CN108840913A - 一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白apjl_0922及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922及其应用。本发明胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该免疫保护性抗原蛋白由273个氨基酸组成，其成熟多肽部分为20‑273位氨基酸。编码该免疫保护性抗原蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。本发明的免疫保护性抗原蛋白具有很好的免疫原性和免疫保护作用强，其具有制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的试剂盒的应用、制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗的应用、制备用于预防由胸膜肺炎放线杆菌引起的疾病的药物的应用。本发明为制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗提供了新的材料，对猪胸膜肺炎的防制具有重要意义。

Description

一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922及其 应用

技术领域

本发明涉及动物传染病亚单位疫苗制备技术领域，具体涉及一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922及其应用。

背景技术

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)是一种革兰氏阴性菌小杆菌，是引起猪胸膜肺炎的病原菌。猪胸膜肺炎是一种高度接触传染的呼吸道疾病，以急性出血性、纤维素性、坏死性支气管肺炎和纤维素性胸膜炎为主要特征，自1957年Pattison等首次报道以来，该病已遍布全球多个国家和地区，严重阻碍养猪业的健康发展。

疫苗免疫是预防和控制猪胸膜肺炎的有效手段。猪胸膜肺炎亚单位疫苗通常是以经鉴定的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白为基础，通过适当处理制成的疫苗制剂。亚单位疫苗使用安全，能激发动物产生高水平抗目的抗原蛋白的抗体，为动物提供一定的保护。但是目前，可被人们用来生产猪胸膜肺炎亚单位疫苗的免疫保护性抗原蛋白数量较少，很大程度上限制了猪胸膜肺炎亚单位疫苗的改进和发展。因此，发掘新的免疫保护性抗原蛋白，对开发高效猪胸膜肺炎亚单位疫苗和该病的控制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922。本发明的目的还在于提供所述免疫保护性抗原蛋白APJL_0922的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，该免疫保护性抗原蛋白由273个氨基酸组成，其成熟多肽部分为20-273位氨基酸。编码该免疫保护性抗原蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，包含所述免疫保护性抗原蛋白成熟多肽的编码序列。

一种重组工程菌，为包含所述重组表达载体的大肠杆菌。

所述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建包含所述免疫保护性抗原蛋白或其成熟多肽编码序列的重组表达载体；所述的重组表达载体的骨架载体优选为pGEX-KG。

(2)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中；所述的宿主细胞优选为大肠杆菌；

(3)培养所述经转化的宿主细胞并诱导其表达所述免疫保护性抗原；所述的培养、诱导的条件优选为：将经转化的宿主细胞在37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.7时，加入IPTG至终浓度1.0mM，37℃继续培养3-4小时。

(4)从所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化所述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原。

所述的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原能够与兔抗胸膜肺炎放线杆菌多克隆抗体进行结合反应，表明其具有很好的免疫反应性，可用于样品中胸膜肺炎放线杆菌抗体水平的测定。因此，上述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原具有制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的试剂盒的应用，所述试剂盒基于的方法包括ELISA法、蛋白印迹法、胶体金免疫法、斑点杂交法等。

所述的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原免疫小鼠后，能为小鼠感染胸膜肺炎放线杆菌提供有效的免疫保护力，表明其具有很好的免疫原性和免疫保护作用。因此，所述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原具有制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗的应用，具有制备用于预防由胸膜肺炎放线杆菌引起的疾病的药物的应用。

相应的，上述编码所述免疫保护性抗原的核苷酸、表达所述免疫保护性抗原的重组表达载体或重组工程菌，也具有这些应用：制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的试剂盒的应用，制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗的应用，制备用于预防由胸膜肺炎放线杆菌引起的疾病的药物的应用。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明的免疫保护性抗原蛋白APJL_0922的免疫原性和免疫保护作用强，用其免疫小鼠后再以6×LD₅₀剂量的胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠，存活率达90％以上；经抗APJL_0922蛋白高免血清被动免疫的小鼠，以6×LD₅₀剂量的胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠，存活率达80％以上。本发明为制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗提供了新的材料，对猪胸膜肺炎的防制具有重要意义。

附图说明

图1是表达载体pGEX-KG-APJL_0922的酶切鉴定图。泳道M：DL15000 DNA marker；泳道1：质粒pGEX-KG-APJL_0922BamHI/HindIII酶切。

图2是工程菌表达目的蛋白APJL_0922的SDS-PAGE检测图。泳道M：预染的蛋白质marker；泳道1：大肠杆菌/pGEX-KG空载体全菌裂解液；泳道2：大肠杆菌/pGEX-KG-APJL_0922菌体裂解沉淀；泳道3：大肠杆菌/pGEX-KG-APJL_0922菌体裂解上清；泳道4：大肠杆菌/pGEX-KG-APJL_0922全菌裂解液。

图3是免疫印迹分析目的蛋白的结果图。A图为APJL_0922纯化后的SDS-PAGE图，B图为转膜后免疫印迹图。泳道M：预染的蛋白质marker；泳道1：纯化的GST蛋白；泳道2：纯化的APJL_0922蛋白。箭头所示为APJL_0922蛋白免疫印迹显色条带。

图4是APJL_0922蛋白的免疫保护力结果图。A图为APJL_0922免疫后攻毒小鼠存活率图，B图为抗APJL_0922多克隆抗体被动免疫小鼠攻毒后小鼠存活率图。感染后72h至观察期结束，小鼠存活率未发生变化。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 APJL_0922蛋白的表达

一、胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA的提取

取1mL过夜培养的胸膜肺炎放线杆菌(JL03)的菌液，12000rpm离心1分钟，弃去上清，然后按照基因组提取试剂盒(武汉博越生物技术有限公司)说明书提取JL03菌株的基因组。具体流程如下：在菌体沉淀中加入200μL RB重悬，10000rpm离心30秒，弃上清，再加入200μL RB重悬沉淀，然后，在离心管中加入20μL溶菌酶剧烈震荡，并放于37℃温箱中温育15分钟，之后再加入200μL结合液CB，颠倒混匀后加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，放于70℃水浴锅中反应10分钟，拿出冷却后加入100μL异丙醇，颠倒混匀，然后将离心管中的所有物质转入吸附柱中，10000rpm离心30秒，倒掉废液，再加入500μL IR，12000rpm离心30秒，弃废液，接着加入700μL WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液，再加入500μL WB，12000rpm离心30秒，弃废液，然后13000rpm离心2分钟，取出吸附柱，放入新的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL EB，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟，所得溶液即基因组，放入-20℃储存备用。

二、APJL_0922基因的制备

根据APJL_0922基因的核苷酸序列(如序列表的SEQID NO.2所示)，设计如下引物：

正向引物：5’-TGGGATCCTGTAAAGAAGAGAAGAAAGC-3’，

反向引物：5’-GGAAGCTTTTACCAACCTTTTATCACAC-3’。

正向引物的下划线部分为BamHI酶切位点，反向引物的下划线部分为HindIII酶切位点。以胸膜肺炎放线杆菌JL03基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增，获得APJL_0922成熟多肽编码序列。扩增体系如下：

PCR反应条件为：预变性：94℃5分钟；循环：94℃30秒，53℃30秒，72℃1分钟，30个循环；最后延伸：72℃10分钟；16℃2分钟。

用1％琼脂糖凝胶检测PCR产物的片段大小和产量，并用DNA纯化试剂盒(武汉博越生物科技有限公司)纯化PCR产物。具体方法如下：PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，将凝胶放在切胶台上，打开紫外灯，用刀片将目的片段切下，置于无菌的1.5mL离心管中，加入300μL的溶胶液，56℃水浴5分钟，期间多次震荡，待胶块完全溶化，将溶液转入吸附柱中，8000rpm离心1分钟，倒掉废液，加入700μL漂洗液，8000rpm离心1分钟，弃掉废液，一共漂洗2次，之后，12000rpm离心1分钟，将吸附柱放入新的离心管中，在吸附膜的中间部位加入30μL灭菌去离子水，65℃水浴2分钟，12000rpm离心1分钟，收集液体即是纯化后的PCR产物，即为APJL_0922成熟蛋白的编码基因片段。

三、重组表达载体的构建

(1)将目的基因与A/T克隆载体pMD18-T连接：将回收到的PCR产物连接到pMD18-T载体上，连接体系为：

回收产物	16μL
		pMD18-T	1μL
10×T4 DNA Buffer	2μL
		T4 DNA连接酶	1μL

混匀后用封口膜封口，标记为pMD18-T-APJL_0922连接产物，置16℃水浴锅中连接过夜。

(2)连接产物的转化和质粒的鉴定

将pMD18-T-APJL_0922连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化方法为：取10μL连接产物加到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀后冰浴20分钟，42℃水浴热激90秒之后，迅速冰浴2分钟，然后加入500μL LB液体培养基，37℃220rpm摇床培养1小时，然后7000rpm离心3分钟，丢弃上清500μL，用剩余培养基重悬菌体，均匀涂于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃温箱培养过夜。然后挑取单菌落，接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12小时。

通过碱裂解法提取质粒：将菌液转入1.5mL离心管中，12000rpm离心1分钟，弃去上清。加入100μL预冷的溶液I，重悬菌体，置于冰上；加入200μL溶液II，颠倒混匀5-6次，冰浴10分钟；加入150μL预冷的溶液III，颠倒混匀5-6次，冰浴10分钟，12000rpm离心10分钟。将上清转移至新的离心管，并加入400μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，12000rpm离心10分钟，弃去上清，加入200μL去离子水，溶解沉淀，然后加入100μL 7.5mol/L的醋酸铵，颠倒混匀后，冰浴10分钟。12000rpm离心10分钟。然后将上清转移到一个新的离心管中，加入300μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。然后12000rpm离心10分钟，弃去上清，加入200μL75％乙醇，12000rpm离心2分钟，吸弃上清，加入20μL含有RNA酶的水，溶解沉淀，得到质粒。然后通过双酶切法进行鉴定，酶切体系如下：

质粒DNA	1.0μL
		10×K Buffer	1.0μL
BamHI(20U/μL)	0.2μL
		HindIII(20U/μL)	0.2μL
ddH2O	7.6μL

37℃反应1小时后，加入终止液，混匀后取5μL样品，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，将含有正确插入片段的质粒命名为pMD18-T-APJL_0922。通过双向测序分析目的基因序列的正确性。

(3)重组表达质粒的构建与鉴定

使用BamHI和HindIII双酶切质粒pMD18-T-APJL_0922，经琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段，并与经过同样酶切处理的原核表达质粒pGEX-KG连接，连接反应体系如下：

目的片段	12μL
		pGEX-KG	5μL
10×T4 DNA Buffer	2μL
		T4 DNA连接酶	1μL

混匀后用封口膜封口，标记为pGEX-KG-APJL_0922，连接产物16℃反应过夜后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化方法、单菌落挑取培养、质粒制备方法同上述pMD18-T-APJL_0922质粒的构建。用BamHI和HindIII双酶切质粒pGEX-KG-APJL_0922之后，得到目的片段和载体大小与预期相符(图1)。

四、工程菌株的制备

将鉴定正确的pGEX-KG-APJL_0922质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养后，挑取单菌落，37℃培养12小时，得到含有pGEX-KG-APJL_0922的重组菌，即为工程菌。同时，用pGEX-KG载体代替pGEX-KG-APJL_0922质粒，步骤同上，得到含有pGEX-KG的重组菌，用作为对照。

五、APJL_0922蛋白的制备和纯化

(1)将以上“四”中制备的工程菌培养于100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养3小时，至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mM，37℃继续培养3小时。

(2)5000rpm离心10分钟收集菌体，将所得菌体用20mL PBS溶液重悬，用高压破碎仪破碎菌体，取样之后12000rpm离心10分钟，分别收集上清和沉淀，取样经SDS-PAGE检测APJL_0922蛋白的表达情况。如图2，SDS-PAGE电泳显示APJL_0922蛋白分子量约为53kDa(包含GST标签)，GST对照蛋白分子量约为26kDa，APJL_0922主要在细菌裂解上清中。然后，将上清加入到谷胱甘肽亲和层析柱，结合完毕后，加20mL PBS洗涤亲和层析柱，然后加入5mL还原型谷胱甘肽溶液洗脱目的蛋白，并将洗脱液收集于1.5mL洁净离心管中，得到纯化的重组APJL_0922蛋白。再依次加入20mL洗脱液、20mL PBS洗涤层析柱，最后用10mL 20％乙醇浸泡保存层析柱。

(3)按上述方法从含有pGEX-KG的重组菌中提取并纯化对照蛋白GST，并通过SDS-PAGE检测纯化的APJL_0922和GST蛋白(图3A)。

六、APJL_0922蛋白的免疫印迹法鉴定

对以上“五”中纯化的重组APJL_0922蛋白进行免疫印迹法分析，方法如下：首先，制备12％的聚丙烯酰胺凝胶，将APJL_0922和GST蛋白点样，进行SDS-PAGE电泳分离。电泳结束后，测量需要转膜的凝胶大小，然后裁剪4张等大的滤纸和1张稍大的硝酸纤维素滤膜，按照：黑色夹板-海绵垫-两层滤纸-凝胶-滤膜-两层滤纸-海绵垫-白色夹板的顺序，安装转膜装置，每铺一层，用玻璃棒赶走气泡；接通电源，80V恒压转印30分钟。转印结束后将硝酸纤维素滤膜取下，用含5％脱脂牛奶的封闭液常温封闭1小时；取出滤膜，用洗涤液洗涤3次，每次5分钟；然后加入用洗涤液以1:400稀释的兔抗胸膜肺炎放线杆菌多克隆抗体，37℃孵育30分钟；取出滤膜，用洗涤液洗涤4次，每次5分钟；然后加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30分钟；取出滤膜，用洗涤液洗涤5次，每次5分钟；然后用DAB显色试剂盒显色。结果表明，APJL_0922蛋白泳道出现与预期一致的显色条带，而GST蛋白没有出现条带，如图3B所示。

实施例2 APJL_0922蛋白免疫保护性的鉴定

(1)小鼠的主动免疫与攻毒

以实施例1中纯化的APJL_0922蛋白和GST蛋白分别免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，每组12只。同时设置TSB空白对照，不进行免疫。第一次免疫剂量为80μg/只，与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，于小鼠背部皮下多点注射接种。间隔两周后，进行第二次免疫，剂量为80μg/只，与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化，于小鼠背部皮下多点注射接种，10天后，用ELISA检测抗体水平，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗(1:5000稀释)。小鼠抗APJL_0922蛋白的抗体效价达1:3.7×10⁴。二免后14天，进行攻毒测试，以6×10⁶CUF/只(6×LD₅₀)剂量的血清1型胸膜肺炎放线杆菌4074株经腹腔注射感染各组小鼠，连续观察7天，记录各组小鼠的发病及死亡情况。如图4A所示，APJL_0922免疫组小鼠存活率为92％，GST免疫组及TSB空白对照组小鼠存活率为0％。

(2)小鼠的被动免疫与攻毒

在上一步主动免疫中，收集各组二次免疫后10天的小鼠血清，组内混合。然后经腹腔注射法，分别接种6周龄雌性BALB/c小鼠(购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，每组12只，每只接种50μL，进行被动免疫接种。于接种后3小时，通过腹腔注射法，以6×10⁶CUF/只剂量的血清1型胸膜肺炎放线杆菌4074株经腹腔注射感染各组小鼠，连续观察7天，记录各组小鼠的发病及死亡情况。如图4B所示，抗APJL_0922蛋白的免疫血清组小鼠存活率为83％，抗GST蛋白的免疫血清和TSB空白血清组小鼠存活率为0％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中师范大学

<120> 一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

<400> 1

Met Asn Phe Lys Lys Val Leu Gly Val Ala Leu Val Ser Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Thr Gly Cys Lys Glu Glu Lys Lys Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gln

20 25 30

Ala Ala Ser Lys Ile Lys Val Gly Val Met Ser Gly Pro Glu His Thr

35 40 45

Val Ala Glu Lys Ala Ala Gln Val Ala Lys Gln Lys Tyr Gly Leu Glu

50 55 60

Val Glu Phe Val Leu Phe Asn Asp Tyr Ala Leu Pro Asn Thr Ala Val

65 70 75 80

Ser Lys Gly Asp Leu Asp Ala Asn Ala Phe Gln His Lys Pro Tyr Leu

85 90 95

Asp Lys Asp Ser Gln Ser Lys Gly Leu Thr Asn Leu Glu Ile Val Gly

100 105 110

Asn Thr Phe Val Phe Pro Leu Ala Gly Tyr Ser Lys Lys Ile Lys Asn

115 120 125

Val Ala Glu Leu Ala Glu Gly Ala Val Val Ala Val Pro Asn Asp Pro

130 135 140

Ser Asn Leu Ala Arg Ala Leu Ile Leu Leu Glu Lys Gln Gly Leu Ile

145 150 155 160

Lys Leu Lys Asp Asn Thr Asn Leu Phe Ser Thr Thr Leu Asp Ile Val

165 170 175

Glu Asn Pro Lys Lys Leu Asn Ile Lys Glu Val Asp Thr Ser Val Ala

180 185 190

Ala Lys Ala Leu Asp Asp Val Asp Leu Ala Val Val Asn Asn Thr Tyr

195 200 205

Ala Gly Gln Val Gly Leu Ser Ala Asn Asp Gly Ile Phe Val Glu Asp

210 215 220

Lys Asp Ser Pro Tyr Val Asn Ile Ile Val Ala Arg Lys Asp Asn Lys

225 230 235 240

Asp Ser Glu Ala Val Lys Asn Phe Val Lys Ser Phe Gln Thr Glu Glu

245 250 255

Val Phe Gly Glu Ala Gln Lys His Phe Lys Asp Gly Val Ile Lys Gly

260 265 270

Trp

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> Actinobacillus pleuropneumoniae

<400> 2

atgaatttta agaaagtatt gggtgtggcg ttagtgtcgg ctttggcatt aaccggttgt 60

aaagaagaga agaaagcgga tgcgcctgcg gcacaagcag cttcaaaaat taaagtcggc 120

gtaatgtccg gtccggaaca taccgttgcg gaaaaagcgg cgcaagtagc taaacaaaaa 180

tacggtttag aagttgagtt cgtattattc aatgactatg cgttaccaaa tacggcggta 240

agcaaaggcg atttagatgc gaacgctttc cagcacaaac cgtatttaga taaagacagc 300

caatcaaaag gcttaactaa ccttgaaatc gtcggtaata ctttcgtatt cccgcttgcc 360

ggttattcta aaaaaattaa aaacgttgct gagctagcgg aaggcgcggt agttgcagta 420

cctaacgacc cttcaaacct tgcgcgcgca ttaatccttt tagagaaaca aggcttaatt 480

aagttaaaag acaataccaa cctgttctca accacattag atattgttga aaatccgaaa 540

aaattaaaca ttaaagaagt agatacttca gtagcggcca aagcgttaga tgatgtggat 600

ttagcggtgg taaacaatac ttacgcaggt caagtcggtt taagtgcgaa tgacggtatt 660

tttgtagaag ataaagattc tccgtatgta aatatcattg tggcgcgcaa agacaacaaa 720

gacagcgaag cggtgaaaaa ctttgtgaaa tcattccaaa ccgaagaagt gttcggcgaa 780

gcgcaaaaac actttaaaga cggtgtgata aaaggttggt aa 822

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggatcctg taaagaagag aagaaagc 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaagctttt accaaccttt tatcacac 28

Claims (10)

1.一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白的成熟多肽，其特征在于：为SEQ ID NO.1所示序列的20-273位氨基酸。

3.编码权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白的核苷酸，其特征在于：序列如SEQ IDNO.2所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于：包含权利要求2所述的成熟多肽的编码序列。

5.一种重组工程菌，其特征在于：为包含权利要求4所述的重组表达载体的大肠杆菌。

6.一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)构建包含权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白或其成熟多肽编码序列的重组表达载体；

(2)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中；

(3)培养所述经转化的宿主细胞并诱导其表达所述免疫保护性抗原；

(4)从所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化，得到所述免疫保护性抗原蛋白或其成熟多肽。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的重组表达载体的骨架载体为pGEX-KG；

步骤(2)中所述的宿主细胞为大肠杆菌；

步骤(2)中培养、诱导的条件为：将经转化的宿主细胞在37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.7时，加入IPTG至终浓度1.0mM，37℃继续培养3-4小时。

8.权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白、权利要求2所述的成熟多肽、权利要求3所述的核苷酸、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组工程菌在制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的试剂盒中的应用。

9.权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白、权利要求2所述的成熟多肽、权利要求3所述的核苷酸、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组工程菌在制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗中的应用。

10.权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白、权利要求2所述的成熟多肽、权利要求3所述的核苷酸、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组工程菌在制备用于预防由胸膜肺炎放线杆菌引起的疾病的药物中的应用。