CN108411020B - 适于毛细管电泳检测平台的一套玉米叶绿体InDel分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供了适于毛细管电泳检测平台的一套玉米叶绿体InDel分子标记，共6个InDel分子标记，并提供一套适于毛细管电泳平台的检测6个InDel分子标记的引物组合及其检测方法。利用这6个InDel分子标记可以：(1)构建玉米品种叶绿体InDel标记指纹数据库；(2)玉米样本母系溯源分析；(3)玉米样本正反交鉴定。通过本发明的叶绿体InDel多态位点及其引物的应用，能够在基因组水平上拓展了玉米可用标记位点的范围；为玉米品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。

Description

适于毛细管电泳检测平台的一套玉米叶绿体InDel分子标记

技术领域

本发明属于农作物分子生物学技术领域，具体地说，涉及适于毛细管电泳检测平台的一套玉米叶绿体InDel分子标记。

背景技术

叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，拥有自身完整的一套基因组，称为叶绿体基因组。叶绿体基因组结构非常保守，DNA一般为双链环状分子，高等植物中叶绿体基因组大小一般为120-160kb。双链环形DNA有4个基本部分组成，分别是大单拷贝区(Largesingle copy region，LSC)，小单拷贝区(small single copy region，SSC)，两个反向重复区(Inverted Repeats,IRs)。

叶绿体基因组信息由于具有以下优势而被广泛应用于植物品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，系统进化，细胞质遗传特性等研究和应用中。(1)叶绿体基因组较小且相对保守，其全序列容易获得；(2)叶绿体基因是母系遗传，不同个体间基因的交换和融合很少发生，叶绿体各基因间有很好的共线性；(3)叶绿体基因组除反向重复区外均为单拷贝基因，几乎不存在旁系同源基因干扰；(4)叶绿体编码区与非编码区进化速度差异显著，存在一些高突变区，可以解决种以下分类单元问题。

在玉米品种、育成材料以及种质资源鉴定的研究和应用中，目前均采用玉米的细胞核基因组的遗传信息。如玉米品种鉴定SSR标记法采用40对SSR引物(王凤格等，2014)；适于玉米DNA指纹分析的芯片maizeSNP3072(Tian et al.,2015)；商业化玉米芯片产品maizeSNP50K(Ganal et al.,2011)；以及基于高通量测序技术的GBS、简化基因组测序方法等。现有玉米样品分子鉴定方法均是基于玉米细胞核基因组序列信息，植物细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，即叶绿体和线粒体基因组信息。并且细胞质基因组信息尤其是叶绿体基因组信息具有上述优点，更加适合于玉米样品的母系溯源等鉴定中。现有玉米基因组多态位点集合中未记载有针对于叶绿体基因组开发的多态位点。

发明内容

本发明的目的是提供适用于玉米母系溯源的一套叶绿体InDel分子标记。

为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型丰富、代表性强的170份玉米自交系材料，对相应材料的叶绿体基因组进行测序并比较其核苷酸多态性，开发玉米叶绿体基因组多态位点。总体思路和步骤如下。(1)170份玉米代表性试验材料的选取，类型包括我国所有杂种优势群，甜糯、地方品种、CMS不育三种类型样品等。(2)高浓度高质量总DNA制备。(3)基于二代测序平台的高通量测序，构建文库大小为500bp、PE140、测序深度为5倍。(4)全基因组序列数据处理、叶绿体基因组拼接，使用两个软件独立拼接，基于玉米B73叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig，进行组装，验证序列准确性。(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定，利用DOGMA软件注释叶绿体基因组。(6)170份材料叶绿体基因组序列进行比对，筛选出11个InDel叶绿体基因组变异位点，11个InDel位点的信息见表1。(7)引物设计，使用primer 6软件，基于毛细管电泳平台进行引物设计。(8)引物评估验证，选取28份各种类型代表性样品基于毛细管电泳平台评估验证上述引物。(9)适于毛细管电泳检测平台的一套InDel多态引物组合获得，基于上述28个样本的试验数据，在以下方面进行评估：引物扩增是否成功，是否反映了母系遗传特征，与测序结果是否一致，是否具有多态。评估结果显示6对引物在毛细管电泳平台上显示了较好的扩增效果，针对11个InDel分子标记的11对引物的扩增结果信息见表2。

本发明提供了用于玉米母系溯源的叶绿体分子标记，所述分子标记为以下11个InDel分子标记的一个或多个，11个InDel分子标记的信息如表1。

表1 11个InDel分子标记的信息

验证成功的6个InDel分子标记CPMIDP01-04,CPMID06-07，分别通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ IDNO.21-22，SEQ ID NO.23-24。

表2 11个InDel分子标记引物与扩增验证结果

进一步地，本发明提供了用于玉米母系溯源的叶绿体分子标记，为表1中编号为CPMIDP01-04,CPMID06-07的InDel分子标记。

本发明提供的上述6对InDel引物可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，每对引物的其中一条的5'端标记荧光集团；配置PCR反应体系加入DNA、引物、dNTP、MgCl₂、Taq酶、Buffer；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。

本发明提供了上述叶绿体分子标记在构建玉米品种叶绿体DNA指纹数据库中的应用。具体可包括如下步骤：(1)提取构建指纹数据库品种的基因组总DNA；(2)利用本发明提供的一套InDel引物，基于荧光毛细管电泳平台，获得叶绿体基因组DNA指纹数据库。

本发明提供了上述叶绿体分子标记在玉米样本母系溯源分析中的应用。本发明提供的用于扩增InDel分子标记的引物是基于玉米叶绿体基因组开发的，为严格母系遗传标记，所以可以应用于玉米样本的母系溯源分析。该应用的前提是在构建了已知玉米自交系品种叶绿体基因组InDel-DNA指纹数据库的基础上。

本发明提供了上述叶绿体分子标记在玉米样本正反交鉴定中的应用。玉米杂交种一般是由两个自交系亲本组成产生的，并且父母本一般情况下属于不同的杂优模式群。本发明基于170个玉米样本的分析显示，除了瑞德/兰卡等少数杂优模式外，多数杂优模式的母本和父本都能够通过叶绿体标记鉴定出来。因此，对于同一个杂交组合采用正反交两种方式生产的种子，能够通过提取总DNA，利用叶绿体标记位点进行鉴定。与以往提取果皮DNA和胚乳DNA的方式相比，本发明的应用方法简便易行。

本发明提供了上述叶绿体分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供了上述叶绿体分子标记在制备玉米基因组芯片中的应用。

本发明提供了上述叶绿体分子标记在玉米杂交后代基因型鉴定中的应用。

本发明提供了上述叶绿体分子标记在玉米种质资源鉴定中的应用。

上述的任一种应用，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述INDEL分子标记，进行PCR扩增；

3)采用荧光毛细管电泳系统检测PCR产物。

上述应用的步骤2)中，PCR反应体系为20μL，包括4μL DNA、0.25μmol/L引物、0.15μmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl₂、1单位Taq酶(Genacea，美国)、1×PCR Buffer。PCR反应程序为94℃5min，94℃40sec，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

电泳及指纹数据获得：PCR产物在毛细管荧光电泳系统AB 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems，USA)上进行电泳，在96孔电泳板的单个孔中分别加入PCR产物、甲酰胺、内标(GeneScanTM-500LIZ，Applied Biosystems，USA)。上述混合样品在PCR仪上运行95℃变性5min，将变性后的电泳产物取出，1000rpm/min离心1min后，于AB 3730XL DNA分析仪上进行电泳。利用电泳仪配套的Date Collection Ver.1.0软件收集原始数据，原始数据导入数据分析软件获得片段长度格式的基因型数据。

本发明的技术关键点在于：

(1)玉米全基因组测序数据分析。由于玉米基因组比较大且复杂，因此处理全基因组测序数据是首先遇到的难点和关键点。本发明中玉米全基因组测序数据分析的步骤为：原始数据质量评估、独立使用SPAdes和SOAPdenovo2两个软件进行拼接、获得高质量拼接的contig，其中序列拼接为关键点，参数设置相对苛刻。

(2)玉米叶绿体基因组数据分离。从总DNA数据中分离得到叶绿体数据是本发明的难点和关键点。由于叶绿体基因组序列相对保守，并且测序质量和长度足够，因此在本发明中叶绿体基因组数据获得是通过拼接的方案，同时结合与玉米叶绿体基因组比对方式。玉米叶绿体基因组数据获得主要步骤为：利用Blast程序筛选叶绿体基因组的contig，使用Sequencher软件组装叶绿体基因组contig，组装好的序列与玉米叶绿体参考基因组(玉米品种B73，Version 3)进行比对验证确认，为获得准确可靠的叶绿体基因组序列提供保障。

(3)叶绿体InDel多态位点确定，是本发明的关键数据和结果。通过代表性样品选取、高质量测序数据、精确数据分析保证获得叶绿体多态位点的准确性和高效性。在本发明中选取来源广泛、表型和基因型丰富的170份材料，基于拼接的170个叶绿体基因组序列，利用MISA软件搜索SSR序列，最终确定叶绿体InDel多态位点，其中不同遗传背景材料，高质量基因序列均是获得准确可靠叶绿体多态位点的重要因素。

本发明针对叶绿体基因组特征，基于高质量的重测序数据开发一套玉米叶绿体基因组多态InDel引物，与核基因组位点标记相比，更适合应用于玉米叶绿体DNA指纹数据库的构建、亲本溯源、正反交鉴定中。通过叶绿体InDel多态位点及其引物的应用，在基因组水平上拓展了玉米可用标记位点的范围；为玉米品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供了新的思路和方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中11个玉米叶绿体INDEL位点开发评估的技术路线图。

图2A-图2D，图2E-图2H分别是采用INDEL分子标记CPMIDP02(SEQ ID NO.15-16)和CPMIDP04分子标记的引物(SEQ ID NO.19-20)对玉米样本郑58(A)、昌7-2(B)、郑单958正交种(C)、郑单958反交种(D)；以及对玉米样本京724(E)、京92(F)、京科968正交种(G)、京科968反交种(H)的正反交中的电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

实施例1玉米叶绿体基因组InDel多态位点及引物的获得

样品选取：选取170份具有广泛代表性的玉米自交系进行全基因组测序。这170份样品包括普通玉米、糯玉米、甜玉米、爆裂玉米等玉米类型；包括了我国所有杂种优势群，唐四平头、旅大红骨、瑞德、兰卡、改良瑞德、改良兰卡、P群以及地方品种。

样品制备：170份玉米样品在培养箱内发苗5天，前3天为无光照条件，后2天为光照条件(即出土之后给予充足光照)。每个样品从30株绿苗中选取叶片并混合，液氮条件下充分研磨。总DNA采用CTAB法提取，并去除RNA。用紫外分光光度计和琼脂糖电泳分别检测所提取DNA的质量。琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有降解；紫外分光光度计检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA没有蛋白污染，RNA含量低)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA盐离子含量低)；DNA浓度大于1000ng/μL。

总DNA高通量测序：对170份玉米样本DNA和PCR产物采用超声打断，切胶回收400-600bp的DNA片段，利用

的建库试剂盒构建500bp大小的文库，利用Hiseq4000PE150的测序平台进行测序，测序深度为5倍，平均每个样本获得约10GB数据。

高通量测序数据处理、叶绿体基因组拼接：高通量测序数据分别独立使用SPAdes(Bankevich et al.,2012)和SOAPdenovo2(Luo et al.,2012)两个软件进行拼接。对于每个软件拼接的contig利用Blast程序进行筛选出叶绿体基因组的contig(Altschul etal.,1997)；筛选出的叶绿体基因组contig使用Sequencher进行组装。然后使用Geneious8.1(Kearse et al.,2012)把所有的reads map到拼接好的叶绿体基因组序列上，验证拼接成的contig序列是否正确。

叶绿体基因组注释、多态位点确定：叶绿体基因组注释用DOGMA(Dual OrganellarGeno Me Annotator)(Wyman et al.,2004)进行，用BLASTX和BLASTN搜索鉴定编码基因的位置。170个玉米叶绿体基因组用MAFFT软件进行比对(Katoh and Standley,2013)，然后用Se-al软件进行手工调整比对结果。对于序列里面出现的倒位比对的原则是进行拉开，以免造成错误的数据多态性。利用DnaSp 5.0统计两个叶绿体基因组中的变异位点和序列多态性(Librado and Rozas,2009)，开发获得11个INDEL多态位点。这11个位点的物理位置和侧翼序列是基于玉米品种B73的叶绿体基因组序列确定的，所述的11个位点具体信息见表1。

引物设计与评估：使用primer 6软件，基于毛细管电泳平台进行引物设计，正向引物5'端修饰FAM荧光。引物评估验证，选取28份各种类型代表性样品在以下方面进行评估：引物扩增是否成功，是否反映了母系遗传特征，与测序结果是否一致，是否具有多态。评估结果显示6对引物在毛细管电泳平台上显示了较好的扩增效果。

PCR扩增：反应体系为20μL，包括4μL DNA、0.25μmol/L引物、0.15μmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl2、1单位Taq酶(Genacea，美国)、1×PCR Buffer。扩增程序为94℃5min，94℃40sec，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

电泳及指纹数据获得：PCR产物在毛细管荧光电泳系统AB 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems，USA)上进行电泳，在96孔电泳板的单个孔中分别加入PCR产物、甲酰胺、内标(GeneScanTM-500LIZ，Applied Biosystems，USA)。上述混合样品在PCR仪上运行95℃变性5min，将变性后的电泳产物取出，1000rpm/min离心1min后，于AB 3730XL DNA分析仪上进行电泳。利用电泳仪配套的Date Collection Ver.1.0软件收集原始数据，原始数据导入数据分析软件获得片段长度格式的基因型数据。

本发明11个玉米叶绿体INDEL位点开发评估的技术路线图见图1。针对获得的11个InDel分子标记设计了扩增引物并进行了引物扩增效果验证，扩增结果信息见表2。验证成功的6个InDel分子标记CPMIDP01-04,CPMID06-07，分别通过以下引物扩增得到：SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQID NO.23-24。

图2A-图2D，图2E-图2H分别是采用CPMIDP02和CPMIDP04分子标记的引物对玉米样本郑58、昌7-2、郑单958正交种、郑单958反交种；以及对玉米样本京724、京92、京科968正交种、京科968反交种的正反交鉴定的结果。

实施例2利用本发明提供的InDel多态引物构建玉米品种叶绿体DNA-InDel指纹数据库

玉米品种DNA提取：每个样品采用种子发苗、给予光照、形成绿苗。DNA提取采取混株提取DNA的方式，混合了30个单株的绿叶，DNA提取具体步骤按照玉米DNA分子鉴定标准执行(王凤格等，2014)。稀释DNA形成工作液，浓度为20ng/μL。

引物合成：根据表2提供的验证成功的6对引物序列，即实施例1确定的6对引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQ ID NO.23-24合成引物；每对引物其中的一条的5'端标记荧光集团。

PCR扩增：PCR反应体系为20μL，包括4μL DNA、0.25μmol/L引物、0.15μmol/L dNTP、2.5mmol/L MgCl₂、1单位Taq酶(Genacea，美国)、1×PCR Buffer。PCR反应程序为94℃5min，94℃40sec，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min，4℃保存。

电泳及指纹数据获得：PCR产物在毛细管荧光电泳系统AB 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems，USA)上进行电泳，在96孔电泳板的单个孔中分别加入PCR产物、甲酰胺、内标(GeneScanTM-500LIZ，Applied Biosystems，USA)。上述混合样品在PCR仪上运行95℃变性5min，将变性后的电泳产物取出，1000rpm/min离心1min后，于AB 3730XL DNA分析仪上进行电泳。利用电泳仪配套的Date Collection Ver.1.0软件收集原始数据，原始数据导入数据分析软件获得片段长度格式的基因型数据。

实施例3利用本发明提供的玉米叶绿体基因组InDel多态引物进行母系溯源分析

待鉴定玉米杂交种A，采用种子发苗的绿叶提取DNA，利用本发明中实施例1确定的6对验证成功的InDel多态引物进行PCR扩增，荧光毛细管电泳，获得指纹数据。具体方法同实施例2。基于A样本(京科968)InDel指纹数据与已知玉米自交系品种叶绿体InDel标记指纹数据库进行比对，确定待测样本叶绿体指纹信息与B自交系(京724)相同，推测杂交种A(京科968)的母本为B(京724)。

实施例4利用本发明提供的玉米叶绿体基因组InDel多态引物进行玉米样本正反交的鉴定

待鉴定正反交的杂交种样品C(郑单958)，利用种子发苗的绿叶提取DNA。基于已知玉米自交系品种叶绿体InDel标记指纹数据库中的郑单958父母本的DNA指纹数据，从实施例1确定的6对验证成功的InDel多态引物中选取待测样品郑单958的父母本中具有多态的引物进行PCR扩增，荧光电泳数据分析之后，获得样品C的指纹，具体方法同实施例2。待测样品C指纹数据与其母本(样品D，郑58)、父本(样品E，昌7-2)指纹数据进行比对。如果C样品与D样品即母本的指纹数据相同，则为正交；如果C样品与E样品即父本的指纹数据相同，则为反交。

本发明中涉及的玉米品种6对叶绿体InDel多态引物的指纹数据见表3。

表3玉米品种6对叶绿体多态引物的指纹数据

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于玉米母系溯源的叶绿体分子标记，其特征在于，所述分子标记为以下:5个InDel分子标记的一个或多个，5个InDel分子标记的信息如下：

2.根据权利要求1所述的叶绿体分子标记，其特征在于，所述5个InDel分子标记自上而下，分别通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQ ID NO.23-24。

3.权利要求1或2所述的叶绿体分子标记在构建玉米品种叶绿体DNA指纹数据库中的应用。

4.权利要求1或2所述的叶绿体分子标记在玉米样本母系溯源分析中的应用。

5.权利要求1或2所述叶绿体分子标记在玉米样本正反交鉴定中的应用。

6.权利要求1或2所述叶绿体分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。

7.权利要求1或2所述叶绿体分子标记在制备玉米基因组芯片中的应用。

8.权利要求1或2所述叶绿体分子标记在玉米杂交后代基因型鉴定中的应用。

9.权利要求1或2所述叶绿体分子标记在玉米种质资源鉴定中的应用。

10.根据权利要求3-9任一所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测玉米样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，根据所述INDEL分子标记，进行PCR扩增；

3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。

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