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CN108998534A - 一种kras基因突变检测的新方法 - Google Patents

一种kras基因突变检测的新方法 Download PDF

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CN108998534A
CN108998534A CN201811030167.7A CN201811030167A CN108998534A CN 108998534 A CN108998534 A CN 108998534A CN 201811030167 A CN201811030167 A CN 201811030167A CN 108998534 A CN108998534 A CN 108998534A
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CN
China
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sequence
dumbbell shaped
shaped template
new method
kras
Prior art date
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CN201811030167.7A
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闵迅
付怡欣
丁世家
黄健
周晓燕
段晓雷
袁建波
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Zunyi Medical University
Original Assignee
Zunyi Medical University
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

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Abstract

一种连接介导的环介导等温扩增对KRAS基因突变检测的新方法；包括以下步骤：(1)连接反应制备哑铃状模版：向连接酶的缓冲液加入连接探针，连接酶，KRAS突变序列后放入PCR仪进行连接，反应得到哑铃状模版；(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系变性后加入染料及Bst酶混匀并置于实时荧光荧光PCR仪中反应，引物识别哑铃状模版并触发环介导等温扩增，实时监测荧光信号。本发明成功构建了用于监测实际样本中KRAS突变的荧光分析法，用本方法对KRAS突变样本中提取的基因组DNA进行检测，具有灵敏度高，特异性强，抗干扰能力强等特点。

Description

一种KRAS基因突变检测的新方法
技术领域
本发明涉及突变检测技术领域，尤其涉及一种KRAS基因突变检测的新方法。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，据世界卫生组织(WHO)统计，全球结直肠癌每年新发病例数约120万，年死亡人数达60余万。随着靶向治疗药物表皮生长因子受体抑制剂(epidermal growth factor receptor inhibitor，EGFRI)西妥昔单抗和帕尼单抗的问世，结直肠癌的治疗进入靶向治疗时代。而KRAS基因是影响肿瘤细胞对EGFRI响应性的重要预测性生物标志物。KRAS基因与CRC的关系密切，在CRC中的突变率为35％～45％。KRAS基因发生突变后，会导致表皮生长因子受体(EGFR)依赖的RAS-RAF-MAPK信号通路持续激活，引起细胞过度增殖和分化，从而诱发CRC。多个研究证实，肿瘤KRAS基因突变后对EGFRI(如西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗不敏感。美国国立综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南2008年版已经指出：所有转移性结直肠癌患者均应进行KRAS基因检测，仅对KRAS基因野生型患者推荐接受EGFRI治疗。因此，临床上将KRAS基因突变状态作为一个重要的治疗标志物，它与结直肠癌的预后和治疗效果密切相关。
目前检测KRAS基因突变的检测方法主要是直接测序法、高分辨率溶解曲线分析法、焦磷酸测序法、定量PCR法、突变扩增阻滞系统法等。直接测序法虽然是检测基因突变的金标准，但也存在着敏感性不够高、技术要求高、操作过程复杂、易造成交叉污染等明显缺点，且各级医院中往往无测序设备，需将标本送往相应的公司进行检测，耗费时间长、成本较高，故有很大的局限性。而焦磷酸测序的缺陷是检测成本高，测序样本制备单链DNA的过程较为繁琐。
因此，发展一种可以灵敏度高、特异性好的检测方法可以有效提高KRAS突变基因的检出率，对早期诊断和临床指导用药具有较大意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种KRAS突变检测方法，用于解决现有技术中突变检测成本较高，灵敏度低，特异性差等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了一种KRAS基因突变检测方法，包括如下步骤：
(1)连接反应制备哑铃状模版：向连接酶的缓冲液加入连接探针，连接酶，KRAS突变序列后放入PCR仪进行连接反应得到哑铃状模版；
(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系混匀变性加入SYBR GreenI和Bst DNA polymerase后置于实时荧光定量PCR仪中，使得引物识别并触发环介导等温扩增，实时监测荧光信号；
如上所述，本发明的一种KRAS基因突变检测方法，具有以下有益效果：本发明成功构建了可以用于检测KRAS突变的荧光分析法，应用本发明对KRAS基因突变进行检测，具有灵敏性高、特异性好、抗干扰能力强等特点。与现有技术比较，本发明的成本低，操作简单方便，灵敏度高，不需要要昂贵的仪器，适用于临床实际样本的检测，为临床KRAS突变的检测提供了新的方法。
附图说明
图1A显示为本发明实施例中连接反应验证的PAGE电泳图。
图1B显示为本发明实施例中连接反应验证的荧光图。
图2A显示为本发明实施例中基于连接的环介导等温扩增反应的实时荧光曲线图。
图2B显示为本发明实施例中基于连接的环介导等温扩增反应产物的琼脂糖电泳图。
图3A显示为本发明实施例中不同浓度MutDNA检测结果的实时荧光曲线图。
图3B显示为本发明实施例中检测结果标准曲线图。
图4显示为本发明实施例中荧光传感器临床实际样本KRAS突变检测的特异性和准确性分析。
具体实施方式
实施例1
构建荧光生物传感器并检测KRAS突变
1、材料与方法
1.1材料
Taq DNA ligase，Bst DNA polymerase购于NEB(北京)有限公司。deoxynucleotide solution mixture(dNTPs)购于宝生物工程(大连)有限公司。nuclease-free Water购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司。HPLC纯化的DNA链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成修饰。实验中所用到的临床标本来源于重庆医科大学附属第一医院。
1.2检测仪器
连接反应使用BIO-RAD PCR仪完成，实时荧光强度由Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪进行监测。
1.3检测方法概述
设计两条茎环状的连接探针用于靶序列的识别，其中一条连接探针5’端修饰磷酸基团，另一条连接探针3’端修饰羟基。将连接探针，靶序列，Taq DNA连接酶及连接酶缓冲液混匀置于PCR仪中进行连接反应。靶序列作为连接模版与连接探针互补配对。在Taq DNA连接酶的作用下，将连接探针连接起来形成哑铃状模版。然后取连接产物加入环介导等温扩增体系，包括两条引物及缓冲液，dNTP。混匀后95℃变性3分钟后置于冰上，加入荧光染料SYBR Green I和Bst DNA聚合酶置于实时荧光定量PCR仪中65℃反应1小时。引物FIP可与哑铃状模版的环状部分杂交，在Bst DNA聚合酶的链置换活性和聚合酶活性下进行环介导等温扩增，产生大量的DNA双链，荧光染料SYBR Green I可特异地结合地结合到DNA双链上，产生可检测的荧光信号，由实时荧光定量PCR仪分析检测。
2、连接反应
表1连接反应体系组成表
组分 用量
MutDNA/WtDNA 1μL
连接探针SLS1 1μL
连接探针SLS2 1μL
Taq DNA Ligase 0.25μL
10×Taq DNA Ligase缓冲液 1μL
nuclease-free水 5.75μL
总体积 10μL
为了更好地提高连接反应的连接特异性，使在MutDNA存在的情况下，茎环状的连接探针可以充分的连接，而野生型序列存在的情况下不能进行连接，首先将混匀后的连接反应体系95℃反应3分钟进行预变性，然后进行连接循环，63℃反应1分钟，95℃反应30秒，重复30个循环。使靶序列存在的情况下，磷酸化的连接探针的5’端与另一条连接探针的3’端连接形成哑铃状模版。所述连接探针其中一条为5’磷酸化的茎环状探针，具体序列为：5’-P-CAGCTCCAACTACCACAAGCGACAGCAGAGGATCCGCTCACACTTCCACACAACAAATCCTCTGCTGTCG-3’
另一条茎环状连接探针序列为：5’-
ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGCACTCTTGCCTACGCCAT-3’
靶序列为：
5’-AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCT-3’野生型序列为：
5’-AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCT-3’
3、环介导等温扩增
表2环介导等温扩增反应体系组成表
组分 用量
连接产物 1μL
引物FIP 0.4μL
引物BIP 0.4μL
dNTP 0.5μL
10×Bst DNA polymerase缓冲液 2μL
nuclease-free水 13.7μL
总体积 18.0μL
为了更好地提高环介导等温扩增的反应效率，减少非特异的互补配对，使引物链与哑铃状模版充分结合，首先将连接后的产物与环介导等温扩增体系中95℃变性3分钟，然后置于冰上，再加入SYBR Green I和Bst DNA聚合酶，混匀后置于实时荧光定量PCR仪中，65℃反应1小时。引物FIP与连接反应形成的哑铃状模版结合，在Bst DNA聚合酶作用下，触发环介导等温扩增，实时荧光定量PCR仪测定荧光信号。
实施例2
验证基于连接的环介导等温扩增方法检测KRAS突变的可行性
1、对连接反应中哑铃状模版产生的验证
对实施例1中所得的连接产物用PAGE电泳和荧光法进行分析验证，如图1A中电泳条带显示,只有在SLS1(连接探针1)、SLS2(连接探针2)、靶序列(MutDNA)和Taq连接酶同时存在的条件下才能够进行连接，产生大约110bp的核酸链条带。图1B中也可以看到，只有在MutDNA存在的情况下，连接探针才可以被连接，分别标记于两条连接探针上的荧光基团和猝灭集团因为距离拉近，荧光被猝灭，产生一个较低的荧光信号。
如图1A:条带1为500bp的DNA Marker；条带2为连接探针SLS1；条带3为连接探针SLS2；条带4为野生型的KRAS序列(WtDNA)；条带5为突变型的KRAS序列(MutDNA)，条带6为SLS1与SLS2的混匀物；条带7为Taq DNA Ligase作用后SLS1与SLS2的连接产物；条带8为SLS1、SLS2、WtDNA的混匀物；条带9为Taq DNA Ligase作用后SLS1、SLS2与WtDNA的连接产物；条带10为SLS1、SLS2、MutDNA的混匀物；条带11为Taq DNA Ligase作用后SLS1、SLS2与MutDNA的连接产物。如图1B所示，a为MutDNA介导连接后产物的荧光信号；b为WtDNA介导连接后产物的荧光信号；c为空白。
2、对连接产物哑铃状模版触发环介导等温扩增的验证
对实施例中连接产物触发环介导等温扩增进行实时荧光分析验证并对扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行验证，如图2A，只有加入MutDNA介导的连接产物后才能产生一个可检测到的实时荧光信号。图2B中也可以看到，只有在加入MutDNA介导的连接产物反应后产物所在的泳道才可以产生片段大小不一的梯状条带。如图2A：a为空白；b为WtDNA介导的连接产物；c为MutDNA介导的连接产物。如图2B:条带1为空白；条带2为WtDNA的连接产物介导的环介导等温扩增产物；条带3为MutDNA的连接产物介导的环介导等温扩增产物。
实施例3
荧光生物传感器及其使用条件的优化
我们还对实验过程中的重要的条件即错配碱基位点、连接反应的温度、连接反应循环数、Bst酶量及环介导等温扩增的温度这几个条件进行了优化，对每一个优化条件选取了空白、WtDNA及不同浓度的MutDNA进行一系列实验。
1、为考察连接探针SLS2中错配位点对KRAS突变的荧光传感器结果的影响，本实验采用了不同的错配位点构建荧光传感器。MutDNA与WtDNA的POI(实时荧光曲线斜率最大的点所对应的时间，POI值越低放大效率越高。)的比值随着错配位点的不同而不同，当错配位点位于位于第三个碱基时，此时POI比值最小，说明这个位点的错配可以更好的区分野生型和突变型。当错配位点位于第二个碱基时，连接探针(SLS1)的核苷酸序列为：
5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGCACTCTTGCCTACGCCCT-3’(错配位点碱基用下划线表示)
当错配位点位于第三个碱基时，连接探针(SLS1)的核苷酸序列为：5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGCACTCTTGCCTACGCAAT-3’
当错配位点位于第四个碱基时，连接探针(SLS1)的核苷酸序列为：5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGCACTCTTGCCTACGACAT-3’
当错配位点位于第五个碱基时，连接探针(SLS1)的核苷酸序列为：5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGCACTCTTGCCTACCCCAT-3’
当错配位点位于第六个碱基时，连接探针(SLS1)的核苷酸序列为：
5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGCACTCTTGCCTAAGCCAT-3’
2、为考察连接反应的温度对KRAS突变的荧光传感器结果的影响，本实验采用了不同的连接温度构建荧光传感器。不同温度下，相同浓度的MutDNA所对应的POI值各不相同，当连接温度位于63℃时，不用浓度的MutDNA能进行最好的区分，且POI值最低。
3、为考察连接循环数对KRAS突变的荧光传感器结果的影响，本实验采用了不同的连接循环数构建荧光传感器。30个循环时，不同浓度的MutDNA能进行最好的区分，且POI值最低，因此选取了30个循环为最佳循环数
4、为考察Bst酶量对KRAS突变的荧光传感器结果的影响，本实验采用了不同的Bst酶量构建荧光传感器。当酶量为0.4UμL-1时，WtDNA与空白没有明显的荧光信号，且不同浓度的MutDNA能进行很好的区分。
5、为考察环介导等温扩增温度对KRAS突变的荧光传感器结果的影响，本实验采用了不同的反应温度构建荧光传感器。当反应温度为65℃时，不用浓度的MutDNA都能被检测到，且有一个较小的POI值。因此选取了65℃为LAMP反应的最佳温度。
实施例4
制备的KRAS突变的荧光传感器的性能分析
为了评估本发明KRAS突变的荧光传感器的性能，在最优的实验条件下，对以无酶水配备的不同浓度的MutDNA标准品进行分析。具体的，所述最优条件如下：选择第三个碱基错配的连接探针SLS2(3rd)作为连接探针，连接反应温度63℃、连接30个循环、Bst DNApolymerase 0.4UμL-1、65℃进行环介导等温扩增反应。
1、具体的，用无酶水稀释MutDNA到8个不同浓度(10aM、100aM、1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM),加样1μL，对实时荧光信号进行检测，并绘制标准曲线。如图3A所示为不同浓度的MutDNA所对应的实时荧光信号。如图3B所示,当MutDNA浓度在10aM到100pM之间时，得到的POI值与MutDNA浓度倒数的对数呈线性相关，线性方程为Y＝-5.303 Log C(M)-35.47，线性相关系数为0.9904。如图3A:a为100pM；b为10pM；c为1pM；d为100fM；e为10fM；f为1fM；g为100aM；h为10aM。
实施例5
制备的KRAS突变的荧光传感器对不同丰度的KRAS突变的检测
为了评估本发明KRAS突变的荧光传感器对不同丰度KRAS突变的检测性能，对MutDNA和WtDNA总浓度为10fM，MutDNA所占百分比分别为0％、0.1％、1％、10％、50％、100％，加样1μL，对实时荧光信号进行检测。占比不同的MutDNA所得的荧光曲线的各不相同。将所得的实时荧光曲线的POI值进行分析，占比不同的MutDNA的POI值并不相同，制备的KRAS突变的荧光传感器能准确对WtDNA和低至0.1％的MutDNA进行较好的区分。
实施例6
制备的KRAS突变的荧光传感器临床样本分析
KRAS突变的荧光传感器的特异性，在分析石蜡包埋福尔马林固定的组织(FFPE)中提取的基因组DNA时具有重要作用。主要取决于设计的增加了碱基错配的连接探针的特异性。为评价本传感器的特异性和准确性，我们对临床标本进行检测。具体的，我们将临床上取得的组织样本提取基因组DNA,然后用实施例3构建的KRAS突变的荧光传感器进行测定。和临床上采用的PCR检测方法(该实验方法采用的试剂盒为AmoyDx的人类KRAS基因突变检测试剂盒(荧光PCR法))比较，进行统计分析，如图4所示，配对四格表卡方检验P<0.01，回归分析系数为0.9545,P<0.01。这些结果说明制备的KRAS突变的荧光传感器能够有效的区分野生型的KRAS基因，具有良好的特异性。和临床上所用的荧光PCR相比，两者的检测结果相同，且对于PCR方法的临界值检测有一个更好的检测性。
序列表
序列表
<110> 遵义医学院
<120> 一种KRAS基因突变检测的新方法
<141> 2018-09-05
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<213> Artificial Sequence
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Claims (10)

1.一种KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)连接反应制备哑铃状模版DSS：向连接酶的缓冲液中加入连接探针SLS1、连接探针SLS2、连接酶、KRAS突变序列MutDNA，混匀后放入PCR仪中95℃预变性3分钟，63℃反应1分钟，95℃反应30秒，30个连接循环反应后得到哑铃状模版；
(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系混匀并置于实时荧光定量PCR仪中，使得引物识别并触发环介导等温扩增，实时监测荧光信号；即设计两条茎环状的连接探针用于靶序列的识别，其中一条连接探针5’端修饰磷酸基团，另一条连接探针3’端修饰羟基，将连接探针，靶序列，Taq DNA连接酶及连接酶缓冲液混匀置于PCR仪中进行连接反应，靶序列作为连接模版与连接探针互补配对；在Taq DNA连接酶的作用下，将连接探针连接起来形成哑铃状模版，然后取连接产物加入环介导等温扩增体系，包括两条引物及缓冲液，dNTP，混匀后95℃变性3分钟后置于冰上，加入荧光染料SYBR Green I和Bst DNA聚合酶置于实时荧光定量PCR仪中65℃反应1小时，引物FIP可与哑铃状模版的环状部分杂交，在BstDNA聚合酶的链置换活性和聚合酶活性下进行环介导等温扩增，产生大量的DNA双链，荧光染料SYBR Green I可特异地结合地结合到DNA双链上，产生可检测的荧光信号，由实时荧光定量PCR仪分析检测。
2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，所述连接探针SLS1与MutDNA之间有19个碱基互补配对，SLS2与MutDNA之间有18个碱基互补配对。
3.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，所述连接探针SLS1为5’磷酸化的探针，序列如序列表所示：
4.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，所述连接探针SLS2为3’羟基化的探针，序列如序列表所示：
5.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，所述MutDNA序列如序列表所示：
6.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，突变的KRAS序列与两条探针SLS1和连接探针SLS2，得到哑铃状模版序列如序列表所示。
7.根据权利要求2所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，所述的引物探针FIP序列如序列表所示：
8.根据权利要求2所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，所述的哑铃状模版与FIP有37个碱基互补配对。
9.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测的新方法，其特征在于，将哑铃状模版与环介导等温扩增体系混匀变性退火，环介导等温扩增总体积为18μL,其组成如下：dNTP 0.5μL、哑铃状模版1μL、10×Bst DNA polymerase缓冲液2μL、无酶水13.7μL、引物FIP 0.4μL、引物BIP 0.4μL。
10.根据权利要求1所述的KRAS突变突变检测的新方法，其特征在于，向变性退火后的反应液中依次加入1μL SYBR Green I和1μL Bst DNA polymerase，混匀后置于实时荧光定量PCR仪中，65℃反应60分钟，每间隔1分钟采集一次荧光信号。
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