CN109456926A

CN109456926A - 一种含嗜盐反硝化菌yl5-2的微生物菌剂及其应用

Info

Publication number: CN109456926A
Application number: CN201811640095.8A
Authority: CN
Inventors: 徐军; 王开春; 李坤; 王强; 田凤蓉; 洪磊; 张璐璐; 孙文妮
Original assignee: Bluestar Lehigh Engineering Institute
Current assignee: Bluestar Lehigh Engineering Institute
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109456926B

Abstract

本发明公开了一种含嗜盐反硝化菌YL5‑2的微生物菌剂及其应用。一种微生物菌剂，含有嗜盐反硝化菌YL5‑2，YL5‑2为Halovibrio属的新物种，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16315,保藏日期为2018年8月20日。本发明所述的微生物菌剂在高盐废水处理中的应用。YL5‑2可用于盐含量大于10％的高盐废水的生物脱氮处理，降低此类废水的脱氮处理成本。本发明公开的嗜盐反硝化菌YL5‑2制备的微生物菌剂，可以用于高盐条件下污染物的降解、转化和生物脱氮过程，包括高盐废水处理，污染海水治理，盐碱地修复，消耗氮素营养，抑制藻类过度繁殖，净化水体，改良底质等。

Description

一种含嗜盐反硝化菌YL5-2的微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及环保微生物领域，特别是涉及一种含嗜盐反硝化菌YL5-2的微生物菌剂及其应用。

背景技术

氮污染是引起水体富营养化的重要原因之一。废水的脱氮处理对于维持水环境质量和防止水体富营养化具有重要作用。石油、化工、食品加工、化肥等行业排放的含氮废水具有高盐的特点。化工、食品加工产生的某些废水，其盐含量甚至超过海水。传统生物法处理低盐度含氮废水具有优势，但当废水浓度过高时，会抑制脱氮微生物的代谢作用。耐盐和嗜盐的脱氮菌的存在，为高盐废水生物脱氮提供里理论上的可能。

生物脱氮菌包括硝化菌和反硝化菌。高盐废水条件下的生物脱氮菌也可以分为硝化菌和反硝化菌。反硝化菌是一类能够将硝酸盐或压硝酸盐还原为气态氮化合物的细菌。因此，从环境中筛选分离并培育耐盐和嗜盐的硝化菌和反硝化菌，就成为解决高盐废水生物脱氮问题的关键。

大连海洋大学焦点等人(焦点、张蕾等.一株中度嗜盐反硝化菌的分离鉴定及其代谢特性研究.《水产科技情报》，2018，45(3)：149～154)从海产养殖废水净化单位中分离得到一株中度嗜盐反硝化菌，属于Halomonas属，其最佳代谢生长条件为温度30℃、盐度100g/L、pH7.5～8.5，C/N比为4:1。

青岛大学郭艳丽等(郭艳丽、张培玉等.一株轻度嗜盐反硝化菌的分离鉴定及特性.《应用与环境生物学报》2010,16(3):394～398)从处理高盐废水的成熟活性污泥中分离得到一株轻度嗜盐好氧反硝化菌YL-1，属于迪茨氏菌(Dietzia sp.)，该菌能够在0％～10％、pH 7.5～8.5、利用乙酸、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠进行反硝化。

南京工业大学訾小利(訾小利.嗜盐反硝化细菌的分离鉴定及其反硝化特性研究.南京工业大学2013年硕士毕业论文)以硝酸钠为唯一氮源且盐浓度为8％的异养反硝化培养基，从盐城盐场的土壤样品中富集、分离和筛选得到了6株嗜盐反硝化菌：NY-1、NY-11与NY-13均为支芽孢杆菌属，(Virgibacillus sp.)，NY-8和NY-10为盐单胞菌属(Halmonassp.)，NY-4为海杆菌属(Marinobacter sp.)，其盐度生长范围均为0％～12％，最适生长盐浓度为3％～8％。其中NY-4的反硝化能力最强，在以柠檬酸三钠为碳源、盐度8％、C/N为5、pH为8时，NO₃-N的去除率为95％。

现有技术关于嗜盐反硝化菌的报道较少，尤其是盐度＞10％的条件下的嗜盐反硝化菌。从环境中获取耐盐能力大于10％的嗜盐反硝化菌是此类废水生物脱氮需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是为解决高盐条件下的生物脱氮问题，尤其是盐度大于10％条件下的高盐废水生物脱氮问题，提供一种含嗜盐反硝化菌YL5-2的微生物菌剂。

本发明的另一目的是提供该菌剂的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现的：

一种微生物菌剂，含有嗜盐反硝化菌YL5-2，YL5-2为Halovibrio属的新物种，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16315,保藏日期为2018年8月20日。

本发明公开的嗜盐反硝化菌YL5-2的16S rRNA序列的GenBank/EMBL/DDBJ的登录号为MF782425，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；全基因组序列的GenBank/EMBL/DDBJ的登录号为NSKD00000000.1。

本发明公开的嗜盐反硝化菌YL5-2为革兰氏阴性、兼性好氧、直杆状或0.5～0.8μm×1.0～3.5μm的小弧菌性状，并且通过单极性鞭毛运动，其固体培养基上的菌落为光滑和浅黄色。

本发明公开的嗜盐反硝化菌YL5-2能够在盐浓度3％～32％、pH6.5～11.0、温度15～45℃范围内生长。当以乙酸为碳源，NO₃-N或NO₂-N为电子受体时，YL5-2的最适生长盐环境为5％～25％，最适生长pH为7.5～8.0、最适生长温度为30～35℃。

本发明公开的嗜盐反硝化菌，当溶解氧＜1.0mg/L(缺氧状态)，其能够以乙酸或其它有机物为电子供体进行反硝化；当溶解氧＜0.5mg/L(缺氧状态)，其能够以乙酸或其它有机物为电子供体进行反硝化；当溶解氧≥1.0mg/L，其能够以乙酸或其它有机物为电子供体进行反硝化；当溶解氧≥2.0mg/L，其能够以乙酸或其它有机物为电子供体进行反硝化。

本发明所述的微生物菌剂优选为复合菌剂，还含有其他废水处理菌。

本发明所述的微生物菌剂在高盐废水处理中的应用。

本发明所述的微生物菌剂优选在盐度5％～25％的高盐废水的生物脱氮处理中的应用。

本发明所述的微生物菌剂进一步优选在缺氧条件下或好氧条件下对盐度大于10％的高盐废水进行反硝化。

利用本发明菌株YL5-2制备的微生物菌剂，当以生物脱氮为主要目标进行应用时，该菌剂的最佳适用耐盐浓度范围是5％～25％。

(1)当废水盐浓度为5％～10％，该菌剂可以NO₃-N或NO₂-N作为电子受体，并且TN≤100mg/L、C/N≥5，且经过72h，NO₃-N或NO₂-N的去除率可以达到90％以上。

(2)当废水盐浓度为10％～20％，该菌剂可以NO₃-N或NO₂-N作为电子受体，并且TN≤100mg/L、C/N≥5，且经过72h，NO₃-N或NO₂-N的去除率都可以达到95％以上。

(3)当废水盐浓度为20％～30％，该菌剂可以NO₃-N或NO₂-N作为电子受体，并且TN≤100mg/L、C/N≥5，且经过72h，NO₃-N或NO₂-N的去除率都可以达到95％以上。

本发明的有益效果：

(1)本发明发现了一个Halovibrio属的新物种，命名为Halovibrio salipaludissp.nov。该菌株是一种兼性或好氧反硝化菌，其耐盐范围是3％～32％，可以在盐浓度5％～25％范围内以NO₃-N和NO₂-作为电子受体进行反硝化。利用YL5-2制备的微生物菌剂，可用于盐含量大于10％的高盐废水的生物脱氮处理，降低此类废水的脱氮处理成本。本发明公开的嗜盐反硝化菌YL5-2制备的微生物菌剂，可以用于高盐条件下污染物的降解、转化和生物脱氮过程，包括高盐废水处理，污染海水治理，盐碱地修复，消耗氮素营养，抑制藻类过度繁殖，净化水体，改良底质等。

附图说明：

图1嗜盐反硝化菌YL5-2细胞在YL琼脂平板上于37℃条件下培养24h后的细胞透射电子显微照(比例尺为2μm)

图2是嗜盐反硝化菌YL5-2与Halovibrio variabilis DSM 3050T及其它亲缘种构建的基于16S rRNA的的系统发育树图。该图用于描述嗜盐反硝化菌YL5-2与Halovibriodenitrificans DSM15503及其它种属。系统发育树分支点处的数字表示置信值>50％(1000次重复)。标尺表示100个核苷酸中有5个被替换。将Pontibacter mucosus PB3^T作为外类群。每种菌株都标明了GenBank登录号。

图3是嗜盐反硝化菌YL5-2与Halovibrio variabilis DSM 3050T及其它亲缘菌种基于16S rRNA的最大简约法(MP)构建的系统发育树图。该图用于描述嗜盐反硝化菌YL5-2与Halovibriovariabilis DSM 3050T及其它菌种的分类群之间的关系。Marinobacteroulmenensis Set74T(AY130994)作为外类群。括号里为GenBank登录号。系统发育树分支点处的数字表示置信值>50％(1000次重复)

生物材料保藏信息

YL5-2，分类命名为Halovibrio salipaludis，保藏日期为2018年8月20日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.16315。

具体实施方式

实施例1该嗜盐反硝化菌的分离及保藏

嗜盐反硝化菌YL5-2是从中国青海省格尔木察尔汗盐湖(36°51′N,94°95′E)沉积土壤中分离得到。察尔汗盐湖湖水常年为饱和盐浓度或接近饱和盐浓度。

配置NaCl浓度为20％的LB液体培养基，并加入甘油250mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇50mg/L，在30℃条件下对察尔汗盐湖沉积土壤富集培养72h。利用YL固体培养基对富集培养液中的菌株进行分离。1L培养基中含有以下组分：葡萄糖：0.6g，柠檬酸三钠0.5g，甘油2mL，酵母提取物0.8g，蛋白胨1.6g，磷酸氢二钾0.35g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸铵0.25g，氯化铵0.25g，MgSO₄ 0.5g，CaCl₂ 0.1g，NaCl 180g；微量元素SL-4 10mL，pH 7.0-7.2；琼脂2.5％。

菌株YL5-2保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16315，保藏日期为2018年8月20日。

实施例2嗜盐反硝化菌YL5-2 16S rRNA序列分析与全基因序列分析

菌株YL5-2基因组DNA提取采用TaKaRa试剂盒(TaKaRa MiniBEST BacteriaGenomic DNA Extraction 68Kit Ver.3.0)。

16S rRNA扩增采用通用细菌引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCA G-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR测序委托上海生工生物科技有限公司进行。菌株YL5-2完整的16S rRNA序列为1518bp，如SEQ ID NO.1所示，GenBank登录号为MF782425。

菌株YL5-2的全基因组测序采用上海上海派森诺生物科技有限公司IlluminaMiSeq 2000高通量测序平台。原始测序数据采用PRINSEQ(版本号v 0.20.4)软件进行过滤和修正，然后采用带有默认参数的SOAP denovo软件(版本号v1.05)软件进行基因组的碱基配对，然后使用CheckM软件(版本1.03)评估基因组的完整性。蛋白质编码开放阅读框架采用Glimmer软件(版本号1.2)进行预测。RNA预测采用RNAmmer软件(版本1.2)。菌株YL5-2全基因组序列共3,495,096bp，GenBank登录号为NSKD00000000.1。

DNA-DNA杂交试验通过菌株YL5-2与其遗传发育最接近的弧菌属Halovibrio模式菌株进行。该方法由De Ley等于1970年提出，DNA杂交值(dDDH)采用GGDC软件第2种模式(版本号2.0)进行基因序列的一一比对得到。DNA试验和分析结果表明，菌株YL5-2和Halovibrio variabilis DSM 3050^T、Halovibrio denitrificans DSM15503^T的DNA-DNA杂交值分别为43.5％和38.2％，远低于70％的阈值(物种划分通常被接受的阈值)。

核苷酸平均一致性值采用全基因组序列的碱基组进行1000次重复拓扑检验得到。该方法由Goris等于2007提出，使用的软件为MUMmer(版本号3.23)和Jspecies(版本号1.2.1)。基于Kim等人和Richter等人提出的物种划分的ANI阈值范围(95-96％)，对菌株YL5-2的基因组和GenBank中与之密切相关的基因组进行ANI分析。结果表明，菌株YL5-2其与Tamilnaduibacter alinus Mi 7的平均核苷酸一致性(ANI)值最高，为88.5％，这为菌株YL5-2^T属于Halovibrio属的一种新物种提供了论据，命名为Halovibrio salipaludissp.nov。

实施例3嗜盐反硝化菌YL5-2的表型特征和生理生化特征鉴定

革兰氏染色特性采用BD革兰氏染色试剂盒进行测试。

细胞运动性使用半MA培养基(0.5％琼脂，w/v)测定。

细胞形态采用透射电子显微镜(TEM)分析检测。即从指数生长的培养液中挑取细胞，用0.5％乙酸铀酰染色细胞，并在显微镜(Tecnai Spirit,FEI,Hillsboro,OR,USA)下对细胞进行拍照。

氧化酶活性使用氧化酶试剂盒(bioMérieux)，通过将3.0％H₂O₂溶液倒入细菌菌落并观察气泡产生来测定过氧化氢酶活性。

温度生长条件在YL液体琼脂培养基上进行，温度分别为4、10、15、20、25、30、33、37、40、45和50℃，pH恒定为7.5，比较不同温度下菌株YL5-2^T的生长速率确定其最佳生长温度。

耐盐能力在0.0-30.0％NaCl(w/v)的YL琼脂和YL液体培养基进行。用缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 5.0-7.0)，Na₂CO₃/NaHCO₃(pH 8.0-12.0))将pH调至5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0(15.0％NaCl，35℃)以测定适合生长的pH范围。

碳源利用能力和酶活性测试采用API 20NE，API ZYM(bioMérieux)和BiologGENIII微孔板。所有测试接种YL培养基上预生长的细胞，并用相关的接种培养基稀释。

菌株YL5-2的表型特征和生理生化特征鉴定结果如表1所示：

表1嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2(a)与Halovibrio denitrificans DSM15503^T(b)，Halovibrio variabilis DSM 3050^T(c)在表型与生理生化等方面的区别特征比较

说明：+，阳性；-，阴性。

嗜盐反硝化菌YL5-2是革兰氏染色阴性、碱性好氧，直杆状或0.5-0.8x1.0-3.5μm的小弧菌形状，并且通过单极性鞭毛运动(图1)。

菌株YL5-2在好氧条件下利用乙酸生长，在缺氧条件下则利用硝酸盐生长(API20NE)。

实施例4嗜盐反硝化菌YL5-2的发酵培养试验

(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠100～250g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。

(2)1L的三角瓶中接种后在35℃条件下培养48h，培养过程中补充水分的散失影响盐浓度的变化。48h后测得10％、15％、20％、25％盐浓度条件下OD600分别为1.72、1.65、1.62、1.60、1.63。进行两次转接培养，每次转接后均培养48h，驯化培养完成后OD600分别为2.56、2.68、2.72、2.68、2.52。

(3)1L培养液接种到20L的好氧发酵罐中进行培养，培养基成分保持不变。仍然培养48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，溶解氧为2.0～4.0mg/L。48h后发酵罐中菌液的OD600可达到2.6～3.0之间。

(4)检验：培养过程中使用显微镜每日取样观察，检查是否有杂菌混入生长；同时观察YL5-2的生长及形态变化情况。

(5)结果：试验结果表明，菌株YL5-2可以快速的进行发酵培养和放大，这表明YL5-2具有大规模工程应用的潜力。

实施例5嗜盐反硝化菌YL5-2的耐盐能力试验

(1)培养基成分为甘油50mg/L、葡萄糖25mg/L、甲醇50mg/L、甲胺20mg/L、氯化钠250g/L，乙酸钠25mg/L，柠檬酸三钠25mg/L、酵母粉10mg/L、蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，琼脂20g/L。

(2)使用新鲜的上述培养基活化菌种，培养3天至菌苔生长丰富备用

(3)盐度梯度设置：根据YL5-2菌种的富集筛选条件，设置培养基的盐度梯度和范围为0％、0.5％、1％、2％、3％、24％、26％、28％、30％、32％、34％。

(4)制备培养基：根据设置的培养基配方制备培养基，盐度较高的培养基热水融化后灭菌，每瓶多加5ml的蒸发水，易挥发的培养基成分待灭菌后加入摇匀，待冷却至60℃左右，倒制平皿，盐度高极易凝固，因此，倒制平皿快速要快(32％盐度培养基倒制平皿时，冷却凝固后有少量盐析出，34％盐度有大量盐晶体析出)。

(5)接种：无菌条件挑取一环新鲜菌苔接入各盐度培养基，由低盐度往高盐度梯度转接，34％盐度培养基划线后随着划线轨迹有大量盐晶体析出，接种完培养皿用封口膜封口，35-37℃培养3-7天，观察菌种生长情况。

(6)试验结果：YL5-2菌种耐盐范围为3-32％。YL5-2菌株在3-30％盐度培养基中三天内可以明显观察到新长出的菌苔，但是在32％饱和盐度培养基中生长7天以上才能长出肉眼可见菌苔。表明YL5-2在3％～30％的盐浓度范围内生长速度均较快。

表2 YL5-2在不同盐浓度培养基上的生长情况

实施例6嗜盐反硝化菌YL5-2的耐盐反硝化能力试验

(1)培养基：乙酸2000mg/L、蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，NO₃-N为100mg/L，NaCl浓度3％～30％，加入缓冲液使pH为7.5～8.0。

(2)试验设计：反硝化试验10个500mL的三角瓶中进行，各加入培养基300mL，设置8个盐度梯度，盐含量分别为3％、6％、10％、12％、15％、20％、25％、30％，其中不含盐的空白组也设置2个平行。

(3)反硝化试验：所有样品灭菌后接种YL-5培养液约10mL，在恒温摇床上进行培养，温度为30～35℃；震荡速度分别为10ppm；分别于24h、48h和72h后取样测定三角瓶中NO₃-N的浓度。试验结果如下表数据：

表3 YL5-2在不同盐浓度下反硝化去除NO₃-N的试验结果(单位：mg/L)

	0	0	3％	6％	10％	12％	15％	20％	25％	30％
											24h	99.6	99.5	91.3	76.2	68.8	67.5	66.4	67.6	72.6	89.6
48h	99.1	99.2	55.4	18.6	14.4	11.7	9.9	14.7	19.1	40.6
											72h	98.5	98.8	13.5	6.7	4.5	3.6	3.8	4.2	8.2	12.5

实施例7嗜盐反硝化菌YL5-2的耐盐反硝化能力试验

(1)培养基：乙酸2000mg/L、蛋白胨20mg/L、牛肉膏20mg/L，NO₂-N为100mg/L，NaCl浓度3％～30％，加入缓冲液使pH为7.5～8.0。

(3)反硝化试验：所有样品灭菌后接种YL-5培养液约10mL，在恒温摇床上进行培养，温度为30～35℃；震荡速度分别为10ppm；分别于24h、48h和72h后取样测定三角瓶中NO₂-N的浓度。试验结果如下表数据：

表4 YL5-2在不同盐浓度下反硝化去除NO₂-N的试验结果(单位：mg/L)

	0	0	3％	6％	10％	12％	15％	20％	25％	30％
											24h	99.7	99.7	95.3	86.2	78.8	77.5	76.4	77.6	81.6	91.6
48h	99.3	99.1	62.4	20.3	16.5	14.8	11.3	15.7	19.1	30.6
											72h	99.0	98.6	15.8	9.7	6.6	4.2	3.8	7.3	8.5	15.3

实施例8利用嗜盐反硝化菌YL5-2制备的微生物菌剂

(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0；为比较不同盐浓度下YL5-2的降解效果，培养基中氯化钠浓度配制成3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为60h，培养结束后控制OD600＞1.0。

(2)所培养得到的菌液即为嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2微生物菌剂。

(3)使用该菌剂在好氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，乙酸为1000mg/L的废水，72h后乙酸的降解率分别为88.3％、91.2％、91.6％、92.3％、92.2％、91.3％、88.2％。

(4)将该菌剂在35℃、缺氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，乙酸为1000mg/L、NO₃-N≤100mg/L的废水，48h后乙酸的降解率分别为81.3％、88.2％、89.5％、89.6％、89.3％、87.1％、81.9％。

(5)将该菌剂用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，乙酸为1000mg/L、NO₂-N≤100mg/L的废水，48h乙酸降解率分别为86.5％、88.3％、92.2％、91.8％、90.7％、83.8％。

(6)将该菌剂用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、COD≤3000mg/L、NO₃≤100mg/L的废水，72h后NO₃-N降解率分别为84.3％、90.2％、93.4％、93.6％、91.8％、82.2％。

实施例9利用嗜盐反硝化菌YL5-2制备的微生物菌剂

(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0；为比较不同盐浓度下YL5-2的降解效果，培养基中氯化钠浓度配制成3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2和Halovibrio denitrificans DSM15503，然后在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为72h，培养结束后控制OD600＞1.0。

(2)所培养得到的菌液即为嗜盐弧菌混合微生物菌剂。

(3)使用该菌剂在好氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，且乙酸为1000mg/L的废水，72h后乙酸的降解率分别为90.3％、92.6％、92.7％、92.8％、91.8％、90.7％、89.5％。

(4)将该菌剂在35℃、缺氧条件下处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，且乙酸为1000mg/L、NO₃-N≤100mg/L的废水，72h后乙酸的降解率分别为84.5％、91.2％、91.8％、92.3％、92.2％、88.5％、83.2％。

(5)将该菌剂在30℃，缺氧条件下用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％，且乙酸为1000mg/L、NO₂≤100mg/L的废水，72h后乙酸降解率分别为83.6％、90.7％、92.0％、91.5％、91.9％、84.2％。

(6)将该菌剂在25℃，缺氧条件下用于处理TDS分别为3％、6％、10％、15％、20％、25％、30％、且COD≤3000mg/L、NO₃≤100mg/L的废水，72h后NO₃降解率分别为88.3％、93.1％、95.5％、95.6％、92.8％、86.6％。

实施例10利用嗜盐反硝化菌YL5-2制备的复合微生物菌剂

(1)培养基成分为甘油500mg/L、葡萄糖250mg/L、甲醇500mg/L、甲胺200mg/L、氯化钠120g/L，乙酸钠250mg/L，柠檬酸三钠250mg/L、酵母粉100mg/L、蛋白胨200mg/L、牛肉膏200mg/L，微量元素少量，pH为7.5～8.0。液体培养基进行灭菌，同时控制好水分蒸发。接种嗜盐弧菌Halovibrio sp.YL5-2和Halovibrio denitrificans DSM15503，然后在35℃条件下进行多次传代扩增培养，单个培养周期为48h，培养结束后控制OD600＞1.0。

(2)所培养得到的菌液即为嗜盐弧菌混合微生物菌剂。

(3)将该菌剂在好氧条件下用于处理TDS为5％、乙酸为1000mg/L的废水，24h、48h、72h后乙酸的降解率分别为22.5％、80.8％、90.6％。

(4)将该菌剂用于处理TDS为18％、乙酸为1200mg/L且NO₃-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.5mg/L，72h后NO₃-N的去除率为95.2％。

(5)将该菌剂用于处理TDS为12％、葡萄糖为800mg/L且NO₃-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，72h后NO₃-N的去除率为76.3％。

(6)将该菌剂用于处理TDS为16％、葡萄糖为900mg/L且NO₃-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，72h后NO₃-N的去除率为83.5％。

(7)将该菌剂用于处理TDS为22％、葡萄糖为900mg/L且NO₃-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，24h、48h、72h后NO₃-N的去除率分别为5.6％、32.8％、82.7％。

(8)将该菌剂用于处理TDS为28％、葡萄糖为900mg/L且NO₃-N为100mg/L的废水，控制溶解氧＜0.2mg/L，24h、48h、72h后NO₃-N的去除率分别为2.8％、40.2％、86.3％。

实施例11利用嗜盐反硝化菌YL5-2制备的复合微生物菌剂

(2)1L的三角瓶中同时接种嗜盐反硝化菌YL5-2，后在35℃条件下培养48h，培养过程中补充水分的散失影响盐浓度的变化。每培养72h进行一次转接，且每次转接前OD600须不低于1.5。

(3)1L培养液接种到20L的好氧发酵罐中进行培养，培养基成分保持不变。仍然培养48h，培养温度为35℃、搅拌速度为100rpm，溶解氧为不低于2.0mg/L。控制48h后发酵罐中菌液的OD600不低于2.5。

(4)20L培养液接种到1000L的好氧发酵罐中继续培养，培养条件与前述相同。随后可根据需要将培养规模进行放大或批量培养。

(5)将培养得到的菌液与利用海水在TDS＞10％条件下富集培养得到的菌液进行混合，即为一种含有嗜盐反硝化菌YL5-2复合微生物菌剂。

(6)将该菌剂用于处理COD≤1000mg/L且NO₃-N≤60mg/L的废水：

①当TDS为3.5％，72h后NO₃-N的去除效率可达到82.1％。

②当TDS为7.5％，72h后NO₃-N的去除效率可达到93.5％。

③当TDS为12％，72h后NO₃-N的去除效率可达到96.6％。

④当TDS为18％，72h后NO₃-N的去除效率可达到97.2％。

⑤当TDS为26％，72h后NO₃-N的去除效率可达到90.3％。

(7)该复合菌剂应用于榨菜废水的处理，在进水TDS为6％～7％、COD为2000～3000mg/L、NO₃-N为150～200mg/L的条件下，采用活性污泥法A/O+接触氧化+絮凝沉淀工艺，连续运行一个月，COD平均去除率可达到90％以上、NO₃-N平均去除率可达到85％以上。

(8)该复合菌剂应用于入海口污染湿地的生态修复。

(9)该复合菌剂应用于近海地区污染地下水的修复，通过投加菌剂和水力循环，污染地下水中COD的降解速度明显加快。

序列表

<110> 中蓝连海设计研究院有限公司

<120> 一种含嗜盐反硝化菌YL5-2的微生物菌剂及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> Halovibrio属(Halovibrio sp.)

<400> 1

cccatggggg cagctacaca tgcagtcgag cggcagcagc tccttcggga ggctggcgag 60

cggcggacgg gtgagtaacg catgggaact tacccagtag tgggggatag cccggggaaa 120

cccggattaa taccgcatac gccctgaggg ggaaagcggg ctccggctcg cgctattgga 180

tgggcccatg tcggattagt tagttggtgg ggtaatggcc taccaaggcg acgatccgta 240

gctggtctga gaggatgatc agccacaccg ggactgagac acggcccgga ctcctacggg 300

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tgaagaaggc cttagggttg taaagcactt tcagcaggga ggaaaagctg atcgttaata 420

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tggaggaaca ccagtggcga aggcgactgc ctgggctgac actgacgctg aggtgcgaaa 720

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gtcgttgggg ctattagagc cttagtgacg cagctaacgc gataagttct ccgcctgggg 840

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cagagggcag caagcgcgcg agtgcaagcg aatcccttaa aacgcctcgt agtccggatc 1260

ggagtctgca actcgactcc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcagat cagaatgctg 1320

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ccagaagcgg ttagtctaac cttcgggagg acgatcgcca cggtgtctgt a 1431

Claims

1.一种微生物菌剂，其特征在于含有嗜盐反硝化菌YL5-2发酵液，YL5-2为Halovibrio属的新物种，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.16315,保藏日期为2018年8月26日。

2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂为复合菌剂，还含有其他废水处理菌。

3.权利要求1所述的微生物菌剂在高盐废水处理中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于权利要求1所述的微生物菌剂在盐度5％～25％的高盐废水的生物脱氮处理中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于权利要求1所述的微生物菌剂在缺氧条件下或好氧条件下对盐度大于10％的高盐废水进行反硝化。