CN108277271A

CN108277271A - 一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA

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Publication number: CN108277271A
Application number: CN201810112515.9A
Authority: CN
Inventors: 范瑶飞
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2018-02-05
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明提供一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA，涉及疾病检测领域，所述miRNA为miRNA‑563‑5p，所述miRNA‑563‑5p在阿兹海默病患者血清中显著上调，本发明提供了一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA，其具有无创，灵敏度高等特点，可用于辅助检测阿兹海默疾病，通过检测外周血血浆中miRNA‑563‑5p的表达水平，对阿兹海默病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；通过检测抑制miRNA‑563‑5p的表达水平，对阿兹海默疾病具有预防和/或治疗的潜在价值。

Description

一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA

技术领域

本发明涉及疾病检测领域，特别地涉及一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA。

背景技术

阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。

该病可能是一组异质性疾病，在多种因素（包括生物和社会心理因素）的作用下才发病。从目前研究来看，该病的可能因素和假说多达30余种，如家族史、女性、头部外伤、低教育水平、甲状腺病、母育龄过高或过低、病毒感染等。绝大部分的流行病学研究都提示，家族史是该病的危险因素。某些患者的家属成员中患同样疾病者高于一般人群，此外还发现先天愚型患病危险性增加。进一步的遗传学研究证实，该病可能是常染色体显性基因所致。最近通过基因定位研究，发现脑内淀粉样蛋白的病理基因位于第21对染色体。可见痴呆与遗传有关是比较肯定的。

先天愚型（DS）有该病类似病理改变，DS如活到成人发生该病几率约为100%，已知DS致病基因位于21号染色体，乃引起对该病遗传学研究极大兴趣。但该病遗传学研究难度大，多数研究者发现患者家庭成员患该病危险率比一般人群约高3~4倍。St.George-Hyslop等（1989）复习了该病家系研究资料，发现家庭成员患该病的危险，父母为14.4%；同胞为3.8%～13.9%。用寿命统计分析，FAD一级亲属患该病的危险率高达50%，而对照组仅10%，这些资料支持部分发病早的FAD，是一组与年龄相关的显性常染色体显性遗传；文献有一篇仅女性患病家系，因甚罕见可排除X-连锁遗传，而多数散发病例可能是遗传易感性和环境因素相互作用的结果。

目前检测手段主要包括神经心理学测验、血液学检查、神经影像学检查、脑电图、脑脊液检测、基因检测，尽管越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，但在阿兹海默疾病中的关键miRNA仍没有确定，其所发挥的功能是对该领域科研人员的挑战，鉴于此，本发明提供一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA。

本发明是以如下技术方案实现的：

本发明提供一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA，所述miRNA为miRNA-563-5p，所述miRNA-563-5p在阿兹海默病患者血清中显著上调。

进一步地，其筛选过程包括：制作血清微小核糖核酸的生物芯片，该芯片包含了人血清中能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针，芯片能高通量地筛选血清中稳定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清中微小核糖核酸的整体变化预测和诊断疾病，我们首先通过测序的方法确定血清中有一个以上拷贝的微小核糖核酸，然后合成这些微小核糖核酸的的反向互补探针，再把这些探针用芯片点样仪点制在一张100×100mm、经过化学修饰的载玻片上，点制在芯片上的样品还包括作为内标的U6、tRNA，人工制备的30个碱基长度的外标，阳性对照等，整个点阵分成8个亚阵，每个亚阵有20行，20列，点间距为200μm，点的直径约为120μm，每条探针重复三次，芯片操作流程为：(1) 对于阿兹海默病患者，样品来自27名中期至晚期阿兹海默病患者的血清，同时以5名65岁健康老人的血清作对照，分别提取样品的血清总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；(2)微小核糖核酸的分离：取50-100μg总RNA用Ambion’s miRNA Isolation Kit分离微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸样品的荧光标记：利用T4 RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4)杂交与清洗：将RNA溶于16μL杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt’s solution)，于42℃杂交过夜，杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4分钟，而后在0.2×SSC液体中室温洗4分钟，玻片甩干后即可用于扫描；(5)芯片扫描：芯片用Lux Scan10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；(6)数据提取及分析：采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因，结果发现，miRNA-563-5p在阿兹海默病患者血清中显著上调。

进一步地，所述miRNA具有辅助抑制阿兹海默疾病进程的功能，取APP转基因小鼠12只，两只作为对照组，实验组10只分别注射miRNA-563-5p核苷酸类似物，对照组与实验组的处理方法相同，仅将miRNA-563-5p核苷酸类似物替换为无意义序列的阴性对照RNA(agomir-control)，每隔5日注射一次，持续注射一个月，期间记录小鼠生存状态，1个月后对所有小鼠进行Morris水迷宫实验，测定后发现对照组的两只小鼠的空间学习及记忆力受到损伤，Aβ蛋白沉积量高，测试组小鼠相较于1个月前无学习能力和记忆力的显著降低。

进一步地，通过检测外周血血浆中miRNA-563-5p的表达水平，对阿兹海默病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；通过检测抑制miRNA-563-5p的表达水平，对阿兹海默疾病具有预防和/或治疗的潜在价值。

本发明的有益效果：本发明提供了一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA，其具有无创，灵敏度高等特点，可用于辅助检测阿兹海默疾病。

具体实施方式

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为本领域常规的分子生物学操作方法，涉及的试剂均为分析纯级试剂，涉及的试剂或仪器均可从正规渠道商购获得。除非特别指出，以下各实施例中涉及的各种实验方法和操作，包括细胞培养，RNA的提取，RCR扩增，荧光定量PCR，细胞染色等等可参考分子克隆，所需技术为本领域技术人员所知悉的。

实施例1：

制作血清微小核糖核酸的生物芯片，该芯片包含了人血清中能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针。芯片能高通量地筛选血清中稳定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清中微小核糖核酸的整体变化预测和诊断疾病。我们首先通过测序的方法确定血清中有一个以上拷贝的微小核糖核酸，然后合成这些微小核糖核酸的的反向互补探针，再把这些探针用芯片点样仪点制在一张100×100mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样品还包括作为内标的U6、tRNA，人工制备的30个碱基长度的外标，阳性对照等。整个点阵分成8个亚阵，每个亚阵有20行，20列，点间距为200μm，点的直径约为120μm，每条探针重复三次。芯片操作流程为：(1) 对于阿兹海默病患者，样品来自27名中期至晚期阿兹海默病患者的血清，同时以5名65岁健康老人的血清作对照，分别提取样品的血清总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；(2)微小核糖核酸的分离：取50-100μg总RNA用Ambion’s miRNAIsolation Kit分离微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸样品的荧光标记：利用T4 RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4)杂交与清洗：将RNA溶于16μL杂交液中(15％甲酰胺；0.2％SDS；3×SSC；50×Denhardt’s solution)，于42℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4分钟，而后在0.2×SSC液体中室温洗4分钟，玻片甩干后即可用于扫描；(5)芯片扫描：芯片用LuxScan10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；(6)数据提取及分析：采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因。结果发现，miRNA-563-5p在阿兹海默病患者血清中显著上调。

实施例2

本实施例采用APP转基因小鼠作为疾病研究动物模型，取APP转基因小鼠12只，两只作为对照组，实验组10只分别注射miRNA-563-5p核苷酸类似物，对照组与实验组的处理方法相同，仅将miRNA-563-5p核苷酸类似物替换为无意义序列的阴性对照RNA(agomir-control)。每隔5日注射一次，持续注射一个月，期间记录小鼠生存状态，1个月后对所有小鼠进行Morris水迷宫实验，测定后发现对照组的两只小鼠的空间学习及记忆力受到损伤，Aβ蛋白沉积量高，测试组小鼠相较于1个月前无学习能力和记忆力的显著降低。

实施例3

对23名阿兹海默病患者进行回顾性分析，分别提取样品的血清总RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-563-5p的表达水平。提取血清的总RNA(用TRIZOL试剂盒)，实时荧光定量PCR检测miRNA-563-5p的表达水平，发现miRNA-563-5p的表达水平随着疾病进程逐渐升高。

综上所述，通过血清检测miRNA-563-5p的表达水平，可用于辅助检测阿兹海默病的疾病进程，因此，通过检测外周血血浆中miRNA-563-5p的表达水平，对许多阿兹海默病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；通过检测抑制miRNA-563-5p的表达水平，对阿兹海默疾病具有预防和/或治疗的潜在价值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA，其特征在于，所述miRNA为miRNA-563-5p，所述miRNA-563-5p在阿兹海默病患者血清中显著上调。

2.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于，其筛选过程包括：制作血清微小核糖核酸的生物芯片，该芯片包含了人血清中能正常检测到的全部微小核糖核酸的探针，芯片能高通量地筛选血清中稳定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清中微小核糖核酸的整体变化预测和诊断疾病，首先通过测序的方法确定血清中有一个以上拷贝的微小核糖核酸，然后合成这些微小核糖核酸的的反向互补探针，再把这些探针用芯片点样仪点制在一张100×100mm、经过化学修饰的载玻片上，点制在芯片上的样品还包括作为内标的U6、tRNA，人工制备的30个碱基长度的外标，阳性对照等，整个点阵分成8个亚阵，每个亚阵有20行，20列，点间距为200μm，点的直径约为120μm，每条探针重复三次，芯片操作流程为：(1) 对于阿兹海默病患者，样品来自27名中期至晚期阿兹海默病患者的血清，同时以5名65岁健康老人的血清作对照，分别提取样品的血清总RNA，甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量；(2)微小核糖核酸的分离：取50-100μg总RNA用Ambion’s miRNA Isolation Kit分离微小核糖核酸；(3)微小核糖核酸样品的荧光标记：利用T4 RNA连接酶标记方法进行荧光标记，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(4)杂交与清洗：将RNA溶于16μL杂交液中，于42℃杂交过夜，杂交结束后，先在42℃左右含0.2％SDS，2×SSC的液体中洗4分钟，而后在0.2×SSC液体中室温洗4分钟，玻片甩干后即可用于扫描；(5)芯片扫描：芯片用LuxScan10K/A双通道激光扫描仪进行扫描；(6)数据提取及分析：采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，最后用SAM分析挑选差异表达基因，结果发现，miRNA-563-5p在阿兹海默病患者血清中显著上调。

3.根据权利要求2所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA具有辅助抑制阿兹海默疾病进程的功能，取APP转基因小鼠12只，两只作为对照组，实验组10只分别注射miRNA-563-5p核苷酸类似物，对照组与实验组的处理方法相同，仅将miRNA-563-5p核苷酸类似物替换为无意义序列的阴性对照RNA，每隔5日注射一次，持续注射一个月，期间记录小鼠生存状态，1个月后对所有小鼠进行Morris水迷宫实验，测定后发现对照组的两只小鼠的空间学习及记忆力受到损伤，Aβ蛋白沉积量高，测试组小鼠相较于1个月前无学习能力和记忆力的显著降低。

4.根据权利要求3所述的miRNA，其特征在于，通过检测外周血血浆中miRNA-563-5p的表达水平，对阿兹海默病具有诊断和/或预后评估的潜在价值；通过检测抑制miRNA-563-5p的表达水平，对阿兹海默疾病具有预防和/或治疗的潜在价值。