CN108414654B - 基于spe柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于SPE柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法，首先利用反相/离子交换混合模式色谱填料的固相萃取柱对预处理后的水样浓缩富集，然后利用高效液相色谱串联质谱(HPLC‑MS/MS)进行分析检测，最后，根据样品的分析色谱图以及每种抗生素的标准工作曲线确定水样中喹诺酮类抗生素的浓度。与现有技术相比，本发明采用SPE‑HPLC‑MS/MS实现了饮用水中痕(微)量典型喹诺酮类抗生素的同时富集检测，检测结果精度可靠，检出限低，相对标准偏差小等，且本方法可有效的应用于粪便、土壤、地表水和饮用水中痕(微)量喹诺酮的检测和定量分析。

Description

基于SPE柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法

技术领域

本发明涉及水环境中痕(微)量有机污染物检测分析技术，尤其是涉及一种基于反相/离子交换混合模式色谱填料的新型SPE柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法。

背景技术

喹诺酮类(Quinolones,QNs)抗生素作为一种人工合成的具有广谱抗性、抗菌力强、穿透力强、高效低毒、半衰期长的的一类抗生素，被广泛应用于人类、畜牧养殖等存在的细菌性疾病的预防和治疗。但是由于QNs抗生素在生物体内仅有很少一部分被生物吸收降解，绝大部分以母体形式排除体外，通过地表径流在自然界中迁移进入饮用水环境中直接影响人类健康，同时环境中喹诺酮的积累能够诱发环境细菌的耐药性造成部分药物“失效”。因此，饮用水源地中QNs抗生素残留情况越来越多的受到人类的关注。

目前QNs抗生素在地表水、水厂中普遍被检出，其中NOR、OFL、ENR、CIP、LOM等在水环境中检出频率高，检出浓度大，部分水厂中也有部分的残留，甚至部分兽药类喹诺酮在人类尿液中检出，如NOR、OFL、CIP、ENR等(Wang H,Wang N,Wang B.,et al.Antibioticsdetected in urines and adipogenesis in school children[J].EnvironmentInternational,2016,89-90:204-211)。因此，建立饮用水源水中QNs抗生素精确的检测分析方法是对其开展有效控制的基础和前提。

虽然目前国内外在QNs抗生素检测分析方法上已开展诸多研究，但多数检测方法只能针对动物源性QNs抗生素分析，检出限相对较高。如中国专利号CN101315351A公开了一种同时检测19种QNs药物的测定方法。所述方法采用乙腈对动物组织样品进行提取，用诺氟沙星-D₅作为样品内标，处理后的样品用HPLC-ESI-MS/MS分析样品浓度。但该方法样品提取后不经富集直接进样测定，适用浓度较高，不适用于饮用水源地痕量QNs抗生素分析。

中国专利号CN104730168A公开了一种水环境中残留的四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素同步检测的方法。所述方法涉及一种水环境中残留抗生素富集检测技术，具体涉及一种采用HLB固相萃取和高效液相色谱串联质谱对水体残留四环素类，氟喹诺酮类和磺胺类抗生素等21种抗生素同时检测的方法。该方法虽然可以检测环境水体中痕量抗生素的残留情况，但是该方法兼顾抗生素种类较多，不同种类抗生素之间存在干扰，对QNs抗生素不够灵敏。

中国专利号CN101696964A公开了一种氟喹诺酮类抗生素的固相萃取与HPLC-荧光检测方法。所述方法涉及氟喹诺酮类抗生素检测技术，具体涉及一种固相萃取与HPLC-荧光检测对水环境样品中OFL、CIP、NOR和ENR等4种典型QNs抗生素的检测方法。该方法采用C18键合硅胶固相萃取柱富集水样中的抗生素，用浓氨体积比为6％的浓氨甲醇溶液洗脱三次，氮吹定容至1mL，利用HPLC-荧光检测分析样品中喹诺酮的浓度。该方法较上一种方法操作简单，成本低，对喹诺酮类抗生素针对性强，但就目前水环境中可能残留的喹诺酮类物质而言，仅针对4种喹诺酮类抗生素，检测种类较少。

目前饮用水环境中残留的抗生素情况受到广泛的关注，但是针对QNs抗生素检测方法检出限较高，研究种类较少，回收率相对较低，本发明方法恰好填补了这一空白，针对水环境中QNs抗生素进行分析检测，可以实现一次性定量分析饮用水中痕量喹诺酮的同时检测，极大提高了检测效率。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于SPE柱同时富集检测饮用水中QNs抗生素的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种基于SPE柱同时富集检测饮用水中QNs抗生素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：

取测试水样过滤除去悬浮物，调节pH并加入络合剂，再加入内标物，完成预处理；

(2)目标物喹诺酮浓缩富集：

先对SPE小柱进行活化，再将步骤(1)得到的预处理后的水样过柱萃取富集，接着取淋洗液淋洗SPE小柱，并真空干燥除去水分，再继续用洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，在氮气流下吹干，并用有机溶液定容，纯化后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)标准工作曲线制作：

以每种喹诺酮与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种喹诺酮定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制每种QNs抗生素的标准工作曲线；

(4)分析检测：

采用HPLC-MS/MS分析步骤(2)中浓缩富集、定容纯化后的样品，确定样品中各目标物的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，再将该峰面积比值代入步骤(3)得到的标准工作曲线中，即得到各目标物与相应内标物浓度比值，最后，将得到的浓度比值乘以步骤(1)加入的各内标物的浓度，即得到测试水样中各喹诺酮类抗生素的含量。

优选的，所述的目标物喹诺酮类抗生素为诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、达氟沙星(Danofloxacin,DOF)、洛美沙星(Lomefloxacin,LOM)、沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)、氟甲喹(Flumequine,FJK)和恶喹酸(Oxolinic acid,OXO)共9种典型QNs抗生素，所选9种目标抗生素目前使用量较大，在水源地及自来水厂中检出频率高，其中的氟甲喹和恶喹酸属于典型酸性喹诺酮，其余7种属于典型哌嗪喹诺酮，具有很好的代表性。

更优选的，步骤(3)中HPLC-MS/MS分析时，

液相色谱运行参数为：

有机相为0.05％-0.3％甲酸/乙腈溶液(v/v)，水相为0.05％-0.3％甲酸/纯水溶液(v/v)，梯度洗脱程序为：0-5min时，水相/有机相的体积比由85％/15％线性降低到75％/25％，在13min时降低到55％/45％，14min时降低到15％/85％，并保持1.5min，17min时回到65％/35％并持续上升，18.5min时回到85％/15％并保持0.5min；进样流速为0.4mL/min，进样体积为5-10μL。

更优选的，步骤(3)中HPLC-MS/MS分析时，

质谱的运行参数为：

采用正电喷雾电离源(ESI+)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi。

更优选的，质谱运行时，在多反应监测(MRM)模式下，通过母离子和两个子离子三个特征离子，对目标物喹诺酮进行定性定量分析，其中，NOR、CIP、OFL、ENR、DOF、LOM、SAR、FJK、OXO的碎裂电压(V)/子离子一(子离子二)碰撞能(eV)分别为125/18(24)，125/16(12)，115/18(26)，110/16(24)，135/22(22)，115/22(24)，130/20(25)，110/30(15)，100/16(30)。

进一步更优选的，液相色谱运行过程中：

有机流动相为体积比为0.1％/99.9％的甲酸/乙腈溶液；

水相为0.1％/99.9％的甲酸/水溶液。

优选的，步骤(1)中预处理过程中：

过滤采用0.45μm的玻璃纤维膜作为滤膜，pH值调节为5.0-9.5，络合剂选用Na₂EDTA，9种目标QNs抗生素的内标物选用100μg/L环丙沙星-D₈。

优选的，步骤(1)中调节测试水样pH值所用试剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液。

优选的，步骤(2)中所述的SPE小柱为反相/离子交换混合模式色谱填料固相萃取柱(HCE-C18)。该填料是在硅胶表面键合C18、C8等烷基链和正电荷制备而成(Guo Z,WangC,Liang T,et al.Polar-copolymerized approach based on horizontalpolymerization on silica surface for preparation of polar-modified stationaryphases[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(27):4555-4560.)，可购自中国华谱新创科技有限公司(货号为SC18HCE-0506A)。

优选的，步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

SPE小柱活化依次采用5mL等体积的甲醇和超纯水过柱活化。

优选的，步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

淋洗液采用1％-8％的甲醇/水溶液(v/v)。

优选的，步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

真空干燥的时间为15-30min。

优选的，步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

所述的洗脱溶剂选用0.05％-3％的甲酸/甲醇溶液(v/v)。

优选的，步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

氮气流吹干时控制洗脱液的温度为35℃。

优选的，步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

定容用的有机溶液采用40-80％的甲醇/水溶液(v/v)。

优选的，步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

定容后采用0.22μm尼龙针式过滤器过滤纯化。

优选的，步骤(3)中标准工作曲线的绘制过程具体如下：

(a)：用甲醇将不同喹诺酮抗生素混合配制成单种喹诺酮抗生素浓度已知并相同的混合标准储备液，置于棕色试剂瓶中；

(b)：用40-80％的甲醇/水溶液(v/v)将步骤(a)所得混合标准储备液稀释为多组不同浓度梯度的样品，同时向各组浓度梯度样品中分别加入相应内标物，并保证内标物在不同浓度梯度样品中的浓度一致；

(c)：采用LC-MS/MS对各浓度梯度样品进行分析，以每种喹诺酮与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种喹诺酮的定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，即可绘制不同喹诺酮的标准工作曲线。

优选的，采用LC-MS/MS对样品进行分析时，定量子离子峰面积的确定方法为：1)用全扫描监测模式(SCAN)确定目标物母离子(m/z)；2)用选择离子监测模式(SIM)对母离子的碎裂电压和加速电压进行优化，确保目标物母离子在最佳状态下(即目标峰面积最大)进入碰撞室；3)在子离子扫描模式(Product Scan)模式下，通过预设碰撞能，筛选母离子经碰撞破裂后响应度最大的两个特征子离子(m/z)；4)用多反应监测模式(MRM)进一步优化碰撞能，确保以母离子和特征子离子为离子对的目标物峰面积最大；5)最终在MRM模式及最优条件下，记录以目标喹诺酮的母离子和特征子离子为离子对所对应的出峰面积，即为对应喹诺酮的定量子离子峰面积。

更优选的，步骤(b)不同浓度梯度样品包括对应喹诺酮浓度分别为1、2、5、10、20、50、80、100和200μg/L的样品。

本发明通过对样品前处理浓缩富集和LC-MS/MS仪器检测条件和参数的探索和优化，实现了饮用水中痕(微)量典型QNs的同时富集检测，大大节省了测样时间，降低了检测成本。在前处理过程中，通过对内标物投加量、固相萃取柱填料、水样pH和洗脱溶剂的选择和优化，综合提高了QNs的回收率，并改善了后续检测中不同QNs和内标物的出峰情况；在仪器分析检测过程中，通过对液相色谱进样条件及质谱检测参数的优化，确保了9种QNs和三种内标物的峰形和分离度，从而获得了较低的检出限和较小的相对标准偏差。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)选择反相/离子交换混合模式色谱填料(HCE-C18)固相萃取柱对9种QNs同时进行富集纯化，满足回收率在80％-120％之间，且效果稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标物有效分离富集的目的，实现了多种QNs的同时富集检测。

(2)采用LC-MS/MS进行定量分析检测，灵敏度高，QNs的检出限均低于2ng/L，定量限均低于5ng/L，能够满足对饮用水中痕量内QNs的检测要求。此外，串联三重四级杆质谱仪根据由对应母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定量分析，选择性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰。

(3)采用内标标准曲线法测定QNs的浓度，线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度。

(4)前处理过程操作简单，环境友好。

附图说明

图1为本发明的分析流程示意图；

图2为本发明中不同SPE填料对目标物回收率的影响图；

图3为本发明中不同pH条件下诺氟沙星在反相/离子交换混合模式色谱填料液相穿透曲线；

图4为本发明中不同水样pH值对目标物回收率的影响图；

图5为本发明中不同洗脱溶剂对目标物回收率的影响图；

图6为本发明中最佳条件下目标物的回收率图；

图7为本发明中目标物QNs的混合标准溶液(100μg/L)的总离子流图；

图8、图9和图10均为本发明中各目标物QNs及相应内标物的提取色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

采用如图1所示的分析方法流程，对饮用水中喹诺酮类同时进行检测，包括以下步骤：

(1)样品预处理：

取测试水样过滤除去悬浮物，调节pH并加入络合剂，再加入内标物，完成预处理；

(2)目标物喹诺酮浓缩富集：

先对SPE小柱进行活化，再将步骤(1)得到的预处理后的水样过柱萃取富集，接着取淋洗液淋洗SPE小柱，并真空干燥除去水分，再继续用洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，在氮气流下吹干，并用有机溶液定容，纯化后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)标准工作曲线制作：

以每种喹诺酮与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种喹诺酮定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制每种喹诺酮类抗生素的标准工作曲线；

(4)分析检测：

采用HPLC-MS/MS分析步骤(2)中浓缩富集、定容纯化后的样品，确定样品中各目标物的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，再将该峰面积比值代入步骤(3)得到的标准工作曲线中，即得到各目标物与相应内标物浓度比值，最后，将得到的浓度比值乘以步骤(1)加入的各内标物的浓度，即得到测试水样中各喹诺酮类抗生素的含量。

上述检测方法中还包括样品前处理优化与检测方法优化，其中，样品前处理优化包括SPE填料、最佳pH和洗脱溶剂的确定。检测方法中各条件优化包括液相色谱条件优化和质谱运行参数优化。

其中，上述优化的具体步骤如下：

1、样品前处理：

1.1SPE小柱填料的确定

固相萃取柱的选择取决于柱填料与目标物上官能团的相互作用，为实现每种QNs富集效率最大化，本发明根据经验总结选择了三种不同柱填料(Isolute C18、反相/离子交换混合模式色谱填料(HCE-C18)和Oasis HLB)的萃取效果，结果见图2。实验结果表明：在三种SPE柱中，经过反相/离子交换混合模式色谱填料固相萃取柱富集时，绝大多数的目标QNs的萃取回收率位于或接近50％-70％范围，可实现对QNs的有效富集且满足环境样品加标回收率的控制限要求。

其中，优选萃取柱的反相/离子交换混合模式色谱填料经液相快速预测和优化其对喹诺酮类抗生素穿透体积，进而预测反相/离子交换混合模式色谱填料材料对喹诺酮类抗生素的富集倍数。具体为：取确定质量的反相/离子交换混合模式色谱填料填充在空色谱柱中，压实活化备用。以确定浓度的目标样品为水相，甲醇为有机相，绘制反相/离子交换混合模式色谱填料对目标物质的吸附效果。优选的萃取柱类型可保证目标QNs的良好富集度和回收率，优选活化方式可最大程度提高萃取柱内填料对目标QNs的吸附和洗脱效果、提高回收率，优选淋洗方式可在最大限度减少目标QNs流失的同时除去萃取柱填料内的杂质、减少后续检测的干扰，优选洗脱方式可确保将萃取柱上富集的目标QNs最大限度洗脱下来、提高目标物的回收率，优选氮吹方式可保证洗脱溶剂快速挥发的同时最大限度减少目标QNs的损失，优选有机溶液可保证氮气吹干后附着于容器壁上的目标QNs完全溶解混合、便于后续仪器进样分析。

同时本方法以目标物质为水相反相/离子交换混合模式色谱填料材料为色谱柱填充材料，绘制穿透曲线如图3所示，实验结果表明，不同pH条件下反相/离子交换混合模式色谱填料材料具有不同的穿透曲线，反相/离子交换混合模式色谱填料很难对pH＝3条件的目标喹诺酮类抗生素保留，0时刻后样品即开始穿透；pH＝5、pH＝7和pH＝8的条件下样品能够在反相/离子交换混合模式色谱填料中得到很好的保存，于15min后开始穿透，保留时间较长，通过反相/离子交换混合模式色谱填料填料体积、进样流速和穿透时间可以估算反相/离子交换混合模式色谱填料材料对喹诺酮的富集量大约为53μg/g，这对饮用水环境残留的痕量(纳克)抗生素能够有效吸附且不会穿透。因此，可确定反相/离子交换混合模式色谱填料适用于饮用水中痕量喹诺酮类抗生素检测。

1.2最佳pH的确定

由于目标QNs多为含酚羟基的弱酸性化合物，故本发明选择水样pH为3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、11.0进行优化，分别代表强酸性条件，弱酸性条件，中性条件，结果见图4。实验结果表明：pH为8.0时，有更多的目标喹诺酮类的萃取回收率在60％-80％范围内，且实验结果与液相预测实验结果相同，因此本发明选择pH值为8.0的水样条件完成对目标QNs的萃取和富集。

1.3洗脱溶剂的确定

为了保证目标物能最大程度的被洗脱下来，本发明考察了不同洗脱溶剂对目标物回收率的影响。洗脱溶剂分别有甲醇，乙腈，甲酸：甲醇(0.1％:99.9％,v/v)。弱酸能很好的将反相/离子交换混合模式色谱填料材料吸附的喹诺酮类物质分离，结果见图5。实验结果表明：当洗脱溶剂为乙腈目标物的回收率最低，部分物质回收率低于40％；当洗脱溶剂为甲酸/甲醇(两者混合比值最优选为0.1％:99.9％,v/v)时，目标物的回收率最高，基本达到80％-120％之间，并且符合定量要求；当洗脱溶剂为甲醇时，洗脱时间和目标物的回收率位于前两者之间。因此本发明的最优选择的洗脱溶剂为甲酸：甲醇(0.1％:99.9％,v/v)。

最佳条件下纯水加标回收率如图6所示。

2.检测方法优化

2.1液相色谱条件优化

为了实现色谱峰分离并提高信号强度，本发明对流动相、流速、进样量及梯度洗脱程序等影响液相分离的关键因素分别做了优化。本发明采用的液相色谱检测条件如下：

流动相A(即有机相)：含有0.05％-0.3％甲酸的乙腈溶液(甲酸/乙腈：0.1％/99.9％，v/v)，流动相B(即水相)：含有0.05％-0.3％甲酸的纯水(甲酸/水：0.1％/99.9％，v/v)；流速：0.4mL/min；进样量：5-10μL；柱温：35℃；梯度洗脱程序：0-5min，85％的B流动相线性降低到75％，5-13min线性降低到55％并持续下降，14min下降到15％并保持1.5min，在17min回到65％且持续上升，18.5min上升到85％，持续0.5min。

进样流速为0.4mL/min，进样体积为5-10μL；

2.2质谱运行参数优化

液相色谱-串联质谱仪能够利用特征碎片离子准确定量，为此，需要优化碎裂电压和碰撞能，以获得最佳分子离子-碎片离子对，使后续对实际水样的检测分析更加精确。本发明采用的质谱运行参数如下：

电离方式：ESI+；干燥气温度：350℃；气体流速：11L/min；毛细管电压：4000v(ESI+)、3000v(ESI-)；雾化器压力：15psi。

本发明选用CIP-D₈作为QNs的内标物，采用内标法定量。内标物与目标物在相同的色谱时间段被洗脱，且在电喷雾电离源模式下响应良好无明显基质干扰。因此，上述内标物是本发明中十分理想的内标物质。在此基础上，以100μg/L为代表的9种喹诺酮类抗生素在ESI正离子模式下的总离子流色谱图见图7。虽然总离子流图中仅有8个色谱峰，但由于串联质谱中是由定量子离子的提取色谱峰面积与浓度关系定量，所以有个别物质的总离子流色谱峰重叠，但并不会影响对该目标物质的分析测定。以100μg/L为代表的8种喹诺酮类抗生素及内标物的HPLC-MS/MS提取色谱图见图8、图9和图10。由此可见，每一种目标物在该优化条件下的提取色谱峰峰形完好，响应值高，为后续水源水中抗生素的定量分析工作提供了可靠保证。

此外，除了采用内标标准曲线外，串联质谱仪利用信号响应强度最大的特征碎片离子作为定量离子，各物质的定量离子见表1。

表1 目标喹诺酮类抗生素质谱参数

实施例1

一种基于反相/离子交换混合模式色谱填料新型SPE柱同时富集检测饮用水中典型喹诺酮类抗生素的方法，其标准工作曲线制作具体步骤如下：

(a)配制混合标准储备液：用40％-80％甲醇/水溶液(v/v)将已知浓度的9种QNs混合配制成单种QNs浓度分别相同的混合标准储备液，置于棕色试剂瓶中；

(b)用40％-80％甲醇/水溶液(v/v)将步骤(a)中混合标准储备液稀释为不同浓度梯度：1、2、5、10、20、50、80、100和200μg/L，同时向各浓度梯度样品中加入CIP-D₈配成100μg/L内标工作溶液；

(c)采用LC-MS/MS对各浓度梯度样品进行分析，采用上述优化后的液相色谱运行参数和质谱运行参数运行LC-MS/MS，以每种QNs与相应内标物浓度比值为横坐标，以分析得出的每种QNs定量子离子与内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制三类QNs的标准工作曲线。

方法检出限与方法定量限通过信噪比(Signal-to-noise，S/N)来计算，以3倍信噪比为方法检出限(Limit of detection，LOD)，10倍信噪比为方法定量限(Limit ofquantitation，LOQ)。本方法的线性范围、相关系数、检出限和定量限结果列于表2。

结果表明目标物质在优化的仪器条件下线性相关性良好，线性相关系数R²>0.98。目标物质的方法检出限范围为0.01-1.36ng/L，方法定量限范围为0.03-4.53ng/L，低浓度水平的检出限与定量限保证了该分析方法检测水环境中痕量QNs的可能性。

表2 目标喹诺酮类抗生素检出限和定量限

实施例2

一种基于反相/离子交换混合模式色谱填料新型SPE柱同时富集检测饮用水中典型的9种喹诺酮同类抗生素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：

选取华东地区某水源地水样，采用0.45μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调pH为5.0-9.5并加入络合剂Na₂EDTA，再加入已知量的100μg/L的内标，完成预处理；

(2)目标物QNs浓缩富集：

先用5-10mL等体积的甲醇和超纯水依次通过SPE小柱(本实施例选用反相/离子交换混合模式色谱填料固相萃取小柱)进行活化，再取500mL步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取4％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥15-30min除去水分，之后继续用8mL甲酸/甲醇溶液(0.1％/99.9％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为35℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm尼龙针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)仪器分析检测：

采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机相为甲酸的乙腈溶液(甲酸/乙腈为0.1％/99.9％，v/v)，水相为含有甲酸的纯水(本实施例中甲酸/水：0.1％/99.9％，v/v)；梯度洗脱程序：0到5min，85％的水相流动相线性降低到75％，在13min时降低到55％，14min降低到15％并保持1.5min；16min回到85％进样流速为0.4mL/min，进样体积为5-10μL；质谱的运行参数为：采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测(SIM)模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。

根据LC-MS/MS分析结果确定样品中各目标物QNs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合实施例1所绘制的标准工作曲线，得到样品中各QNs与相应内标物浓度比值，再结合步骤(1)加入的已知的各内标物的浓度，即可确定样品中各QNs的含量。

最后，所得华东地区饮用水样品在本实施例检测操作条件下的分析检测结果和回收率见表3。

表3 华东地区某水源地QNs残留情况及回收率

实验结果表明：所建方法已成功应用于华东地区某水源水中QNs残留的分析检测，在所有目标QNs均在水源地中检出，且NOR、CIP、ENR、DOF,等检出浓度相对于其他抗生素较高。

实施例3

一种基于反相/离子交换混合模式色谱填料新型SPE柱同时富集检测饮用水中典型的9种喹诺酮同类抗生素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：

选取华东地区某水源地水样，采用0.45μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调pH为5.0-9.5并加入络合剂Na₂EDTA，再加入已知量的100μg/L的内标，完成预处理；

(2)目标物QNs浓缩富集：

先用5-10mL等体积的甲醇和超纯水依次通过SPE小柱(本实施例选用反相/离子交换混合模式色谱填料固相萃取小柱)进行活化，再取500mL步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取1％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥15-30min除去水分，之后继续用5mL甲酸/甲醇溶液(0.1％/99.9％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为35℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm尼龙针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)仪器分析检测：

采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机相为含有0.05％(v/v)甲酸的乙腈溶液，水相为含有0.05％(v/v)甲酸的纯水溶液；梯度洗脱程序：0到5min，85％的水相流动相线性降低到75％，在13min时降低到55％，14min降低到15％并保持1.5min；16min回到85％进样流速为0.4mL/min，进样体积为5-10μL；质谱的运行参数为：采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测(SIM)模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。

根据LC-MS/MS分析结果确定样品中各目标物QNs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合实施例1所绘制的标准工作曲线，得到样品中各QNs与相应内标物浓度比值，再结合步骤(1)加入的已知的各内标物的浓度，即可确定样品中各QNs的含量。

实施例4

一种基于反相/离子交换混合模式色谱填料新型SPE柱同时富集检测饮用水中典型的9种喹诺酮同类抗生素的方法，包括以下步骤：

(1)样品预处理：

选取华东地区某水源地水样，采用0.45μm的玻璃纤维膜作为滤膜过滤除去悬浮物，调pH为5.0-9.5并加入络合剂Na₂EDTA，再加入已知量的100μg/L的内标，完成预处理；

(2)目标物QNs浓缩富集：

先用5-10mL等体积的甲醇和超纯水依次通过SPE小柱(本实施例选用反相/离子交换混合模式色谱填料固相萃取小柱)进行活化，再取500mL步骤(1)预处理后的水样过柱萃取富集，然后取8％的甲醇/水溶液(v/v)作为淋洗液淋洗小柱，并真空干燥15-30min除去水分，之后继续用5mL甲酸/甲醇溶液(0.1％/99.9％，v/v)作为洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，控制其水浴温度为35℃，在氮气流下吹干，并用50％甲醇/水溶液(v/v)溶解残留物并定容，最后，将其采用0.22μm尼龙针式过滤器过滤后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)仪器分析检测：

采用LC-MS/MS分析步骤(2)浓缩富集后的样品，设置液相色谱运行参数为：有机相为含有0.3％(v/v)甲酸的乙腈溶液，水相为含有0.3％(v/v)甲酸的纯水溶液；梯度洗脱程序：0到5min，85％的水相流动相线性降低到75％，在13min时降低到55％，14min降低到15％并保持1.5min；16min回到85％进样流速为0.4mL/min，进样体积为5-10μL；质谱的运行参数为：采用正电喷雾电离源(ESI+)和负电喷雾电离源(ESI-)，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；同时采用全扫描SCAN、选择离子监测(SIM)模式、子离子扫描Product Ion和多反应监测MRM模式记录。

根据LC-MS/MS分析结果确定样品中各目标物QNs的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，结合实施例1所绘制的标准工作曲线，得到样品中各QNs与相应内标物浓度比值，再结合步骤(1)加入的已知的各内标物的浓度，即可确定样品中各QNs的含量。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种基于SPE柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品预处理：

取测试水样过滤除去悬浮物，调节pH并加入络合剂，再加入内标物，完成预处理；

(2)目标物喹诺酮浓缩富集：

先对SPE小柱进行活化，再将步骤(1)得到的预处理后的水样过柱萃取富集，接着取淋洗液淋洗SPE小柱，并真空干燥除去水分，再继续用洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液，在氮气流下吹干，并用有机溶液定容，纯化后转移至棕色进样瓶中待测；

(3)标准工作曲线制作：

以每种喹诺酮与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种喹诺酮定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，分别绘制每种喹诺酮类抗生素的标准工作曲线；

(4)分析检测：

采用HPLC-MS/MS分析步骤(2)中浓缩富集、定容纯化后的样品，确定样品中各目标物的定量子离子与相应内标物的峰面积比值，再将该峰面积比值代入步骤(3)得到的标准工作曲线中，即得到各目标物与相应内标物浓度比值，最后，将得到的浓度比值乘以步骤(1)加入的各内标物的浓度，即得到测试水样中各喹诺酮类抗生素的含量；

步骤(1)中预处理过程中：

过滤采用0.45μm的玻璃纤维膜作为滤膜，pH值调节为5.0-9.5，络合剂选用Na₂EDTA，内标物选用100μg/L环丙沙星-D₈；

步骤(1)中调节测试水样pH值所用试剂为氢氧化钠和/或磷酸盐缓冲溶液；

步骤(2)中所述的SPE小柱为反相/离子交换混合模式色谱填料固相萃取柱HCE-C18；

步骤(2)的目标物喹诺酮浓缩富集中：

SPE小柱活化依次采用5mL等体积的甲醇和超纯水过柱活化；

淋洗液采用1％-8％的甲醇/水溶液，v/v；

真空干燥的时间为15-30min；

所述的洗脱溶剂选用0.05％-3％的甲酸/甲醇溶液，v/v；

氮气流吹干时控制洗脱液的温度为35℃；

定容用的有机溶液采用40％-80％的甲醇/水溶液，v/v；

定容后采用0.22μm尼龙针式过滤器过滤纯化；

所述的目标物喹诺酮类抗生素为诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、氟甲喹和恶喹酸；

步骤(3)中HPLC-MS/MS分析时，

液相色谱运行参数为：

有机流动相为体积比为0.1％：99.9％的甲酸/乙腈溶液；

水相为体积比0.1％：99.9％的甲酸/水溶液，梯度洗脱程序为：0-5min时，水相/有机相的体积比由85％/15％线性降低到75％/25％，在13min时降低到55％/45％，14min时降低到15％/85％，并保持1.5min，17min时回到65％/35％并持续上升，18.5min时回到85％/15％并保持0.5min；进样流速为0.4mL/min，进样体积为5-10μL；

质谱的运行参数为：

采用正电喷雾电离源，干燥气温度为350℃；气体流为11L/min；正电离模式毛细管电压4000v；负电离模式毛细管电压3000v；雾化器压力为15psi；在多反应监测模式下，通过母离子和两个子离子共三个特征离子，对目标物喹诺酮进行定性定量分析，其中，诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、达氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星、氟甲喹、恶喹酸的碎裂电压/子离子一/子离子二的碰撞能分别为125V/18eV/24eV，125V/16eV/12eV，115V/18eV/26eV，110V/16eV/24eV，135V/22eV/22eV，115V/22eV/24eV，130V/20eV/25eV，110V/30eV/15eV，100V/16eV/30eV。

2.根据权利要求1所述的一种基于SPE柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，步骤(3)中标准工作曲线的绘制过程具体如下：

(a)：用甲醇将不同喹诺酮抗生素混合配制成单种喹诺酮抗生素浓度已知并相同的混合标准储备液，置于棕色试剂瓶中；

(b)：用40％-80％的甲醇/水溶液，v/v，将步骤(a)所得混合标准储备液稀释为多组不同浓度梯度的样品，同时向各组浓度梯度样品中分别加入相应内标物，并保证内标物在不同浓度梯度样品中的浓度一致；

(c)：采用LC-MS/MS对各浓度梯度样品进行分析，以每种喹诺酮与相应内标物浓度比值为横坐标，以每种喹诺酮的定量子离子与相应内标物峰面积比值为纵坐标，即可绘制不同喹诺酮的标准工作曲线。

3.根据权利要求2所述的一种基于SPE柱同时富集检测饮用水中喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，步骤(b)不同浓度梯度样品包括对应喹诺酮浓度分别为1、2、5、10、20、50、80、100和200μg/L的样品。

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