CN109371087A - 一种小分子茶叶肽的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种小分子茶叶肽的提取方法，包括以下步骤：步骤一、将茶叶加入纯化水中，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；步骤二、将所述煎煮混合物降温至55‑57℃，依次分阶段加入中性蛋白酶、端肽酶和蚕虫消化道蛋白酶，得酶解液；步骤三、将所述酶解液加热升温进行酶灭活，分离，得小分子茶叶多。本发明采用中性蛋白酶、端肽酶和蚕虫消化道蛋白酶复合酶对茶叶蛋白进行靶向酶解，并结合离心技术、纳滤技术，使得制备的茶叶肽产品的纯度高，肽分子量为180‑500道尔顿的肽含量可达到99％以上，制备的茶叶肽产品能完全溶于水，口感好，无异味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域，具有广阔的应用前景。

Description

一种小分子茶叶肽的提取方法

技术领域

本发明涉及生物肽分离技术领域，尤其涉及一种小分子茶叶肽的提取方法。

背景技术

茶叶，指茶树的叶子和芽，泛指可用于泡茶的常绿灌木茶树的叶子。茶叶中的蛋白质绝大多数是非水溶性的，只有1-2％为水溶性的，而且在制茶过程中，由于蛋白质的变性凝固，使一些蛋白的水溶性进一步降低。茶叶中非水溶性蛋白质主要是谷蛋白，约占蛋白总量的80％，其次是白蛋白、球蛋白和精蛋白等。非水溶性蛋白质难以直接被人体和动物消化吸收，且其功能性质也不佳，因此尚未被很好地研究和利用。近年来，为了更好地利用茶叶蛋白，人们普遍采用酶解法对茶叶蛋白进行酶解，茶叶蛋白酶解后产生的多肽除了具有易被人体消化吸收的特性外，还具有很强的抗氧化、降低胆固醇、抗肿瘤等功能特性。

小分子肽是多肽的一种分类，分子量段一般在1000道尔顿以下，也称作小肽、低聚肽或小分子活性肽，一般由2-6个氨基酸组成，相比于分子量较大的蛋白，其具有不需要消化、直接吸收，吸收时不需要消耗人体能量、不会增加人体胃肠功能负担的优点，此外其还具有载体的功能，能将人体内的其它营养载在其本体上，输送到人体的细胞、组织内，因此，受到了越来越多的关注。但是，现有的小分子多肽的提取工艺存在蛋白提取效率较低，提取的小分子肽中杂质含量较多以及产品分子量分布广的缺陷。因此，研究一种蛋白提取效率高、小分子肽含量高的茶叶肽的提取工艺对实现茶叶中多肽的综合开发具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有小分子茶叶肽提取工艺中蛋白提取效率低以及提取的小分子多肽含量较低以及产品分子量分布广的问题，本发明提供一种小分子茶叶肽的提取方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种小分子茶叶肽的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、将茶叶加入纯化水中，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55-57℃，依次分阶段加入中性蛋白酶、端肽酶和蚕虫消化道蛋白酶，得酶解液；

步骤三、将所述酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，得小分子茶叶肽。

相对于现有技术，本发明提供的小分子茶叶肽的提取方法，利用复合蛋白酶分阶段加入，首先加入内切酶中性蛋白酶进行酶切，使蛋白酶分子量酶切均匀，还能保持茶叶中的生物碱等活性成分不被氧化，然后加入外切酶端肽酶将苦味肽上的疏水氨基酸切除，脱除苦味，最后加入蚕蛹消化道蛋白酶进一步深度酶解，三种酶协同作用，可实现对茶叶蛋白质、长链多肽不同位点、广谱性的酶切，得到分子量分布较为集中的小分子肽，提高小分子茶叶肽的提取率。本发明提取方法可操作性强，酶解得到的小分子茶叶肽分子量小，活性高，小分子茶叶肽的提取率可达到90％以上，相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子肽在提取的多肽中占比达到90％以上，分子量为180-500道尔顿的小分子肽在提取的多肽中占比可达到70％以上。

本发明中加入的蚕虫消化道蛋白酶是取自蚕虫消化道的蛋白酶，由多种蛋白酶组成，蚕虫以树叶为生，主食桑叶，可以昼夜不停地吃桑叶，所以生长非常快，也说明蚕虫对叶类物质具有较强的消化吸收能力，蚕虫消化道蛋白酶可以对茶叶蛋白多个位点进行更加高效、广谱地酶切，经蚕虫消化道蛋白酶分解的蛋白，可以产生大量、种类繁多的小分子量的多肽，使提取的小分子茶叶肽具有更高的活性。

本发明中提取率是指提取的小分子茶叶肽在茶叶中总蛋白质中所占的比例。

本发明中所述中性蛋白酶为枯草杆菌中性蛋白酶。

优选的，步骤一中，所述纯化水的加入量为茶叶重量的7-8倍。

优选的，步骤一中，所述煎煮的温度为90-95℃，煎煮时间为1-2h。

优选的煎煮步骤，有助于瓦解细胞壁，促使细胞内蛋白的溶出，缩短茶叶蛋白提取和多肽制备的时间。

优选的，步骤二中，将中性蛋白酶、端肽酶和蚕虫消化道蛋白酶依次分阶段加入的具体步骤为：首先加入茶叶重量1-1.5％的中性蛋白酶，搅拌25-35分钟后，加入茶叶重量0.3-0.5％的端肽酶，搅拌25-35分钟后，加入茶叶重量0.3-0.5％的蚕虫消化道蛋白酶，搅拌酶解3-4h。

优选的复合蛋白酶分阶段酶解的步骤，可有效酶解茶叶蛋白，提高蛋白转化为多肽的转化率，提高小分子肽的收得率，同时还能缩短酶解时间，提高生产效率。

优选的，步骤二中，搅拌速度为65-70r/min。

优选的搅拌速度可以蛋白酶充分与茶叶接触，提高酶解速率。

优选的，所述蚕虫消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将蚕虫去除虫皮和脂肪，取消化道整体，冷冻，粉碎，加入蚕虫重量8-12倍量的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，浸泡提取5-6h，离心分离，取上清液，透析除盐，冷冻干燥，得蚕虫消化道蛋白酶。

优选的蚕虫消化道蛋白的提取方法提取效率高，还能保持酶的活性。

可选的，步骤三中，将所述酶解液加热升温至90-95℃，保温10-15分钟进行酶灭活。

优选的，步骤三中分离纯化的步骤具体为：将灭活后的酶解液依次经卧螺离心机和三相离心机离心，分离，得小分子茶叶肽。

卧螺离心机适合粘稠液体的过滤，比板框过滤机效率更高，通过卧螺离心机初步过滤除去不溶物，然后通过三相离心机除去酶解液中的油脂和其它悬浮物，可以提高过滤效率，提高小分子茶叶肽的纯度。

优选的，步骤三之后还包括步骤四：将所述小分子茶叶肽经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤，得纳滤液，将所述纳滤液浓缩，干燥，得小分子茶叶肽成品。

可选的，所述干燥方式为喷雾干燥。

将分离以后得到的酶解液进一步经过经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤，可以除去酶解液中掺杂的单个氨基酸、盐类物质和少量活性较低的大分子蛋白和多肽，进一步提高小分子茶叶肽产品的纯度，获得分子量分布范围集中的小分子茶叶肽，使分子量为180-500道尔顿的肽含量达到99％以上，同时避免盐类物质造成小分子茶叶肽口感较差的问题出现，还能更好使滤液浓缩，节省后续工序浓缩时间，降低能耗。

优选的，所述卧螺离心机的转速为3500-4000r/min。

优选的转速可使酶解液的油脂和其它悬浮物与小分子多肽更好地将分离，缩短离心时间。

本发明还提供了一种小分子茶叶肽，由上述的小分子茶叶肽的提取方法制得。

本发明酶解茶叶蛋白采用复合酶分阶段酶解的方法，并结合离心技术、纳滤技术，使产品99％以上为二肽到五肽的小分子肽，无单个氨基酸和盐分，无五肽以上分子量多肽；制备的小分子茶叶肽产品能完全溶于水，口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域，能更方便的添加在食品、固体饮料、液态饮品、保健品和药品中，使人体更好的吸收。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种小分子茶叶肽的提取方法：

步骤一、选取干茶叶100g，加入700ml纯化水搅拌均匀，在90℃条件下，煎煮1h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55℃，加入1g的中性蛋白酶，搅拌25min，加入0.3g的端肽酶，搅拌35min，加入蚕虫消化道蛋白0.3g，搅拌30min，继续搅拌酶解3.0h，酶解过程始终保持搅拌器转速为68转/分钟，得酶解液；

步骤三、将所述酶解液升温至90℃，灭酶15分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3600r/min；再用三相离心机过滤纯化，去除不溶物，得离心液；

步骤四、将所述离心液经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩；浓缩液喷雾干燥后，得到小分子茶叶肽产品。

其中，所述蚕虫消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将蚕虫去除虫皮和脂肪，取消化道整体，与-15℃冷冻，粉碎为200目，加入蚕虫重量8倍量的PH6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，浸泡提取5h，采用高速离心机以5000r/min的转速进行离心分离，取上清液，采用超滤装置透析除盐，于-10℃冷冻干燥，得蚕虫消化道蛋白酶。

本实施例小分子茶叶肽的提取率可达到91.6％，产品中相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽含量为99.5％。

实施例2

一种小分子茶叶肽的提取方法：

步骤一、选取干茶叶1000g，加入7500ml纯化水搅拌均匀,在92℃条件下，煎煮1.5h；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至56℃，加入12g的中性蛋白酶，搅拌30min后，加入4g的端肽酶，搅拌25min，加入蚕虫消化道蛋白4g，搅拌25min，继续搅拌酶解3.5h，酶解过程始终保持搅拌器转速为68转/分钟，得酶解液；

步骤三、将所述酶解液升温至92℃，灭酶12分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为4000r/min；然后再用三相离心机过滤纯化，去除不溶物；

步骤四、将所述离心液经经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩；浓缩液喷雾干燥后，得到小分子茶叶肽产品。

其中，所述蚕虫消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将蚕虫去除虫皮和脂肪，取消化道整体，与-20℃冷冻，粉碎为200目，加入蚕虫重量10倍量的PH6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，浸泡提取5.5h，采用高速离心机以6000r/min的转速进行离心分离，取上清液，采用超滤装置透析除盐，于-15℃冷冻干燥，得蚕虫消化道蛋白酶。

本实施例小分子茶叶肽的提取率可达到94.7％，产品中相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽含量为99.4％。

实施例3

一种小分子茶叶肽的提取方法：

步骤一、选取干茶叶100kg，加入800L纯化水搅拌均匀，在95℃条件下，煎煮2.0h；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至57℃，加入1.5kg的中性蛋白酶，搅拌35min后，加入500g的端肽酶，搅拌30min，加入蚕虫消化道蛋白500g，搅拌35min，继续搅拌酶解4.0h，酶解过程始终保持搅拌器转速为68转/分钟，得酶解液；

步骤三、将所述酶解液升温至95℃，灭酶10分钟；然后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3500r/min；再用三相离心机过滤纯化，去除不溶物，得离心液；

步骤四、将所述离心液经经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩，浓缩液喷雾干燥后，得到小分子茶叶肽产品。

其中，所述蚕虫消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将蚕虫去除虫皮和脂肪，取消化道整体，与-15℃冷冻，粉碎为200目，加入蚕虫重量12倍量的PH6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，浸泡提取6h，采用高速离心机以8000r/min的转速进行离心分离，取上清液，采用超滤装置透析除盐，于-10℃冷冻干燥，得蚕虫消化道蛋白酶。

本实施例小分子茶叶肽的提取率可达到93.5％，产品中相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽的含量为99.6％。

实施例4

一种小分子茶叶肽的提取方法：

步骤一、选取干茶叶100kg，加入800L纯化水搅拌均匀，在95℃条件下，煎煮2.0h；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至57℃，加入1.5kg的中性蛋白酶，搅拌35min后，加入500g的端肽酶，搅拌30min，加入蚕虫消化道蛋白500g，搅拌35min，继续搅拌酶解4.0h，酶解过程始终保持搅拌器转速为68转/分钟，得酶解液；

步骤三、将所述酶解液升温至95℃，灭酶10分钟；然后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3500r/min；再用三相离心机过滤纯化，去除不溶物，得离心液；将所述离心液用双效浓缩器进一步浓缩，浓缩液喷雾干燥后，得到小分子茶叶肽产品。

本实施例小分子茶叶肽的提取率可达到93.8％，相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽在提取的多肽中的占比为72.1％，产品中肽含量为88.4％。

对比例1

本对比例提供一种小分子茶叶肽的提取方法，提取方法与实施例4相同，不同的是步骤二为：将所述煎煮混合物降温至57℃，加入1.5kg的中性蛋白酶，搅拌35min后，加入500g的端肽酶，搅拌30min，加入500g木瓜蛋白酶继续搅拌酶解4.5h，酶解过程始终保持搅拌器转速为68转/分钟。

本对比例中小分子茶叶肽的提取率为72.67％，相对分子质量500-180的小分子肽在提取的多肽中的占比为56.8％，产品中肽含量为80.4％。

对比例2

本对比例提供一种小分子茶叶肽的提取方法，提取方法与实施例4相同，不同的是步骤二为：将所述煎煮混合物降温至57℃，加入1.5kg的中性蛋白酶，搅拌35min后，加入500g的复合风味蛋白酶Flavourzyme，搅拌30min，加入500g蚕虫消化道蛋白继续搅拌酶解4.5h，酶解过程始终保持搅拌器转速为68转/分钟。

本对比例中小分子茶叶肽的提取率为83.34％，相对分子质量500-180的小分子肽在提取的多肽中的占比为53.5％，产品中肽含量为84.5％。

综上所述，本发明采用中性蛋白酶、端肽酶和蚕虫消化道蛋白酶复合酶对茶叶蛋白进行靶向酶解，并结合离心技术、纳滤技术，使得制备的茶叶肽产品的纯度高，肽分子量为180-500道尔顿的肽含量可达到99％以上，且生产周期短，生产成本低，制备过程不产生任何有毒有害物质，制备的茶叶肽产品能完全溶于水，口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域，具有广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将茶叶加入纯化水中，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55-57℃，依次分阶段加入中性蛋白酶、端肽酶和蚕虫消化道蛋白酶，得酶解液；

步骤三、将所述酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，得小分子茶叶肽。

2.如权利要求1所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，步骤一中，所述纯化水的加入量为茶叶重量的7-8倍；和/或

所述煎煮的温度为90-95℃，煎煮时间为1-2h。

3.如权利要求1所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，步骤二中，将中性蛋白酶、端肽酶和蚕虫消化道蛋白酶依次分阶段加入的具体步骤为：首先加入茶叶重量1-1.5％的中性蛋白酶，搅拌25-35分钟，加入茶叶重量0.3-0.5％的端肽酶，搅拌25-35分钟，加入茶叶重量0.3-0.5％的蚕虫消化道蛋白酶，搅拌酶解3-4h。

4.如权利要求3所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，搅拌速度为65-70r/min。

5.如权利要求1或3所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，所述蚕虫消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将蚕虫去除虫皮和脂肪，取消化道整体，冷冻，粉碎，加入蚕虫重量8-12倍量的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，浸泡提取5-6h，离心分离，取上清液，透析除盐，冷冻干燥，得蚕虫消化道蛋白酶。

6.如权利要求1所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，步骤三中，将所述酶解液加热升温至90-95℃，保温10-15分钟进行酶灭活。

7.如权利要求1所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，步骤三中分离纯化的步骤具体为：将灭活后的酶解液依次经卧螺离心机和三相离心机离心，分离，得小分子茶叶肽。

8.如权利要求7所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，步骤三之后还包括步骤四：将所述小分子茶叶肽经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤，得纳滤液，将所述纳滤液浓缩，干燥，得小分子茶叶肽成品。

9.如权利要求7所述的小分子茶叶肽的提取方法，其特征在于，所述卧螺离心机的转速为3500-4000r/min。

10.一种小分子茶叶肽，其特征在于，所述小分子茶叶肽由权利要求1-9任一项所述的小分子茶叶肽的提取方法制得。