CN108676906B - 玉米叶绿体基因组ssr位点及在品种鉴定中的应用 - Google Patents
玉米叶绿体基因组ssr位点及在品种鉴定中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了玉米叶绿体基因组的SSR位点及在品种鉴定中的应用。本发明通过代表性样品选取、高质量测序数据、精确数据分析保证获得叶绿体多态位点的准确性和高效性，选取来源广泛、表型和基因型丰富的玉米材料，基于拼接的玉米材料叶绿体基因组序列，利用MISA软件搜索SSR，最终确定13个叶绿体SSR多态位点。利用这些SSR位点可以：(1)构建玉米品种叶绿体DNA‑SSR指纹数据库；(2)玉米样本母系溯源分析；(3)玉米样本正反交鉴定。应用本发明的叶绿体SSR位点，能够在基因组水平上拓展了玉米可用标记位点的范围，为玉米品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及玉米叶绿体SSR分子标记及其应用。
背景技术
叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，拥有自身完整的一套基因组，称为叶绿体基因组。叶绿体基因组信息由于具有以下优势而被广泛应用于植物品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，系统进化，细胞质遗传特性等研究和应用中。(1)叶绿体基因组较小且相对保守，其全序列容易获得；(2)叶绿体基因组是母系遗传，不同个体间基因的交换和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性；(3)叶绿体基因组除反向重复区外均为单拷贝基因，几乎不存在旁系同源基因干扰；(4)叶绿体编码区与非编码区进化速度差异显著，存在一些高突变区，可以解决种以下分类单元问题。
在玉米品种、育成材料以及种质资源鉴定的研究和应用中，目前均采用玉米的细胞核基因组的遗传信息。如玉米品种鉴定SSR标记法采用40对SSR(simple sequencerepeat)引物(王凤格等，2014)；适于玉米DNA指纹分析的芯片maizeSNP3072(Tian et al.,2015)；商业化玉米芯片产品maizeSNP50K(Ganal et al.,2011)；以及基于高通量测序技术的GBS、简化基因组测序方法等。现有玉米样品分子鉴定方法均是基于玉米细胞核基因组序列信息，植物细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，即叶绿体和线粒体基因组信息。并且细胞质基因组信息尤其是叶绿体基因组信息具有上述优点，更加适合于玉米样品的母系溯源等鉴定中。现有玉米基因组多态位点集合中未记载有针对于叶绿体基因组开发的SSR多态位点。
发明内容
本发明的目的是提供适用于玉米母系溯源的一套叶绿体SSR分子标记。
为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的170份玉米自交系材料，基于高质量的重测序数据开发玉米叶绿体基因组SSR位点组合并阐述了其在玉米样品鉴定中的应用。总体思路和步骤如下。(1)170份玉米代表性试验材料的选取，类型包括我国所有杂种优势群，甜糯、地方品种、CMS不育三种类型样品等。(2)高浓度高质量总DNA制备。(3)基于二代测序平台的高通量测序，构建文库大小为500bp、PE140、测序深度为5倍。(4)全基因组序列数据处理、叶绿体基因组拼接，使用两个软件独立拼接，基于玉米B73叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig，进行组装，验证序列准确性。(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定，利用DOGMA软件注释叶绿体基因组。(6)将170份材料叶绿体基因组序列进行比对，利用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件搜索SSR位点，具体筛选指标为单碱基重复次数必须高于10，二碱基重复次数高于8，三碱基重复次数高于5，四碱基重复次数高于4，五碱基重复次数高于3，六碱基重复次数高于3，获得33个SSR位点。(7)在33个SSR位点两侧设计引物，基于荧光毛细管电泳平台验证分析，根据扩增是否成功、是否为单峰、是否为多态等指标进行分析，最后评估确定13个叶绿体SSR多态位点。
所述13个SSR多态位点的物理位置是基于玉米品种B73叶绿体基因组序列比对确定的，所述的13个SSR多态位点编号是CPMSSRP-01到CPMSSRP-13，具体位点信息见表1。本发明13个玉米叶绿体SSR位点开发评估的技术路线图见图1。
表1 13个叶绿体SSR多态位点信息
本发明提供的上述13个叶绿体SSR位点为单碱基长度多态，所以这套位点组合可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，基于SSR位点侧翼序列设计引物，其中一条引物的5′端标记荧光集团；配置PCR反应体系加入DNA、引物、dNTP、MgCl2、Taq酶、Buffer；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入SSR Analyzer软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。
本发明还提供了一种用于构建玉米叶绿体基因组SSR-DNA指纹数据库的方法。具体可包括如下步骤：(1)提取构建指纹数据库品种的基因组总DNA；(2)利用本发明提供的一套13个SSR位点，基于荧光毛细管电泳平台，获得叶绿体基因组DNA指纹数据库。
本发明还提供了一种玉米样本母系溯源分析的方法。因为本发明提供的13个多态位点是基于玉米叶绿体基因组开发的，为严格母系遗传标记，所以可以应用于玉米样本的母系溯源分析。该应用的前提是在构建了已知玉米自交系品种叶绿体基因组SSR-DNA指纹数据库的基础上。
本发明还提供了一种玉米杂交种正反交鉴定的方法。玉米杂交种一般是由两个自交系亲本组成产生的，并且父母本一般情况下属于不同的杂优模式群。基于170个玉米样本的分析显示，除了瑞德/兰卡等少数杂优模式外，多数杂优模式的母本和父本都能够通过叶绿体标记鉴定出来。因此，对于同一个杂交组合采用正反交两种方式生产的种子，能够通过提取总DNA，利用叶绿体标记位点进行鉴定。与以往提取果皮DNA和胚乳DNA的方式相比，本方法简便易行。
本发明提供了上述SSR分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记在制备玉米基因组芯片中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记在玉米种质资源鉴定中的应用。
本发明提供了上述SSR分子标记在玉米胞质遗传研究中的应用。
上述的任一种应用，包括以下步骤：
1)提取待测玉米样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，进行PCR扩增所述SSR分子标记；
3)采用荧光毛细管电泳系统检测PCR产物。
上述应用的步骤2)中，13个SSR位点分别独立进行PCR扩增；由于扩增程序相同，可以放在一个板上不同孔中，扩增1次。PCR反应体系为20μL，包括4μL DNA、0.25μmol/L引物、0.15μmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl2、1单位Taq酶(Genacea，美国)、1×PCR Buffer。PCR反应程序为94℃5min，94℃40sec，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min，4℃保存。
电泳及指纹数据获得：PCR产物在毛细管荧光电泳系统AB3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems，USA)上进行电泳，在96孔电泳板的单个孔中分别加入PCR产物、甲酰胺、内标(GeneScanTM-500LIZ，Applied Biosystems，USA)。上述混合样品在PCR仪上运行95℃变性5min，将变性后的电泳产物取出，1000rpm/min离心1min后，于AB 3730XL DNA分析仪上进行电泳。利用电泳仪配套的Date Collection Ver.1.0软件收集原始数据，原始数据导入数据分析软件获得片段长度格式的基因型数据。
本发明的技术关键点在于：
(1)玉米全基因组测序数据分析。由于玉米基因组比较大且复杂，因此处理全基因组测序数据是首先遇到的难点和关键点。本发明中玉米全基因组测序数据分析的步骤为：原始数据质量评估、独立使用SPAdes和SOAPdenovo2两个软件进行拼接、获得高质量拼接的contig，其中序列拼接为关键点，参数设置相对苛刻。
(2)玉米叶绿体基因组数据分离。从总DNA数据中分离得到叶绿体数据是本发明的难点和关键点。由于叶绿体基因组序列相对保守，并且具有足够测序质量和长度，因此在本发明中叶绿体基因组数据获得是通过拼接的方案，同时结合与玉米叶绿体基因组比对方式。玉米叶绿体基因组数据获得主要步骤为：利用Blast程序筛选叶绿体基因组的contig，使用Sequencher软件组装叶绿体基因组contig，组装好的序列与玉米叶绿体参考基因组(玉米品种B73，Version 3)进行比对验证确认，为获得准确可靠的叶绿体基因组序列提供保障。
(3)叶绿体SSR多态位点确定，是本发明的关键数据和结果。通过代表性样品选取、高质量测序数据、精确数据分析保证获得叶绿体多态位点的准确性和高效性。在本发明中选取来源广泛、表型和基因型丰富的170份材料，基于拼接的170个叶绿体基因组序列，利用MISA软件搜索SSR序列，最终确定叶绿体SSR多态位点，其中不同遗传背景材料，高质量基因序列均是获得准确可靠叶绿体多态位点的重要因素。
本发明针对叶绿体基因组特征，基于高质量的重测序数据开发一套玉米叶绿体基因组多态SSR位点，与核基因组位点相比，更适合应用于玉米叶绿体DNA指纹数据库的构建、亲本溯源、正反交鉴定中。通过叶绿体SSR多态位点及其引物的应用，可在基因组水平上拓展玉米可用标记位点的范围；为玉米品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中13个玉米叶绿体SSR位点开发评估的技术路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
实施例1利用本发明提供的SSR多态位点组合构建玉米品种叶绿体DNA-SSR指纹数据库
玉米品种DNA提取：每个样品采用种子发苗、给予光照、形成绿苗。DNA提取采取混株提取DNA的方式，混合了30个单株的绿叶，DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。
引物设计合成：本发明提供的13个SSR位点(表1)为单碱基长度多态，所以这套位点可以基于荧光毛细管电泳平台设计引物。每个位点基于其侧翼序列设计一对引物，其中一条引物的5′端标记荧光集团。
PCR扩增：PCR反应体系为20μL，包括4μL DNA、0.25μmol/L引物、0.15μmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl2、1单位Taq酶(Genacea，美国)、1×PCR Buffer。PCR反应程序为94℃5min，94℃40sec，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min，4℃保存。
电泳及指纹数据获得：PCR产物在毛细管荧光电泳系统AB3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems，USA)上进行电泳，在96孔电泳板的单个孔中分别加入PCR产物、甲酰胺、内标(GeneScanTM-500LIZ，Applied Biosystems，USA)。上述混合样品在PCR仪上运行95℃变性5min，将变性后的电泳产物取出，1000rpm/min离心1min后，于AB 3730XL DNA分析仪上进行电泳。利用电泳仪配套的Date Collection Ver.1.0软件收集原始数据，原始数据导入SSR Analyzer软件分析获得片段长度格式的基因型数据。
实施例2利用本发明提供的玉米叶绿体基因组SSR多态位点进行母系溯源分析
待鉴定玉米杂交种A，采用种子发苗形成的绿叶提取DNA，利用本发明中提供的13个SSR位点进行PCR扩增，荧光毛细管电泳，获得指纹数据。具体方法同实施例1。基于A样本(京科968)SSR指纹数据与已知玉米自交系品种叶绿体SSR标记指纹数据库(参考自中国玉米标准DNA指纹数据库对外平台，网址为：www.maizedna.org)进行比对，确定待测样本叶绿体指纹信息与B自交系(京724)相同，推测杂交种A(京科968)的母本为B(京724)。
实施例3利用本发明提供的玉米叶绿体基因组SSR多态位点进行玉米样本正反交的鉴定
待鉴定正反交的杂交种样品C(郑单958)，利用种子发苗的绿叶提取DNA。基于已知玉米自交系品种叶绿体SSR标记指纹数据库中的郑单958父母本的DNA指纹数据，从13个多态SSR位点中选取待测样品郑单958的父母本中具有多态的位点进行PCR扩增，荧光电泳数据分析之后，获得样品C的指纹，具体方法同实施例1。待测样品C指纹数据与其母本(样品D，郑58)、父本(样品E，昌7-2)指纹数据进行比对。如果C样品与D样品即母本的指纹数据相同，则为正交；如果C样品与E样品即父本的指纹数据相同，则为反交。
本发明中涉及的玉米品种13对叶绿体SSR多态位点的指纹数据见表2。
表2玉米品种13对叶绿体多态引物的指纹数据
| 位点编号 | 多态类型 | 京科968(A) | 京724(B) | 郑单958(C) | 郑58(D) | 昌7-2(E) |
| CPMSSRP-01 | (A)12 | (A)11 | (A)11 | (A)11 | (A)11 | (A)12 |
| CPMSSRP-02 | (A)11 | (A)11 | (A)11 | (A)11 | (A)11 | (A)11 |
| CPMSSRP-03 | (T)15 | (T)14 | (T)14 | (T)14 | (T)14 | (T)15 |
| CPMSSRP-04 | (A)12ctc(T)10 | (A)11ctc(T)9 | (A)11ctc(T)9 | (A)11ctc(T)9 | (A)11ctc(T)9 | (A)11ctc(T)9 |
| CPMSSRP-05 | (T)11 | (T)10 | (T)10 | (T)10 | (T)10 | (T)10 |
| CPMSSRP-06 | (T)15 | (T)14 | (T)14 | (T)14 | (T)14 | (T)14 |
| CPMSSRP-07 | (G)14 | (G)12 | (G)12 | (G)12 | (G)12 | (G)9 |
| CPMSSRP-08 | (A)6g(A)11 | (A)6g(A)9 | (A)6g(A)9 | (A)6g(A)9 | (A)6g(A)9 | (A)5g(A)11 |
| CPMSSRP-09 | (T)9 | (T)8 | (T)8 | (T)8 | (T)8 | (T)9 |
| CPMSSRP-10 | (A)4(T)10 | (A)4(T)8 | (A)4(T)8 | (A)4(T)8 | (A)4(T)8 | (A)4(T)8 |
| CPMSSRP-11 | (T)13 | (T)10 | (T)10 | (T)10 | (T)10 | (T)11 |
| CPMSSRP-12 | (A)8 | (A)8 | (A)8 | (A)8 | (A)8 | (A)8 |
| CPMSSRP-13 | (T)10 | (T)9 | (T)9 | (T)9 | (T)9 | (T)10 |
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 玉米叶绿体基因组SSR位点及在品种鉴定中的应用
<130> KHP181112408.6
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (9)
1.玉米叶绿体基因组的SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记为以下13个SSR分子标记的组合，13个SSR分子标记的信息如下：所述B73的版本为Version 3，
2.权利要求1所述的SSR分子标记在构建玉米品种叶绿体DNA指纹数据库中的应用。
3.权利要求1所述的SSR分子标记在玉米样本母系溯源分析中的应用。
4.权利要求1所述SSR分子标记在玉米样本正反交鉴定中的应用。
5.权利要求1所述SSR分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
6.权利要求1所述SSR分子标记在制备玉米基因组芯片中的应用。
7.权利要求1所述SSR分子标记在玉米种质资源鉴定中的应用。
8.权利要求1所述SSR分子标记在玉米胞质遗传研究中的应用。
9.根据权利要求2-8任一所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测玉米样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，进行PCR扩增所述SSR分子标记；
3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物，收集数据进行分析获得基因型数据。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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| analysis of the genus Zea（Poaceae） using polymorphic chloroplast simple sequence repeats;Jim Provan等;《Plant systematic and evolution》;19990930;第218卷;表2 * |
| 用SSR标记研究西南糯玉米种质资源的遗传多样性;刘永建;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20021215;D047-36 * |
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