CN111850129A

CN111850129A - 检测微卫星nr21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111850129A
Application number: CN202010826594.7A
Authority: CN
Inventors: 傅新晖; 林汉杰; 黄京林; 陈志婷; 谭小丽; 黄艳; 汪建平
Original assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University
Current assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-17
Also published as: CN111850129B

Abstract

本发明公开了检测微卫星NR21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。本发明首先提供了检测微卫星NR21位点稳定性的引物对，利用该引物对能够准确、快速、特异地检测微卫星NR21位点的稳定性，与现有片段分析法商品化试剂盒的金标准方法相比，本发明构建的检测微卫星NR21位点稳定性的方法或试剂盒的检测灵敏度为95.77％、特异性为100％，且对设备的要求也大大降低，无需使用基因分析仪，只需一台带有HRM功能的荧光定量PCR仪即可；另外，本发明方法或试剂盒的操作程序大大简化，每检测一个样本所需的时间相较金标准方法缩短了约1小时，且成本降低了80％；因此，该方法或试剂盒在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用前景良好。

Description

检测微卫星NR21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及检测微卫星NR21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内的恶性肿瘤疾病当中，其发病率高居第3位，死亡率在恶性肿瘤行列高居第2位，在消化道恶性肿瘤中占全球发病和死亡首位，严重威胁着人类的健康与生存。近年来随着中国民众生活方式及饮食结构的变化，它已成为我国消化系统发病率第二，患病率第一位的恶性肿瘤。微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是结直肠癌发病的重要原因，在预测肠癌患者预后及化疗反应方面也有重要作用，同时对Lynch综合征的诊断具有重要意义。

近年来，MSI的相关临床和基础方面研究取得较好的进展，对MSI与CRC的关系取得深入认识。2016年，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)在《结直肠癌临床实践指南》(2016.V2)指出，Lynch综合征应行MSI或错配修复(mismatch repair，MMR)检测：1)70岁及以下诊断结直肠癌患者以及符合Bethesda指南的大于70岁患者均应行Lynch综合征肿瘤检测；2)所有Ⅱ期患者均应行MSI或MMR检测，因为MSI-H的Ⅱ期患者预后较好，且不会从5-氟尿嘧啶单药辅助治疗获益。对于具有MSI-H特征的Ⅱ期结肠癌，组织分化差不再认为是高危因素。此外，NCCN指南指出，对局部晚期、复发性或转移性的胃癌患者，考虑PD-1抑制剂治疗前，需行MSI或MMR检测。FDA已批准抗PD-1药pembrolizumab，用于不可切除或转移性MSI-H或dMMR的实体肿瘤的二线或后续治疗选择。

目前，检测微卫星不稳定性的方法包括：MMR蛋白免疫组化法、DNA测序、片段分析法、高效液相色谱技术、高分辨率熔解曲线(high-resolution melt，HRM)法等。片段分析法是目前公认的金标准方法；但该方法成本较高，检测时间较长，并且必须在价格昂贵的测序仪上进行分析，大部分实验室无法开展检测(V Deschoolmeester et al.，Detection ofmicrosatellite instability in colorectal cancer using an alternativemultiplex assay of quasi-monomorphic mononucleotide markers，J Mol Diagn，2008,10(2):154-9)。

HRM法完全是基于核酸的物理性质进行分析，只需在常规PCR基础上增加一些饱和染料，熔解曲线的形状取决于GC含量、片段长度和产物序列，通过熔解曲线的差异即可分辨；样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，具有快速、低成本、灵敏性高等优点，同时只需在荧光定量PCR仪上即可进行分析；但HRM法对引物设计的要求很高：引物既要有很好的特异性，又要求其扩增出的片段足够短，才能获得较好的检测灵敏度。

NR21是结直肠癌微卫星不稳定性检测的重要位点之一，当发生不稳定时单核苷酸重复数会出现改变。因此，有必要筛选一种准确、快速且廉价的检测NR21位点稳定性的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供检测微卫星NR21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。

本发明的目的是提供高分辨率熔解曲线法在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用。

本发明另一目的是提供检测微卫星NR21位点稳定性的引物对。

本发明另一目的是提供所述引物对在检测微卫星NR21位点稳定性或制备检测微卫星NR21位点稳定性的试剂/试剂盒中的应用。

本发明另一目的是提供一种检测微卫星NR21位点稳定性的试剂盒。

本发明另一目的是提供一种检测微卫星NR21位点稳定性的方法。

本发明另一目的是提供所述引物对、所述试剂盒或所述方法在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了高分辨率熔解曲线法在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用。

本发明提供了检测微卫星NR21位点稳定性的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

上游引物(SEQ ID NO:1)：5’-tggcacagttctatttttatattta-3’；

下游引物(SEQ ID NO:2)：5’-cactttctggtcactcgcgtttaca-3’。

所述引物对在检测微卫星NR21位点稳定性或制备检测微卫星NR21位点稳定性的试剂/试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种检测微卫星NR21位点稳定性的试剂盒，包括所述的引物对。

优选地，所述试剂盒还包括饱和荧光染料。

更优选地，所述饱和荧光染料为Eva Green。

优选地，所述试剂盒还包括Buffer、dNTP和Taq酶。

本发明还提供了一种检测微卫星NR21位点稳定性的方法，利用所述引物对进行荧光定量PCR反应并进行HRM分析。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，利用所述引物对进行荧光定量PCR反应和HRM分析，收集荧光信号，绘制熔解曲线；

(2)比较结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线，判断所述结直肠癌患者是否为微卫星NR21位点稳定型患者。

优选地，步骤(2)所述判断是否为微卫星NR21位点稳定型患者的方法为：若结直肠癌患者肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示所述结直肠癌患者为微卫星NR21位点不稳定型患者；反之，则表示所述结直肠癌患者为微卫星NR21位点稳定型患者。

优选地，步骤(1)所述荧光定量PCR反应的体系为：DNA1～5μL、10×Buffer2～2.5μL、dNTP 2～2.5μL、Eva Green 1～1.25μL、上游引物1～1.25μL、下游引物1～1.25μL、Taq酶0.2～0.25μL、无酶水加至20～25μL。

更优选地，步骤(1)所述荧光定量PCR反应的体系为：DNA1μL、10×Buffer2.5μL、dNTP 2.5μL、Eva Green 1.25μL、上游引物1.25μL、下游引物1.25μL、Taq酶0.25μL、无酶水加至24μL。

优选地，步骤(1)所述荧光定量PCR反应的程序为：95℃10min；95℃20s、62℃20s、72℃20s，40cycles；熔解温度从73℃逐渐升温至83℃，升温速度为1℃/s，11s；40℃30s。

优选地，步骤(1)所述收集荧光信号的频率为11～13次/℃。

更优选地，步骤(1)所述收集荧光信号的频率为12次/℃。

优选地，步骤(1)所述DNA的浓度为50～100ng/μL。

更优选地，步骤(1)所述DNA的浓度为75ng/μL。

另外，所述引物对、所述试剂盒或所述方法在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了检测微卫星NR21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法。本发明首先提供了检测微卫星NR21位点稳定性的引物对，利用该引物对、以及本发明构建的检测微卫星NR21位点稳定性的方法能够准确、快速、特异地检测微卫星NR21位点的稳定性；

与现有片段分析法商品化试剂盒的金标准方法相比，本发明方法的灵敏度为95.77％、特异性为100％，能够满足临床需求，且对设备的要求也大大降低，无需使用基因分析仪，只需一台带有HRM功能的荧光定量PCR仪即可；另外，本发明方法的操作程序大大简化，每检测一个样本所需的时间相较金标准方法缩短了约1小时，且成本降低了80％；因此，该方法在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用前景良好。

附图说明

图1是引物对1对样品1的荧光定量PCR检测熔解曲线。

图2是引物对1对样品2的荧光定量PCR检测熔解曲线。

图3是引物对2对样品2的荧光定量PCR检测熔解曲线。

图4是引物对3对样品2的荧光定量PCR检测熔解曲线。

图5是引物对4对样品2的荧光定量PCR扩增曲线。

图6是引物对5对样品2的荧光定量PCR扩增曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测微卫星NR21位点稳定性的方法的建立

1、引物

本实施例提供了检测微卫星NR21位点稳定性的引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。

上游引物(SEQ ID NO:1)：5’-tggcacagttctatttttatattta-3’；

下游引物(SEQ ID NO:2)：5’-cactttctggtcactcgcgtttaca-3’。

2、反应体系

利用上述引物对，使用Blend Taq Plus酶(Toyobo，CAT NO.BTQ-201)配制如表1所示的荧光定量PCR反应体系(24μL)：

表1荧光定量PCR反应体系

名称	用量(μL)
		10×Buffer	2-2.5
dNTP	2-2.5
		Eva Green	1-1.25
上游引物	1-1.25
		下游引物	1-1.25
Taq酶	0.2-0.25
		无酶水	15-17

3、检测方法

(1)样品来源及基因组DNA提取：所有结直肠癌患者肿瘤样品及正常样品均来自中山大学附属第六医院病理科，收集组织，使用石蜡样品提取试剂盒对基因组DNA进行提取。将结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA均调整至75ng/μL，在上述反应体系中分别加入1μL DNA，涡旋混匀后，使用罗氏LightCycler 480荧光定量PCR仪，按照以下程序进行荧光定量PCR反应，以频率为12次/℃收集荧光信号，绘制熔解曲线；

荧光定量PCR反应的程序为：95℃10min；95℃20s、62℃20s、72℃20s，40cycles；熔解温度78℃，40℃30s。

(2)比较结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的熔解曲线，按照以下方法判断结直肠癌患者是否为微卫星NR21位点稳定型患者：

若结直肠癌患者肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示结直肠癌患者为微卫星NR21位点不稳定型患者；反之，则表示结直肠癌患者为微卫星NR21位点稳定型患者。

实施例2检测微卫星NR21位点稳定性的试剂盒的构建

一种检测微卫星NR21位点稳定性的试剂盒，包括以下组分：核苷酸序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的上游引物和下游引物、Eva Green、Buffer、dNTP和Taq酶。

上游引物(SEQ ID NO:1)：5’-tggcacagttctatttttatattta-3’；

下游引物(SEQ ID NO:2)：5’-cactttctggtcactcgcgtttaca-3’。

试验例1利用不同引物对检测微卫星NR21位点稳定性的结果对比

1、实验方法

本试验例利用实施例1构建得到的检测微卫星NR21位点稳定性的方法，摸索了5组引物对(表2)对检测结直肠癌患者肿瘤微卫星NR21位点稳定性的实验结果的影响，并对本发明方法(HRM分析)的结果和现有片段分析法商品化试剂盒(北京阅微基因技术有限公司

MSI检测试剂盒)的结果进行比较，商品化试剂盒的工作步骤参照产品说明书。本试验例的样本1和样本2均来自中山大学附属第六医院病理科。

2、实验结果

5组引物对及其峰型、判读结果的比较如表2所示，引物对1对样品1的荧光定量PCR检测熔解曲线如图1所示，引物对1对样品2的荧光定量PCR检测熔解曲线如图2所示，引物对2对样品2的荧光定量PCR检测熔解曲线如图3所示，引物对3对样品2的荧光定量PCR检测熔解曲线如图4所示，引物对4对样品2的荧光定量PCR扩增曲线如图5所示，引物对5对样品2的荧光定量PCR扩增曲线如图6所示，从表2和图1-6可以看出，样品2使用商品化试剂盒检测判读为微卫星NR21位点不稳定型；而使用上述5组引物对、利用实施例1构建得到的检测微卫星NR21位点稳定性的方法进行检测，发现只有引物对1(核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示)可以准确判读样品2的微卫星NR21位点不稳定型，其余4对引物(引物对2-5)均无法准确判读。因此，以引物对1作为检测微卫星NR21位点稳定性的引物对。

表2 5组引物对及其扩增产物的HRM峰型、判读结果的比较

注：样品扩增CT值以18～25为佳，若样品扩增CT值不在该范围内，则判读为该次荧光定量PCR反应扩增效果不好或无法扩增，最后有可能会影响扩增产物的量和后续的HRM分析。

试验例2本发明方法与现有片段分析法商品化试剂盒的检出率、检测时间和成本比较

1、实验方法

141对(即肿瘤组织及其对应正常组织，编号1-141)结直肠癌患者样品均来自于中山大学附属第六医院病理科，按照实施例1中的方法分别提取样品基因组DNA，采用试验例1中得到的引物对1(核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)，利用实施例1构建得到的检测微卫星NR21位点稳定性的方法对141对样品分别进行检测。

上游引物(SEQ ID NO:1)：5’-tggcacagttctatttttatattta-3’；

下游引物(SEQ ID NO:2)：5’-cactttctggtcactcgcgtttaca-3’。

同时，利用现有片段分析法商品化试剂盒(北京阅微基因技术有限公司

MSI检测试剂盒)(该试剂盒工作原理是：以荧光定量PCR为基础结合毛细管电泳来检测微卫星不稳定性)对上述141对样品进行检测。

另外，对以上2种检测方法所用的检测时间、成本进行核算和对比。

2、实验结果

本发明方法与现有片段分析法商品化试剂盒的检出率比较结果如表3所示，可以看出，本发明方法与现有片段分析法商品化试剂盒有138例结果一致，3例样品结果不符；本发明方法的灵敏度＝68/(68+3)×100％＝95.77％，特异性＝70/(70+0)×100％＝100％。

因此，本发明方法与现有片段分析法商品化试剂盒(金标准方法)相比，特异性为100％，敏感度也高达95.77％，能满足临床需求。

表3本发明方法与现有片段分析法商品化试剂盒的检出率比较结果

本发明方法与现有片段分析法商品化试剂盒的检测时间和成本比较结果如表4所示，可以看出，利用本发明方法进行微卫星NR21位点稳定性的检测，每个样品的检测时间比现有片段分析法商品化试剂盒检测时间缩短了33.3％，同时每个样品的检测成本降低了80％。

因此，使用本发明方法进行微卫星NR21位点稳定性的检测，可以大大节约检测时间和成本，更好的服务临床病人。

表4本发明方法与现有片段分析法商品化试剂盒的检测时间和成本比较结果

	本发明方法	现有片段分析法商品化试剂盒
			检测时间	2小时/样品	3小时/样品
实验成本	10元/样品	50元/样品

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学附属第六医院

中山大学

<120> 检测微卫星NR21位点稳定性的引物对、试剂盒及方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggcacagtt ctatttttat attta 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactttctgg tcactcgcgt ttaca 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtcgctggc acagttctat tttta 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtcactcgc gtttacaaac aagaa 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagtcgctg gcacagttct atttt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcattcaca ctttctggtc actcg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccggagtcg ctggcacagt tctat 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctccgcattc acactttctg gtcac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcagcagaat tccagccgga gtcgc 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacactttct ggtcactcgc gtt 23

Claims

1.高分辨率熔解曲线法在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用。

2.检测微卫星NR21位点稳定性的引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求2所述引物对在检测微卫星NR21位点稳定性或制备检测微卫星NR21位点稳定性的试剂/试剂盒中的应用。

4.一种检测微卫星NR21位点稳定性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括饱和荧光染料。

6.一种检测微卫星NR21位点稳定性的方法，其特征在于，利用权利要求2所述引物对进行荧光定量PCR反应并进行HRM分析。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别以结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织的DNA作为模板，利用权利要求2所述引物对进行荧光定量PCR反应和HRM分析，收集荧光信号，绘制熔解曲线；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述判断是否为微卫星NR21位点稳定型患者的方法为：若结直肠癌患者肿瘤组织的熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，而正常组织的熔解曲线仅显示出一个熔解峰，则判断两者的峰型不一致，表示所述结直肠癌患者为微卫星NR21位点不稳定型患者；反之，则表示所述结直肠癌患者为微卫星NR21位点稳定型患者。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述荧光定量PCR反应的体系为：DNA 1～5μL、10×Buffer 2～2.5μL、dNTP 2～2.5μL、Eva Green 1～1.25μL、上游引物1～1.25μL、下游引物1～1.25μL、Taq酶0.2～0.25μL、无酶水加至20～25μL；

步骤(1)所述荧光定量PCR反应的程序为：95℃10min；95℃20s、62℃20s、72℃20s，40cycles；熔解温度从73℃逐渐升温至83℃，升温速度为1℃/s，11s；40℃30s。

10.权利要求2所述引物对、权利要求4～5任一所述试剂盒或权利要求6～9任一所述方法在检测微卫星NR21位点稳定性中的应用。