CN109293750A - 一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白sbp及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于细菌性抗原技术领域，公开了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP及其制备方法及应用；核苷酸序列为SEQ ID NO:1；氨基酸序列为SEQ ID NO:2；重组表达载体包含核苷酸序列SEQ ID NO:1。本发明采用pGEX‑6p‑1载体来构建重组表达质粒，表达重组蛋白SBP，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体，其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽‑S‑转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

Description

一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于细菌性抗原技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP及其制备方法及应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，为非发酵菌中的假单胞菌属，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，在医院病房及医疗器械中也普遍存在，是临床上最为常见的条件致病菌之一。目前在全球范围内，该菌已成为ICU病房、烧伤、战创伤感染，机械通气相关肺炎(VAP)分离率最高的病原菌之一。PA感染可发生在人体任何部位和组织，如烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等，也可引起心内膜炎、胃肠炎、肺炎甚至败血症等全身感染，全身感染死亡率超过20％。此外，由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。耐药性日趋严重，中国耐药菌监测网(CHINET)资料显示，2017年PA对亚胺培南和美罗培南的年度耐药率分别为23.6％和20.9％，而呼吸机相关性肺炎患者检出的菌株对二者的耐药率更高。正是由于上述原因，2017年WHO发布的《全球抗生素耐药细菌优先性列表》中将PA列为第最危急级别。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫，

综上所述，现有技术存在的问题是：由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择，但目前还未见有上市的铜绿假单胞菌疫苗。研究疫苗的关键是寻找到免疫原性和免疫保护效果好的抗原。

解决上述技术问题的难度和意义：基因工程亚单位疫苗通过基因工程的手段，将病原体的致病因子或其突变体的基因克隆至的蛋白表达载体，重组子在工程菌内进行大规模表达，经过纯化后制备成基因工程亚单位疫苗。该疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等有点，已成为疫苗研发的重要方向。研发基因工程疫苗的关键是如何从成千上万的病原体蛋白质组中筛选到良好的保护性抗原分子。本发明人研究团体采用反向疫苗学的技术，从铜绿假单胞菌全基因组编码的五千多个开放读码框中筛选出了重组蛋白SBP，发现它具有良好的免疫原性和免疫保护效果，这为下一步开发铜绿假单胞菌疫苗等免疫调控手段具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP及其制备方法及应用。

本发明是这样实现的，一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP，所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；氨基酸序列为SEQ IDNO:2。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的重组表达载体，所述重组表达载体包含核苷酸序列SEQ ID NO:1。

本发明的另一目的在于提供一种导入所述重组表达载体的宿主菌。

本发明的另一目的在于提供一种与所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP配合使用的氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂。

本发明的另一目的在于提供一种所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的制备方法，所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的制备方法包括以下步骤：

步骤一，取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-1-SBP/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取10mL一次活化的菌液加入到1000mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时；

步骤二，加入200μLIPTG置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加50mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min，收集上清与10ml用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose4B凝胶珠结合处理；

步骤三，向余下约10mL已结合蛋白的Glutathione Sepharose4B中加入10ml PBS和2PreScission protease，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后取20μL样品变性处理，上样10μL进行蛋白电泳，在呈相系统下观察结果，酶切下来的SBP蛋白分子量～26kDa，与预期蛋白分子量大小相符合。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过反向疫苗学技术和免疫蛋白组学技术，从铜绿假单胞菌的五千多个蛋白质中，首次发现PA基因(PA5505)编码的ABC转运复合物底物结合蛋白ABC transportersubstrate-bindingprotein(SBP)具有良好的免疫原性和免疫保护效果，具体表现在SBP免疫小鼠产生的抗体效价几何平均滴度为1:47200，抗体阳性率达到100％；此外，在致死性PA感染肺炎模型中SBP免疫表现出的保护率高达73.3％。这些数据说明SBP是良好的PA基因工程疫苗候选抗原。本发明采用基因工程技术克隆表达此重组蛋白，便于分离纯化，可直接与佐剂(如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。

本发明采用pGEX-6p-1载体来构建重组表达质粒，表达重组蛋白SBP，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体，其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

本发明的基因工程重组SBP蛋白具有以下优点：

1)重组SBP蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体和具有免疫保护效果；利用本发明重组SBP蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经动物实验证实，所述SBP诱导的免疫应答具有良好的抗PA感染的保护效果。

2)重组SBP蛋白可在原核表达系统－大肠杆菌中表达，成本低，产量高；

3)选择pGEX载体系列时，SBP重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，使得纯化的SBP蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

附图说明

图1是本发明实施例提供的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的SBP基因片段的PCR扩增结果示意图；

图中：泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；；泳道2：目的基因片段SBP(～720bp)。

图3是本发明实施例提供的重组质粒pGex-6p-1-SBP的双酶切鉴定结果示意图；

图中：泳道1：核酸(DNA)分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2～6：重组表达质粒pGEX-6p-1-SBP经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约720bp。

图4是本发明实施例提供的蛋白SBP诱导鉴定结果示意图；

图中：泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道2：结合诱导表达的超声上清的GST填料；泳道3：经PP酶酶切后的上清；泳道4：经PP酶酶切后的GST填料。

图5是本发明实施例提供的纯化后的蛋白SBPSDS-PAGE电泳结果示意图；

图中：泳道1：蛋白分子量标准(Marker)，从上到下大小分别为：130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、15kDa、10kDa；泳道2：纯化的SBP蛋白。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升的问题。本发明采用基因工程技术克隆表达此重组蛋白，便于分离纯化，可直接与佐剂(如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP祛除了该蛋白的信号肽和跨膜区，截取了SBP片段(Ala22-Phe260)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明还提供一种用于表达SBP的重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述SBP重组蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:1。

本发明还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。

本发明采用基因工程技术克隆表达此重组蛋白，便于分离纯化，可直接与佐剂(如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。

如图1所示，本发明实施例提供的铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的制备方法包括以下步骤：

S101：取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-1-SBP/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取10mL一次活化的菌液加入到1000mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时；

S102：加入200μLIPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加50mL lysis buffer(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与10ml用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理；

S103：向余下约10mL已结合蛋白的Glutathione Sepharose4B中加入10ml PBS和2PreScissionprotease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后取20μL样品变性处理，上样10μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的SBP蛋白分子量～26kDa，与预期蛋白分子量大小相符合。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

本发明所使用的菌株与各种试剂如下：

1.铜绿假单胞菌菌株

铜绿假单胞菌国际标准株PA01由美国ATCC提供(BAA-47^TM)，临床菌株PAXN-1来自中国典型培养物保藏中心(保藏号：CCTCC M 2015730)。

2.试剂

质粒pGEX-6p-1、大肠杆菌菌株XL-1blue为发明人所在单位保存，primeSTAR HSDNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和EcoR I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；

T4DNA Ligase为Fermentas公司产品；

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose4B为美国GE Healthcare公司产品。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1：SBP基因的克隆和重组质粒pGEX-6P-1-SBP的构建

1.首先根据铜绿假单胞菌PA01的SBP蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，确定需要扩增的SBP目的基因片段。

2.根据分析结果，采用PCR方法自PA01基因组扩增SBP目的基因片段，扩增步骤如下：

1)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO：3-4(下划线示酶切位点碱基序列)

2)-80℃冷冻库中取出保存的铜绿假单胞菌菌株PA01涂布于LB固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提PA01基因组。

3)以PA01全基因组DNA为模板PCR扩增SBP基因片段

PCR体系：

PCR扩增反应条件98℃预变性5min，98℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图2中。

4)使用凝胶回收试剂盒回收SBPPCR产物。

3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：

1)BamH I和EcoR I酶切pGEX-6p-1质粒和SBPPCR产物

酶切反应体系：

37℃酶切2h。

2)使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6p-1质粒和经BamH I和EcoR I酶切的PCR产物。

3)连接和转化

通过紫外分光光度计测定SBP酶切回收产物核酸浓度：32ng/μl，pGEX-6p-1酶切回收产物核酸浓度：63ng/μl。

连接反应体系：

混匀，16℃连接2h。

4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1-blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6p-1质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ulLB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。

各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取200μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

5)pGEX-6p-1-SBP阳性重组质粒的筛选、鉴定

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

③质粒DNA进行BamH I和EcoR I双酶切；

双酶切反应体系：

37℃酶切2h；

④1％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图3，可见泳道2样品为构建成功的pGEX-6p-1-SBP重组质粒；

⑤pGEX-6p-1-SBP重组质粒送往上海生工公司测序，测序结果比GeneBank序列信息比对，结果发现二者的序列核苷酸序列完全相同。

实施例2：重组融合蛋白SBP在原核表达系统－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

1.SBP诱导表达

1)取过夜培养的pGEX-6p-1-SBP/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp+抗性的LB培养基中，180rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mL Amp+抗性的LB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2～3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG 4μL(1mol/L)，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃诱导表达3h。

2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mLlysisbuffer(20mM PB，pH 7.2，250mMNacl)混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心15min，分离上清和沉淀。

2.处理上清

取Glutathione Sepharose4B20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的Glutathione Sepharose4B加入20μL 2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。

3.SBP目的蛋白的酶切

同样方法制备结合目的蛋白的Glutathione Sepharose4B填料，在填料中加入100μLPBS和20μLPreScissionprotease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，取10μL样品变性处理，上样5μL进行蛋白电泳。余下填料用100μL PBS洗涤3次，然后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳。

4.SDS-PAGE电泳

将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。将处理好的样品分别取5μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1～2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像系统下观察结果，PGEX-6p-1-SBP/XL-1blue在30℃中以可溶性的形式表达(图4，泳道3)。

实施例3：SBP抗原的制备

1.放大培养获取蛋白

取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-1-SBP/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取10mL一次活化的菌液加入到1000mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时，加入200μLIPTG(终浓度为200μM)置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加50mL lysis buffer(同实施例2)重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与10ml用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose4B(GE公司)凝胶珠(beads)结合处理。

2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取SBP目的蛋白

向余下约10mL已结合蛋白的Glutathione Sepharose4B中加入10ml PBS和2PreScissionprotease(PP酶，GE公司)，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后取20μL样品变性处理，上样10μL进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的SBP蛋白分子量～26kDa，与预期蛋白分子量大小相符合，见图5。

实施例4：动物的免疫

1)首次免疫，用PBS稀释SBP抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃；用5号半型针头，双侧大腿肌肉注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上；

3)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与首次免疫相同，免疫途径同上；

实施例5：抗体的检测

第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后抗原特异性IgG应答水平。

1.制备液体

1)包被液的配制：称取Na₂CO₃1.6g，NaHCO₃2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6；

2)封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

3)抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500μL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

4)洗涤液的制备：同抗体稀释液；

5)显色液(TMB)，为天根公司产品；

6)终止液(2MH₂SO₄)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2.ELISA检测SBP重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

1)用包被液将纯化后的SBP重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；

2)包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，100μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

3)封闭：酶标板加封闭液200μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

4)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；

5)取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤3遍，空干；

6)将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

7)加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱40min，洗涤三遍，空干；

8)加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应5min；

9)加入终止液(2MH₂SO₄)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

10)结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。

结果：SBP蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价几何平均滴度为1:47200；末次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的SBP重组蛋白具有良好的免疫原性。

实施例6：SBP重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价

SBP重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价按照参考文献：Gao Chen等ClinImmunol2017，183，354-363进行。简要地说，SBP末次免疫后10～14天，用生理盐水将准备PAXN-1菌液并调节浓度至1.5×10¹⁰CFU/mL，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μL，采用同样剂量的生理盐水(NS)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以CO₂吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。

表1SBP重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果

表1显示：阴性对照组和空白对照组的存活率为分别为16.7％和10.0％，重组融合蛋白SBP加Al(OH)₃佐剂组的存活率为73.3％，通过公式计算得到SBP的保护率为70.3％。因此，本发明的SBP重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对PAXN-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 重庆艾力彼生物科技有限公司

<120> 一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP及其制备方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 1

gccgagtccc tcaccgtcgc ggccaccccg gtgccgcacg cggagatcct caacgtggtc 60

aagccgctgc tggccaagga aggcgtggac ctgaagatca aggagttcac cgactacgtg 120

cagccgaacg tgcaggtctc ggaaaagcgc ctggacgcca acttcttcca gcaccagccg 180

tacctcgatg agttcaacaa ggccaagggc accgacctgg tcgccgtgac cggcgtacac 240

atcgagccgc tgggcgccta ctcgagcaag tacaagaagc tcgacgaact gccttccggc 300

gctaccgtgg tgattcccaa cgacgccacc aacggcggcc gcgccctgct cctgctggac 360

aaggccgggg tgatcaagct caaggacaac aagagcatca ccgccacgcc gaaggacatc 420

gtcgacaatc cgaagaacat caagatccgc gaactggaag ccgcgaccct gccgcgcgtg 480

ctgacccagg tcgacatggc gctgatcaat accaactacg ccctggaagc caagctgaac 540

ccaaccaagg atgcgctggc catcgaaggc agcgactcgc cctacgtgaa catcctcgtc 600

gcgcggccgg acaacaagga cagcgacgcc atgcagaagc tggccaaggc cctgcacagc 660

gccgagatca agcagttcat ccaggagaag tacaaaggcg cggtggtacc ggcgttc 717

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 2

Ala Glu Ser Leu Thr Val Ala Ala Thr Pro Val Pro His Ala Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Val Val Lys Pro Leu Leu Ala Lys Glu Gly Val Asp Leu Lys

20 25 30

Ile Lys Glu Phe Thr Asp Tyr Val Gln Pro Asn Val Gln Val Ser Glu

35 40 45

Lys Arg Leu Asp Ala Asn Phe Phe Gln His Gln Pro Tyr Leu Asp Glu

50 55 60

Phe Asn Lys Ala Lys Gly Thr Asp Leu Val Ala Val Thr Gly Val His

65 70 75 80

Ile Glu Pro Leu Gly Ala Tyr Ser Ser Lys Tyr Lys Lys Leu Asp Glu

85 90 95

Leu Pro Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Pro Asn Asp Ala Thr Asn Gly

100 105 110

Gly Arg Ala Leu Leu Leu Leu Asp Lys Ala Gly Val Ile Lys Leu Lys

115 120 125

Asp Asn Lys Ser Ile Thr Ala Thr Pro Lys Asp Ile Val Asp Asn Pro

130 135 140

Lys Asn Ile Lys Ile Arg Glu Leu Glu Ala Ala Thr Leu Pro Arg Val

145 150 155 160

Leu Thr Gln Val Asp Met Ala Leu Ile Asn Thr Asn Tyr Ala Leu Glu

165 170 175

Ala Lys Leu Asn Pro Thr Lys Asp Ala Leu Ala Ile Glu Gly Ser Asp

180 185 190

Ser Pro Tyr Val Asn Ile Leu Val Ala Arg Pro Asp Asn Lys Asp Ser

195 200 205

Asp Ala Met Gln Lys Leu Ala Lys Ala Leu His Ser Ala Glu Ile Lys

210 215 220

Gln Phe Ile Gln Glu Lys Tyr Lys Gly Ala Val Val Pro Ala Phe

225 230 235

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatccg ccgagtccct caccgtc 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggaattcg aacgccggta ccaccg 26

Claims (5)

1.一种铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP，其特征在于，所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的核苷酸序列为SEQ ID NO:1；氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.一种包含权利要求1所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含核苷酸序列SEQ ID NO:1。

3.一种导入权利要求2所述重组表达载体的宿主菌。

4.一种与权利要求1所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP配合使用的氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂。

5.一种如权利要求1所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的制备方法，其特征在于，所述铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白SBP的制备方法包括以下步骤：

步骤一，取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6p-1-SBP/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的LB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5～6h后，取10mL一次活化的菌液加入到1000mL含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3～4h至OD600为1.0时；

步骤二，加入200μLIPTG置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体，再加50mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min，收集上清与10ml用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose4B凝胶珠结合处理；

步骤三，向余下10mL已结合蛋白的Glutathione Sepharose4B中加入10ml PBS和2PreScission protease，室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后取20μL样品变性处理，上样10μL进行蛋白电泳，在呈相系统下观察结果，酶切下来的SBP蛋白分子量～26kDa，与预期蛋白分子量大小相符合。