CN104399067A - 一种装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽药制剂领域，涉及一种壳聚糖微球装载溶菌酶的兽药制剂及其制备方法。所述的装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂，其分子量为5-50kDa的壳聚糖与负电性交联剂通过静电作用形成纳米微球，将溶菌酶包封于微球内部。本发明采用离子交联法联合冷冻干燥法制备，反应条件温和，工艺流程可控，降低了产业化开发的难度，具有生产实用性和价值。本发明采用溶菌酶与壳聚糖协同作用，分子量在5-50kDa的壳聚糖可穿透G-的细胞外膜，递送溶菌酶至内壁层水解其肽聚糖结构，有效增强了溶菌酶对革兰氏阴性菌（G-）的抑制能力，使得该制剂具有可部分替代抗生素的广谱抑菌作用。

Description

一种装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于兽药制剂领域，涉及一种壳聚糖微球装载溶菌酶的兽药制剂及其制备方法。

背景技术

当前养殖环境下，畜禽细菌性感染引发的疾病呈不断上升趋势，其防治手段主要依赖于抗生素类药物。由于长期不合理使用，动物源性细菌已对抗生素产生了严重的耐药性，也引发了老百姓对食品安全的担忧，寻找高效广谱的抗生素替代药物迫在眉睫。目前，兽用抗菌药物的创新研究主要基于以下几个方面：（1）针对细菌的耐药机制对抗生素母体结构或药效基团进行化学改进，研发新一代抗生素。然而从发展现状来看，抗生素的研发速度远落后于细菌产生耐药性的速度。（2）多肽（酶）类抗菌药物的研究。此类药物的细菌耐药性报导较少，被认为是最有前途的抗生素替代产品。但作为生物体来源的药物不可避免的存在免疫原性、稳定性、生产成本过高等问题。（3）现有抑菌药物的给药载体研究。适当的载体结构可在体内转运过程中包裹药物，在细胞靶向位点上释放药物，充分发挥药物的作用效果，降低不良反应，避免药物在体内被蛋白酶降解，其在兽药新制剂上的潜在应用价值日趋受到重视。但是，给药载体的引入只能解决给药途径问题，并不能解决常规抗生素药物的细菌耐药性问题。

溶菌酶是专一作用于细菌细胞壁的天然抗菌蛋白，可通过切断细胞壁的肽聚糖网络从而分解细菌，因此，对表层细胞壁结构的革兰氏阳性菌（G+）的抑菌效果较好，且未有细菌耐药性的报导，近年来已广泛用于畜禽饲料的添加剂中。但是，由于革兰氏阴性菌（G-）的细胞壁表层覆盖了一层脂质外膜难以穿透，使得溶菌酶对G-的抑制效果较弱，限制了其在畜禽养殖场的应用。若要将溶菌酶开发成可部分替代抗生素作用的药物，需要加强其对G-的抑制能力。

壳聚糖是自然界中广泛存在的甲壳素脱乙酰产物，分子表面的伯胺基（-NH₂）质子化后带正电，对细菌脂质细胞膜的静电亲和力赋予了其抑菌特性，也是普遍用于食品、医疗、农业等领域的天然抑菌剂。研究表明，不同分子量壳聚糖的抑菌机理有所不同。高分子量的壳聚糖可吸附在细菌细胞表面，形成一层高分子膜，阻止营养物质向细胞内运输，加速细菌凋亡。低分子量的壳聚糖则可穿透细胞膜进入细菌细胞内，干扰细胞的正常生理功能，导致细菌死亡。 

壳聚糖也作为载体运送药物，最常用于药物载体的壳聚糖分子量在50-100kDa之间，中等分子量。然而，通过壳聚糖的辅助作用来增强溶菌酶对革兰氏阴性菌（G-）抑制作用的兽药制剂，以及相关的制备方法研究均未见报道。

发明内容

本发明为了克服生物抑菌剂溶菌酶对革兰氏阴性菌（G-）抑制作用的不足，提供一种可协同发挥溶菌酶及壳聚糖的抑菌作用，从而对革兰氏阳性菌、阴性菌均有良好抑菌效果的装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂。

本发明的另一目的是提供可得到适宜粒径大小、包封率及载药量的上述兽药制剂的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供一种装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂，通过壳聚糖与负电性交联剂以静电作用形成纳米微球，将溶菌酶包封于微球内部。在生理pH下微球缓慢崩解，壳聚糖有效穿透细胞膜，递送溶菌酶至革兰氏阴性菌的作用位点，发挥杀菌作用。所述兽药制剂中，溶菌酶为主要抑菌组分，壳聚糖既是载体也是协同抑菌组分。溶菌酶的活度为20000U/mg。壳聚糖为盐酸盐形式，分子量为5-50kDa，脱乙酰度为>85%。

本发明同时提供了一种上述兽药制剂的制备方法，采用离子交联联合冷冻干燥技术，具体包括以下步骤：

将分子量在5-50kDa的壳聚糖盐酸盐、溶菌酶先后溶入水中，微孔过滤。将负电性交联剂以一定速率滴加到含溶菌酶的壳聚糖水溶液中，室温下搅拌。自然沉降，分离出上层乳白色悬浮液。低温离心，取下层沉淀，再经冷冻干燥，制得装载溶菌酶的壳聚糖微球。

上述装载溶菌酶的壳聚糖微球的制备方法中，壳聚糖盐酸盐的浓度为0.5-5.0mg/ml。

上述装载溶菌酶的壳聚糖微球的制备方法中，溶菌酶的浓度为0.1-2.5mg/ml。

上述装载溶菌酶的壳聚糖微球的制备方法中，负电性交联剂是硫酸葡聚糖、三聚磷酸钠或海藻酸钠。

上述装载溶菌酶的壳聚糖微球的制备方法中，负电性交联剂的滴加可采用医用注射泵，滴加速率为0.1-7.0ml/h。

上述装载溶菌酶的壳聚糖微球的制备方法中，负电性交联剂滴加时，壳聚糖水溶液的搅拌速率为300-1000rpm，滴加完成后的搅拌时间为10-30min。

上述装载溶菌酶的壳聚糖微球的制备方法中采用医用注射泵滴加负电性交联剂。所述自然沉降时间为6小时。所述低温离心可以在4℃离心（速率8500xg）30min，所述冷冻步骤在- 80℃冷冻1天。 

本发明制得的装载溶菌酶的壳聚糖微球粒径为187-304nm，包封率为23.42-47.53%，载药量为15.45-25.77%，对大肠杆菌E.coli（革兰氏阴性菌属）的抑制率为51.5-88.2%，而未有载体包裹的溶菌酶对其抑制率仅为10.7%。

本发明的有益效果是：

现有技术主要依赖抗生素类药物进行畜禽细菌性感染疾病的防治，其长期滥用造成的细菌耐药性问题凸显。溶菌酶为天然来源的革兰氏阳性菌（G+）专一抑菌剂，目前未有细菌耐药性报导，但现有技术对革兰氏阴性菌（G-）作用的不足限制了其作为抗生素替代药物的开发。本发明采用溶菌酶与壳聚糖协同作用，分子量在5-50kDa的壳聚糖可穿透G-的细胞外膜，递送溶菌酶至内壁层水解其肽聚糖结构，有效增强了溶菌酶对革兰氏阴性菌（G-）的抑制能力，使得该制剂具有可部分替代抗生素的广谱抑菌作用。

本发明的兽药制剂中，溶菌酶为经典的畜禽饲料添加剂成分，壳聚糖为获FDA批准的的生物抑菌材料，制剂原料简单安全。本发明采用离子交联法联合冷冻干燥法制备，反应条件温和，工艺流程可控，降低了产业化开发的难度，具有生产实用性和价值。

附图说明

图1装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂对革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）的抑制曲线。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例做进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

取分子量5kDa，脱乙酰度>85%的壳聚糖盐酸盐加入水中，室温下搅拌溶解，微孔过滤，制得浓度为的5.0mg/ml的壳聚糖水溶液。然后加入活度为20000U/mg的溶菌酶，使其在壳聚糖水溶液中的浓度为0.1mg/ml。以硫酸葡聚糖为负电性交联剂，采用医用注射泵将硫酸葡聚糖的水溶液以7.0ml/h的速度滴加到含溶菌酶的壳聚糖水溶液中，此时壳聚糖水溶液的搅拌速率为700rpm，滴加完成后继续搅拌30min，得到装载溶菌酶的壳聚糖微球混悬液。将此混悬液静置使其自然沉降6小时，分离出上层乳白色悬浮液。4℃离心（速率8500xg）30min，取下层沉淀，-80℃冷冻1天，冷冻干燥，制得装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂。该制剂的平均粒径为187nm，包封率为23.42%，载药量为15.45%。

将所述制剂进行常规的体外抑菌活性实验，以革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）为实验菌，未有载体包裹的溶菌酶为对照。本实施例装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂对E.coli的最高抑制率为51.5%，而对照溶菌酶的最高抑制率仅为10.7%，结果如附图1所示。

实施例2

取分子量20kDa，脱乙酰度>85%的壳聚糖盐酸盐加入水中，室温下搅拌溶解，微孔过滤，制得浓度为1.0mg/ml的壳聚糖水溶液。然后加入活度为20000U/mg的溶菌酶，使其在壳聚糖水溶液中的浓度为0.8mg/ml。以硫酸葡聚糖为负电性交联剂，采用医用注射泵将硫酸葡聚糖的水溶液以2.5ml/h的速度滴加到含溶菌酶的壳聚糖水溶液中，此时壳聚糖水溶液的搅拌速率为1000rpm，滴加完成后继续搅拌30min，得到装载溶菌酶的壳聚糖微球混悬液。将此混悬液静置使其自然沉降6小时，分离出上层乳白色悬浮液。4℃离心（速率8500xg）30min，取下层沉淀，-80℃冷冻1天，冷冻干燥，制得装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂。该制剂的平均粒径为247nm，包封率为30.28%，载药量为23.87%。

将所述制剂进行常规的体外抑菌活性实验，以革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）为实验菌，未有载体包裹的溶菌酶为对照。本实施例装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂对E.coli的最高抑制率为85.3%，而对照溶菌酶的最高抑制率仅为10.7%，结果如附图1所示。

实施例3

取分子量20kDa，脱乙酰度>85%的壳聚糖盐酸盐加入水中，室温下搅拌溶解，微孔过滤，制得浓度为1.5mg/ml的壳聚糖水溶液。然后加入活度为20000U/mg的溶菌酶，使其在壳聚糖水溶液中的浓度为0.8mg/ml。以海藻酸钠为负电性交联剂，采用医用注射泵将硫酸葡聚糖的水溶液以4.5ml/h的速度滴加到含溶菌酶的壳聚糖水溶液中，此时壳聚糖水溶液的搅拌速率为300rpm，滴加完成后继续搅拌10min，得到装载溶菌酶的壳聚糖微球混悬液。将此混悬液静置使其自然沉降6小时，分离出上层乳白色悬浮液。4℃离心（速率8500xg）30min，取下层沉淀，-80℃冷冻1天，冷冻干燥，制得装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂。该制剂的平均粒径为256nm，包封率为42.63%，载药量为18.22%。

将所述制剂进行常规的体外抑菌活性实验，以革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）为实验菌，未有载体包裹的溶菌酶为对照。本实施例装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂对E.coli的最高抑制率为75.6%，而对照溶菌酶的最高抑制率仅为10.7%，结果如附图1所示。

实施例4

取分子量50kDa，脱乙酰度>85%的壳聚糖盐酸盐加入水中，室温下搅拌溶解，微孔过滤，制得浓度为1.0mg/ml的壳聚糖水溶液。然后加入活度为20000U/mg的溶菌酶，使其在壳聚糖水溶液中的浓度为2.5mg/ml。以硫酸葡聚糖为负电性交联剂，采用医用注射泵将硫酸葡聚糖的水溶液以1.0ml/h的速度滴加到含溶菌酶的壳聚糖水溶液中，此时壳聚糖水溶液的搅拌速率为900rpm，滴加完成后继续搅拌30min，得到装载溶菌酶的壳聚糖微球混悬液。将此混悬液静置使其自然沉降6小时，分离出上层乳白色悬浮液。4℃离心（速率8500xg）30min，取下层沉淀，-80℃冷冻1天，冷冻干燥，制得装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂。该制剂的平均粒径为286nm，包封率为47.53%，载药量为25.77%

将所述制剂进行常规的体外抑菌活性实验，以革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）为实验菌，未有载体包裹的溶菌酶为对照。本实施例装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂对E.coli的最高抑制率为88.2%，而对照溶菌酶的最高抑制率仅为10.7%，结果如附图1所示。

实施例5

取分子量50kDa，脱乙酰度>85%的壳聚糖盐酸盐加入水中，室温下搅拌溶解，微孔过滤，制得浓度为0.5mg/ml的壳聚糖水溶液。然后加入活度为20000U/mg的溶菌酶，使其在壳聚糖水溶液中的浓度为1.2mg/ml。以三聚磷酸钠为负电性交联剂，采用医用注射泵将硫酸葡聚糖的水溶液以0.1ml/h的速度滴加到含溶菌酶的壳聚糖水溶液中，此时壳聚糖水溶液的搅拌速率为900rpm，滴加完成后继续搅拌30min，得到装载溶菌酶的壳聚糖微球混悬液。将此混悬液静置使其自然沉降6小时，分离出上层乳白色悬浮液。4℃离心（速率8500xg）30min，取下层沉淀，-80℃冷冻1天，冷冻干燥，制得装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂。该制剂的平均粒径为304nm，包封率为43.72%，载药量为21.46%。

将所述制剂进行常规的体外抑菌活性实验，以革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）为实验菌，未有载体包裹的溶菌酶为对照。本实施例装载溶菌酶的壳聚糖微球制剂对E.coli的最高抑制率为80.2%，而对照溶菌酶的最高抑制率仅为10.7%，结果如附图1所示。

Claims (10)

1. 一种装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂，其特征在于分子量为5-50kDa的壳聚糖与负电性交联剂通过静电作用形成纳米微球，将溶菌酶包封于微球内部。

2.根据权利要求1所述装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂，其特征在于所述溶菌酶的活度为20000U/mg。

3.根据权利要求1所述装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂，其特征在于所述壳聚糖为盐酸盐形式。

4.根据权利要求1所述装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂，其特征在于所述负电性交联剂为硫酸葡聚糖、三聚磷酸钠或海藻酸钠。

5.一种制备权利要求1所述装载溶菌酶的壳聚糖微球兽药制剂的方法，包括如下步骤：将分子量为5-50kDa的壳聚糖盐酸盐、溶菌酶先后溶入水中，微孔过滤；将负电性交联剂滴加到含溶菌酶的壳聚糖水溶液中，室温下搅拌；自然沉降，分离出上层乳白色悬浮液；离心后取下层沉淀，再经冷冻干燥，制得装载溶菌酶的壳聚糖微球。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖盐酸盐，其浓度为0.5-5.0mg/ml。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述溶菌酶的浓度为0.1-2.5mg/ml。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述负电性交联剂是硫酸葡聚糖、三聚磷酸钠或海藻酸钠。

9.权利要求5所述的制备方法，其特征在于负电性交联剂的滴加速率为0.1-7.0ml/h，搅拌速率为300-1000rpm。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于制得的装载溶菌酶的壳聚糖微球粒径为187-304nm，包封率为23.42-47.53%，载药量为15.45-25.77%。