活细胞的百分比。
图9显示了游离培美曲塞L-γ六谷氨酸(gG6)、脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)、培美曲塞和叶酸受体α靶向抗体(FR1Ab)脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6-FR1Ab)在NCI H2342非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌亚型中的示例性剂量反应关系，其描述为48小时治疗后活细胞的百分比。
图10显示了游离培美曲塞L-γ六谷氨酸(gG6)、脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)、培美曲塞和叶酸受体α靶向抗体(FR1Ab)脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6-FR1Ab)在HT-29(结肠癌)中48小时的剂量反应关系。游离培美曲塞gG6似乎是效力最低的。此外，脂质体培美曲塞gG6的效力是培美曲塞的两倍，而脂质体培美曲塞gG6-FR1Ab的效力是游离培美曲塞的5倍。
图11显示了游离培美曲塞L-γ六谷氨酸(gG6)、脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)、培美曲塞和叶酸受体α靶向抗体(FR1Ab)脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6-FR1Ab)在HT-29(结肠癌)中48小时的示例性剂量反应关系。
图12显示了培美曲塞、游离培美曲塞L-γ六谷氨酸(hexa gG6)、脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体hexa gG6)和游离培美曲塞对暴露256nM相应剂48小时后的卵巢癌OAW28细胞生长的影响。脂质体培美曲塞hexa gG6能够比培美曲塞hexa gG6和培美曲塞更有效地进入细胞，以抑制卵巢癌OAW28细胞的生长。
图13显示了游离培美曲塞L-γ六谷氨酸(hexa gG6)和脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体hexa gG6)对暴露256nM相应剂48小时后的结肠癌SW260细胞生长的影响。非靶向和靶向脂质体培美曲塞hexa gG6能够比游离培美曲塞hexa gG6更有效地进入细胞以抑制结肠癌SW260细胞的生长。
图14显示了在48小时内暴露于癌细胞系SW620(CRC)、HT-29(结肠癌)、H1806(三阴性乳腺癌)、OAW28(卵巢癌)、H292(NSCLC，腺癌亚型)和H2342(NSCLC，腺癌亚型)后，脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)相对于培美曲塞的相对效力。
图15显示了与培美曲塞相比，在48小时内暴露于脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(Lps hexa gG6)后对HCC1806三阴性乳腺癌细胞的治疗效果。
图16显示了与培美曲塞相比，在48小时内暴露于脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(Lps hexa gG6)后对H292非小细胞肺癌细胞的治疗效果。
图17显示了与培美曲塞相比，在48小时内暴露于脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(Lps hexa gG6)后对OAW28卵巢癌细胞的治疗效果。
图18显示了在48小时内暴露于16至128nM的各种剂量水平的脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)和培美曲塞后对H292非小细胞肺癌细胞的治疗效果。在每个测试剂量范围内，与培美曲塞相比，脂质体培美曲塞gG6制剂优于抑制H292非小细胞肺癌细胞。
图19显示了在48小时内暴露于16nM、32nM、64nM和128nM脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)和培美曲塞后对HCC1806三阴性乳腺癌细胞的治疗效果。在每个测试剂量下，脂质体培美曲塞gG6制剂在抑制HCC1806三阴性乳腺癌细胞方面优于培美曲塞。
图20显示了在48小时内和一系列浓度下暴露后脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)和培美曲塞对OAW28卵巢癌细胞的治疗效果。在剂量为128nM时，培美曲塞似乎比脂质体培美曲塞gG6脂质体制剂更有效地抑制细胞增殖，而剂量为32nM和64nM的脂质体制剂比培美曲塞具有更好的治疗效果；在16nM时，脂质体培美曲塞gG6治疗效果与培美曲塞相似。
图21显示脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)和培美曲塞在16nM、32nM、64nM和128nM下对分化的人嗜中性粒细胞的毒性。该图表明，与培美曲塞相比，脂质体培美曲塞gG6对分化的人嗜中性粒细胞的毒性显著降低。
图22显示了脂质体培美曲塞L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)和培美曲塞在48小时内暴露于16nM、32nM、64nM和128nM相应剂后对AML12肝细胞的作用。引人注目的是，在任何测试剂量水平下用脂质体培美曲塞gG6处理后，对AML12肝细胞似乎没有任何毒性。相反，培美曲塞处理导致在所研究的所有剂量下AML12肝细胞计数减少约40％。
图23显示了脂质体L-γ六谷氨酸(脂质体gG6)和培美曲塞在48小时内暴露于16nM、32nM、64nM和128nM的相应剂后对CCD841结肠上皮细胞的作用。在所有测试浓度下，培美曲塞导致CCD841结肠上皮细胞数量减少约≥50％，而用脂质体gG6处理后细胞数量减少约20％或更少。
具体实施方式
本申请描述了优于先前癌症治疗的进步和向癌细胞递送抗叶酸剂的方法。特别地，本公开涉及一类先前未被认可的抗叶酸剂。
更具体地，本申请描述了包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂，例如但不限于培美曲塞聚谷氨酸和洛美曲索聚谷氨酸。在一个非限制性实例中，使用对一种或多种叶酸受体α、β和δ具有特异性亲和力的靶向部分靶向包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂(例如培美曲塞聚谷氨酸)。在另一个非限制性实例中，包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂是非靶向的。
叶酸是水溶性B族维生素。叶酸在体内/细胞中的主要作用是作为参与丝氨酸，蛋氨酸，胸苷和嘌呤生物合成的各种甲基转移酶的辅因子，这是涉及细胞分裂的关键过程。叶酸的主要功能是介导参与核苷酸生物合成的一碳单元的转移，高半胱氨酸(Hcy)的再甲基化和生物甲基化反应。作为核苷酸从头生物合成的重要辅助因子，叶酸在DNA合成，稳定性和完整性以及修复中起重要作用。叶酸还提供用于DNA甲基化(调节基因表达)，蛋白质(重要的翻译后修饰)和脂质(在其合成中重要的，例如磷脂酰胆碱)的主要甲基供体。如下面更详细解释的，因此，开发抗叶酸剂作为癌症的治疗，意图阻断叶酸的作用，从而抑制细胞分裂，DNA/RNA合成和修复以及蛋白质合成。
在自然界中，叶酸以聚谷氨酸化形式存在于动物产品和叶类蔬菜中。聚谷氨酸不适合生理转运。天然聚谷氨酸在空肠中被分解成单谷氨酸，然后它们被生理运输并被细胞吸收。将聚谷氨酸化形式的膳食叶酸裂解成空肠中的单谷氨酸，在那里它被吸收。一旦被肠细胞吸收，叶酸就会被聚谷氨酸化并保留在细胞内或释放到门静脉循环中，用于各种隔室的代谢，储存或肠肝再循环。叶酸进入血浆并通过进入肝细胞和其它细胞迅速清除。
肝脏占据进入门静脉循环的大部分叶酸，而剩余的叶酸通过肝脏，进入大循环并被其它组织吸收，在那里它被转化成其聚谷氨酸化形式用于细胞内储存。肝脏是叶酸的主要储存库。手术胆道引流可在6小时内导致血清叶酸减少，而饮食限制在3周内不会产生相当的下降，可能是因为估计叶酸的总体储存量在500至20,000mcg之间。该观察结果表明存在大量的叶酸肝肠循环。
单谷氨酸是血液中叶酸的唯一循环形式，并且是穿过细胞膜转运的叶酸的唯一形式。一旦被肠细胞吸收，叶酸就会被聚谷氨酸化并保留在细胞内或释放到门静脉循环中，用于各种隔室的代谢，储存或肠肝再循环。一旦单谷氨酸被摄取到细胞中，细胞内叶酸主要以聚谷氨酸存在，这种形式作为参与丝氨酸、蛋氨酸、胸苷和嘌呤生物合成的各种甲基转移酶的辅因子具有生物活性，这是涉及细胞分裂的关键过程。
聚谷氨酸化包括使用ATP作为其能量源，通过酶叶酰聚谷氨酸合成酶(FPGS)将将γ-连接中的谷氨酸基团添加至邻近的叶酰谷氨酸的末端羧基。
聚谷氨酸化是指向分子(例如抗叶酸剂)中添加谷氨酸残基，使得聚谷氨酸化后的所得分子具有多于一个谷氨酸残基。文献中使用多个名称来指谷氨酸残基，例如谷氨酸、谷氨酰基、谷氨酰自由基等。每个谷氨酸残基(谷氨酰基)可以独立地为L-形式或D-形式。
例如，培美曲塞，其化学名称为“N-[4-2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基])乙基]苯甲酰基]-1-谷氨酸”已经具有一个谷氨酰基(单谷氨酸化)。如本文所述向培美曲塞中添加谷氨酸残基产生聚谷氨酸化培美曲塞。例如，向培美曲塞中添加5个以上的谷氨酸残基将导致总共6个谷氨酰基(一个来自培美曲塞并且另外添加5个谷氨酰基)，并且在该文件中称为培美曲塞六谷氨酸或六谷氨酸化培美曲塞。在文献中，这一实体也可以称为五谷氨酸化培美曲塞或培美曲塞五谷氨酸。
γ聚谷氨酸化是指如上所述向分子中添加谷氨酸残基，其中肽键位于谷氨酸的氨基和谷氨酸侧链的γ碳的羧基之间。α聚谷氨酸化是指向分子中添加谷氨酸残基，如上所述，其中肽键位于谷氨酸的氨基和谷氨酸侧链的α碳上的羧基之间。
单个分子可以仅通过γ聚谷氨酸化，仅通过α聚谷氨酸化，或通过γ聚谷氨酸化和α聚谷氨酸化的组合形成。
70多年前，抗叶酸剂被开发作为“叶酸模拟分子”细胞毒性剂。其基本原理是设计一类分子，这些分子可以抵抗快速复制细胞(如癌细胞)中叶酸的作用，利用生理叶酸转运机制及其在细胞分裂过程中促进DNA复制的细胞内作用模式。具体地，设计抗叶酸剂以模拟叶酸的全身转运，生理细胞摄取(例如，通过还原型叶酸载体(RFC)和质子偶联叶酸转运蛋白(PCFT))和细胞内加工。抗叶酸剂在DNA和RNA合成期间特异性地起作用，在细胞周期的S期期间发挥细胞毒性作用。因此，它们对快速分裂的细胞如恶性细胞和骨髓细胞具有更大的毒性作用。
一般而言，人体中存在四种叶酸和抗叶酸剂转运蛋白：还原型叶酸载体(RFC)、叶酸受体(FR)、质子偶联叶酸转运蛋白(PCFT)和ATP结合盒式转运蛋白。如上所述，这些转运机制都不能有效地将游离的聚谷氨酸转运穿过细胞膜。
RFC是可饱和的阴离子依赖性细胞膜载体，其对还原型叶酸和亲水性抗叶酸剂如MTX或PMX具有更大的亲和力，对PMX的亲和力比对MTX的亲和力高2倍。它们是溶质载体超家族的成员，并利用高跨膜阴离子梯度，特别是有机磷酸盐梯度，其由细胞的能量状态调节，以实现上游叶酸转运到细胞中。
RFC对细胞毒性抗叶酸剂的转运不是肿瘤特异性的。因为RFC在正常组织中普遍表达并且在大多数正常组织特征的中性pH下表现出高水平的活性，所以已经显示通过RFC转运的抗叶酸剂对选择类型的正常组织造成毒性。
叶酸受体α、β和δ(FR-α、FR-β和FR-δ)是高亲和力叶酸结合蛋白，其通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结构域锚定在细胞膜中。FR对FA具有特别高的亲和力。它们通过内吞作用机制将叶酸转运到细胞中。一旦进入细胞质，当囊泡酸化至pH 6.0-6.5时，叶酸从受体释放并通过已提出部分由PCFT介导的机制从内体输出。尽管FR-α对其优选的底物具有比RFC更高的亲和力，但其叶酸转运到细胞中需要一系列步骤，例如结合、内陷、囊泡形成和移位、酸化以及底物从囊泡输出到细胞质中。由于转运到细胞中所需的这些多个步骤，FR介导的叶酸转运速率是RFC介导的速率的1％。
质子偶联叶酸转运蛋白(PCFT)是叶酸-H+同向转运蛋白，其在酸性细胞外环境中最有效地起作用，所述酸性细胞外环境尤其是缺氧环境的特征。RFC和PCFT之间的重要区别在于最佳pH值会影响它们对转运底物的亲和力。在pH 7.4，抗叶酸剂的转运主要由RFC介导，因为RFC活性是最佳的并且PCFT的活性被最小化。或者，随着pH降低，PCFT活性更加突出。除了介导肠道叶酸吸收和摄入其中存在酸性细胞外环境的组织(例如实体瘤)或在中性pH环境中效率较低地转运到组织中，PCFT可能在叶酸受体介导的内吞作用中起作用。
几种ATP结合盒式转运蛋白是叶酸和抗叶酸剂的低亲和力、高容量ATP依赖性外排泵。这些包括多药耐药相关蛋白MRP1-MRP5和乳腺癌耐药蛋白BCRP。所有这些抗药性外排泵不仅仅涉及从细胞中泵出抗叶酸剂，而且还显示出从细胞中泵出其它类别的药物。
通过FPGS将细胞内叶酸转化为聚谷氨酸，而GGH除去末端谷氨酸，从而通过ATP结合盒式转运蛋白(有时也称为叶酸外排泵)促进叶酸从细胞输出回细胞外循环。不希望受理论束缚，聚谷氨酸化叶酸被认为更好地保留在细胞中，因为它们是ATP结合盒式转运蛋白的不良底物。此外，不希望受理论束缚，与单谷氨酸相比，聚谷氨酸叶酸被认为是细胞内叶酸依赖性酶的更好底物。
与叶酸的情况一样，抗叶酸剂如MTX、PMX和RTX被认为通过FPGS诱导的聚谷氨酸化保留在肿瘤和正常细胞中，并在通过GGH水解成单谷氨酸后从细胞输出。与生理叶酸一样，聚谷氨酸化抗叶酸剂在细胞中保留的时间更长，从而通过延长暴露时间来增加其细胞毒性。聚谷氨酸化抗叶酸剂通常具有更高的亲和力，因此在胸苷酸和嘌呤生物合成中抑制其靶叶酸依赖性酶的程度大于单谷氨酸化形式。正因为如此，FPGS和GGH被认为是维持叶酸和抗叶酸剂的细胞内稳态的重要酶，用于最佳的叶酸依赖性一碳转移反应和抗叶酸剂诱导的细胞毒性作用。
一旦进入细胞内，叶酸和抗叶酸剂(例如但不限于培美曲塞和普拉曲沙)通过FPGS聚谷氨酸化成聚谷氨酸。这个过程是生物活动所必需的。例如，聚谷氨酸化促进保留(增加细胞内浓度)并增加对叶酸依赖性酶(包括胸苷酸合成酶)的亲和力。细胞形成聚谷氨酸的能力也增强了抗叶酸剂的细胞毒性作用，从而使抗叶酸剂成为非常有效的细胞毒性剂。
本申请人承诺研究聚谷氨酸化形式的抗叶酸剂的细胞毒性作用，以评估它们在治疗癌细胞中的有效性。因为聚谷氨酸化形式的抗叶酸剂不被正常细胞或癌细胞摄取(如下面更详细讨论)，申请人假定如果这种聚谷氨酸化形式可以直接递送到癌细胞，则可以改善抗叶酸剂的毒性，减少了由于癌细胞中过量的抗叶酸剂流出而可能发生的对正常细胞的不良毒性。
特别地，存在于癌细胞中的过量的抗叶酸剂可以通过叶酸和抗叶酸剂的高容量ATP依赖性外排泵返回到循环系统。即使当使用WO 2016/25882中描述的靶向脂质体方法递送抗叶酸剂时也是如此，其全部内容通过引用整体并入本文。换句话说，即使WO 2016//25882的技术可以在基本上绕过正常细胞的同时向癌细胞递送抗叶酸剂，但是过量的递送的抗叶酸剂的流出可以返回到循环系统并被正常细胞吸收，导致不良毒性。虽然与在患者的循环系统中与传统施用游离抗叶酸剂相关的毒性相比，这些毒性显著降低，但它们仍然是不合需要的。本文所述的抗叶酸剂和递送系统可以进一步降低虽然通过WO 2016/25882实现的对正常细胞的显著降低的毒性作用，并且对正常细胞提供甚至更大的毒性降低。
本发明人意识到使用聚谷氨酸化抗叶酸剂用于癌症治疗的潜在优点。例如，聚谷氨酸，尤其是五谷氨酸，可以使细胞更有效地保留其叶酸池。然而，由于它们的高负电荷和其它性质，五谷氨酸目前没有已知的交叉细胞膜转运底物。
本公开描述了向癌细胞递送不同类型的抗叶酸剂(例如，聚谷氨酸)的先进和改进技术，所述抗叶酸剂先前不能被癌细胞吸收。由于缺乏跨细胞膜转运，递送至癌细胞的聚谷氨酸被有效地保留在癌细胞内。这减少和/或消除了与例如非聚谷氨酸化抗叶酸剂(例如单谷氨酸化抗叶酸剂)相关的毒性，因为聚谷氨酸不会返回到循环系统。事实上，即使它们返回，它们也不会被健康细胞吸收。
由聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物提供的治疗益处及其用途是众多且令人惊讶的。
首先，许多细胞毒性剂的活性形式，特别是抗叶酸剂，是聚谷氨酸化形式，因此，先前无法递送的聚谷氨酸化形式的抗叶酸剂的递送意味着药物立即具有活性。此外，已知一些实体瘤的FPGS活性和聚谷氨酸化水平低或缺乏。这意味着FPGS活性低的肿瘤对通过非聚谷氨酸化药物的化学疗法更具抗性，因为药物在进入细胞后仍然依赖于低内源性FPGS活性来激活。
第二，药物在其非聚谷氨酸化状态下的保留也是有问题的。治疗肿瘤，特别是具有低内源性FPGS活性的肿瘤的部分问题至少是双重的。前一段讨论了由于FPGS水平低而药物活化程度低的问题。除了这种缺陷之外，非聚谷氨酸化药物如非聚谷氨酸化培美曲塞在细胞中的保留有限，因为它们可以被主动转运出细胞。非聚谷氨酸化药物(例如，非聚谷氨酸化培美曲塞)的转运本身就是一个双重问题。首先，如果非聚谷氨酸化药物被转运出细胞，它就不能再在癌细胞内起作用进行治疗。此外，位于细胞外的细胞毒性剂如抗叶酸剂可以重新进入其它细胞，包括正常细胞，并对正常细胞产生不良毒性。有可能在进入细胞后，某些细胞过程可能起到将本文提供的聚谷氨酸化抗叶酸剂还原为单谷氨酸的作用。然而，目前的测试表明，所提供的聚谷氨酸化抗叶酸剂的毒性和活性在这种还原发生之前杀死细胞。
第三，因为聚谷氨酸化抗叶酸剂保留在细胞内并且不在细胞外转运，所以可以仅施用聚谷氨酸化抗叶酸药物(例如，静脉内施用)有限的时间，从而进一步减少对正常组织的潜在不良毒性。减少的施用时间还改善了患者的舒适度并降低了成本，因为临床环境中的施用时长可以按比例减少。在例如肿瘤细胞内保留聚谷氨酸化抗叶酸剂意味着即使在从细胞外环境中除去药物(例如，停止静脉内给药)之后肿瘤细胞也不太可能从治疗中恢复。
第四，所公开的脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(例如靶向和非靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂)的活性在肿瘤中未减少，即使肿瘤缺乏FPGS。这是因为不依赖于FPGS激活药物。
由于所有上述原因，脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂具有比以相同方法递送的非聚谷氨酸化抗叶酸剂更高的治疗指数。也就是说，本发明人期望该药物具有最小/降低的毒性，并且患者能够耐受较高剂量的药物并具有较低的副作用。在未聚谷氨酸化的施用药物中不存在上述益处。
本公开的组合物和方法所涵盖的聚谷氨酸化抗叶酸剂的非详尽列表包括聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。
在一些实施方案中，五谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：五谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、五谷氨酸化培美曲塞(PMX)、五谷氨酸化洛美曲索(LTX)、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。
在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物(例如，聚谷氨酸和递送载体，例如含有聚谷氨酸的脂质体)组分是“分离的”。如本文所用，术语分离是指自然界中未发现的形式的组合物。分离的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物包括已经纯化到一定程度的那些，它们不再是自然界中发现的形式。在一些实施方案中，分离的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物组分基本上是纯的。分离的组合物将不含或基本上不含与它们天然相关的物质，例如其它细胞组分，例如蛋白质和核酸，它们可能在自然界中或者制备它们的环境(例如，细胞培养物)中被发现。聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且仍然为了实际目的而分离-例如，当用于诊断或疗法时，聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物通常与药学上可接受的载体或稀释剂混合。在一些实施方案中，分离的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物(例如，聚谷氨酸化和递送载体，例如含有聚谷氨酸的脂质体含有少于1％或少于0.1％的DNA或蛋白质。
在一些实施方案中，在所提供的脂质体组合物中大于70％、80％或90％的聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化的。在一些实施方案中，提供的组合物中大于70％、80％或90％的聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化的。在一些实施方案中，脂质体组合物中大于70％、80％或90％的聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化的。在一些实施方案中，所提供的组合物中大于70％、80％或90％的聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化的。在一些实施方案中，脂质体组合物中大于70％、80％或90％的聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化的。在一些实施方案中，组合物中大于70％、80％或90％的聚谷氨酸化抗叶酸剂具有5-10或≥4个谷氨酰基。在一些实施方案中，脂质体组合物中大于70％、80％或90％的聚谷氨酸化抗叶酸剂具有5-10或≥4个谷氨酰基。
在一些实施方案中，α(L-α或D-α)或D-γ聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物(例如，聚谷氨酸和递送载体，例如含有聚谷氨酸的脂质体)在水溶液中。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂的浓度为100ng/ml至700mg/ml。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂的浓度大于100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml、750μg/ml、1mg/ml、100mg/ml、250mg/ml或500mg/ml。在一些实施方案中，含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体的浓度为100ng/ml至1mg/ml。在一些实施方案中，浓度大于100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml、750ug/ml或1mg/ml。
在一些实施方案中，六谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：六谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、六谷氨酸化培美曲塞(PMX)、六谷氨酸化洛美曲索(LTX)、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。
例如，培美曲塞是多靶点抗叶酸剂，其抑制参与叶酸代谢以及嘌呤和嘧啶合成的至少三种酶。这些酶是胸苷酸合成酶(TS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶(GARFT)(参见图2)。培美曲塞由FDA批准并且目前仍然是间皮瘤和非小细胞肺癌的重要治疗剂。
在间皮瘤和非小细胞肺癌的治疗中，培美曲塞被批准与顺铂组合用于恶性间皮瘤疗法，并且用于非小细胞肺癌患者的初始以及维持治疗。培美曲塞已证明与多西紫杉醇具有相同的疗效，但在非小细胞肺癌的二线治疗中具有显著较低的毒性。培美曲塞最常见和最严重的毒性-骨髓抑制和粘膜炎-已通过补充叶酸和维生素B12得到显著改善，但仍存在不良毒性。在一些具体实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化PMX。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化PMX。
使用如本文所述的聚谷氨酸化抗叶酸剂可以减少、最小化和/或消除这些毒性。在本文所述的一些特定实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化PMX。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化PMX。
在一些特定的实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化RTX。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化RTX。
由于直接抑制甘氨酰胺核糖核苷酸转移酶(GARFT)活性，洛美曲索是抑制嘌呤合成的第一种有效的抗叶酸剂。在特定的实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化LTX。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化LTX。
如本文所讨论的，在临床环境中使用抗叶酸剂如培美曲塞已经导致严重的临床困境。已经显示快速更新正常组织细胞如骨髓、胃肠道和口腔粘膜细胞对这类药物的细胞毒性作用敏感，因为它们也更频繁地复制它们的DNA。因此，在临床实践中，抗叶酸剂的使用经常导致严重且危及生命的血液学和非血液学毒副作用。此外，毒性一方面被认为是剂量限制性的，另一方面是妨碍获得良好功效的能力。由于其相关的严重危及生命的毒性，有希望的抗叶酸剂在开发过程中失败，例如洛美曲索或在临床实践中使用有限，例如雷替曲塞和培美曲塞
本文所述的因子也是针对一般抗叶酸剂和通过聚谷氨酸化增强其抗肿瘤活性的那些抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤、培美曲塞、洛美曲索和雷替曲塞)的抗性机制的核心。
所公开的聚谷氨酸化抗叶酸剂提供了克服与抗叶酸药物的剂量限制性毒性相关的药理学难题的策略。所提供的方法向肿瘤细胞递送先前无法递送(由于缺乏运输机制)的聚谷氨酸化形式的抗叶酸剂有效负载，同时(1)最小化/减少暴露于正常组织细胞，(2)优化/改善抗叶酸剂对癌细胞的细胞毒性作用和(3)最小化/减少外排泵的影响。
本文提供的聚谷氨酸化学实体与不以聚谷氨酸化形式递送至细胞的对应抗叶酸剂相比具有许多优点。例如，聚谷氨酸化抗叶酸剂作为推注施用，其绕过FPGS诱导的抗叶酸剂(例如PMX、MTX、RTX和LTX)所需的聚谷氨酸化活性，以具有增加的活性(通过增加对叶酸依赖性酶的结合亲和力)和细胞保留。如本文中的图、公开内容和实施例所反映的，细胞中较高聚谷氨酸化(例如，含有4、5或多于5个谷氨酸基团的药物)的保留是其链长的直接功能。因此，在去除细胞外药物后，相对大部分未结合的MTX-Glu4和大部分MTX-Glu5在细胞中保留至少24小时，并继续对DHFR、DNA合成和细胞活力发挥抑制作用。
通过仔细利用叶酸途径的细胞和分子生物学，新的化学实体不仅可以设计用于增加和/或最大化聚谷氨酸化形式的抗叶酸剂的肿瘤细胞内浓度。某些靶向形式的新化学实体可以利用肿瘤和正常组织之间的差异细胞极性，其中癌症特异性形态学未被认可对于减轻与使用抗叶酸剂用于癌症治疗相关的临床和药理学挑战的目标是有用的。此外，新的化学实体将最小化由细胞外排泵介导的肿瘤细胞抗性治疗。
作为实例而非限制，靶向脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物可包括聚乙二醇化脂质体，其包括包埋和/或包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂；和靶向部分，其包含氨基酸链(例如，抗体或抗体片段)，所述氨基酸链包含多个氨基酸，所述靶向部分对至少一种类型的叶酸受体具有特异性亲和力，所述靶向部分连接PEG和脂质体的外部中的一个或两个。在一个示例性实施方案中，脂质体包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂(LPA)可以是培美曲塞的五谷氨酸化形式或任何合适的抗叶酸剂的五谷氨酸化形式。在一个示例性实施方案中，脂质体包封的聚谷氨酸酯化抗叶酸剂(LPA)可以是培美曲塞的六谷氨酸化形式或任何合适的抗叶酸剂的六谷氨酸化形式。
作为实例而非限制，非靶向脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物可包括聚乙二醇化脂质体，其包括包埋和/或包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一个示例性实施方案中，脂质体包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂(LPA)可以是培美曲塞的五谷氨酸化形式或任何合适的抗叶酸剂的五谷氨酸化形式。在一个示例性实施方案中，脂质体包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂(LPA)可以是培美曲塞的六谷氨酸化形式或任何合适的抗叶酸剂的六谷氨酸化形式。
在一些实施方案中，靶向的，任选地聚乙二醇化的脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物包括聚乙二醇化脂质体，其包括包埋和/或包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂；和靶向部分，其包含氨基酸链(例如，抗体或抗体片段)，所述氨基酸链包含多个氨基酸，所述靶向部分对至少一种类型的叶酸受体具有特异性亲和力。对至少一种类型的叶酸受体，即与PEG和脂质体外部中的一个或两个连接的靶向部分的特异性亲和力，可以定义为例如但不限于包括0.5x10-10至10x10-6摩尔[0.05纳摩尔至10微摩尔]的平衡解离常数(Kd)。
在一些实施方案中，靶向的，任选地聚乙二醇化的脂质体组合物包含聚乙二醇化脂质体，其包括包埋和/或包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂；和靶向部分，其包含氨基酸链(例如，抗体或抗体片段)，所述氨基酸链包含多个氨基酸，所述靶向部分对至少一种类型的叶酸受体具有特异性亲和力。在一些实施方案中，对于至少一种类型的叶酸受体，靶向部分的特异性亲和力是0.5x10-10至10x10-6摩尔的平衡解离常数(Kd)。在其它实施方案中，靶向部分连接至PEG和脂质体外部中的一个或两个。
使用需要聚谷氨酸化以增强活性的游离细胞毒性剂，例如抗叶酸剂，存在至少三个主要限制。本文考虑和公开的新化学实体旨在解决这些基本限制。这些限制包括以下内容。第一个限制是对正常组织细胞的毒性；这种毒性是由于细胞摄取单谷氨酸化形式，例如通过RFC或PCFT，以及随后通过FPGS细胞内转化为聚谷氨酸化形式，其具有增强的细胞毒性，加上在正常组织细胞中延长细胞滞留。第二个限制是递送足够量的最活跃的聚谷氨酸化形式的药物，因为这种化合物不能穿过细胞膜。相反，其细胞内可用性取决于细胞将从细胞外环境转运的药物的单谷氨酸化形式聚谷氨酸化的能力。第三个限制是在肿瘤细胞内保留足够水平的最细胞毒性形式，例如抗叶酸剂的五谷氨酸化和六谷氨酸化形式。这是由于癌细胞下调FPGS的能力导致聚谷氨酸化减少，并且在某些情况下，通过GGH增加聚谷氨酸化形式的分解以及外排泵(ATP盒)的上调，所述外排泵能够将单和其它低谷氨酸化形式(1-、2-、3)-谷氨酸，但不是更高(例如，五谷氨酸化和六谷氨酸化)形式的叶酸及其类似物泵出细胞。
本文考虑和公开的聚谷氨酸化抗叶酸剂新化学实体不具有上述缺点和限制，并且旨在解决这些和其它限制。实际上，新的化学实体将减少/最小化与药物活性形式的全身转运、细胞摄取和肿瘤内细胞积聚相关的药理学挑战。本公开的新化学实体优先靶向肿瘤细胞以暴露于五谷氨酸化和六谷氨酸化形式的抗叶酸剂和/或最小化这种抗叶酸药物混合液暴露于正常细胞，特别是骨髓中和胃肠道的上皮内膜中的高转换(例如，快速复制)的正常细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了包含聚谷氨酸化抗叶酸剂的组合物。在其它实施方案中，该组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在其它实施方案中，该组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。根据一些实施方案，聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，聚谷氨酸化的成员是五谷氨酸化的。在其它实施方案中，聚谷氨酸化的成员是六谷氨酸化的。
在一个实施方案中，组合物包含聚谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，组合物包含五谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，组合物包含六谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。
在一个实施方案中，组合物包含聚谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，组合物包含五谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，组合物包含六谷氨酸化PMX。
在另一个实施方案中，组合物包含聚谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，组合物包含五谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，组合物包含六谷氨酸化的MTX。
在另一个实施方案中，组合物包含聚谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，组合物包含五谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，组合物包含六谷氨酸化的RTX。
在另一个实施方案中，组合物包含聚谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，组合物包含五谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，组合物包含六谷氨酸化的LTX。
在另外的实施方案中，本公开提供了脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，其包含聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，脂质体任选地被聚乙二醇化(PLPA)。在一些实施方案中，PLPA组合物包含五谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，PLPA组合物包含六谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，PLPA脂质体是阴离子或中性的。在其它实施方案中，PLPA脂质体是阳离子性的。在一些实施方案中，PLPA组合物包含至少10％包埋聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体。在一些实施方案中，PLPA脂质体的直径为20nm至200nm。在其它实施方案中，脂质体的直径为80nm至120nm。
根据一些实施方案，LPA包含选自由以下组成的组的聚谷氨酸化抗叶酸剂：聚谷氨酸化MTX、聚谷氨酸化PMX、聚谷氨酸化LTX、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化RTX、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是五谷氨酸化的。在其它实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是六谷氨酸化的。
在一个实施方案中，LPA包含聚谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，LPA包含五谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。在另一个实施方案中，LPA包含六谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。
在一个实施方案中，LPA包含聚谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，LPA包含五谷氨酸化PMX。在另一个实施方案中，LPA包含六谷氨酸化PMX。
在另一个实施方案中，LPA包含聚谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，LPA包含五谷氨酸化的MTX。在另一个实施方案中，LPA包含六谷氨酸化的MTX。
在另一个实施方案中，LPA包含聚谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，LPA包含五谷氨酸化的RTX。在另一个实施方案中，LPA包含六谷氨酸化的RTX。
在另一个实施方案中，LPA包含聚谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，LPA包含五谷氨酸化的LTX。在另一个实施方案中，LPA包含六谷氨酸化的LTX。
脂质体
在一些实施方案中，提供了靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂可包含脂质体，所述脂质体包含内部空间；设置在内部空间内的聚谷氨酸化抗叶酸剂；连接到脂质体外部的PEG分子；和靶向部分，其包含对癌细胞表面上表达的至少一种抗原(例如，叶酸受体(例如，FR-α、FR-β和/或FR-δ))具有特异性亲和力的蛋白质(例如，抗体或抗体片段)；所述靶向部分连接至PEG和脂质体外部中的至少一个。
在其它实施方案中，提供了非靶向脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂。
靶向和非靶向脂质体组合物中包含的脂质体可以是本领域已知的任何脂质体。然而，本领域技术人员将理解，任何特定药物，例如但不限于本文所讨论的聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体包封，可能涉及大量常规实验，以实现有用和功能性的脂质体制剂。通常，所提供的脂质体可具有任何脂质体结构，例如，具有通过一个或多个脂质双层与外部介质隔离的内部空间的结构，或具有半透膜与亲脂性中心部分的任何微胶囊，其中膜隔离内部。脂质双层可以是由亲水部分和疏水部分表征的两亲分子的任何排列。通常，双层中的两亲分子排列成二维片层，其中疏水部分向片层内取向，而亲水部分向外取向。形成所提供的脂质体的两亲分子可以是任何已知的或后来发现的两亲分子，例如合成或天然来源的脂质或生物相容的脂质。脂质体也可以由两亲聚合物和表面活性剂形成，例如聚合物体和囊泡。出于本公开的目的，但不是限制，这些脂质体形成材料也称为“脂质”。
本文提供的脂质体组合物制剂可以是液体或干燥形式，例如干粉或干饼。干粉或干饼可以在例如冻干条件下进行初级干燥，或者任选地，干饼或干粉可以仅经历初级干燥或者初级干燥和二次干燥两者。在干燥形式中，粉或饼可以例如具有1％至6％的水分，例如2％至5％的水分或2％至4％的水分。干燥的一个示例性方法是冻干(也称为冷冻干燥)。本公开的任何组合物和方法可包括脂质体、冻干脂质体或由冻干脂质体重构的脂质体。在一些实施方案中，所公开的组合物和方法包括一种或多种冻干保护剂或冷冻保护剂。这些保护剂通常是多羟基化合物，例如糖(单糖、二糖和多糖)、多元醇及其衍生物、甘油或聚乙二醇、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、葡聚糖、甘油或氨基糖苷。在其它实施方案中，冻干保护剂或冷冻保护剂占脂质体外部、脂质体内部或脂质体外部和内部的溶液的至多10％或至多20％。
在一些实施方案中，脂质体包括空间稳定剂，其增加其在循环中的寿命。一种或多种空间稳定剂如亲水性聚合物(聚乙二醇(PEG))、糖脂(单唾液酸神经节苷脂(GM1))或其它物质占据紧邻脂质体表面的空间并从该空间中排除其它大分子。因此，阻碍了血浆调理素对脂质体表面的接近和结合，从而抑制了巨噬细胞与这种脂质体或任何其它清除机制的相互作用，并且增强了脂质体在循环中的寿命。在一些实施方案中，空间稳定剂或空间稳定剂群是PEG或包含PEG的组合。在其它实施方案中，空间稳定剂是PEG或包含数均分子量(Mn)为200至5000道尔顿的PEG的组合。这些PEG可以是任何结构，例如直链、支链、星形或梳形结构，并且可商购获得。
所公开的脂质体的直径不受特别限制。在一些实施方案中，脂质体的直径在例如30-150nm(纳米)的范围内。在其它实施方案中，脂质体的直径为40-70nm。
脂质体的特性受用于制备脂质体的脂质的性质的影响。已经使用多种脂质来制备脂质体。这些包括阳离子性、阴离子性和中性脂质。在一些实施方案中，包含聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体是阴离子性或中性的。在其它实施方案中，提供的脂质体是阳离子性的。通常可以通过测量脂质体的ζ电位来确定电荷(例如，阴离子、中性或阳离子)。脂质体的ζ电位可以是正的、零或负的。在一些实施方案中，脂质体的ζ电位小于或等于零。在一些实施方案中，脂质体的ζ电位在0至-150mV的范围内。在另一个实施方案中，脂质体的ζ电位在-30至-50mV的范围内。
在一些实施方案中，阳离子脂质用于制备阳离子脂质体，其通常用作基因转染剂。阳离子脂质体上的正电荷使得能够与细胞表面上的负电荷相互作用。在阳离子脂质体与细胞结合后，脂质体通过胞吞作用在细胞内转运。
在一些实施方案中，使用中性至阴离子脂质体。在一个实施方案中，使用阴离子脂质体。使用例如HSPC等中性脂质和PEG-DSPE等阴离子脂质的混合物，可以形成阴离子脂质体，其不太可能与正常细胞非特异性结合。通过使用肿瘤靶向抗体，例如叶酸受体抗体，包括例如叶酸受体α抗体、叶酸受体β抗体和/或叶酸受体δ抗体，可以实现与肿瘤细胞的特异性结合。
作为实例，至少一种(或一些)脂质是两亲性脂质，定义为具有亲水和疏水部分(通常为亲水性头部和疏水性尾部)。疏水部分通常定向成疏水相(例如，在双层内)，而亲水部分通常定向于水相(例如，在双层外)。亲水部分可包含极性或带电基团，例如碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根合、氨基、巯基、硝基、羟基和其它类似基团。疏水部分可包含非极性基团，其包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基和被一个或多个芳族、环脂族或杂环基团取代的基团。两亲化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。
通常，例如，脂质是磷脂。磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等。应理解，可以使用其它脂质膜组分，例如胆固醇、鞘磷脂和心磷脂。
包含本文提供的脂质体的脂质可以是阴离子和中性(包括两性离子和极性)脂质，其包括阴离子和中性磷脂。中性脂质在选定的pH下以不带电或中性两性离子形式存在。在生理pH下，这种脂质包括例如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰甘油。两性离子脂质的实例包括但不限于二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)。阴离子脂质在生理pH下带负电荷。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰基磷脂酰甘油(POPG)以及其它阴离子修饰基团结合到中性脂质。
阴离子和中性脂质在本文中统称为非阳离子脂质。这些脂质可含有磷，但它们不限于此。非阳离子脂质的实例包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰-1-乙醇胺(DSPE)、棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、16-0-单甲基PE、16-0-二甲基PE、18-1-反式PE、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二鲸蜡醇磷酸酯和胆固醇。
可以使用本领域已知的脂质体组分(也称为脂质体组分)使用任何脂质体组装方法组装脂质体。脂质体组分包括例如脂质，如DSPE、HSPC、胆固醇和这些组分的衍生物。其它合适的脂质可商购自例如Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,Alabama,U.S.A.)。适用于制备阴离子脂质体的可用的负性或中性电荷脂质的部分列表可以是例如以下中的至少一种：DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、DMPE、DPPE、DOPE、DMPA·Na、DPPA·Na、DOPA·Na、DMPG·Na、DPPG·Na、DOPG·Na、DMPS·Na、DPPS·Na、DOPS·Na、DOPE-戊二酰·(Na)2、四肉豆蔻酰心磷脂·(Na)2、DSPE-mPEG-2000·Na、DSPE-mPEG-5000·Na和DSPE-马来酰亚胺PEG-2000·Na。
脂质衍生物可以包括例如至少一种或多种空间稳定剂和/或官能团与脂质体组分的键合(优选共价键合)，之后应将空间稳定剂和/或官能团视为脂质体组分的一部分。官能团包括可用于将脂质体组分连接至另一部分(例如蛋白质)的基团。这些官能团至少包括马来酰亚胺。这些空间稳定剂包括选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)；聚L-赖氨酸(PLL)；单唾液酸神经节苷脂(GM1)；聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)；聚(丙烯酰胺)(PAA)；聚(2-甲基-2-噁唑啉)；聚(2-乙基-2-噁唑啉)；磷脂酰聚甘油；聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]；两亲性聚-N-乙烯基吡咯烷酮；L-氨基酸基聚合物；和聚乙烯醇。
由于脂质体的组分可包括与其结合的任何分子(即化学品/试剂/蛋白质)，因此在一些实施方案中，所提供的脂质体的组分至少包括选自下组的成员：DSPE、DSPE-PEG、DSPE-马来酰亚胺、HSPC；HSPC-PEG；HSPC-马来酰亚胺；胆固醇；胆固醇-PEG；和胆固醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，所提供的脂质体的组分包括DSPE、DSPE-PEG、DSPE-马来酰亚胺、HSPC；HSPC-PEG；HSPC-马来酰亚胺；胆固醇；胆固醇-PEG；和胆固醇-马来酰亚胺。在一个示例性实施方案中，构成脂质体的脂质体组分包含DSPE；DSPE-FITC；DSPE-马来酰亚胺；胆固醇；和/或HSPC。
在一些实施方案中，脂质体脂质双层的至少一种组分是官能化的(或反应性的)。如本文所用，官能化组分是包含可用于将试剂和部分交联至脂质的反应性基团的组分。如果脂质被官能化，则其形成的任何脂质体也被官能化。在一些实施方案中，反应性基团是将与交联剂(或其它部分)反应以形成交联的基团。脂质体脂质双层中的反应性基团位于脂质上的任何位置，使其与交联剂接触并与另一部分(例如，空间稳定剂或靶向部分)交联。在一些实施方案中，反应性基团在脂质的头部基团中，包括例如磷脂。在一些实施方案中，反应性基团是马来酰亚胺基团。马来酰亚胺基团可在二硫醇交联剂存在下彼此交联，所述二硫醇交联剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)。
应理解，还可考虑使用除上述那些之外的其它官能化脂质、其它反应性基团和其它交联剂。除马来酰亚胺基团外，所考虑的反应性基团的其它实例包括但不限于其它硫醇反应性基团、氨基如伯胺和仲胺、羧基、羟基、醛基、炔基、叠氮基、羰基、卤代乙酰基(例如碘乙酰基)、亚氨酸酯基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、巯基和吡啶基二硫化物基团。
功能化和非官能化脂质可从许多商业来源获得，包括Avanti Polar 5 Lipids(Alabaster,Ala.)。
在一些实施方案中，所提供的脂质体还包含置于其外部的免疫刺激剂、可检测标记物或两者。免疫刺激剂或可检测标记物可以离子键合或共价键合到脂质体的外部，包括例如任选地键合到脂质体的空间稳定剂组分。
术语免疫刺激剂(immunostimulatory agent)，也称为免疫刺激剂(immunostimulant/immunostimulator)，是指通过诱导其任何组分的活化或增加其活性来刺激免疫系统的物质。这些免疫刺激剂可包括半抗原、佐剂、蛋白质免疫刺激剂、核酸免疫刺激剂和化学免疫刺激剂中的一种或多种。许多佐剂含有旨在刺激免疫应答的物质，例如脂质A、百日咳博德特氏菌或结核分枝杆菌衍生的蛋白质。某些佐剂可商购获得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)；默克佐剂65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham,Philadelphia,Pa.)；铝盐，如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰脂质A和quil A。细胞因子，例如GM-CSF、白介素-2、-7、-12和其它类似生长因子，也可用作佐剂。在一个示例性实施方案中，免疫刺激剂可以是选自由荧光素、DNP、β-葡聚糖、β-1,3-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖组成的组中的至少一种。
可检测标记物可以例如至少包括放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂、酶、染料、墨水、磁性化合物、生物催化剂或可通过本领域已知的任何合适方法，例如磁共振成像(MRI)、光学成像、荧光/发光成像或核成像技术检测的颜料。
在一些实施方案中，免疫刺激剂和/或可检测标记物通过将其与脂质体共培育而连接到外部。例如，免疫刺激剂和/或可检测标记物可以通过疏水相互作用或通过离子键如抗生物素蛋白/生物素键或金属螯合键(例如，Ni-NTA)与脂质体膜结合。或者，免疫刺激剂或可检测标记物可以共价键合到脂质体的外部，例如通过共价键合到脂质体组分或空间稳定剂，即PEG。
一种示例性试剂是异硫氰酸荧光素(FITC)，其基于实验，可充当免疫刺激剂和可检测标记物。
在其它非限制性实施方案中，所提供的脂质体包围内部空间。在一些实施方案中，内部空间包含但不限于水溶液。在一些实施方案中，内部空间包含如本文提供的聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，内部空间还包含药学上可接受的载体，例如海藻糖。在另一个实施方案中，海藻糖以约5％至20％重量百分比的海藻糖或以5％至20％总浓度的一种或多种冻干保护剂或冷冻保护剂的任何组合存在。在一些实施例中，内部空间包含缓冲液。在其它实施方案中，缓冲液是HEPES缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。在其它实施方案中，柠檬酸盐缓冲液的浓度为5至200mM。在一些实施方案中，内部空间的pH为2.8至6。在另外的实施方案中，脂质体的内部空间包含乙酸钠和/或乙酸钙。在一些实施方案中，脂质体的内部空间包含50mM至500mM的乙酸钠和乙酸钙的总浓度。
在一些实施方案中，靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂包含含有脂质体的介质，所述脂质体包含内部空间；设置在内部空间内的水性聚谷氨酸化抗叶酸剂；和靶向部分，其包含对至少一种叶酸受体具有特异性亲和力的蛋白质，并且其中靶向部分位于脂质体的外部。在一些实施方案中，介质是水溶液。在一些实施方案中，内部空间、外部空间(例如，介质)或内部空间和介质两者包含一种或多种上文列出的冻干保护剂或冷冻保护剂。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘露醇、海藻糖、山梨糖醇和/或蔗糖。
在一些实施方案中，非靶向脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂包含含有脂质体的介质，所述脂质体包含内部空间；和设置在内部空间内的水性聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，介质是水溶液。在一些实施方案中，内部空间、外部空间(例如，介质)或内部空间和介质两者包含一种或多种上文列出的冻干保护剂或冷冻保护剂。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘露醇、海藻糖、山梨糖醇和/或蔗糖。
如上所述，脂质体可包含空间稳定剂，其可延长其循环寿命。对于包含空间稳定剂的那些实施方案，空间稳定剂可以是选自由以下组成的组中的至少一个成员：聚乙二醇(PEG)、聚-L-赖氨酸(PLL)、单唾液酸神经节苷脂(GM1)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酰胺)(PAA)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、磷脂酰聚甘油、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、两亲性聚-N-乙烯基吡咯烷酮、L-氨基酸基聚合物和聚乙烯醇。在一些实施方案中，空间稳定剂或空间稳定剂群是PEG。在一个实施方案中，空间稳定剂是PEG。在另一个实施方案中，PEG的数均分子量(Mn)为200至5000道尔顿。这些PEG可以是任何结构，例如直链、支链、星形或梳形结构，并且可商购获得。
在一些实施方案中，脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(LPA或PLPA)是水溶性的。也就是说，脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂是水溶液形式。在一些实施方案中，LPA或PLPA包含含有少于200,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子的内部空间。在一些实施方案中，LPA或PLPA含有10,000至100,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子。在其它实施方案中，LPA或PLPA含有10,000至100,000个五谷氨酸化抗叶酸剂分子。在其它实施方案中，LPA或PLPA含有10,000至100,000个五谷氨酸化抗叶酸剂分子。
在一些实施方案中，LPA或PLPA的内部空间含有少于200,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：聚谷氨酸化MTX、聚谷氨酸化PMX、聚谷氨酸化LTX、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化RTX、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个聚谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个聚谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个聚谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个五谷氨酸化LTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个六谷氨酸化LTX分子分子。
在一些实施方案中，LPA或PLPA的内部空间含有10,000至100,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：聚谷氨酸化MTX、聚谷氨酸化PMX、聚谷氨酸化LTX、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化RTX、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，脂质体含有10,000至100,000个聚谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，脂质体含有10,000至100,000个聚谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有10,000至100,000个聚谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有10,000至100,000个五谷氨酸化LTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有10,000至100,000个六谷氨酸化LTX分子。
在一些实施方案中，LPA或PLPA的内部空间含有少于200,000个五谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸LY309887。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个五谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个五谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个五谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个五谷氨酸化RTX分子。
在一些实施方案中，LPA或PLPA的内部空间含有少于200,000个六谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个六谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个六谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个六谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个六谷氨酸化RTX分子。
在一些实施方案中，脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚乙二醇化的(即聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂(PLPA或PLPNA))。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA是水溶性的。也就是说，PLPA或PLPNA是水溶液形式。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA包含含有少于200,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子的内部空间。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子。在其它实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个五谷氨酸化抗叶酸剂分子。在其它实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个六谷氨酸化抗叶酸剂分子。
在一些实施方案中，PLPA或PLPNA的内部空间含有少于200,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：聚谷氨酸化MTX、聚谷氨酸化PMX、聚谷氨酸化LTX、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化RTX、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，脂质体含有少于200,000个聚谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个聚谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个聚谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个五谷氨酸化LTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个六谷氨酸化LTX分子分子。
在一些实施方案中，PLPA或PLPNA的内部空间含有10,000至100,000个聚谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：聚谷氨酸化MTX、聚谷氨酸化PMX、聚谷氨酸化LTX、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化RTX、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，脂质体含有10,000至100,000个聚谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个聚谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个聚谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个五谷氨酸化LTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个六谷氨酸化LTX分子。
在其它实施方案中，PLPA或PLPNA的内部空间含有少于200,000个五谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸LY309887。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个五谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个五谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个五谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个五谷氨酸化RTX分子。
在其它实施方案中，PLPA或PLPNA的内部空间含有少于200,000个六谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个六谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个六谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个六谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有少于200,000个六谷氨酸化RTX分子。
在其它实施方案中，PLPA或PLPNA的内部空间含有10,000至100,000个五谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸LY309887。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个五谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个五谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个五谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个五谷氨酸化RTX分子。
在其它实施方案中，PLPA或PLPNA的内部空间含有10,000至100,000个六谷氨酸化抗叶酸剂分子，其是选自由以下组成的组：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸LY309887。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个六谷氨酸化PMX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个六谷氨酸化MTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个六谷氨酸化RTX分子。在一些实施方案中，PLPA或PLPNA含有10,000至100,000个六谷氨酸化RTX分子。
在一些实施方案中，包含脂质体组合物的溶液的pH为pH 5至8或pH 2至6。
靶向脂质体
在一些实施方案中，本公开提供脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，其中脂质体是聚乙二醇化的并且包含聚谷氨酸化抗叶酸剂和与PEG和脂质体外部中的一个或两个连接的靶向部分，并且其中靶向部分对目标靶细胞上的表面抗原具有特异性亲和力。此类脂质体在本文中通常可称为“靶向脂质体”，例如包括在脂质体的表面上或以其它方式连接于脂质体的一种或多种靶向部分或生物分布调节剂的脂质体。靶向脂质体的靶向部分可以是能够特异性结合所需靶标(例如，在目标靶细胞表面上表达的抗原靶标)的任何部分或剂。在一个实施方案中，靶向脂质体特异性地且优先地结合目标靶细胞表面上的靶标，所述目标靶细胞内化靶向脂质体，脂质体包封的聚谷氨酸化细胞毒性剂(例如，聚谷氨酸化抗叶酸剂，例如五谷氨酸化或六谷氨酸化PMX、LTX和MTX)发挥其细胞毒性作用。在其它实施方案中，靶细胞是癌细胞、肿瘤细胞或转移细胞。在一些实施方案中，靶向脂质体是免疫脂质体。
术语连接或连接的是指例如，任何类型的键合，例如共价键合、离子键合(例如，抗生物素蛋白-生物素)通过疏水相互作用键合，以及通过如马来酰亚胺的官能团或如PEG的接头键合。例如，可检测标记物、空间稳定剂、脂质体、脂质体组分、免疫刺激剂可以直接、通过马来酰亚胺官能团或PEG-马来酰胺基团彼此连接。
在一些实施方案中，与脂质体连接的靶向部分是多肽。在其它实施方案中，靶向部分是抗体或抗体片段。在另外的实施方案中，靶向部分包含抗体、人源化抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体中的一种或多种。在另外的实施方案中，靶向部分对肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异性亲和力，所述表位存在于肿瘤细胞上但在非肿瘤细胞上不存在或不可接近。在一些实施方案中，靶向部分还包含免疫刺激剂、可检测标记物和设置在PEG和脂质体外部的至少一个上的马来酰亚胺中的一种或多种。在一些实施方案中，脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(LPA)或聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(PLPA)脂质体的靶向部分是阴离子性或中性的。在其它实施方案中，LPA或PLPA脂质体的靶向部分是阳离子性的。在一些实施方案中，靶向部分LPA或PLPA脂质体组合物包含至少10％脂质体包埋的聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，靶向部分-LPA或靶向部分-PLPA脂质体的直径为20nm至200nm。在其它实施方案中，脂质体的直径为80nm至120nm。
在一些实施方案中，靶向部分-LPA或靶向部分-PLPA包含多肽靶向部分，例如抗体或抗体片段，并且靶向部分以0.5x10-10至10x10-6范围的平衡解离常数(Kd)结合靶抗原，如使用BIACORE分析测定。在其它实施方案中，靶向部分-LPA或靶向部分-PLPA包含多肽靶向部分。
在一些实施方案中，靶向部分-LPA或靶向部分-PLPA包含多肽靶向部分，例如抗体或抗体片段，并且靶向部分对选自由以下组成的组的靶抗原具有特异性亲和力：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘着蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜素、内皮素受体、HER2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。
在其它实施方案中，靶向部分包含多肽靶向部分，例如抗体或抗体片段，并且靶向部分对叶酸受体具有结合特异性。在一些实施方案中，靶向部分以0.5x10-10至10x10-6范围的平衡解离常数(Kd)结合叶酸受体，如使用BIACORE分析所测定。在一些实施方案中，由靶向部分结合的叶酸受体是选自由以下组成的组的一种或多种叶酸受体：叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ)。
在一些实施方案中，靶向部分是抗体或抗体的抗原结合部分，其特异性结合在目标靶细胞表面上表达的目标靶标。在一些实施方案中，靶向部分是全长抗体。在一些实施方案中，靶向部分是抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中，靶向部分包含抗体来源的一个或多个互补决定区(CDR)。可用作所公开的靶向脂质体的靶向部分的合适蛋白质的实例包括全长人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体。所提供的靶向脂质体的抗体可以具有上述特征的组合。例如，人源化抗体可以是抗原结合片段，并且也可以聚乙二醇化和多聚化。
术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人(例如鼠)序列的片段。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的CDR的残基取代(Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv]框架区(FR)残基被来自非人物种的抗体中的相应残基替换，所述抗体具有所需的特异性、亲和力和能力。可以通过替换Fv框架区中和/或替换的非人残基内的额外残基来进一步修饰人源化抗体，以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个，通常是两个或三个可变结构域，其含有对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利No.5,225,539和5,639,641中。
如本文所讨论，叶酸受体(FR)不同于还原型叶酸载体(RFC)并且利用不同的途径将叶酸和抗叶酸剂带入细胞中。在一些实施方案中，靶向部分特异性结合叶酸受体。在其它实施方案中，靶向部分特异性结合选自叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体δ的叶酸受体。可以使用本领域已知的技术常规地产生叶酸受体α的抗体。此外，许多抗叶酸受体抗体的序列属于公有领域和/或可商购获得并且易于获得。
抗叶酸受体的鼠抗体是可以用作所公开的靶向脂质体的靶向部分的抗体的实例，是针对叶酸受体的鼠抗体。这些抗体的序列是已知的，并且描述于例如美国专利No.5,646,253；8,388,972；8,871,206；和9,133,275以及国际申请No.PCT/US2011/056966和PCT/US2012/046672。例如，基于已经在公有领域中公开的序列，可以合成抗体的基因并将其置于瞬时表达载体中，并且在HEK-293瞬时表达系统中产生抗体。抗体可以是完整抗体、Fab或本文讨论的或本领域另外已知的任何各种抗体变体。
在一些实施方案中，靶向脂质体包含30至500个靶向部分(例如，30至250个靶向部分或30至200个靶向部分)。在一些实施方案中，所提供的靶向脂质体含有少于220个靶向部分，少于200个靶向部分，或少于靶向175个部分。在一些实施方案中，靶向部分非共价键合至脂质体的外部(例如，通过离子相互作用或GPI锚)。
在一些实施方案中，靶向脂质体外部的分子包括脂质、靶向部分、空间稳定剂(例如PEG)、马来酰亚胺和胆固醇。在一些实施方案中，靶向部分通过马来酰亚胺官能团共价结合。在一些实施方案中，靶向部分与脂质体组分或空间稳定剂(例如PEG分子)共价结合。在一些实施方案中，所有靶向部分与脂质体的一种组分如PEG结合。在其它实施方案中，靶向部分与脂质体的不同组分结合。例如，一些靶向部分可以与脂质组分或胆固醇结合，一些靶向部分可以与空间稳定剂(例如PEG)结合，并且其它靶向部分可以与可检测标记物或另一个靶向部分结合。
在一些实施方案中，靶向脂质体的靶向部分对癌细胞表面上表达的抗原具有亲和力和特异性(即，特异性结合)。在其它一些实施方案中，靶向脂质体的靶向部分对一种或多种选自由叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体δ组成的组的抗原具有亲和力和特异性。在一个实施方案中，靶向部分对选自由叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体δ组成的组的抗原具有特异性亲和力(即，特异性结合)。在另一个实施方案中，靶向部分对至少两种选自由叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体δ组成的组的抗原具有特异性亲和力。在另一个实施方案中，靶向部分对三种抗原具有特异性亲和力，所述三种抗原是例如叶酸受体α；叶酸受体β；和叶酸受体δ。靶向部分可以对抗原的表位具有亲和力和特异性，因为有时靶向部分不结合完整抗原而仅结合抗原中许多表位中的一种表位。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换使用，并且是指能够被特定抗体或结合部分识别并特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，表位可以由连续的氨基酸和通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时丢失。表位通常包含独特空间构象中的至少3个，更通常至少5或8-10个氨基酸。
在一些实施方案中，靶向部分对肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异性亲和力，所述表位存在于肿瘤细胞上但在非肿瘤细胞上不存在或不可接近。例如，在一些情况下，肿瘤抗原位于正常细胞和恶性癌细胞的表面上，但肿瘤表位仅在癌细胞中暴露。作为另一个实例，肿瘤抗原可以经历癌症的构象变化，从而导致癌细胞特异性表位存在。对本文所述表位具有特异性亲和力的靶向部分是有用的，并且包括在所公开的组合物和方法中。在一些实施方案中，具有癌细胞特异性表位的肿瘤细胞是癌细胞。此类肿瘤细胞表面抗原的实例包括叶酸受体α、叶酸受体β和叶酸受体δ。
在一些实施方案中，脂质体组合物作为含有脂质体和载体(例如药学上可接受的载体)的药物组合物提供。所提供的药物组合物中包含的药学上可接受的载体的实例包括生理盐水、等渗右旋糖、等渗蔗糖、林格氏溶液和汉克斯溶液。在一些实施方案中，添加缓冲物质以维持药物组合物的储存稳定性的最佳pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH为6.0至7.5。在一些实施方案中，pH为6.3至7.0。在其它实施方案中，pH为6.5。理想地，药物组合物的pH允许脂质体膜脂质的稳定性和包埋实体的保留。组氨酸、羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)、吗啉乙基磺酸盐(MES)、琥珀酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐，通常浓度为2-20mM，是示例性缓冲物质。其它合适的载体包括例如水、缓冲水溶液、0.4％NaCl和0.3％甘氨酸。可加入蛋白质、碳水化合物或聚合物稳定剂和张力调节剂，例如明胶、白蛋白、葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮。可以用葡萄糖或更惰性的化合物如乳糖、蔗糖、甘露糖醇或糊精将组合物的张力调节至0.25-0.35mol/kg的生理水平。这些组合物可以使用本领域已知的常规灭菌技术(例如，通过过滤)常规灭菌。得到的水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂在施用前与无菌水性介质混合。
所提供的药物脂质体组合物还可含有接近生理条件所需的其它药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂，和张力调节剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。另外，脂质体悬浮液可包括脂质保护剂，其保护脂质免受储存时的自由基和脂质过氧化损害。亲脂性自由基猝灭剂，例如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂，例如铁胺，是合适的。
所提供的流体药物制剂中的脂质体浓度可以根据需要广泛变化，例如，通常小于约0.05重量％或至少约2-10重量％至多达30至50重量％并且可根据所选择的特定施用方式，主要通过流体体积和粘度来选择。例如，可以增加浓度以降低与治疗相关的流体负荷。这对于患有动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压的患者可能是特别理想的。或者，可以将由刺激性脂质组成的脂质体药物组合物稀释至低浓度以减轻施用部位的炎症。
一些实施方案涉及将聚谷氨酸化抗叶酸剂的靶向聚乙二醇化脂质体制剂递送至其表面上表达叶酸受体的肿瘤的方法。示例性方法包括施用本公开中包含脂质体的任何组合物中的至少一种的步骤，其量为将治疗有效剂量的靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂递送至肿瘤。
施用的脂质体药物组合物的量将取决于包埋在脂质体内的特定聚谷氨酸化抗叶酸剂治疗实体、所治疗的疾病状态、所用脂质体的类型以及临床医生的判断。通常，施用的脂质体药物组合物的量足以递送治疗有效剂量的特定治疗实体。
递送治疗有效剂量所必需的脂质体药物组合物的量可以通过药物测试领域中常见的常规体外和体内方法来确定。例如参见D.B.Budman,A.H.Calvert,E.K.Rowinsky(编辑).Handbook of Anticancer Drug Development,LWW,2003。各种治疗组合物的治疗有效剂量是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，治疗实体通过药物脂质体组合物递送并提供至少与通过在其常规非脂质体制剂中施用相同量的治疗实体获得的活性相同或更高的活性。通常，脂质体药物组合物的剂量范围为例如每千克体重约0.005至约500mg治疗实体，最常见的是每千克体重约0.1至约100mg治疗实体。
如本文所用，“有效量”是指足以提供医学上期望的结果的药剂剂量。有效量将随期望的结果、治疗或预防的特定病状、所治疗的受试者的年龄和身体状况、病状的严重程度、治疗的持续时间、并行或组合治疗(如果有的话)的性质、特定的施用途径和健康从业者的知识和专业知识中的相似因素而变化。“有效量”可以根据所述目的凭经验和常规方式确定。在本公开中，术语“受试者”和“患者”可互换使用并具有相同的含义。通常优选使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
例如，如果受试者患有肿瘤，则有效量可以是减少肿瘤体积或负荷的药剂(例如，聚谷氨酸化抗叶酸剂)的量(例如通过对肿瘤成像确定)。还可以通过血液或其它体液或组织(例如活检体)中癌细胞的存在和/或频率来常规评估有效量。如果肿瘤正在影响组织或器官的正常功能，则可以通过测量组织或器官的正常功能来常规评估有效量。在某些情况下，有效量是减轻或消除一种或多种，优选所有症状所需的量。
例如“治疗(treating/treatment/to treat)”的术语是指(a)治愈、减缓、减轻症状和/或停止诊断的病理状况或病症的进展的治疗措施和(b)预防和/或减缓目标疾病或病状发展的预防措施。因此，需要治疗的受试者包括已经患有癌症或病状的受试者；那些有患癌症或病状风险的人；以及要预防感染或病状的人。在某些实施方案中，如果受试者显示例如与疾病或病症(例如，癌症、类风湿性关节炎)相关的症状的全部、部分或短暂改善或消除，则根据本文提供的方法成功“治疗”受试者。
还提供了包含所提供的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物(例如，含有五谷氨酸化或六谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体)的药物组合物。药物组合物是无菌组合物，其包含样品脂质体，优选抗叶酸剂，优选在药学上可接受的载体中。
术语“递送媒剂”通常是指用于帮助、促进或便于聚谷氨酸化的抗叶酸剂进入细胞的任何组合物，例如病毒序列、病毒材料或脂质或脂质体制剂。
术语“药学上可接受的载体”是指例如一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适于施用于人或其它受试者。
术语“载体”表示天然或合成的有机或无机成分，脂质体组合物与其结合以便于施用。药物组合物的组分以防止相互作用的方式混合，所述相互作用将显著损害其所需的药物效率。合适的缓冲剂包括乙酸和盐(1-2％W/V)、柠檬酸和盐(1-3％W/V)、硼酸和盐(0.5-2.5％W/V)以及磷酸和盐(0.8-2％W/V)。合适的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％W/V)、氯丁醇(0.3-0.9％W/V)和对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％W/V)。
除非本文另有说明，否则可获得多种施用途径。选择的特定模式将取决于所选择的特定活性剂、所治疗的具体病状和治疗功效所需的剂量。所提供的方法可以使用医学上可接受的任何已知施用模式并且根据良好医学实践来实施。在一些实施方案中，施用途径是注射。在其它实施方案中，注射是通过肠胃外途径，所述肠胃外途径选自肌肉内、皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、关节内、硬膜内、鞘内、静脉内、肌肉内或胸骨内注射。在一些实施方案中，施用途径是输注。在另外的实施方案中，施用途径是口服、鼻腔、粘膜、舌下、气管内、眼科、直肠、阴道、眼部、局部、透皮、肺部或吸入。
在一些实施方案中，将PLPA和/或靶向-PLPA制备为输注组合物、注射组合物、肠胃外组合物或局部组合物。在其它实施方案中，注射包括以下一种或多种：腹膜内注射、直接肿瘤内注射、动脉内注射和静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、经皮和鼻内途径递送。在另一个实施方案中，PLPA和/或靶向-PLPA是液体溶液或悬浮液。然而，本文还提供了适于在注射前溶解或悬浮在液体媒剂中的固体形式。在一些实施方案中，根据本领域已知的方法将靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂配制成肠溶包衣片剂或凝胶胶囊。
在一些实施方案中，将靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸制剂施用于中枢神经系统肿瘤，使用缓慢、持续的颅内输注脂质体直接进入肿瘤(例如，对流增强递送(CED))。参见Saito等人,Cancer Research 64:2572-2579(2004)；Mamot等人,J.Neuro-Oncology 68:1-9(2004)。在其它实施方案中，将制剂直接施用于组织表面。还提供了持续释放、pH依赖性释放和聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂的其它特定化学或环境条件介导的释放施用(例如，长效注射和易蚀植入物)。此类释放介导组合物的实例在本文中进一步描述或在本领域中已知。
对于通过吸入施用，通过使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，可以加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式方便地递送组合物。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门递送计量的量来确定。
当需要全身递送组合物时，它们可以配制用于通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中。药物肠胃外制剂包括成分的水溶液。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。或者，脂质体的悬浮液可以制备成油基悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。
或者，非靶向或靶向的聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂可以是粉末形式或冻干形式，用于在使用前用合适的媒剂(例如无菌无热原水)复原。
还可以将所提供的组合物(例如，聚谷氨酸化抗叶酸剂和含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体)配制在直肠或阴道组合物中，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。
所提供的组合物具有体内、离体和体外应用。在一些实施方案中，组合物具有体外应用。体外使用可包括如细胞培养和组织工程的用途，其中需要选择性处理细胞亚群。例如，在来自正常患者或患有癌症的患者的干细胞培养期间，可以如所讨论的那样用样品组合物或样品脂质体处理细胞以解决癌细胞亚群。可能出现癌症亚群，因为供体最初患有癌症或因为细胞在体外程序期间自发转化。
在一些实施方案中，脂质体组合物在试剂盒中提供，所述试剂盒包含具有脂质体的容器，和任选地具有被脂质体靶向或优先结合的实体(抗原)的容器，和说明书，例如与在一种或多种应用中使用脂质体组合物相关的程序或信息。这种说明书可以通过任何介质提供，例如硬纸拷贝、电子介质或访问包含该说明书的数据库或网站。
在一些实施方案中，本公开提供了杀死过度增殖细胞的方法，其包括使过度增殖细胞与包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)接触。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合过度增殖细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合过度增殖细胞表面上的细胞表面抗原的靶向部分，所述抗原选自由以下组成的组：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合的靶向部分，其包含特异性结合选自由以下组成的组的过度增殖细胞表面上的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。
在一些实施方案中，本公开提供抑制肿瘤细胞增殖的方法，其包括使肿瘤细胞与包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)接触。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合过度增殖细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合肿瘤细胞表面上的细胞表面抗原的靶向部分，所述抗原选自由以下组成的组：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合的靶向部分，其包含特异性结合选自由以下组成的组的肿瘤细胞表面上的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗过度增殖性疾病的方法，其包括向患有过度增殖性疾病或有患过度增生性疾病风险的受试者施用有效量的包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合目标靶细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗免疫系统病症(例如，自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎)的方法，其包括向患有自身免疫疾病或有患自身免疫疾病风险的受试者施用有效量的包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)。在一些实施方案中，免疫系统病症是自身免疫疾病。在其它实施方案中，免疫系统病症是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化普拉曲沙(PTX)。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化普拉曲沙(PTX)。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合目标靶细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌症风险的受试者施用有效量的包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组的癌症：肺癌(例如非小肺癌)、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和血液系统恶性病(例如白血病或淋巴瘤)。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合目标靶细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜蛋白、内皮素受体、HER2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗肺癌(例如，非小细胞肺癌)的方法，其包括向患有肺癌或有患肺癌风险的受试者施用有效量的包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)。在特定的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，脂质体是非靶向的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合肺癌(例如，非小细胞肺癌)细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：粘蛋白1、叶酸受体-δ、结合素4、NaPi2b、CD56、EGFR和SC-16。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：粘蛋白1、叶酸受体-δ、结合素4、NaPi2b、CD56、EGFR和SC-16。
在一些实施方案中，本公开提供了治疗胰腺癌的方法，其包括向患有胰腺癌或有患胰腺癌的风险的受试者施用有效量的包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，脂质体是非靶向的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合胰腺癌细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：TACSTD2(TROP2)、粘蛋白1、叶酸受体-δ、间皮素、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4和结合素4。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：TACSTD2(TROP2)、粘蛋白1、叶酸受体-δ、间皮素、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4和结合素4。
在另外的实施方案中，本公开提供了治疗乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(雌激素受体-、孕酮受体-和HER2-))的方法，其包括向患有乳腺癌或有患乳腺癌风险的受试者施用有效量的包含聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，脂质体是非靶向的。在另外的实施方案中，递送载体在其表面上包含靶向部分，其特异性结合乳腺癌细胞表面上的抗原。在其它实施方案中，递送载体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：LIV-1(ZIP6)、EGFR、HER2、HER3、粘蛋白1、叶酸受体-δ、GONMB和结合素4。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：LIV-1(ZIP6)、EGFR、HER2、HER3、粘蛋白1、叶酸受体-δ、GONMB和结合素4。
在一些实施方案中，将所提供的组合物(例如，含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体)施用于患有或有患血液癌症的风险的受试者，所述血液癌症可通过其细胞表面上的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的表达来区分。因此，在一些实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症、实体瘤和/或转移或有患癌症、实体瘤和/或转移风险的受试者施用有效量的包含靶向部分和聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸化剂的递送载体(例如，脂质体)，所述癌症、实体瘤和/或转移可通过其细胞表面癌症上的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的表达来区分，并且其中靶向部分在递送载体的表面上表达并特异性结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在另外的实施方案中，递送载体包含靶向部分，其特异性结合在血液癌细胞表面上表达的细胞表面抗原。在另外的实施方案中，靶向部分特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原：CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和/或CD98。
在一些实施方案中，本公开提供聚谷氨酸化抗叶酸剂在制备用于治疗过度增殖性疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含5个或更多个谷氨酰基。在一些实施方案中，五谷氨酸化的抗叶酸剂五谷氨酸化或六谷氨酸化。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是甲氨蝶呤(MTX)。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化AG2034。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化普拉曲沙。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化AG2034。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化GW1843。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化氨基蝶呤。在一些实施方案中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，聚谷氨酸抗叶酸剂在脂质体中。在一些实施方案中，过度增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是选自由以下组成的组：肺(例如，非小肺癌)、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和血液恶性病。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，过度增殖性疾病是自身免疫疾病。在一些实施方案中，过度增殖性疾病是类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，将所公开的组合物(例如，含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体)施用于患有癌症、实体瘤和/或转移或有患癌症、实体瘤和/或转移的风险的受试者，所述癌症、实体瘤和/或转移可通过其细胞表面上的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的表达来区分。因此，在一些实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症、实体瘤和/或转移或有患癌症、实体瘤和/或转移的风险的受试者施用有效量的包含靶向部分和聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)，所述癌症、实体瘤和/或转移可通过其细胞表面癌症上的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的表达来区分，并且其中靶向部分在递送载体的表面上表达并特异性结合肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化PMX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。在另外的实施方案中，递送载体包含靶向部分，其特异性结合在癌症、实体瘤和/或转移细胞表面上表达的细胞表面抗原。在另外的实施方案中，靶向部分特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘着蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜素、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。在其它实施方案中，递送载体是脂质体，并且脂质体包含特异性结合选自由以下组成的组的细胞表面抗原的靶向部分：GONMB、CD56、TACSTD2(TROP2)、CEACAM5、叶酸受体-α、叶酸受体-β、粘蛋白1、叶酸受体-δ、STEAP1、间皮素、结合素4、ENPP3、鸟苷酸环化酶C(GCC)、SLC44A4、NaPi2b、CD70(TNFSF7)、CA9(碳酸酐酶)、5T4(TPBG)、SLTRK6、SC-16、组织因子、LIV-1(ZIP6)、CGEN-15027、P-钙粘着蛋白、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、VEGFR2(CD309)、肌腱蛋白、胶原蛋白IV、骨膜素、内皮素受体、HER 2、EGFR、CD30、CD79b、CD19、CD138、CD74、CD37、CD19、CD22、CD33和CD98。
在其它实施方案中，本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌症风险的受试者施用有效量的包含在其表面上特异性结合叶酸受体的靶向部分和聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂的递送载体(例如，脂质体)，所述癌症含有在其细胞表面上表达叶酸受体的细胞。在其它实施方案中，叶酸受体是叶酸受体α、叶酸受体β或叶酸受体δ。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组的成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的五谷氨酸化抗叶酸剂：五谷氨酸化MTX、五谷氨酸化PMX、五谷氨酸化LTX、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化RTX、五谷氨酸化吡曲克辛、五谷氨酸化普拉曲沙、五谷氨酸化AG2034、五谷氨酸化GW1843、五谷氨酸化氨基蝶呤和五谷氨酸化LY309887。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含选自由以下组成的组的六谷氨酸化抗叶酸剂：六谷氨酸化MTX、六谷氨酸化PMX、六谷氨酸化LTX、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化RTX、六谷氨酸化吡曲克辛、六谷氨酸化普拉曲沙、六谷氨酸化AG2034、六谷氨酸化GW1843、六谷氨酸化氨基蝶呤和六谷氨酸化LY309887。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化PMX。在具体实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化MTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化RTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的聚谷氨酸化抗叶酸剂包含六谷氨酸化LTX。在一些实施方案中，施用的递送载体是脂质体。在其它实施方案中，脂质体是聚乙二醇化的。如本文所公开的，与正常细胞(即，与癌细胞不同的不会主动摄取脂质体和/或不表达叶酸受体的细胞)相比，含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的靶向叶酸受体的聚乙二醇化脂质体能够向癌细胞，特别是表达叶酸受体的癌细胞递送大量聚谷氨酸化抗叶酸剂。可以根据所公开的方法治疗任何表达叶酸受体的癌症。应该注意的是，一些癌症可能在早期表达叶酸受体，而大多数癌症可能在晚期表达叶酸受体。
可以通过本发明方法治疗的癌症包括癌瘤、肉瘤和黑素瘤。癌瘤包括但不限于基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、CNS癌、结肠直肠癌、肾或肾细胞癌、喉癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC，包括腺癌、巨大(或燕麦)细胞癌和鳞状细胞癌)、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌(包括基底细胞癌和鳞状细胞癌)、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、直肠癌、呼吸系统癌症和泌尿系统癌症。
肉瘤是在骨(骨肉瘤)和软组织(纤维肉瘤)中出现的间充质肿瘤。肉瘤包括但不限于脂肪肉瘤(包括粘液样脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性外周神经鞘瘤(也称为恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤或神经性肉瘤)、尤因氏肿瘤(包括尤因氏骨肉瘤、骨外(即非骨)尤因氏肉瘤和原始神经外胚层肿瘤)、滑膜肉瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、卡波西肉瘤、血管内皮瘤、硬纤维瘤(也称为侵袭性纤维瘤病)、皮肤纤维肉瘤(DFSP)、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、血管外皮细胞瘤、恶性间质瘤、肺泡软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤、增生性小细胞肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)和软骨肉瘤。
黑素瘤是由皮肤和其它器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。黑素瘤的实例包括但不限于恶性雀斑样痣黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤和肢端黑色素瘤。
在一些实施方案中，通过本文公开的一种或多种方法治疗的癌症是实体瘤淋巴瘤。实体瘤淋巴瘤的实例包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，通过本文公开的一种或多种方法治疗的癌症是骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、上皮内肿瘤、黑素瘤神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤或横纹肌肉瘤。
所公开的方法可以在任何可能受益于本文考虑的组合物(例如，聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，例如含有五谷氨酸化或六谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体)递送的受试者中实施。哺乳动物受试者，特别是人受试者是优选的。在一些实施方案中，受试者还包括动物，例如家养宠物(例如，狗、猫、兔和雪貂)、牲畜或农场动物(例如，牛、猪、羊、鸡和其它家禽)、马(例如纯种马)、实验室动物(例如小鼠、大鼠和兔子)和其它哺乳动物。在其它实施方案中，受试者包括鱼和其它水生物种。
向其递送药剂的受试者可以是正常受试者。或者，受试者可能患有或有风险患上可被诊断的病状或可从所提供的一种或多种组合物的递送中受益的病状。在一些实施方案中，此类病状包括癌症(例如，实体瘤癌症或非实体癌症，例如白血病)。在一些实施方案中，这些病状(例如，癌症)涉及表达抗原的细胞，所述抗原可以被本文公开的靶向聚乙二醇化脂质体聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂特异性结合。在其它实施方案中，这些抗原特异性结合并内化靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂进入细胞。在一些实施方案中，靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂特异性结合在癌细胞表面表达的叶酸受体(例如，叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ))。
用于诊断可用所提供的组合物治疗的病状的测试是本领域已知的并且对于医疗从业者来说是熟悉的。可以使用市售抗体确定细胞类型是否表达叶酸受体。这些实验室测试包括但不限于显微镜分析、培养依赖性测试(例如培养)和核酸检测测试。这些包括湿支架、染色增强显微镜、免疫显微镜(例如，FISH)、杂交显微术、颗粒凝集、酶联免疫吸附测定、尿液筛选测试、DNA探针杂交和血清学测试。除了进行上述实验室测试外，医疗从业者通常还会记录完整的病史并进行全面的体检。
患有癌症的受试者可以是例如具有可检测的癌细胞的受试者。有患癌症风险的受试者可以是例如具有高于正常患癌症概率的受试者。这些受试者包括例如具有遗传异常的受试者，该遗传异常被证明与患癌症的可能性较高相关，有家族性癌症倾向的受试者，暴露于致癌剂(即致癌物如烟草、石棉或其它化学毒素)的受试者，以及之前接受癌症治疗和明显缓解的受试者。
在一些实施方案中，本公开提供了选择性地将靶向叶酸受体的聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂以较高速率(例如，比在其细胞表面上不表达叶酸受体的细胞高至少两倍、至少三倍、至少四倍或至少五倍)递送至其表面上表达叶酸受体的肿瘤细胞的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了制备本文公开的脂质体组合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括形成混合物，所述混合物包含：(1)脂质体组分；和(2)在水溶液中的聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂。在其它实施方案中，混合物包含聚乙二醇化脂质体组分。然后将混合物均质化以在水溶液中形成脂质体。此外，可以将混合物通过膜挤出以形成在水溶液中包封聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体。应理解，本发明的脂质体组分可包含任何脂质(包括胆固醇)，包括官能化脂质和与靶向部分、可检测标记物和空间稳定剂连接的脂质，或所有这些的任何子集。进一步注意到，水溶液中的生物活性聚谷氨酸化抗叶酸剂可包含本文所讨论的或本领域已知的脂质体内部或外部的任何试剂和化学品，包括例如缓冲剂、盐和冷冻保护剂。
在一些实施方案中，本公开提供了制备本文公开的靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(靶向PLPA)或非靶向PLPA的方法。在一个实施方案中，该方法包括形成混合物，所述混合物包含：(1)脂质体组分；(2)在水溶液中的聚谷氨酸化(例如，五谷氨酸化或六谷氨酸化)抗叶酸剂；和(3)靶向部分。然后将混合物均质化以在水溶液中形成脂质体。此外，可以将混合物通过膜挤出以形成在水溶液中包封靶向聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体。应理解，靶向聚乙二醇化脂质体组分可包含任何脂质(包括胆固醇)，包括官能化脂质和与靶向部分、可检测标记物和空间稳定剂连接的脂质，或所有这些的任何子集。还应注意，靶向聚乙二醇化脂质体可包含本文所讨论的或本领域已知的脂质体内部或外部的任何试剂和化学品，包括例如缓冲剂、盐和冷冻保护剂。
上述方法任选地还包括在除去步骤后冻干组合物以形成冻干组合物的步骤。如上所述，水溶液中的靶向PTPLA或非靶向PTPLA可包含本文所述的或本领域已知的冷冻保护剂。如果要冻干组合物，则优选冷冻保护剂。
另外，在冻干步骤之后，该方法任选地还包括在冻干步骤后通过将组合物溶解在溶剂中来重构冻干组合物的步骤。重构方法是本领域已知的。一种示例性溶剂是水。其它溶剂包括盐水溶液和缓冲溶液。
虽然本文讨论了某些示例性实施方案，但应理解脂质体可通过本领域已知的任何方法制备。参见例如G.Gregoriadis(编辑),Liposome Technology,第1-3卷,第1版,1983；第2版,1993,CRC Press,45Boca Raton,Fla。适用于制备脂质体组合物的方法的实例包括挤出、反相蒸发、超声处理、溶剂(例如乙醇)注射、微流化、洗涤剂透析、醚注入和脱水合/再水合。脂质体的大小通常可以通过控制用于低压挤出的膜的孔径或微流化中使用的压力和通过次数或本领域已知的任何其它合适方法来控制。
通常，聚谷氨酸化抗叶酸剂包含在脂质体的内部，即内部空间中。在一个实施方案中，取代的铵部分或基本上完全从脂质体周围的外部介质中除去。这种除去可以通过本领域已知的任何合适的方式完成(例如，稀释、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、透析、超滤和沉淀)。因此，制备上述脂质体组合物或本领域已知的脂质体组合物的方法可任选地进一步包括在挤出步骤后在脂质体外的水溶液中除去聚谷氨酸化抗叶酸剂的步骤。
在其它实施方案中，本公开提供了选择性靶向叶酸受体的靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(PLPA)，其包含：包含内部空间的脂质体，设置在内部空间内的聚谷氨酸化抗叶酸剂，连接于脂质体外部的空间稳定剂分子，和包含对至少一种叶酸受体具有特异性亲和力的蛋白质的靶向部分，所述靶向部分连接于空间稳定剂和脂质体外部中的至少一种。该实施方案的组分可以与本公开的其它实施方案所描述的相同。例如，靶向聚乙二醇化脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂和可以是PEG的空间稳定剂如本公开的其它部分中所述。
在一些实施方案中，本公开提供了制备非靶向组合物的方法，所述组合物包含脂质体，所述脂质体包含包埋的和/或包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂，所述方法包括：形成包含脂质体组分、溶液中的聚谷氨酸化抗叶酸剂的混合物；使混合物均匀化以在溶液中形成脂质体；处理混合物以形成包埋和/或包封聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体。在一些实施方案中，所述处理包括以下中的一种或多种：薄膜水合、挤出、在线混合和搅拌，并且一旦形成颗粒，颗粒的尺寸可通过挤出和超声中的一种或多种进一步修改。在一些实施方案中，非靶向组合物包含至少10％脂质体包埋的聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，脂质体是阴离子性或中性的。在一些实施方案中，脂质体是阳离子性的。
在一些实施方案中，本公开提供了制备靶向组合物的方法，所述靶向组合物包含聚乙二醇化脂质体，所述聚乙二醇化脂质体包含包埋和/或包封的聚谷氨酸化抗叶酸剂；靶向部分氨基酸链，所述氨基酸链包含多个氨基酸，所述靶向部分对至少一种类型的叶酸受体具有特异性亲和力，所述特异性亲和力定义为对于至少一种类型的叶酸受体包括范围为0.5x10-10至10x10-6摩尔[0.05纳摩尔至10微摩尔]的平衡解离常数(Kd)，47所述靶向部分连接至PEG和脂质体外部中的一个或两个，所述方法包括：形成包含脂质体组分、溶液中的聚谷氨酸化抗叶酸剂的混合物；使混合物均匀化以在溶液中形成脂质体；处理混合物以形成包埋和/或包封聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体；和在包埋和/或包封聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体表面上提供靶向部分，所述靶向部分对叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ)中的至少一种具有特异性亲和力。在一些实施方案中，处理包括以下中的一种或多种：薄膜水合、挤出、在线混合和搅拌，并且一旦形成颗粒，颗粒的尺寸可通过挤出和超声中的一种或多种进一步修改。在一些实施方案中，靶向组合物包含至少10％脂质体包埋的聚谷氨酸化抗叶酸剂。在一些实施方案中，脂质体是阴离子性或中性的。在一些实施方案中，靶向部分对以下一种或多种具有特异性亲和力：叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ)。在其它实施方案中，靶向部分对叶酸受体α(FR-α)和叶酸受体β(FR-β)具有特异性亲和力。在另外的实施方案中，靶向部分对肿瘤细胞表面抗原上的表位具有特异性亲和力，所述表位存在于肿瘤细胞上但在非肿瘤细胞上不存在或不可接近。
实施例
以下实施例旨在说明而非以明暗或暗示的任何方式、状态或形式限制本公开。虽然它们是可能使用的那些中的典型，但是可替代地使用本领域技术人员已知的其它程序、方法或技术。示例性组合物包含示例性脂质体。实施例组合物和实施例脂质体均用于实施例部分中描述的实验中，并且贯穿本公开是本公开的具体实例，并不意味着限定本公开的全部范围。
图5显示了L-γ五谷氨酸化培美曲塞的化学式。一旦进入细胞内，培美曲塞通过酶叶酰聚谷氨酸合成酶转化为聚谷氨酸化形式。所示的化学式为五谷氨酸化形式，其中每个谷氨酸为L-型。此外，每个键是通过谷氨酸的γ羧基。
图6显示了本公开所涵盖的示例性L-γ聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物的化学式。谷氨酸呈L-形式，它们通过谷氨酸的γ羧基连接。
方法
六谷氨酸化培美曲塞(HGP)脂质体的生产
简言之，通过以下程序将γHGP(gG6)包封在脂质体中。首先，称出脂质体膜的脂质组分，并在约65℃的温度下作为浓缩的乙醇溶液混合。在该实施例中，使用的脂质是氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇和DSPE-PEG-2000(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])。HSPC:胆固醇:PEG-DSPE的摩尔比约为3:2:0.15。接下来，将gG6以20mg/ml的浓度溶解在含水缓冲液中，pH为6.5-6.9。将药物溶液加热至65℃。使用小孔针将乙醇脂质溶液注入gG6溶液中。在该步骤期间，使用磁力搅拌器充分搅拌药物溶液。在升高的温度(63℃-72℃)下进行混合以确保脂质处于液晶状态(与在低于脂质转变温度Tm＝51℃-54℃的温度下达到的凝胶状态相反)。结果，脂质水合并在水性核心中形成含有gG6的多个双层(多层)囊泡(MLV)。
使用过滤器挤出缩小MLV的大小
通过使用两次通过堆叠(径迹蚀刻的聚碳酸酯)膜的高压挤出将MLV片段化成所需尺寸的单层(单双层)囊泡。堆叠的膜具有孔径为200nm的两层和孔径为100nm的六层。在挤出过程中，温度保持在Tm以上，以确保脂质膜的可塑性。由于挤出，大且大小和层状不均匀的MLV变成小的、均匀的(100-120nm)单层囊泡(ULV)，其将药物隔离在其内部。使用具有背散射检测器(90°)的Malvern Zetasizer Nano ZS仪器(Southborough,MA)在石英微比色杯中测量25℃下的流体动力学尺寸(直径)。在分析之前将样品在制剂基质中稀释50倍。
脂质体的纯化
在产生含有gG6的ULV后，使用用于小体积的柱或用于大体积的相对于合适缓冲液切向流渗滤除去脂质体外gG6。尽管可以使用任何缓冲溶液，但在该实施例中使用的缓冲液是5mM HEPES，145mM氯化钠，pH 6.7。完成纯化后，使用0.22微米过滤器进行过滤灭菌。
抗体缀合
通过将DSPE-PEG-马来酰亚胺添加到脂质组合物中来制备活化的脂质体。脂质体含有四种不同的脂质：氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-2000)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-马来酰亚胺)，比例为3:2:0.1125:0.0375。
通过使用Traut试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷)将巯基连接到伯胺上来完成抗体硫醇化。将抗体以0.9-1.6mg/ml的浓度悬浮于PBS中。将Traut试剂(14mM)加入到终浓度为1-5mM的抗体溶液中，然后在室温下培育1小时后通过透析除去。将硫醇化抗体以60g/mol磷脂的比例加入到活化的脂质体中，并将反应混合物在室温下培育1小时并使用4uL-半胱氨酸过夜以终止反应，并通过透析除去未缀合的抗体。
纳米粒子的物理特征
HGP(五谷氨酸化培美曲塞)和脂质体的剂量反应研究。
在第3天(48小时)和第4天(72小时)通过CellTiter-(CTG)发光细胞活力测定法测定细胞活力。该测定法基于定量存在于其中的ATP来确定培养物中活细胞的数量，其反过来表示代谢活性细胞的存在。CTG测定法使用荧光素酶作为读数。为了评估细胞活力，使用CellTiter-发光细胞活力测定法研究培美曲塞、HGP和脂质体对不同癌细胞生长的剂量反应抑制。收集人癌细胞，计数并在第0天以相同的细胞密度接种。在第1天将每种测试物的一系列8个稀释液加入细胞中。使用GraphPad Prism产生并拟合剂量反应曲线，计算每种测试物的IC50。IC50越低，测试物在癌细胞生长抑制方面越有效。
在第0天，将细胞以每孔5x 104个细胞的细胞密度接种到96孔板中的100μl新鲜培养基中。产生培养基中每种测试物的8个连续2倍稀释液并在第1天一式三份加入细胞中。另外，仅用载体(用于游离药物的HBS或用于脂质体HGP的空脂质体)作为对照处理三个孔的细胞。
在第3天和第4天，向每个孔中加入100μl试剂，并在室温下培育15分钟。记录每个孔的荧光素酶发光。另外，将载体(HBS或空脂质体)在培养基中的8份连续2倍稀释液加入空孔中并包括在测定法中以产生背景发光信号。通过分别从读数中减去背景发光信号来标准化荧光素酶信号。
人正常原代骨髓CD34+细胞获自ATCC.(ATCC目录号PCS-800-012)。将细胞在37℃下解冻1分钟，然后置于冰上。然后将细胞重悬于StemSpan SFEM(干细胞技术目录号9650)加10％热灭活的胎牛血清(Corning 35-015-CV)中。将细胞以2.5x104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中。第二天，通过离心收集活细胞并重悬于嗜中性粒细胞生长培养基(StemSpan SFEM加10％热灭活的胎牛血清加100ng/ml人干细胞因子(Sigma目录号H8416)、20ng/ml人粒细胞集落刺激因子(Sigma目录号H5541)和10ng/ml人重组IL3(SigmaSRP3090)，密度为2.5x104个细胞/孔。细胞在37℃培育10天。每两天加入新鲜培养基。然后收集成熟的嗜中性粒细胞并以1x104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并在37℃下培育过夜。第二天，将测试物或媒剂重悬于嗜中性粒细胞生长培养基中并加入板中。然后将细胞在37℃下培育48小时或72小时，然后使用Cell Titer Glo Assay(Promega目录号G7572)在每个时间点测定。
用于细胞系AML12(非癌肝细胞)和CCD841(非癌性结肠上皮细胞)的方法类似于用于癌细胞的方法。
结果
游离培美曲塞γ-六谷氨酸(gG6)\(非靶向)脂质体γ-六谷氨酸(脂质体gG6)、培美曲塞和叶酸受体α靶向抗体(FR1Ab)脂质体培美曲塞γ-六谷氨酸(脂质体gG6-FR1Ab)在NCI H2342非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌亚型中的剂量反应关系如图7所示。输出是通过荧光素酶发光测量的细胞活力。如此图7所示，通过IC50测量，游离培美曲塞gG6似乎是最不有效的。脂质体培美曲塞gG6和脂质体培美曲塞gG6-FR1Ab分别比游离培美曲塞的效力高7倍和40倍。图8和9显示了类似的数据，描述为48小时处理后活细胞的百分比。
关于HT-29结肠癌细胞系的类似数据显示于图10和11中，其描绘以百分比表示的细胞活力。如这些图所示，游离培美曲塞gG6似乎是效力最低的。在这种情况下，脂质体培美曲塞gG6的效力是培美曲塞的两倍，并且脂质体培美曲塞gG6-FR1Ab比游离培美曲塞的效力高5倍。
另外的细胞系，即OAW28卵巢癌细胞和SW260结肠癌细胞，也用培美曲塞γG5(也称为gG6)制剂处理。如图12所示，并且与上述数据一致，游离培美曲塞gG6效果最差，并且脂质体培美曲塞gG6似乎比培美曲塞更有效。
图13显示，与非靶向脂质体培美曲塞gG6和游离培美曲塞gG6相比，脂质体培美曲塞gG6-FR1Ab导致癌细胞的数值更高的抑制。
在另一组剂量反应实验中，研究了代表不同类型癌症的6种细胞系，即HT-29(结肠癌)、H2342(NSCLC，腺癌亚型)、H292(NSCLC，腺癌亚型)、SW620(CRC)、H1806(三阴性乳腺癌)和OAW28(卵巢癌)(图14)。处理由使用脂质体培美曲塞六谷氨酸(脂质体gG6)暴露48小时组成。
在暴露后48小时内，所有上述衍生物与培美曲塞相比的相对效力示于图14中。对每种细胞系使用各种衍生物处理的相对效力，如该图所示，通过将培美曲塞的IC50除以脂质体培美曲塞六谷氨酸的IC50来计算。如该图所示，在所有细胞系中，脂质体培美曲塞六谷氨酸的效力远远超过培美曲塞的效力。举例来说，考虑NSCLC细胞系H292。如该图所示，脂质体培美曲塞六谷氨酸的效力为培美曲塞的25倍至≥50倍。这表明4％或更低剂量的脂质体培美曲塞六谷氨酸将具有与100％剂量的培美曲塞相同的治疗效果。
比较脂质体培美曲塞六谷氨酸(脂质体gG6/Lps hexa gG6)和培美曲塞对乳腺癌、肺癌和卵巢癌中代表性细胞系的细胞毒活性的癌细胞活力研究显示在图15-17中。这些数据表明，脂质体培美曲塞六谷氨酸比培美曲塞更有效。此外，作为功效的指标，在图18-20中描绘了在范围介于16至128nM的不同剂量水平下对相同细胞系的实验结果。如这些图所示，在这些剂量范围的每一个中，就肺癌和乳腺癌细胞系(分别为图18和19)而言，脂质体培美曲塞六谷氨酸在抑制癌细胞方面优于培美曲塞。在卵巢癌细胞系中，剂量为128nM的培美曲塞似乎与脂质体培美曲塞六谷氨酸同样有效(参见图20，而剂量为32nM和64nM的脂质体培美曲塞六谷氨酸具有比培美曲西更好的治疗效果；在16nM时，脂质体培美曲塞六谷氨酸和培美曲塞的治疗效果较低且量级相似。
在培美曲塞治疗的患者中观察到的主要毒性是骨髓抑制，其表现为血细胞计数的减少，包括嗜中性粒细胞计数(一种白细胞)。对口腔和肠道的内膜也有一些不利影响，表现为腹泻和粘膜炎，以及在某些情况下对肝脏具有不利影响。为了评估上述毒性，在48小时在分化为嗜中性粒细胞、CCD841结肠上皮细胞和AML12肝细胞的CD34+细胞上测量治疗剂脂质体培美曲塞六谷氨酸和培美曲塞。如图21所示，与培美曲塞相比，脂质体培美曲塞六谷氨酸对分化的人嗜中性粒细胞的毒性显著降低。与培美曲塞相比，在16nM至128nM的剂量范围内用衍生物处理后更好地保留的嗜中性粒细胞计数也支持这一点(图21)。引人注目的是，在研究的剂量水平下用脂质体培美曲塞六谷氨酸处理后，对肝细胞似乎没有任何毒性(图22)。相反，所研究的所有剂量的培美曲塞导致肝细胞计数减少约40％。最后，在处理上皮结肠细胞后观察到相同的趋势(图23)。如该图所示，所研究的所有剂量的培美曲塞导致细胞数量减少约≥50％，相较于用脂质体培美曲塞六谷氨酸处理后减少约20％或更少。
在本公开的非限制性示例性实施方案中，提供了包含聚谷氨酸化抗叶酸剂的组合物。
在前一段的组合物中，组合物可包含五谷氨酸化或六谷氨酸化抗叶酸剂。
在前两段中任一段的组合物中，聚谷氨酸化抗叶酸剂可以是选自由以下组成的组的一种或多种成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酰胺化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。
在前三段中任一段的组合物中，组合物可包含聚谷氨酸化抗叶酸剂，其可为聚谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。
在前四段中任一段的组合物中，组合物可包含聚谷氨酸化抗叶酸剂，其可包括五谷氨酸化或六谷氨酸化抗叶酸剂。
在前五段中任一段的组合物中，组合物可包含聚谷氨酸化抗叶酸剂，其可包括五谷氨酸化或六谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。
非限制性示例脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂(LPA)组合物可包含前六段中任一段的组合物，并且脂质体可任选地聚乙二醇化(PLPA)。
在前一段的LPA或PLPA组合物中，聚谷氨酸化抗叶酸剂可包括五谷氨酸化或六谷氨酸化抗叶酸剂。
在前两段中任一段的LPA或PLPA组合物中，聚谷氨酸化抗叶酸剂可以是选自由以下组成的组的一种或多种成员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酰胺化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。
在前三段中任一段的LPA或PLPA组合物中，聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。
在前四段中任一段的LPA或PLPA组合物中，聚谷氨酸化抗叶酸剂可包括五谷氨酸化或六谷氨酸化抗叶酸剂。
在前五段中任一段的LPA或PLPA组合物中，聚谷氨酸化抗叶酸剂可包括五谷氨酸化或六谷氨酸化PMX、MTX、RTX和/或LTX。
在前六段中任一段的LPA或PLPA组合物中，脂质体可以是阴离子性或中性的。
在前七段中任一段的LPA或PLPA组合物中，靶向部分可以连接至PEG和脂质体外部中的一个或两个，并且靶向部分可以对目标靶细胞上的表面抗原具有特异性亲和力。
在前八段中任一段的LPA或PLPA组合物中，靶向部分可以连接至PEG和脂质体外部中的一个或两个，并且可以是多肽。
在前九段中任一段的LPA或PLPA组合物中，靶向部分可以连接至PEG和脂质体外部中的一个或两个，并且可以是抗体或抗体片段。
在前十段中任一段的LPA或PLPA组合物中，免疫刺激剂、可检测标记物和马来酰亚胺中的一种或多种可以置于PEG和脂质体外部中的至少一个上。
在前十一段中任一段的LPA或PLPA组合物中，多肽可以结合抗原，其平衡解离常数(Kd)在0.5x10-10至10x10-6的范围内，如使用BIACORE分析所测定的。
在前十二段中任一段的LPA或PLPA组合物中，多肽可特异性结合一种或多种叶酸受体，所述叶酸受体是选自由以下组成的组：叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ)。
杀死过度增殖细胞的非限制性示例方法可包括使过度增殖细胞与段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物接触。
在前一段的方法中，过度增殖细胞可以是癌细胞。
用于治疗癌症的非限制性示例方法可包括向患有癌症或有患癌风险的受试者施用有效量的段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
在前一段的方法中，癌症可以是选自由以下组成的组的一种或多种：肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和恶性血液病。
对于正在进行或已经进行癌症疗法的受试者的非限制性示例维持疗法可以包括向正在进行或已经进行癌症疗法的受试者施用有效量的段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
非限制性示例药物组合物可包括段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
用于治疗免疫系统病症的非限制性示例方法可包括向患有免疫系统病症或有患免疫系统病症风险的受试者施用有效量的段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
用于治疗感染的非限制性示例方法可包括向患有感染性疾病或有感染性疾病风险的受试者施用有效量的段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
将聚谷氨酸化抗叶酸剂递送至表面上表达叶酸受体的肿瘤的非限制性示例方法可包括向患有肿瘤的受试者施用一定量的段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物，以将治疗有效剂量的聚谷氨酸化抗叶酸剂递送至肿瘤。
制备脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物的非限制性示例方法包括形成包含脂质体组分、溶液中的聚谷氨酸化抗叶酸剂的混合物；使混合物均匀化以在溶液中形成脂质体；处理混合物以形成含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体的混合物，所述组合物可包括段落中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
非限制性示例药物组合物可包括段落[0254]-[0272]中任一段的聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
尽管已经参考各种一些实施例描述了本公开，但是应该理解，在不脱离本公开的精神的情况下可以进行各种修改。因此，应当参考所附权利要求以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围来确定本公开的范围。所有引用的文章和参考文献的公开内容，包括专利申请和出版物，出于所有目的通过引用并入本文。
用于制备这些化学实体的各种新化学实体、方法和设备在下面的所附权利要求中阐述。

Claims (75)

1.一种组合物，其包含聚谷氨酸化抗叶酸剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂包含通过其γ羧基连接的L-谷氨酸。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中组合物包含五谷氨酸化或六谷氨酸化的抗叶酸剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组中的一员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化或六谷氨酸化的抗叶酸剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化或六谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。
8.一种脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物(LPA)，其包含如前述权利要求中任一项所述的聚谷氨酸化抗叶酸剂，其中所述脂质体任选地被聚乙二醇化(PLPA)。
9.根据权利要求8所述的LPA组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化或六谷氨酸化的抗叶酸剂。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的LPA组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂是选自由以下组成的组中的一员：聚谷氨酸化甲氨蝶呤(MTX)、聚谷氨酸化培美曲塞(PMX)、聚谷氨酸化洛美曲索(LTX)、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化雷替曲塞(RTX)、聚谷氨酸化吡曲克辛、聚谷氨酸化普拉曲沙、聚谷氨酸化AG2034、聚谷氨酸化GW1843、聚谷氨酸化氨基蝶呤和聚谷氨酸化LY309887。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的LPA组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂是聚谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的LPA组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化或六谷氨酸化的抗叶酸剂。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的LPA组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂包含五谷氨酸化或六谷氨酸化的PMX、MTX、RTX或LTX。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的LPA组合物，其中所述脂质体包含至少10％脂质体包埋的聚谷氨酸化细胞毒性药物。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的LPA组合物，其中所述PEG化脂质体的直径在20nm至200nm的范围内。
16.根据权利要求8-15中任一项所述的LPA组合物，其中所述PEG化脂质体的直径在80nm至120nm的范围内。
17.根据权利要求8-16中任一项所述的LPA组合物，其中所述脂质体是由脂质体组分形成。
18.根据权利要求17所述的LPA组合物，其中所述脂质体组分包含阴离子脂质和中性脂质中的至少一种。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的LPA组合物，其中所述脂质体组分是选自由以下组成的组中的至少一种：DSPE；DSPE-PEG-马来酰亚胺；HSPC；HSPC-PEG；胆固醇；胆固醇-PEG；和胆固醇-马来酰亚胺。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的LPA组合物，其中脂质体组分包含选自由以下组成的组中的至少一种：DSPE；DSPE-PEG-FITC；DSPE-PEG-马来酰亚胺；胆固醇；和HSPC。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的LPA组合物，其中一种或多种脂质体组分还包含空间稳定剂。
22.根据权利要求21所述的LPA组合物，其中所述空间稳定剂是选自由以下组成的组中的至少一种：聚乙二醇(PEG)；聚L-赖氨酸(PLL)；单唾液酸神经节苷脂(GM1)；聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)；聚(丙烯酰胺)(PAA)；聚(2-甲基-2-噁唑啉)；聚(2-乙基-2-噁唑啉)；磷脂酰聚甘油；聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]；两亲性聚-N-乙烯基吡咯烷酮；L-氨基酸基聚合物；和聚乙烯醇。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的LPA组合物，其中所述PEG的数均分子量(Mn)是200至5000道尔顿。
24.根据权利要求8所述的LPA组合物，其中所述脂质体是阴离子性或中性的。
25.根据权利要求8所述的LPA组合物，其中所述脂质体具有小于或等于零的ζ电位。
26.根据权利要求8所述的LPA组合物，其中所述脂质体具有0至-150mV的ζ电位。
27.根据权利要求8所述的LPA组合物，其中所述脂质体具有-30至-50mV的ζ电位。
28.根据权利要求8所述的LPA组合物，其中所述脂质体是阳离子性的。
29.根据权利要求8所述的LPA组合物，其中所述脂质体具有内部空间，并且所述内部空间包含所述聚谷氨酸化抗叶酸剂和药学上可接受的水性载体。
30.根据权利要求29所述的LPA组合物，其中所述药学上可接受的水性载体是海藻糖。
31.根据权利要求29-30中任一项所述的LPA组合物，其中所述药学上可接受的载体包含5重量％至20重量％的海藻糖。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的LPA组合物，其中所述药学上可接受的载体包含浓度在5至200mM之间并且pH在2.8至6之间的柠檬酸盐缓冲液。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的LPA组合物，其中所述药学上可接受的载体包含在50mM至500mM之间的乙酸钠和乙酸钙总浓度。
34.根据权利要求8-33中任一项所述的LPA组合物，其中每一个PEG化脂质体包含少于200,000分子的所述聚谷氨酸化抗叶酸剂。
35.根据权利要求8-34中任一项所述的LPA组合物，其中每一个PEG化脂质体包含10,000至100,000分子的所述聚谷氨酸化抗叶酸剂。
36.根据权利要求8-35中任一项所述的LPA组合物，其中所述聚谷氨酸化抗叶酸剂的pH是5-8。
37.根据权利要求8-36中任一项所述的LPA组合物，其还包含与PEG和所述脂质体的外部中的一个或两个连接的靶向部分，并且其中所述靶向部分对目标靶细胞上的表面抗原具有特异性亲和力。
38.根据权利要求37所述的LPA组合物，其中所述靶向部分通过共价键与所述PEG和所述脂质体的外部中的一个或两个连接。
39.根据权利要求37-38中任一项所述的LPA组合物，其中所述靶向部分是多肽。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的LPA组合物，其中所述靶向部分是抗体或抗体片段。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的LPA组合物，其还包含安置在所述PEG和所述脂质体的外部中的至少一个上的免疫刺激剂、可检测标记物和马来酰亚胺中的一种或多种。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的LPA组合物，其中如使用BIACORE分析所测定，所述靶向部分以在0.5x10-10至10x10-6的范围内的平衡解离常数(Kd)结合所述抗原。
43.根据权利要求37-42中所述的LPA组合物，其中所述靶向部分特异性地结合选自由以下组成的组中的一种或多种叶酸受体：叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ)。叶酸受体。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的LPA组合物，其中所述靶向部分包含选自由以下组成的组中的一种或多种：抗体、人源化抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、单结构域抗体、双特异性抗体、合成抗体、聚乙二醇化抗体和多聚体抗体。
45.根据权利要求37-44中任一项所述的LPA组合物，其中每一个PEG化脂质体包含30至200个靶向部分。
46.根据权利要求37-45中任一项所述的LPA组合物，其还包含免疫刺激剂、可检测标记物和马来酰亚胺中的一种或多种，其中所述免疫刺激剂、所述可检测标记物或所述马来酰亚胺与所述PEG或所述脂质体的外部连接。
47.根据权利要求37-46中任一项所述的LPA组合物，其中免疫刺激剂是选自由以下组成的组中的至少一种：蛋白质免疫刺激剂；核酸免疫刺激剂；化学免疫刺激剂；半抗原；和佐剂。
48.根据权利要求47所述的LPA组合物，其中所述免疫刺激剂是选自由以下组成的组中的至少一种：荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；DNP；β葡聚糖；β-1,3-葡聚糖；和β-1,6-葡聚糖。
49.根据权利要求47-48中任一项所述的LPA组合物，其中所述免疫刺激剂和所述可检测标记物是相同的。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的LPA组合物，其还包含半抗原。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的LPA组合物，其中所述半抗原包含荧光素或β1,6-葡聚糖中的一种或多种。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的LPA组合物，其还包含至少一种选自由以下组成的组的冷冻保护剂：甘露醇；海藻糖；山梨糖醇；和蔗糖。
53.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其呈单位剂型形式。
54.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗疾病。
55.如前述权利要求中任一项所述的化合物或组合物的用途，其用于制造供治疗疾病用的药物。
56.一种至少治疗或预防需要这种治疗或预防的受试者的疾病的方法，所述方法包括施用如前述权利要求中任一项所述的化合物或组合物。
57.一种杀死过度增殖的细胞的方法，其包括使过度增殖的细胞与如权利要求1-56所述的脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物接触。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述过度增殖的细胞是癌细胞。
59.一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌风险的受试者施用有效量的如权利要求1-55中任一项所述的脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组：肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和血液恶性病。
61.一种治疗癌症的方法，其包括向患有癌症或有患癌风险的受试者施用有效量的如权利要求1-55中任一项所述的组合物。
62.根据权利要求61所述的治疗癌症的方法，其中所述癌症是选自由以下组成的组：肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌、胃癌、胃肠癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、肾癌、胆管癌、胆囊癌和血液恶性病。
63.一种治疗癌症的方法，其包括向具有癌细胞或有具有癌细胞风险的受试者施用有效量的如权利要求1-55中任一项所述的组合物，所述癌细胞在其表面上表达由所述靶向部分结合的叶酸受体。
64.一种用于正在进行或已经进行了癌症疗法的受试者的维持疗法，其包括向正在进行或已经进行了癌症疗法的受试者施用有效量的如权利要求1-55中任一项所述的组合物。
65.一种药物组合物，其包含如权利要求1-55中任一项所述的脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物。
66.一种治疗免疫系统病症的方法，其包括向患有免疫系统病症或有患免疫系统病症风险的受试者施用有效量的如权利要求1-55中任一项所述的组合物。
67.一种治疗感染性疾病的方法，其包括向患有感染性疾病或有患感染性疾病风险的受试者施用有效量的如权利要求1-55中任一项所述的组合物。
68.一种将聚谷氨酸化抗叶酸剂递送至在表面上表达叶酸受体的肿瘤的方法，所述方法包括：向患有所述肿瘤的受试者施用一定量的如权利要求1-55中任一项所述的组合物，以便将治疗有效剂量的所述聚谷氨酸化抗叶酸剂递送至所述肿瘤。
69.一种制备脂质体聚谷氨酸化抗叶酸剂组合物的方法，所述组合物包含如权利要求1-55中任一项所述的组合物，所述方法包括：在溶液中形成包含脂质体组分和聚谷氨酸化抗叶酸剂的混合物；使所述混合物均匀化以在所述溶液中形成脂质体；以及处理所述混合物以形成含有聚谷氨酸化抗叶酸剂的脂质体。
70.一种药物组合物，其包含如权利要求1-55中任一项所述的组合物。
71.一种制备如权利要求1-55中任一项所述的组合物的方法，其包括以下步骤：在溶液中形成包含脂质体组分和聚谷氨酸化细胞毒性药物的混合物；使所述混合物均匀化以在所述溶液中形成脂质体；处理所述混合物以形成包埋和/或囊封聚谷氨酸化细胞毒性药物的脂质体；以及在所述脂质体的表面上提供所述靶向部分，所述靶向部分对叶酸受体α(FR-α)、叶酸受体β(FR-β)和叶酸受体δ(FR-δ)中的至少一种具有特异性亲和力。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述处理步骤包括以下步骤中的一个或多个：薄膜水合、挤出、在线混合和搅拌。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述处理步骤包括通过一个或多个挤出和/或超声处理步骤来改变所述脂质体的大小的一个或多个步骤。
74.一种靶向组合物，其包含如权利要求8所述的LPA组合物。
75.一种非靶向组合物，其包含如权利要求8所述的LPA组合物。
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