CN109563132A - 皮肤再生或伤口治疗用的肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明是关于皮肤再生或伤口治疗用的肽及其用途。在本发明中的新型肽不仅促进成纤维细胞的胶原蛋白生成并促进伤口愈合，黑抑制素瘤细胞的黑色素生成及酪氨酸酶活性，出现了优秀的美白效果。由于其组成是非常小的肽，因此可将因外部物质入侵引起的副作用降至最低，从而期待可以用作代替现有的皮肤再生或伤口治疗用制剂的有效物质。

Description

皮肤再生或伤口治疗用的肽及其用途

技术领域

本发明用于皮肤再生或治疗伤口用的肽及其用途。

本发明是在韩国凡部处的支持下，根据课题1711030975完成的，上述课题的研究管理专业机构是韩国研究财团，研究项目名称是创意材料探索事业，研究课题名称：功能性免疫技术的生物降解性皮肤再生材料的开发，研究期间为2015年12月4日至2016年4月30日。。

本公开专利是根据2016年03月23日提交于韩国专利厅的韩国空开专利10-2016-0034327首先提出的，上述公开专利中的公开项将作为本发明书中的参考项。

背景技术

皮肤作为人体的第一道保护膜，它防止外部环境的刺激(如紫外线，污染物质等)带来的身体的器官温度，湿度变化，它在体温调节等维持体内平衡方面发挥重要作用。作为皮肤最外面部分的角质层，它是由皮肤细胞变化形成的组织，完全由死细胞构成。真皮层的皮肤结缔组织里稀疏形成的细胞层向表皮层靠拢，细胞活力丧失，变成牢固而规则的细胞层。由这种构造形成的皮肤在最外面保护着我们身体的水分，也作为一个防御线进行着抵挡外部入侵各种物质的防御作用。即，如果皮肤表面有伤口的情况，表皮的快速再生能力可以促进伤口的恢复，防止通过伤口产生进一步的感染，并能起到减少皮肤表面的疤痕的作用。

当受伤的皮肤组织被重新构成时，涉及各种反应，具体来说，角蛋白细胞的移动，增殖，分化，受损细胞的分离，上皮组织的产生都与其相关。伤口愈合的过程是由各种细胞和因子参与而非常复杂的反应，首先血小板在伤口部位聚集，各种游离的细胞增殖因子，如转化生长因子(transformation growth factor)，血小板衍生生长因子，上皮细胞增殖因子等，随着血管内皮细胞，吞噬细胞，成纤维细胞和上皮细胞等被刺激从而促进细胞增殖，同时，这些细胞自身分泌成纤维细胞增殖，转化生长因子和白细胞介素(interleukin)等物质的产生及释放，进行着伤口愈合的机制。

目前，广泛用作伤口愈合治疗剂的EGF(表皮生长因子Epidermal growth factor)使用可以通过精制提纯或从细菌中大量表达的方法获得。直接精制提纯的情况，需要时间、金钱还有大量的劳动力，此外，用细菌中过量表达的方法细胞中的表达量过低以及因细菌蛋白水解酶的回收率低的问题导致的低产量。还有，有报告显示EGF对慢性的伤口部位出现治疗效果差，因温度和蛋白水解酶的影响半衰期缩短，效率对比价格贵而很难商业化也是正在经历的现实情况。

在这样的背景下，为了使历来皮肤再生或伤口治疗用制剂的问题最小化的同时进行开发具有有效治疗效果的新制剂，相关研发(韩国公开专利第10-2015-0135743)正在积极开展中，但到目前为止尚未完善。

发明的详细说明

技术问题

本发明是为了解决上述问题而提出的方案，本发明的发明者们对皮肤再生或伤口愈合的制剂进行了深入研究，制造了15个以下的氨基酸形成的肽，使用上述肽处理时，发现成纤维细胞的胶原蛋白产生量增加，抑制了黑素瘤细胞的黑色素产生量及酪氨酸酶活性，以此为基础完成了本发明。

因此，本发明的目的是为提供由标记为序列1或序列2的氨基酸合成用于皮肤再生或伤口愈合的肽。

此外，本发明的另一个目的在于提供一种用于皮肤再生或伤口治疗用的药物组成物，其有效成分包含上述肽以及编码此肽的多聚核苷酸。

再者，本发明的目的还在于提供一种改善皮肤老化或伤口的保健食品/化妆品组成物，其有效成分包含上述肽。

但是，本发明达成的技术课题并不局限于上文所提及的课题，从业者可通过下文内容准确地理解上文中未言及的其他课题。

解决问题的方法

为了实现上述目标，本发明提供了一种由标记为序列1或2的氨基酸合成的肽。

作为本发明的实例，上述肽N-或C-末端由乙酰基，芴基甲氧基羰基，甲酰基，棕榈酰基，肉豆蔻基，硬脂基，和聚乙二醇(PEG)组成的保护基群中选择一个进行结合。

本发明还提供了含有上述肽或编码该肽的多聚核苷酸的有效成分用于皮肤再生或伤口愈合的药物组成物。

作为本发明的实例，上述肽的含量可以为1至500ng/ml的浓度。

作为本发明的另一实例，上述伤口可以是创伤。

作为本发明的又一实例，上述组成物还包括允许使用的药物载体。

并且，本发明还提供一种改善皮肤老化或伤口的改善用化妆品组成物，其有效成分包含上述肽。

作为本发明的实例，上述组成物的形态可以是悬浮液，乳液，糊剂，凝胶，乳膏，乳液，粉末，蜡或喷雾剂。

作为本发明的另一个实施方案，其可以是具有皮肤美白活性的物质。

并且，本发明还提供一种皮肤再生或伤口治疗的方法，包含使用上述肽向个体投入的阶段。

并且，本发明还提供了上述肽的皮肤再生或伤口治疗用途。

发明的效果

根据本发明的新型肽增强了成纤维细胞的胶原蛋白量产生，不仅促进伤口愈合，而且还抑制了黑素瘤细胞的黑色素产生量及酪氨酸酶活性，表现出优秀的美白效果，而且由于其组成是非常小的肽，因此可将因外部物质入侵引起的副作用降至最低，期待其成为代替现有皮肤再生或伤口治疗用制剂的有效物质。

附图说明

图1是经过本发明的肽1处理时，人类纤维亚细胞中产生Procollagen的量的测定结果。

图2是经过本发明的肽1处理时，人类纤维亚细胞中产生Col1A1量的测定结果。

图3是经过本发明的肽1处理时，黑素瘤细胞产生的黑色素量的测定结果。

图4是经过本发明的肽1处理时，黑素瘤细胞酪氨酸酶的(Tyrosinase)活性评价结果。

图5是经过本发明的肽1处理时，对in vivo伤口模型的伤口治疗效果得到确认的结果。

图6是经过本发明的肽2处理时，对in vivo伤口模型的伤口治疗效果得到确认的结果。

图7是经过本发明的肽1处理时，对in vivo伤口模型中对伤口治疗效果定量化评价的结果。

图8是表示本发明的肽2处理对in vivo伤口模型的伤口愈合的效果的图，并对结果进行了评估。

图9是本发明的肽1或2对急性创伤动物模型中的伤口治疗效果的确认结果。

图10是本发明的肽1或2对急性创伤动物模型中的伤口治疗效果的定量化评价的结果。

图11是经过本发明的肽1或2对急性伤口动物模型处理时，皮肤组织变化通过H&E染色进行结果确认。

具体实施方式

以下，是本发明的详尽说明。

本发明提供的是由标记为序列1或2的氨基酸合成的肽。

本发明中的“肽(peptide)”是指由两个以上的氨基酸通过肽键连接在一起的聚合物，从本发明的目的性上来说，它是指具有皮肤再生或伤口愈合活性的肽。虽然关于肽治疗药物的研究非常多，但也暴露出很多不足：由于肽本身分子较大，很难有效地进入目标组织或细胞，而且肽的半衰期较短，进入体内短期内就会失去活性。本发明的技术意义在于在具备有效治疗效果的同时，实现由20个以下的氨基酸或更少的氨基酸组成的新型肽。

本发明中的肽是由被标记为序列1或2的氨基酸合成的，并且包括了与上述被标记为序列1或2的氨基酸序列具有相同序列的氨基酸序列，序列相同性一般在75％以上，80％以上良，90％以上优，95％以上最佳；还可包括其他的氨基酸序列，其目的在于目标化序列、标签(tag)、被标示的残基、可延长半衰期或增加肽稳定性。

此外，关于本发明的肽可包含功能变异体。上述功能变异体包括在本说明书中记载的肽序列(序列号1或2)的生物学等同物等。例如，肽的结合亲和力和/或其它为了改善生物学特性的肽的氨基酸或是可以对多聚核苷酸序列进行另外的改变。这样的变形删除肽的氨基酸序列残基、插入和/或替代，氨基酸侧链取代基的相对相似性，如疏水性，亲水性，电荷大小等。关于氨基酸侧链取代基的大小，形状和类型根据分析，精氨酸，赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的Lt丙氨酸，甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸，可以看出，色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸，赖氨酸和组氨酸；丙氨酸，甘氨酸和丝氨酸；还有苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸在生物功能上是等效的。

并且，本发明中的肽，可通过所属领域中已知的多种方法获得。举例来说，可利用多聚核苷酸重组及蛋白质表达系统进行合成，或通过类似合成肽的化学合成法在试验管中合成，以及通过无细胞蛋白质合成系统等合成。

并且，为了获得更为优越的化学稳定性、更强的药理特性(半衰期、吸收性、药价、效价、效果等)、被改变的特异性(例如：广范围的生物学活性谱)、抗原性减少，肽的N-或C-末端可以与保护基结合。虽然比较理想的保护基是乙酰基、琥珀酰亚胺基、甲酰基、棕榈酰基、十四烷基、十八酰基或聚乙二醇(PEG)，但并不仅限于此，只要是能够改变肽性质，特别是能够增强肽稳定性的成分，都可以。对于本发明中“稳定性”，不仅是指从活体内蛋白质水解酶的攻击下保护本发明肽的活体内稳定性，也意味着储存稳定性(例如：常温中的储存稳定性)。

本发明中，多聚核苷酸(polynucleotide)是核苷酸结合而成的聚合体，主要起传递遗传信息的作用。本发明的目标，是包括将编码序列1或2的肽的多聚核苷酸序列具有相同序列的多聚核苷酸序列，序列相同性一般在75％以上，80％以上良，90％以上优，95％以上最佳。本发明中的“相同性”是为了比较出野生型氨基酸序列或多聚核苷酸序列之间的相似程度，从业者可通过广泛使用的比较软件进行比较，计算出两个以上序列间的相同性百分比(％)。

作为本发明的另一形态，本发明提供了一种皮肤再生或伤口治疗方法。包含上述肽或其编码的多聚核苷酸作为活性成分，作为活性成分的组成物，用于治疗再生或伤口愈合的药物组成物；上述肽的主要用于皮肤再生或伤口愈合，并将有效药量应用到个体的阶段。

本发明中所用的术语“治疗”，指的是通过应用本发明的药学类组成物，与伤口有关的症状有所好转或朝有益方向进展的所有行为。

本发明中的“个体”，指的是需要治疗伤口的对象，更为具体，是指人类或非-人类的灵长类、小鼠(mouse)、狗、猫、马以及牛等哺乳类动物。

本发明中所使用的术语“皮肤再生”大致是指皮肤老化和其中皮肤组织对抗诱发的外部刺激而重构形成的一系列反应，作为一个实例，表现出了皮肤美白，皮肤弹性增强和皱纹改善效果。

上述“皮肤美白”不仅通过抑制黑色素的合成来增亮肤色，这意味由紫外线，激素或遗传引起的黄褐斑或雀斑等的皮肤色素过度沉着都可以得到改善。.

本发明中使用的术语“伤口(would)”意味着组织被外部刺激所损伤形成的伤口，常见伤口的愈合通常是由于细胞的退化和死亡，从周围的组织，脂质细胞的泄漏，组织液和纤维蛋白的沉积等等。从本发明的目的上来说，上述伤口治疗过程和如前所述促进相同的过程，以帮助重建成正常的皮肤组织，另一方面，上述伤口可取的创伤处得到构建，但不仅限于此。

根据本发明的一个实施例，两种肽(肽1和肽2)(参见实施例1)，并通过处理上述肽，胶原蛋白产生量增加并且可以促进伤口愈合，B16F10黑素瘤细胞系可以抑制黑色素形成和酪氨酸酶活性，并且可以确认出优秀的美白效果(参见实施例2至4)。此外，使用刮伤试验(scrat ch assay)和急性创伤动物模型评估HaCaT细胞的迁移能力，上述肽的优秀伤口治疗效果(伤口减少)(参见实施例5和6)，可以作为一种有效物质，用来替代现有的皮肤再生或伤口愈合的制剂及皮肤美白制剂，可以被广泛使用。

另一方面，本发明的肽或编码此肽的多聚核苷酸是通过胶体悬浊液、粉末、食盐水、脂质、脂质体、微球体(microspheres)或纳米球形因子等药物载体进行转运。肽或编码此肽的多聚核苷酸与转运工具形成复合体或与其连接后，利用脂质、脂质体、微小粒子、金、纳米粒子、聚合体、聚合反应体、多糖类、聚氨基酸、树状聚体、皂角苷、增进吸附物质或脂肪酸等从业者熟悉的转运系统转运至生体内。

此外，药物载体在制作时通常使用乳糖、葡萄糖(右旋糖)、蔗糖、山梨糖、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油等，但并不仅限于此。另外，除以上成分外，还可包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。

此外，本发明的药物组成物可以用于本发明的目的，为了皮肤再生的效果可是正确使用含有本发明1至500ng/ml浓度的肽，如果预期浓度没有细胞毒性且有效治疗效果，即对此不为设限。

根据目的不同，本发明的药物使用方法包括经口服用或非经口应用(比如：肌肉、静脉、腹腔、皮下、皮内以及局部应用)，虽然应用量根据患者的状态、体重、疾病程度、药物剂型、应用方式及时间有所不同，但从业可者根据情况进行优选。

特别是，当本发明的药物组成物用作皮肤外用剂时，另添加脂肪物质，有机溶剂，增溶剂，增稠剂和胶凝剂，软化剂，抗氧化剂，悬浮剂，稳定剂，发泡剂(foaming agent)，芳香剂，表面活性剂，水，离子乳化剂，非离子乳化剂，填料，螯合剂，螯合剂，防腐剂，维生素，阻塞剂，润湿剂，精油，染料，颜料，亲水性活性剂，亲脂性活性或脂质囊泡等皮肤外用剂，以及通常用于皮肤局部剂的任何其它成分可能含有常规用于科学领域的佐剂。此外，上述成分通常可使用于皮肤病学领域中。还有，当药物组成物作为皮肤外用剂时，可以是软膏，贴剂，凝胶，霜剂或喷雾剂的形式。

本发明药物组成物是按照药物剂量来应用的。在本发明中的“药物剂量”是指在药物治疗中，以合理的受益/危险比率治疗疾患时所使用的充分药量，决定药物剂量的要素包括患者疾患的种类、严重程度、药物活性、对药物的敏感度、服用时间、服用方式以及排出率、治疗时间、同时应用的药物等，以及其他在医学领域众所周知的要素。根据本发明的药物，可作为治疗药单独使用，也可与其他抗炎药合并使用，可与传统的抗炎药物同时、单独或是按顺序服用，即单一或多种一起服用。最重要的是，考虑到上述要素，在无副作用的基础上，以最小的药物剂量得到最大药效，在此方面从业者可以轻松抉择。

本发明的药物剂量，具体来说，根据患者的年龄、性别、状态、体重、体内活性成分的吸收度、不活性率、排泄速度、疾病种类以及合并使用的药物有所不同，根据服用方式、肥胖程度、性别、体重、年龄等有所增减。

并且，作为本发明的另一种形态，本发明提供了一种用于改善皮肤老化或伤口的保健食品/化妆品组成物，其中含有本发明上述肽或含有其编码的多聚核苷酸，作为活性成分。

本发明中的“改善”，是指与治疗状态相关的参数，例如，至少是使症状程度有所减少的所有行为。

此时，保健食品/化妆品组成物可用于预防或改善皮肤老化或伤口，在相关疾病发生之前或之后，为了治疗可以和药剂一起或单独使用。

本发明的保健食品组成物，可将有效成分直接添加进食品，或与其他食品或食品成分一起使用，可根据通常使用的方法择优选择，有效成分的混合量可根据其使用目的(预防或改善用)进行添加。一般来说，在生产食品或饮料时本发明组成物的推荐添加量是分别占原料重量的15％以下、10％以下。但是，如果是以健康及卫生为目的，或以调节健康为目的长时间摄取时，添加量可在上述范围以下。

本发明的健康食品组成物，作为上述食品或饮料的有效成分外，也可作为其他成分的必要成分，并且没有特殊限制。举例来说，可作为普通饮料的芳香剂或天然碳水化合物等添加成分使用。上述天然碳水化合物，包括比如单糖：葡萄糖、果糖等；比如双糖：麦芽糖、蔗糖等；以及多糖：糊精、环式糊精等普通的糖，以及木糖醇、山梨糖醇、苏藻糖醇等糖醇。除上述以外的甜味剂，还有天然甜味剂(索马甜、甜叶菊提取物(比如：甜菊糖双甙、甘草酸苷等)以及合成甜味剂(糖精、阿斯巴甜等)都可以使用。上述天然碳水化合物的比例可根据从业者的选择进行设定。

除上述以外，本发明的保健食品还可包括各种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成增味剂及天然增味剂等的增味剂、染色剂及重量剂(芝士、巧克力等)、果胶酸及果胶酸盐、海藻酸及海藻酸盐、有机酸、胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精以及碳酸饮料中使用的酸化剂等。这些成分可以单独或组合使用，这次添加剂的比例可由从业者进行选择。

本发明的化妆品可制作成为业界常见的各种剂型，比如：溶液、悬浮液、乳浊液、膏、凝胶、霜、乳液、散粉、肥皂、含有表面活性剂的清洁物、油、粉状粉底、乳状粉底、蜡状粉底以及喷雾，但并不仅限于此。更具体地说，可以制作成温和化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华、儿童面霜、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、面膜、喷雾或是散粉等形式。

本发明的化妆品中含有的有效载体，可根据不同剂型，使用业界常用的载体。若本发明的剂型是膏、霜、或凝胶，可使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅胶、皂土、硅石、滑石或是氧化锌等。

若本发明的剂型是粉末或喷雾，作为载体成分，可以是乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙或是聚酰胺粉末，特别是喷雾，可包括氯氟代烃、丙烷/丁烷或二甲醚等推进剂。

若本发明的剂型是液体或乳浊液，作为载体成分，可以是溶液、溶解剂或是乳浊剂，例如：水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、丙二醇油、甘油酯、聚乙二醇或山梨醇酐脂肪酸酯。

若本发明的剂型是悬浊液，作为载体成分，可以是水、乙醇或是丙二醇等液态的稀释剂；乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐羧酸酯等悬浊液、微晶纤维素、氢氧化铝、皂土、琼脂或黄蓍胶等。

若本发明的剂型是含有表面活性剂的清洁物，作为载体成分，可以是脂肪族醇硫酸盐、脂肪族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、乙酰乙酸叔丁酯、脂肪酸酰胺硫酸盐、烷基胺甜菜碱、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪族胺、植物油、羊毛脂衍生物或是乙氧基化的甘油脂肪酸酯等。

本发明的化妆品成分，除了有效成分和载体成分外，还含有化妆品中常见的成分，例如抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、染料以及芳香剂等辅助剂。

为了更好的理解本发明，下文将展示一些实施例，但这些实施例只是帮助理解本发明，本发明的内容并不仅限于下述实施例。

[实施例]

实施例1.合成肽

在本实施例中，将合成如下表1中所示的肽。然后，利用高效液相色谱法(SHIMADZUProminence HPLC)将合成的肽完全分离出来，色谱柱利用的是Shiseido capcell pakC18Column(4.6×50mm)，或利用高效液相色谱质谱仪(HP 1100series LC/MSD)来确认合成的肽质量。

【表1】

实施例2.人类成纤维细胞的胶原蛋白生成能力评价

胶原蛋白作为皮肤结缔组织的主要成分，在创伤等的伤口治疗或皮肤过程中，胶原蛋白的表达增加可以说是必不可少的。因此，在本实施例中，实施例1制造出的根据肽的过程中的(肽1)现有技术的胶原制造人类成纤维细胞(Human dermal fibroblast，HDF)的胶原蛋白生成能力通过传统的文献(J.Biol.Chem.1993 268(14):9941-9944)中记载的实验方法进行评价。首先，将人类成纤维细胞培养在添加了10％Fetal Bovine Albumin(FBS)的DMEM培养基中培养，在6孔板中把上述培养的细胞按照每个2×10₅cell/well的浓度进行分株，在培养24小时后，将培养基用2％FBS置换。从此时开始，经过24小时后，本发明治疗的肽(100，10，1毫微克/毫升)和经过培养的24个小时的培养物，使用Procollagen Type I C-peptide(PIP)EIA Kit试剂盒，测量procollagen的分泌量，通过Trizol试剂提取的RNA后，通过PCR确认了人类成纤维细胞的real-time COL1A1(胶原I型α11)，它证实了mRNA的表达。另一方面，作为对照组在不加特殊处理对照组(Control)，作为阳性对照组，使用处理后的TGF的对照组(TGF-)。

结果如图1和2示，经本发明的肽处理过的组与对照组及经TGF-β处理过的组进行比较，procollagen的分泌量是有所增加的；也发现了Col1A1的表达在浓度大于10ng/ml时是可以显著增加的。本发明的从皮肤再生的结果或通过诱导胶原蛋白的产生的肽被认为有助于促进伤口愈合。

实施例3.黑色素瘤细胞的黑色素生成能力评价

皮肤的颜色是由黑色素细胞分泌的黑色素量来决定的，而用来改善非正常皮肤色素沉着的研究一直在广泛进行着。特别是，在慢性创伤面色素过度沉着是一个重要的医学问题。但目前的情况是仍未开发出解决这种问题的治疗方法。接下来，在本实施例中，将把实施例1中合成的肽(肽)应用到黑素瘤细胞中，并通过文献(Life Sci.2013Aug 14；93(5-6):226-32)中记载的实验方法对应用了本发明肽的黑色素瘤细胞的黑色素生成能力进行评价。将黑色素瘤细胞的B16F10细胞，将其放入添加了10％Fetal Bovine Albumin的DMEM培养基中进行培养，并将上述培养好的细胞在12孔板中按照每个1×10₅cell/well的浓度进行分株。经过24小时的培养后，用能够促进黑色素合成的α-MSH(10uM)和本发明的肽(1，10，100ng/ml)将其处理并重新培养24小时，然后用PBS将各个well进行洗涤后，加入1N的NaOH溶液，并在100℃中溶解30分钟。然后，通过ELISA在405nm处测量吸光度，从而确认由黑色素瘤细胞生产的黑色素的量。另一方面，作为不做任何其他处理的对照组，阳性对照组将使用仅由α-MSH处理过的组。

其结果如图3所示，仅用α-MSH处理的组别中，黑色素瘤产生出大量黑色素；与此相反，用本发明肽进行处理的组，黑色素的生成显著减少，特别是，即使与并未经过α-MSH处理的组别相比也未观察到大的差别。由上述结果可以知道，本发明的肽有抑制黑素生成、美白皮肤的作用。

实施例4.黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性评价

酪氨酸酶(Tyrosinase)，在生成黑色素的过程中，是用来调节反应速度的，是控制细胞内黑色素量的关节酶。在本实施例中，将把实施例1中合成的肽(肽)应用到黑素瘤细胞中，并通过传统文献(J.Dermatol.Sci.Vol.57(2010)170-177)中记载的实验方法对应用了本发明肽的黑色素瘤细胞的酪氨酸酶活性能力进行评价。将黑色素瘤细胞B16F10细胞在12孔板中按照每个1×10₅cell/well的浓度进行分株并培养24小时后，处理α-MSH(1M)和本发明(1，10，100ng/ml激活)的肽，并再次培养24小时，然后用PBS将各个well进行洗涤后，使其悬浮在含有1％Triton X-100的50mM的Phosphate buffer(pH 6.8))中。Vortexing后，在-80℃进行30分钟的冻结，之后使其在室温下融化，1000g离心10分钟之后，将1上清液和10mML-DOPA放入96well-plate中，并在37℃下使其发生反应。然后，通过ELISA在405nm处测量吸光度，从而确认黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性。另一方面，作为不做任何其他处理的对照组，阳性对照组将使用仅由-MSH及Kojic acid处理过的组。

其结果如图4所示，仅用α-MSH处理的组别中，黑色素瘤酪氨酸酶活性明显增强；与此相反，用本发明肽进行处理的组，酪氨酸酶活性显著减弱，特别是，即使与具有抑制酪氨酸酶活性的Kojic acid处理的组别相比也未观察到大的差别。由上述结果可以知道，本发明肽可通过抑制酪氨酸酶的活性从而美白皮肤的作用。

实施例5.利用In vitro伤口愈合模型来确认伤口治愈效果

在本实施例中，上述实施例1中合成的肽(肽1和2)中的一个治疗伤口愈合效果是由scratch assay划痕试验证实。在serum free培养基中添加mitomycin C(10ug/ml)后，将人上皮细胞HaCaT细胞培养2小时使其发生scratch损伤。在添加10％FBS的培养基中加入肽(1或10ng/ml)，作为阳性对照组是加入了TGF-β(1ng/ml)，随着时间的推移，观察细胞的散布力，并将创伤大小的减少定量化。

如图5和6所示结果，利用本发明的肽处理的组中，可证实HaCaT细胞的运动依赖肽浓度的增加。另外，将上述创伤大小定量化并进行评价的结果，如图7和8所示，确定在肽1或肽2治疗的伤口尺寸的显著减少，特别是肽2，其效果更为显著。不仅仅是在高浓度(10ng/ml)中，即使是在低浓度(10ng/ml)也可观察到明显的伤口减少效果。

实施例6.使用急性创伤动物模型来确认伤口愈合效果

在本实施例中，利用上述实施例1中合成的肽(肽1和2)进行处理时，伤口愈合效果可通过利用急性创伤动物模型在in vivo进行确认。

6-1.伤口大小的变化确认

将8周龄的Balb/c nude小鼠用Avertin(2.5％)进行麻醉后，使用直径10mm的圆形punch将动物背部的皮肤切开从而诱发其急性创伤。被掀开的部位历经24小时、总5回的肽处理(500ng/回)，随着时间的推移，测定14天间伤口面积的减少，作为阳性对照组是用EGF进行处理(10ug/回)。这时，肽以20％pluronic F-127(PBS)和mixture状态处理，用数码相机和ImageJ软件，将随时间推移测定伤口大小并将其数值化，然后进行比较。

结果如图9和10所示，用肽1或多2的肽处理时，可以确认近似阳性对照组，或伤口大小比其更大的减少。特别地，肽2是分子量两倍于肽1的二聚体形式，并且即使在比所述第一肽浓度较低的处理中，不仅比那些肽1处理效果结果更优秀，积极对照组的治疗效果也证实了更好的伤口愈合控制小组。

6-2.组织学改变确认

用实施例6-1中的方法诱发急性创伤，诱发急性创伤后第5天后将皮肤组织切开制成组织切片。之后，经过H&E染色并通过显微镜对肽组织学上的变化进行观察。在另一方面，EGF被用作阳性对照。

结果如图11所示，与PBS对照组相比，用肽1和肽2处理的组织具有比阳性对照组更厚的表皮(epidermis)和真皮层(dermis)，上皮形成(epithelialization)也进展活跃，从而确认与伤口的治疗和恢复先关联的组织学结论。

鉴于上述结果，本发明的肽(肽1和肽2)能明显加快伤口恢复率，它可以用为治疗伤口的有效物质使用。

上文的阐述是对本发明的举例说明，具有本发明所属技术领域常识的人在不改变本发明技术思想或必要特征的情况下，可以轻松地将本发明变形为其他具体的形态。因此，必须明白的是上文中所述的实施例是所有方面举例，但并不仅限于此。

序列表

<110> 生物佩普株式会社

<120> 皮肤再生或伤口治疗用的肽及其用途

<130> X17U10C0026

<150> KR 10-2016-0034327

<151> 2016-03-23

<160> 2

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽1

<400> 1

Arg Glu Gly Arg Thr

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>多肽2

<400> 2

Arg Glu Gly Arg Thr Arg Glu Gly Arg Thr

1 5 10

Claims (12)

1.一种肽，是由标记为序列1或2的氨基酸合成的。

2.如权利要求1所述的肽，其特征在于N-或C-末端可从由乙酰基、芴基甲氧基羰基，甲酰基，棕榈酰基，肉豆蔻基，硬脂基和聚乙二醇PEG组成的保护基群中选择一个进行结合。

3.一种用来于皮肤再生或伤口治疗的药物组成物，其有效成分包含由标记为序列1或2的氨基酸合成的肽，以及编码此肽的多聚核苷酸。

4.如权利要求3所述的药物组成物，其特征在于所述肽的N-或C-末端可从由乙酰基、芴基甲氧基羰基，甲酰基，棕榈酰基，肉豆蔻基，硬脂基和聚乙二醇PEG组成的保护基群中选择一个进行结合。

5.如权利要求3所述的药物组成物，其特征在于上述肽的浓度含有1至500ng/ml。

6.如权利要求3所述的药物组成物，其特征在于为上述伤口创伤被愈合。

7.如权利要求3所述的药物组成物，其特征在于还包括允许使用的药物载体。

8.一种化妆品组成物，用于改善皮肤老化或伤口，其有效成分包含标记为序列1或2的氨基酸合成的肽。

9.如权利要求8所述的化妆品组成物，其特征在于形态可以是悬浮液、乳液、糊剂、凝胶、霜剂、洗剂、粉末、蜡或喷雾剂。

10.如权利要求8所述的化妆品组成物，其特征在于含有皮肤美白活性成分。

11.一种治疗方法，能够皮肤再生或治疗伤口，其有效成分包括被标记为序列1或2的氨基酸合成的肽。

12.上述标记为序列1或2的氨基酸合成的肽的用途是为了皮肤再生或治疗伤口。