CN109172812B

CN109172812B - 一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法

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Publication number: CN109172812B
Application number: CN201810851697.1A
Authority: CN
Inventors: 赵雪芹; 王大巾
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Shanghai EKM Biotechnology Co ltd; Shaoxing Maimang Intelligent Technology Co ltd
Priority date: 2018-07-28
Filing date: 2018-07-28
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2038-07-28
Also published as: CN109172812A

Abstract

本发明公开了一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，由以下步骤组成：1）一层组装微囊的制备；2）二层组装微囊的制备。运用层层自组装技术固定化溶菌酶。组装材料为羧甲基淀粉钠与壳聚糖，依靠静电力先将溶菌酶与羧甲基淀粉钠组装得到一层组装微囊，再将一层组装微囊与壳聚糖组装得到二层组装微囊，这种逐层沉积的方法，靠聚合物分子间的弱相互作用，使层与层之间自发缔合并形成性能稳定、结构完整、具有特定功能的超分子结构或分子聚集体。其制备过程条件温和且工序简单，所用基体材料适用范围广，适应性强。

Description

一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药制备技术领域，具体涉及一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法。

背景技术

溶菌酶(lysozyme)是一种能水解细菌细胞壁肽聚糖的水溶性碱性蛋白酶。该酶广泛存在于多种组织中，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活；可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰氏阳性菌。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

溶菌酶是一种天然蛋白质，不会产生残留的问题，而且作为非特异性免疫因子不会使病原菌产生耐药性，是一种安全性很高的饲料酶制剂，有很好的前景。溶菌酶作为饲料添加剂对养殖动物的生长和免疫都有一定的影响。溶菌酶自身的抗菌、抗病毒的特性会提高动物的免疫性能，另外溶菌酶在一定程度上可提高蛋白酶活性，加快蛋白质的分解利用，加快了抗炎或抗菌多肽的产生。抗炎或抗菌多肽是体内重要的生物活性物质，参与多种免疫反应，具有消除炎症、减少腹泻等消化道疾病发生的作用，因此间接的溶菌酶也具有治疗腹泻等疾病的功效。朱忠珂等在饲料中添加溶菌酶证实其可以提高肉仔鸡的免疫力；邢思等在异育银鲫和草鱼饲料中添加溶菌酶证实其可有效提高鱼类的抗感染能力和生长性能。由于溶菌酶的抑菌作用，它可作为食品防腐剂使用。Grinde等证实溶菌酶可抑制包括四种致病菌在内的五种革兰氏阴性菌，因而用于鲑鱼防腐。有人发现利用溶菌酶保鲜液可以有效抑制弧菌属生长，并且通过对副溶血性弧菌、霍乱弧菌等对虾致病菌的抗菌作用来有效延长南美对虾的保质期。研究证实该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、溶壁微球菌有分解作用，对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用。

层层自组装(layer-by-layer self-assembly，LBLSA)利用在带相反电荷的聚电解质溶液中逐层沉积，靠聚合物分子间的弱相互作用(如静电引力、氢键、共价键等)，使层与层之间自发缔合并形成结构完整、性能稳定、具有特定功能的分子聚集体或超分子结构。其制备工序简单，无需复杂的仪器设备，通过简易的交替、沉积、清洗就可以获得纳米或亚微米级的聚集体；其制备过程条件温和，很好的维持了生物大分子的天然构象尤其适用于不稳定、易失活的酶；其基体材料适用范围广；其组装材料选择范围广，例如合成聚电解质有烯丙胺盐酸盐(PAH)、苯乙烯磺酸钠(PSS)等，天然大分子有蛋白质、多糖等。根据组装过程中驱动力不同，可以分为多种组装方式，其中静电层层自组装将静电作用作为驱动力，可以克服活性生物大分子易失活的缺点，影响因素有载体材料浓度、结构和性质，反应时间等。目前利用层层自组装技术制备微囊的载体材料主要分为合成载体材料和天然载体材料两大类。天然载体材料主要是一些天然高分子如壳聚糖等。多糖来源广泛，价格低廉，种类丰富，结构多样，稳定性高，可降解，生物相容性好，根据天然多糖的带电性质，可以将其分为三大类：一是带正电荷的碱性多糖：壳聚糖；二是带负电荷的酸性多糖：海藻酸、透明质酸、果胶等；三是不带电荷的中性多糖：纤维素、淀粉等。除了碱性和酸性多糖，中性多糖可通过化学修饰制备出性质良好的层层自组装载体材料。目前，应用在层层自组装技术上的多糖载体材料主要包括了壳聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物、海藻酸钠、果胶及其衍生物等。利用壳聚糖与镁铝硅酸盐之间的静电力，层层自组装制备了纳米薄膜，证实组装微囊降低了壳聚糖在胃液中的降解作用，且与单独的壳聚糖薄膜相比，药物释放速率降低，通过控制壳聚糖/镁铝硅酸盐质量比来调节药物的释放速率，以实现消化道靶向传输。有人以β-壳聚糖功能化的SiO₂颗粒为基质，通过层层静电吸附上葡聚糖硫酸盐和巯基乙胺壳聚糖，然后用硫醇进行交联并除去SiO₂核得到纳米胶囊组装微囊，结果表明，与未交联的壳聚糖胶囊相比，此组装微囊能抵抗胃液降解，具有良好的物理稳定性。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

1)一层组装微囊的制备

称取一定量的羧甲基淀粉钠和溶菌酶，充分溶解在pH＝1.2-12的磷酸缓冲液中，按照一定比例将溶菌酶溶液缓慢滴入到CMS中，在一定温度下反应2小时，取适量组装液在10000rpm的转速下离心10min，离心物用去离子水洗涤3次后再用无水乙醇洗涤，收集洗涤液和上清液并计算其中未组装上的溶菌酶含量，离心物即为一层组装微囊；

2)二层组装微囊的制备

配制一定浓度的壳聚糖溶液，将步骤1)制得的一层组装微囊用pH＝1.2-12的磷酸缓冲液溶解，缓慢滴入到CS溶液中，室温下反应2h，在4000rpm的转速下离心3min，离心物用去离子水洗涤3次后再用丙酮洗涤，收集洗涤液和上清液并计算其中未组装上的溶菌酶含量，离心物即为二层组装微囊。

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于步骤1)中溶菌酶与羧甲基淀粉钠的质量比为1:1-10，一定温度为28-55℃。

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于溶菌酶与羧甲基淀粉钠的质量比为1:3，一定温度为28℃。

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于步骤2)中一层组装微囊与壳聚糖的质量比为1:2-8。

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于一层组装微囊与壳聚糖的质量比为1:8。

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于步骤1)中磷酸缓冲液为Na₂HPO4和KH₂PO4按6:1的质量比混合后，溶于蒸馏水中制得。

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于步骤1)中磷酸缓冲液的pH值为3。

所述的一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于步骤2)中磷酸缓冲液的pH值为4。

本发明利用溶菌酶的抗菌抗病毒作用，运用层层自组装技术固定化溶菌酶，组装材料为羧甲基淀粉钠与壳聚糖，依靠静电力先将溶菌酶与羧甲基淀粉钠组装得到一层组装微囊，再将一层组装微囊与壳聚糖组装得到二层组装微囊，以期解决水产养殖业长期使用抗生素存在安全隐患的问题。

附图说明

图1为pH对溶菌酶zeta-电位的影响；

图2为pH对溶菌酶平均粒径的影响；

图3为pH对CMS zeta-电位的影响；

图4为CMS浓度对其zeta-电位的影响；

图5为pH对CS zeta-电位的影响；

图6为pH对一层组装物zeta-电位的影响；

图7为CS浓度对其zeta-电位的影响；

图8为溶菌酶/CMS质量比对溶菌酶包封率和一层微囊载药量的影响；

图9为溶菌酶/CMS质量比对一层组装微囊zeta-电位的影响；

图10为不同组装温度对溶菌酶包封率的影响；

图11为不同CS浓度对溶菌酶包封率和二层微囊载药量的影响；

图12为不同一层组装物/CS质量比对溶菌酶包封率的影响；

图13为包封后溶菌酶/相同浓度溶菌酶原液活性比较；

图14为二层组装微囊形貌；

图15为空白小球与载药微球紫外光谱；

图16为红外光谱图；

图17为二层组装微囊在模拟人体消化液pH条件中体外释放性能；

图18为组装微囊体外抑菌效果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明做进一步详细描述，并给出具体实施方式。

实施例1：组装材料和条件的选择

1)配制不同pH的磷酸缓冲液

称取1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，依次用HCl或NaOH调节溶液的pH值至1.2，3，5，6.8，7.4，11，12，最后加蒸馏水定容至1L即可。高压蒸汽灭菌锅进行灭菌后可长期储存于4℃冰箱。

2)测定溶菌酶在不同pH下的zeta-电位和平均粒径

用上述7种不同pH值的溶液分别配制浓度为1mg/mL的溶菌酶溶液，在25℃，静置1h，经0.22μm的膜过滤后将样品溶液缓慢加入到样品皿中，保证没有气泡进入，电极部分擦拭后保持干燥，放入测试槽，设置平衡时间为1min，用粒径动态光散射仪测定溶菌酶在不同pH条件下的zeta-电位，见图1。

用上述7种不同pH值的溶液分别配制浓度为1mg/mL的溶菌酶溶液，在25℃，静置1h后将样品溶液加入到比色皿中，放入测试槽，设置平衡时间为1min，用粒径动态光散射仪测定溶菌酶在不同pH条件下的平均粒径，见图2所示。

如图1、2所示，溶菌酶在pH＝11左右带电量最小，此时溶菌酶分子链之间容易发生聚集导致平均粒径最大，该pH值接近溶菌酶的等电点(pI)。当pH值小于pI时，溶菌酶分子中的氨基基团结合氢离子使其带正电荷，并且pH值越小，带电荷量越大，相应的平均粒径越小，这主要是因为溶菌酶分子链之间相互排斥，减少了蛋白质的聚集，排斥力越大，溶菌酶在溶液中的稳定性越高；当pH值大于pI时，溶菌酶分子中的羧基基团电离导致其带负电荷，并且pH值越大，带电荷量越大，相应的平均粒径越小。

3)测定组装材料在不同pH和浓度下的zeta-电位

测定组装材料在不同pH下的zeta-电位：用上述溶液分别配制浓度为1mg/mL的CMS溶液和CS溶液，方法同2)，不同pH对CMS zeta-电位的影响见图3。

测定不同浓度CMS溶液的zeta-电位：用pH＝3.0的磷酸缓冲液分别配制浓度为0.5，1，2，3，4，6mg/mL的CMS溶液，测定方法同2)。不同浓度CMS溶液的zeta-电位的影响见图4。

溶菌酶在不同pH值下的zeta-电位情况(图1)，在pH＝3时，CMS和溶菌酶带相反电荷且所带电荷量较大，且溶菌酶在pH＝3.0时，分子分散好，粒径小，故选为后续进行一层微囊组装的pH条件。

随着浓度增大(图4)，CMS所带电荷量先增加再降低，当浓度为3mg/mL时，其所带电荷量最大，可成为后续进行一层微囊组装的CMS浓度。

测定不同浓度CS溶液的zeta-电位：用1-2％的醋酸溶液分别配制浓度为0.5，1，2，3，4，6mg/mL的CS溶液，测定方法同2)。pH对CS zeta-电位的影响见图5。

pH对一层组装物zeta-电位的影响：见图6所示，在pH＝4时，CS和一层组装物带相反电荷且所带电荷量较大，可成为后续进行二层微囊组装的pH条件。不同浓度的CS zeta-电位图见图7所示。CS的浓度为1，3，4，6mg/mL时，其所带电荷量较大，可成为后续进行二层微囊组装的CS浓度。

实施例2：层层自组装法制备组装微囊

利用在带相反电荷的聚电解质溶液中逐层沉积，靠聚合物分子间的弱相互作用，使层与层之间自发缔合并形成性能稳定、结构完整、具有特定功能的超分子结构或分子聚集体。

一层组装微囊的制备：称取一定量的CMS和溶菌酶，充分溶解在pH＝3.0的磷酸缓冲液中，按照一定比例将溶菌酶溶液缓慢滴入到CMS中，在不同温度下反应一段时间，取适量组装液在10000rpm的转速下离心10min，离心物用去离子水洗涤3次后再用无水乙醇洗涤，收集洗涤液和上清液并计算其中未组装上的溶菌酶含量，离心物即为一层组装微囊。

二层组装微囊的制备：配制一定浓度的CS溶液，将上述一层组装微囊用pH＝4.0的磷酸缓冲液溶解，缓慢滴入到CS溶液中，室温下反应2h，在4000rpm的转速下离3min，离心物用去离子水洗涤3次后再用丙酮洗涤，收集洗涤液和上清液并计算其中未组装上的溶菌酶含量，离心物即为二层组装微囊。

先将溶菌酶与CMS依靠静电力组装得到一层组装微囊，再将一层组装微囊与CS组装得到二层组装微囊，其中一层组装最适pH值为3.0，二层组装最适pH值为4.0。CMS最佳浓度为3mg/mL。

不同组装条件对溶菌酶包封率的影响：不同溶菌酶/CMS质量比对溶菌酶包封率的影响见图8；溶菌酶/CMS质量比对一层组装微囊zeta-电位的影响见图9。

当溶菌酶/CMS质量比小于等于1/2时，溶菌酶包封率达到100％(图8)，此时一层组装微囊的载药量随着溶菌酶/CMS质量比的减小而下降。当溶菌酶/CMS质量比等于1/3时(图9)，一层组装微囊所带电荷量最大，有利于与CS的结合，可成为一层微囊组装的最佳溶菌酶/CMS质量比。

不同组装温度对溶菌酶包封率的影响见图10。从图10可知，随着温度从28℃上升到55℃，溶菌酶包封率逐渐下降，这主要是因为随着温度升高，CMS和溶菌酶分子的运动加速，不利于二者相互作用，溶菌酶包封率降低。

不同CS浓度对溶菌酶包封率的影响见图11：随着CS浓度的提高，溶菌酶包封率和二层微囊载药量都逐渐下降。当CS浓度为1mg/mL时，包封率为84.9％，二层组装微囊载药量为22.1％。

不同一层组装物/CS质量比对溶菌酶包封率的影响见图12：随着一层组装物/CS质量比减小，溶菌酶包封率逐渐提高，考虑到反应体系的大小，选择1/8为最佳一层组装物/CS质量比。

实施例3：层层自组装微囊特性研究

相对酶活：将溶壁微球菌菌液、标准品溶液、样品溶液于37℃水浴中预温5min。取0.2mL待测样本与2mL菌液混匀；立即倒入比色皿，在530nm处比浊，20s时读取透光度值T₀，2min 20s时读取透光度值T₂。

按以下公式计算出固定化酶活：

包封后溶菌酶/相同浓度溶菌酶原液活性比较见图13：由图13可知，相同浓度的溶菌酶，经层层自组装法包封后，相对活性反而提高了7.3％，这是由于制备条件温和不会降低溶菌酶的活性，且过程中反应溶液里的Na+、K+对溶菌酶活性有促进作用引起的。

表征

扫描电镜(SEM)表面形态分析：将冻干后的CS/CMS-lysozyme用PBS稀释后滴到硅片上，室温下，待水分完全挥发后，表面喷金处理，用扫描电子显微镜(SEM)观测微囊的微观构造及表面形貌，见图14，由图14可知，二层组装微囊接近球形，大小从5μm到20μm不等，由于层层自组装微球所带电荷所致，微球有部分黏连。

紫外光谱：取适量样品(CS/CMS，CS/CMS-lysozyme)溶于PBS中配置成一定浓度的溶液，利用紫外分光光度计进行250-800cm^-1扫描全谱见图15，根据溶菌酶全波长扫描图，负载溶菌酶的二层组装微囊在278nm处呈现溶菌酶特征峰，而不负载溶菌酶的空白小球在278nm处无特征峰，说明溶菌酶成功被包封进微囊中。

红外光谱：取适量样品(CS，CMS，lysozyme，CS/CMS，CS/CMS–lysozyme)，加入KBr粉末，在玛瑙研钵中充分研磨使之混合均匀。取出适量混合物均匀铺洒在干净的压模内，于压片机上制片。此片装于固体样品架上，插入红外光谱仪样品池处，从4000-400cm^-1进行扫描得到吸收光谱，见图16。

对于溶菌酶来说：

3325cm^-1的宽峰：自由氨基N-H伸缩振动峰；

2935cm^-1：C-H伸缩振动峰；

中红外区三个酰胺特征峰：酰胺I(1700～1600cm-1)与氨基酸二级结构有关，1655cm-1的峰α-螺旋的伸缩振动；

酰胺II(1600～1500cm^-1)1536cm^-1N-H、C-H伸缩振动峰；

酰胺Ⅲ(1320～1230cm^-1)1237cm^-1。

CMS/CS hydrogel在3433cm^-1的宽峰和CMS/CS-lysozyme复合物中3325cm^-1的宽峰，表明所有水凝胶含有OH基团，其来源于原料。溶菌酶的掺入使CMS/CS-lysozyme峰移向较低的波数。

在CMS/CS-lysozyme中，可观察到来源于CS的胺基(1655cm^-1)和CMS的羧酸盐基团(1601cm^-1)的两峰。随着溶菌酶的掺入，胺基基团增多，1601cm^-1的羧酸盐峰消失。

CMS/CS hydrogel和CMS/CS-lysozyme复合物1415cm^-1来源于CMS。

CMS/CS hydrogel和CMS/CS-lysozyme复合物1074cm^-1，1156cm^-1来源于CS。

CMS/CS的1406cm^-1高波段位移至CMS/CS-lysozyme的1422cm^-1，为原料中COO^-的共振伸缩，表明了CS与CMS良好的分子相容性。

体外效果评价

降解实验

模拟人体消化液的配制方法：

胃模拟液(pH＝1.2)：36.5％的浓盐酸7mL溶于适量水中，摇匀后稀释定容到1L。

小肠模拟液(含胰酶，pH＝6.8)：取KH2PO46.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释定容至1L，即得。

结肠模拟液(pH＝7.2)：KH2PO43.403g和K2HPO44.355g溶于100mL水中，混合均匀后，稀释至1L，即得。

取样品适量溶于胃模拟液，在37℃下进行体外降解试验。降解开始后，在2h内，定时取上清液1mL，并及时补充等量体积的新鲜介质，在278nm处测定溶菌酶浓度根据标准曲线，计算累积释放率。

样品离心收集后溶于小肠模拟液，在37℃下进行体外降解试验。降解开始后，定时取上清液1mL，并及时补充等量体积的新鲜介质，在278nm处测定溶菌酶浓度根据标准曲线，计算累积释放率。

样品离心收集后溶于结肠模拟液，在37℃下进行体外降解试验。降解开始后，定时取上清液1mL，并及时补充等量体积的新鲜介质，在278nm处测定溶菌酶浓度根据标准曲线，计算累积释放率。

累计释放量：即在该时间点时，溶出杯中药物的量，加上前面取样时取走的药物量。

计算方法：假如有3个点，t1，t2，t3。用m1，m2，m3表示在这三个点时溶出杯中释放出的药物质量。c1，c2，c3为三个点时溶出杯中药物溶液浓度。取样量为v，亦即要补加的体积。第三个点的累计释放量为：m3+c2×v+c1×v；第二个点：m2+c1×v；第一个点：m1。

二层组装微囊在pH＝1.2的模拟胃液中缓慢释放溶菌酶如图17所示，2h时，累积降解率为29.2％；在pH＝6.8的模拟小肠液中，由于胰酶对多糖的降解，组织微囊的结构发生变化，溶菌酶的释放明显增加，第8h时，累计降解率达到96.7％，溶菌酶基本释放完；随后在pH＝7.2的模拟结肠液中2h内，溶菌酶全部释放，累积降解率达到100％。

抑菌实验：取一定量的样品溶液(空白，CMS-lysozyme，CS/CMS-lysozyme)加入1mL的稀释菌菌悬液(107CFU/mL)，终浓度5mg/mL，随后立即放入37℃恒温振荡箱中孵育24h后，取出100μL的细菌菌悬液，然后将菌液进行10倍梯度稀释，用肉眼数出平板上的菌落数，使涂到平板上的细菌数量在30-300之间。至少3组平行试验。

抑菌率(R)按下式进行计算：

一层组装微囊和二层组装微囊对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌作用，见图18和表1，其中二层组装微囊对E.coli和S.aureus的抑菌率均比一层组织微囊大，这是由于二层组装微囊中CS本身就具有抑菌效果。

表1组装微囊抑菌率

Claims

1.一种口服溶菌酶微粒制剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

1）一层组装微囊的制备

称取一定量的羧甲基淀粉钠和溶菌酶，充分溶解在pH=3的磷酸缓冲液中，按照一定比例将溶菌酶溶液缓慢滴入到CMS中，在一定温度下反应2小时，取适量组装液在10000 rpm的转速下离心10min，离心物用去离子水洗涤3次后再用无水乙醇洗涤，收集洗涤液和上清液并计算其中未组装上的溶菌酶含量，离心物即为一层组装微囊；

2）二层组装微囊的制备

配制一定浓度的壳聚糖溶液，将步骤1)制得的一层组装微囊用pH=4的磷酸缓冲液溶解，缓慢滴入到CS溶液中，室温下反应2h，在4000 rpm的转速下离心3min，离心物用去离子水洗涤3次后再用丙酮洗涤，收集洗涤液和上清液并计算其中未组装上的溶菌酶含量，离心物即为二层组装微囊；所述溶菌酶与羧甲基淀粉钠的质量比为1:3，一定温度为28℃；

步骤2)中一层组装微囊与壳聚糖的质量比为1:8；

步骤1)中磷酸缓冲液为Na₂HPO₄和KH₂PO₄按6:1的质量比混合后，溶于蒸馏水中制得。