CN115326994A

CN115326994A - 一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法、系统及使用方法

Info

Publication number: CN115326994A
Application number: CN202211080401.3A
Authority: CN
Inventors: 汪阳忠; 李钢; 王天南; 戚大伟; 陈燕芳; 陈敏; 费婷; 吴达
Original assignee: Shanghai Tobacco Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Tobacco Group Co Ltd
Priority date: 2022-09-05
Filing date: 2022-09-05
Publication date: 2022-11-11

Abstract

本发明提供一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，包括以下步骤：在尿液加入内标样品、水解、冷冻干燥、浓缩、复溶后离心获得样品溶液；将样品溶液采用构建的多中心切割二维液相色谱‑串联质谱系统分析，通过内标法对烟气暴露生物标志物进行准确定量。本发明同时提供了一种多维液相色谱质谱联用分析系统及其使用方法，本发明通过第一维的分离有效去除杂质干扰，结合捕集柱的富集作用提升目标物检测的灵敏度和准确性，对前处理条件、流动相、色谱柱和质谱参数等进行综合优化，可实现极性差异大且含量差异大的多类别酸碱性化合物的同时分析，为人体烟气暴露评价提供一种更加高效便捷的高通量分析方法。

Description

一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法、系统及使用方法

技术领域

本发明属于烟气暴露生物标志物分析领域，涉及一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法。

背景技术

随着健康中国全面施行及消费者对“吸烟与健康”问题的日益关注，烟草制品健康风险已成为公众关注的热点。当前，国际烟草制品风险评估的化学评价方法逐步由分析吸烟机有害成分释放量过渡到以吸烟者为评估对象的烟气暴露水平分析，采用烟气暴露生物标志物进行评估。

烟气暴露分析中，烟碱、烟草特有亚硝胺、多环芳烃和芳香胺的代谢物是目前最具有代表性的标志物，能够反映吸烟人群的烟气暴露水平。由于烟气暴露生物标志物种类多、含量及化学性质差异大，目前不同种类的烟气暴露生物标志物需要采用不同的方法进行分析，如吸烟者尿液烟碱代谢物含量相对较高，可直接采用气质联用或液质联用分析；烟草特有亚硝胺、多环芳烃及芳香胺标志物含量极低，需要通过液液萃取、固相萃取柱或功能性纳米材料等对体液中的目标物进行净化和富集后再进行检测，前处理成本较高，过程繁琐，容易造成样品损失或污染。开发多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法能够极大地提高检测效率，使人体烟气暴露评价更为高效便捷。

多维液相色谱因具有将两种或两种以上不同分离原理的液相色谱优化组合的特性而成为近年来的研究热点，其具有较高的选择性和灵敏度，是分析复杂基质样品的理想选择，在分析生物样品、蛋白组学和天然产物中得到了广泛应用。多维液相色谱有多种分离模式，包括单中心切割和多中心切割等。相比单中心切割的方法，多中心切割可分析的目标物种类更多、性质差异更大，适用范围更广。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，用于解决现有技术中处理成本较高，过程繁琐，容易造成样品损失或污染的缺陷，本发明可以实现人体尿液中多种烟气暴露生物标志物的同时分析。

为实现上述目的及相关目的，本发明提供一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，包括以下步骤：

A1)在尿液加入内标样品、水解、冷冻干燥、浓缩、复溶后离心获得样品溶液；

A2)将样品溶液采用构建的多中心切割二维液相色谱-串联质谱系统分析，通过内标法对烟气暴露生物标志物进行准确定量。

优选地，所述尿液：内标溶液的体积比＝(1:0.001)-(1:0.060)。

优选地，步骤A1)中，所述水解为酶解或酸解。

优选地，步骤A1)中，所述复溶溶剂为去离子水、甲醇或者乙腈，优选地，所述复溶溶剂为去离子水。

优选地，所述酶解采用的酶为β-葡萄糖醛酸酶和芳基硫酸酯酶中的至少一种。

优选地，所述尿液：β-葡萄糖醛酸酶的体积比＝(1:0.001)-(1:0.1)。

优选地，所述酸解采用的酸为盐酸。

优选地，所述尿液中还加入缓冲液。更优选地，所述缓冲液为乙酸钠-乙酸缓冲液。

优选地，所述尿液：乙酸钠-乙酸缓冲液的体积比＝(1:0.2)-(1:4)。

进一步优选地，所述乙酸钠-乙酸缓冲液的浓度为5-500mM。

进一步优选地，所述乙酸钠-乙酸缓冲液的pH为4.0-6.0。

优选地，所述离心转速为5000-13000rpm。

优选地，所述离心时间为5-20min。

优选地，所述多类别烟气暴露生物标志物选自可替宁、N-亚硝基假木贼碱、N-亚硝基新烟碱、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、 1-羟基萘、2-羟基萘、1-羟基芘、1-羟基菲、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、2- 羟基芴或3-羟基芴中的一种或多种。

优选地，步骤A1)中，内标物选自d₃-可替宁(d₃-COT)、d₄-N-亚硝基假木贼碱(d₄-NAB)、 d₄-N-亚硝基新烟碱(d₄-NAT)、4-(甲基-d₃-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(d₃-NNAL)、d₇-1- 氨基萘(d₇-1-NA)、d₇-2-氨基萘(d₇-2-NA)、d₉-3-氨基联苯(d₉-3-ABP)、d_9-4-氨基联苯 (d₉-4-ABP)、d₉-1-羟基芘(d₉-1-OHPyr)、¹³C₆-3-羟基菲(¹³C₆-3-OHPhe)、¹³C₆-3-羟基芴 (¹³C₆-3-OHFlu)、d₇-2-羟基萘(d₇-2-OHNap))的一种或多种。

优选地，所述采用多中心切割二维液相色谱-串联质谱进行多类别烟气暴露生物标志物测定，包括以下步骤：

B1)配制标准样品：取可替宁、N-亚硝基假木贼碱、N-亚硝基新烟碱、4-(甲基亚硝胺)-1-(3- 吡啶基)-1-丁醇、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、1-羟基萘、2-羟基萘、1- 羟基芘、1-羟基菲、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、2-羟基芴和3-羟基芴成分的标样中的任一种或多种，加入内标样品，再加入甲醇定容，配成标准溶液；

B2)样品检测：分别将步骤B1)配制的标准样品和经样品前处理后待测样品采用多中心切割二维液相色谱-串联质谱系统分析，通过第一维液相色谱进行分离除杂，所述多类别烟气暴露生物标志物根据第一维分离的保留时间分成多组捕集，再由第二维液相色谱进行分离，通过质谱进行测定，确定待测样品中多类别烟气暴露生物标志物成分的含量。

优选地，步骤B2)中，第一维色谱柱：离子交换柱、C18柱或CN柱；优选地，为CN 柱。

优选地，步骤B2)中，补偿泵流动相：去离子水、甲醇、乙腈、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、氨水溶液中的至少一种；优选地，为去离子水。

优选地，步骤B2)中，捕集柱：C18柱、HILIC柱、PAH柱、NH2柱、PFP柱、Amino 柱、CN柱、Phenyl柱中的至少一种。

优选地，步骤B2)中，第二维色谱柱：C18柱、PAH柱、PFP柱或HILIC柱；进一步优选地，所述第二维色谱柱为C18柱；更进一步优选地，所述第二维C18色谱柱为T3或RP18 色谱柱。

优选地，一维色谱条件为：

一维泵流动相A相：甲酸铵-水溶液，流动B相；甲醇或乙腈溶液；

第一维色谱柱柱温：25-45℃，检测波长：230-400nm；进样量：0.5-20μL；

流速：0-30min流速为0.2-0.4mL/min，31-65min流速为0.0-0.4mL/min；

补偿泵的流动相:去离子水；补偿流速：00-900μL/min；

梯度洗脱程序：0-3min，3-5％B；10-15min，85-95％B；21-30min，3-5％B；

优选地，二维色谱条件为：

二维泵流动相A：甲酸-水溶液；流动相B：乙腈或甲醇溶液；

第二维色谱柱温为25-45℃；

梯度洗脱：0-12min，3-5％B；15-18min，85-95％B；18.1-23min，3-5％B； 30-32min，85-95％B；32.1-37min，3-5％B；37.1-52min,35-50％B；54-59min,85 -95％B；59.1-65min，3-5％B。

优选地，质谱条件为：

质谱：三重四级杆串联质谱，采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)模式；离子源温度：500-600℃；离子对驻留监测时间：20-50ms；雾化气和辅助气压力：50-60psi；气帘气压力：10-25psi；正离子模式扫描时，电喷雾电压：4000-5500V；负离子模式扫描时，电喷雾电压：-4500至-5500V。

本发明第二方面还提供一种多维液相色谱质谱联用分析系统，包括第一维液相色谱、补偿泵、三通接口、多通阀、捕集柱单元、第二维液相色谱；所述第一维液相色谱包括有进样器、第一维柱温箱、一维泵、一维色谱柱、检测器；所述捕集柱单元包括捕集柱和多色谱柱选择切换阀；所述第二维液相色谱包括有二维泵、第二维柱温箱、二维色谱柱、质谱；所述一维泵与一维色谱柱相连，所述一维色谱柱的出口经管线与所述检测器相连，所述二维色谱柱的出口经管线与质谱相连；所述三通接口经管线分别与检测器的出口、补偿泵、两位多通阀相连，所述两位多通阀经管线分别与二维泵、二维色谱柱的入口相连，所述多色谱柱选择切换阀与多通阀相连通，所述捕集柱与多色谱柱选择切换阀连通。

优选地，所述捕集柱单元包括第一捕集柱、第二捕集柱、第三捕集柱、第四捕集柱、第五捕集柱、第六捕集柱及多色谱柱选择切换阀，所述第一捕集柱两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第一入口和多色谱柱选择切换阀第一出口相连，所述第二捕集柱两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第二入口和多色谱柱选择切换阀第二出口相连；所述第三捕集柱两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第三入口和多色谱柱选择切换阀第三出口相连；所述第四捕集柱两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第四入口和多色谱柱选择切换阀第四出口相连；所述第五捕集柱两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第五入口和多色谱柱选择切换阀第五出口相连；所述第六捕集柱两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第六入口和多色谱柱选择切换阀第六出口相连。

本发明第三方面还提供一种多维液相色谱质谱联用分析系统的使用方法，包括以下步骤：

E1)捕集阶段：

E11)采用多维液相色谱质谱联用分析系统的捕集模式，通过第二捕集柱捕集第一目标组分；

E12)将捕集模式切换为分析模式，将第一和第二目标组分间的杂质组分切入废液；

E13)待第二目标组分从一维色谱柱上洗脱时，切换回捕集模式；多色谱柱选择切换阀同步切换到第三捕集柱，用于捕集第二目标组分；

E14)第二目标组分捕集完成后，将捕集模式切换为分析模式，将第二和第三目标组分间的杂质组分切入废液；

E15)待第三目标组分从一维色谱柱上洗脱时，切换回捕集模式；多色谱柱选择切换阀同步切换到第四捕集柱，用于捕集第三目标组分；

E16)第三目标组分捕集完成后，将捕集模式切换为分析模式，将第三和第四目标组分间的杂质组分切入废液；

E17)待第四目标组分从一维色谱柱上洗脱时，切换回捕集模式；多色谱柱选择切换阀同步切换到第五捕集柱，用于捕集第四目标组分；

E18)第四目标组分捕集完成后，将捕集模式切换为分析模式，将第四和第五目标组分间的杂质组分切入废液；

E19)待第五目标组分从一维色谱柱上洗脱时，切换回捕集模式；多色谱柱选择切换阀同步切换到第六捕集柱，用于捕集第六目标组分，以使所有目标组分在捕集柱上捕集完成；

E2)分析阶段：

切换为分析模式，一维泵的流动相对一维色谱柱进行杂质洗脱和色谱柱再平衡，二维泵 (6)的流动相对捕集单元上的所有目标组分依次进行洗脱分析。

优选地，所述捕集模式包括以下步骤：

F1)样品溶液在一维泵的流动相带动下，流入一维色谱柱进行初步分离得到多个目标组分，第一目标组分经检测器流入三通接口第一接口，同时，通过补偿泵引入的补偿流动相流入三通接口第2接口，使目标组分与补偿流动相混合；

F2)将步骤F1)获得的目标组分经三通接口第三接口流出后，由多通阀的第1流入接口进入，经多通阀第一接口进入多通阀第二接口，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入，经多色谱柱选择切换阀第二入口流出，进第二捕集柱捕集，流动相从第二捕集柱经色谱柱选择切换阀第二出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口后，从多通阀第六接口流出，进入废液，完成第一目标组分的捕集；

F3)从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入后，经多色谱柱选择切换阀第三入口流出，进第三捕集柱捕集，流动相从第三捕集柱经多色谱柱选择切换阀第三出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口后，从多通阀第六接口流出，进入废液，完成第二目标组分的捕集；

F4)从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入后，经多色谱柱选择切换阀第四入口流出，进第四捕集柱捕集，流动相从第四捕集柱经多色谱柱选择切换阀第四出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口后，从多通阀第六接口流出，进入废液，完成第三目标组分的捕集；

F5)从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入后，经多色谱柱选择切换阀第五入口流出，进第五捕集柱捕集，流动相从第五捕集柱经多色谱柱选择切换阀第五出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口后，从多通阀第六接口流出，进入废液，完成第二目标组分的捕集；

F6)从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入后，经多色谱柱选择切换阀第六入口流出，进第六捕集柱捕集，流动相从第六捕集柱经多色谱柱选择切换阀第六出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口后，从多通阀第六接口流出，进入废液，完成第二目标组分的捕集；将步骤F1)中初步分离得到多个目标组分在捕集柱上捕集完成.

优选地，所述分析模式包括以下步骤：

G1)一维色谱柱洗脱液在一维泵引入的流动相带动下，流入三通接口第一接口，同时，通过补偿泵引入的补偿流动相流入三通接口第二接口；

G2)将步骤G1)获得的混合液经三通接口第三接口流出后，由多通阀第一接口进入，经多通阀(7)的第六接口排出废液；

G3)二维泵引入的流动相经多通阀第三接口流入，经切换后从多通阀第二接口流出，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入，经多色谱柱选择切换阀第二入口流出，进入第二捕集柱(10)洗脱，洗脱液经多色谱柱选择切换阀第二出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT” 出口流出，进入多通阀第五接口，从多通阀第四接口流出，进入二维色谱柱进行进一步分离，洗脱液流入质谱测定；

G4)二维泵引入的流动相经多通阀第三接口流入，经切换后从多通阀第二接口流出，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入，经多色谱柱选择切换阀第二入口流出，进入第二捕集柱洗脱，洗脱液经多色谱柱选择切换阀第二出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口，从多通阀第四接口流出，进入二维色谱柱进行进一步分离，洗脱液流入质谱测定；

G5)二维泵引入的流动相经多通阀第三接口流入，经切换后从多通阀第二接口流出，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入，经多色谱柱选择切换阀第三入口流出，进入第三捕集柱洗脱，洗脱液经多色谱柱选择切换阀第三出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口，从多通阀第四接口流出，进入二维色谱柱进行进一步分离，洗脱液流入质谱测定；

G6)二维泵引入的流动相经多通阀第三接口流入，经切换后从多通阀第二接口流出，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入，经多色谱柱选择切换阀第四入口流出，进入第四捕集柱洗脱，洗脱液经多色谱柱选择切换阀第四出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口，从多通阀第四接口流出，进入二维色谱柱进行进一步分离，洗脱液流入质谱测定；

G7)二维泵引入的流动相经多通阀第三接口流入，经切换后从多通阀第二接口流出，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入，经多色谱柱选择切换阀第五入口流出，进入第五捕集柱洗脱，洗脱液经多色谱柱选择切换阀第五出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口，从多通阀第四接口流出，进入二维色谱柱进行进一步分离，洗脱液流入质谱检测器测定；

G8)二维泵引入的流动相经多通阀第三接口流入，经切换后从多通阀第二接口流出，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口进入，经多色谱柱选择切换阀第六入口流出，进入第五捕集柱洗脱，洗脱液经多色谱柱选择切换阀第六出口流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口流出，进入多通阀第五接口，从多通阀第四接口流出，进入二维色谱柱进行进一步分离，洗脱液流入质谱检测器测定，以使各个捕集柱上捕集的目标分析物洗脱下来，分别进行质谱分析。

如上所述，本发明具有以下的有益效果：

针对尿液样品基质复杂，烟气暴露生物标志物种类多，性质差异大等特点，本发明提供一种多中心切割二维液相色谱-串联质谱法，进一步提供一种天然同位素法，实现尿液中多类别烟气暴露生物标志物的同时定量分析。本发明通过第一维的分离有效去除杂质干扰，提升目标物检测的灵敏度和准确性，同时对前处理条件、流动相、色谱柱和质谱参数等进行综合优化，实现了极性差异较大的酸碱性化合物的同时分析，为人体烟气暴露评价提供了一种更加高效便捷的高通量分析方法。

现有技术中，第一维洗脱的时候溶剂的有机相比例较高，很多化合物都无法用补集柱补集，仪器公司简单的处理方式就是用定量环，把第一维分成多段转到定量环，储存在里面，分析的时候直接转到第二维。导致如果样品基质复杂，定量环上会有很多其他化合物，干扰第二维的分析，而且直接转移，色谱峰有时候会很宽，灵敏度不高。定量环体系适用于含量相对较高，基质相对不复杂的体系。但是如果化合物的灵敏度极低，比样品的基质干扰也特别严重，这时候用定量环体系难以解决，本发明的装置能够很好的解决以上问题。

附图说明

图1为多中心切割二维液相色谱-串联质谱系统示意图。

图2为COT标准品的MRM图。

图3为NNAL标准品的MRM图。

图4为NAT标准品的MRM图。

图5为NAB标准品的MRM图。

图6为2-NA和1-NA标准品的MRM图。

图7为3-ABP和4-ABP标准品的MRM图。

图8为2-OHNap和1-OHNap标准品的MRM图。

图9为2-OHFlu和3-OHFlu标准品的MRM图。

图10为1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、4-OHPhe和9-OHPhe标准品的MRM图。

图11为1-OHPyr标准品的MRM图。

图12为采用RP18色谱柱和T3色谱柱分析多环芳烃的TIC色谱图。

图13为实际样品的TIC色谱图。

附图标记：

1 一维泵

2 一维色谱柱

3 检测器

4 三通接口

41 三通接口第一接口

42 三通接口第二接口

43 三通接口第三接口

5 补偿泵

6 二维泵

7 多通阀

71 多通阀第一接口

72 多通阀第二接口

73 多通阀第三接口

74 多通阀第四接口

75 多通阀第五接口

76 多通阀第六接口

8 多色谱柱选择切换阀

81 多色谱柱选择切换阀第一入口

82 多色谱柱选择切换阀第一出口

83 多色谱柱选择切换阀第二入口

84 多色谱柱选择切换阀第二出口

85 多色谱柱选择切换阀第三入口

86 多色谱柱选择切换阀第三出口

87 多色谱柱选择切换阀第四入口

88 多色谱柱选择切换阀第四出口

89 多色谱柱选择切换阀第五入口

810 多色谱柱选择切换阀第五出口

811 多色谱柱选择切换阀第六入口

812 多色谱柱选择切换阀第六出口

813 多色谱柱选择切换阀“IN”入口

814 多色谱柱选择切换阀“OUT”出口

9 第一捕集柱

10 第二捕集柱

11 第三捕集柱

12 第四捕集柱

13 第五捕集柱

14 第六捕集柱

15 二维色谱柱

16 质谱

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例中使用的试剂及实验用具均为常规使用的试剂及实验用具，均可从市场上购买获得。具体使用试剂和仪器如下：

1、试剂

乙腈、甲醇(HPLC级，美国TEDIA公司)；甲酸(≥98％，德国默克公司)；甲酸铵(美国sigma公司)；β-葡萄糖醛酸酶(美国Sigma公司)；人工尿液(东莞创峰)；可替宁(COT)、 N-亚硝基假木贼碱(NAB)、N-亚硝基新烟碱(NAT)、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、d₃-可替宁(d₃-COT)、d₄-N-亚硝基假木贼碱(d₄-NAB)、d₄-N-亚硝基新烟碱 (d₄-NAT)、4-(甲基-d₃-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(d₃-NNAL)、1-氨基萘(1-NA)、2 -氨基萘(2-NA)、3-氨基联苯(3-ABP)、4-氨基联苯(4-ABP)、d₇-1-氨基萘(d₇-1-NA)、 d₇-2-氨基萘(d₇-2-NA)、d₉-3-氨基联苯(d₉-3-ABP)、d₉-4-氨基联苯(d₉-4-ABP)、1-羟基萘 (1-OHNap)、2-羟基萘(2-OHNap)、1-羟基芘(1-OHPyr)、1-羟基菲(1-OHPhe)、2-羟基菲(2-OHPhe)、3-羟基菲(3-OHPhe)、4-羟基菲(4-OHPhe)、9-羟基菲(9-OHPhe)、2-羟基芴(2-OHFlu)、3-羟基芴(3-OHFlu)、d₉-1-羟基芘(d₉-1-OHPyr)、¹³C₆-3-羟基菲(¹³C₆-3-OHPhe)、 ¹³C₆-3-羟基芴(¹³C₆-3-OHFlu)、d₇-2-羟基萘(d₇-2-OHNap)等购自加拿大TRC试剂公司。

2、仪器

美国Agilent公司1290液相色谱仪，配有自动进样器、四元混合泵、二元泵、一元泵，柱温箱、两位多通阀(7)、G4234A/C快速转换阀、二极管阵列检测器(3)(DAD)；电子天平(精度：0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司)；SW12H超声仪(瑞士Sono Swiss公司)；Milli-Q纯水仪(美国Millpore公司)；Eppendorf 5810R高速离心机和超低温冰箱(德国Eppendorf公司)；API 5500三重四极杆质谱(16)(美国SCIEX公司)；冻干机(美国 LABCONCO公司)。

3、质谱(16)检测中各分析物和内标的MRM参数如表1所示：

表1分析物及内标的MRM参数

实施例1

1样品前处理

将收集的尿液样品在室温下解冻，取5mL样品于100mL烧杯，依次加入10mL乙酸钠-乙酸缓冲液(10mM，pH 5.1)、50μL内标溶液和50μLβ-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后封口膜密封，置于37℃的恒温水浴槽中避光酶解16h。酶解后的样品放置于-80℃超低温冰箱冷冻，随后真空冷冻干燥(隔板温度30℃)，用500μL去离子水复溶，12000rpm离心10min，取上清液进行分析。

2COT的同位素目标物含量计算

¹²C和¹³C的天然丰度分别为98.89％和1.11％，而COT含有10个碳原子，在采用MRM分析COT时，本方法选取了m/z 178.0作为COT的定量母离子，其是天然¹³C-COT的[M+H]⁺离子，含量为COT的[M+H]⁺离子的11.1％，该含量可满足方法检测需求。

3分析条件

一维泵的流动相A为10mM甲酸铵-水溶液，B为甲醇，采用Angela Venusil XBP CN色谱柱(2.1mm×100mm，5μm)作为第一维的分离柱，柱温为30℃，DAD检测波长为260nm，进样量为20μL，0-30min流速为0.3mL/min，31-65min流速为0mL/min。梯度洗脱条件为：0-3min，3％B；10-15min，95％B；21-30min，3％B。补偿泵(5)的流动相为去离子水，补偿流速为600μL/min。

二维泵的流动相A为0.1％的甲酸-水溶液，B为乙腈，采用XBridge C18色谱柱(4.6mm ×30mm，5μm)作为捕集柱，Atlantis T3色谱柱(2.1mm×150mm，3.0μm)作为第二维的分析柱。柱温为30℃，0-11min流速为0.1mL/min，11.2-65min流速为0.3mL/min。梯度洗脱条件为0-12min，5％B；15-18min，95％B；18.1-23min，5％B；30-32min， 95％B；32.1-37min，5％B；37.1-52min，40％B；54-59min，95％B；59.1-65min， 5％B。

质谱采用电喷雾电离源(ESI)；检测方式为多反应监测(MRM)；离子源温度为600℃；离子对驻留监测时间(Dwell time)为50ms；雾化气和辅助气压力为50psi；气帘气压力为 10psi；碰撞气水平为Medium；正离子模式扫描时，电喷雾电压为5500V；负离子模式扫描时，电喷雾电压为-4500V。

实施例2

图2至图11为18种分析物标样第二维分离的MRM图，可以看出，除3-/4-ABP、 2-/3-OHFlu、2-/3-OHPhe、1-/4-OHPhe等几种同分异构体外，其余化合物都得到有效的分离。

实施例3

对配制的标准工作溶液进行分析，以标样与内标的浓度比为横坐标，峰面积比为纵坐标，进行线性回归后得到各目标化合物的标准工作曲线。取各目标物的最低浓度标准工作溶液平行测定10次，计算标准偏差，以10倍标准偏差为方法的定量限，3倍标准偏差为方法的检出限。结果如表2所示，方法的线性关系良好(R²>0.993)；COT的检出限为87.0pg/mL，定量限为290.0pg/mL；其它目标分析物的检出限为0.8-13.1pg/mL，定量限为2.7-43.7pg/mL，均满足定量检测需求。

表2目标物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

名称	线性方程	R<sup>2</sup>	检出限(pg/ml)	定量限(pg/ml)
					NNAL	Y＝1.4e<sup>-2</sup>X+1.8e<sup>-2</sup>	0.9999	2.5	8.4
COT	Y＝9.5e<sup>-2</sup>X-7.6e<sup>-1</sup>	0.9999	87.0	290.0
					NAT	Y＝7e<sup>-3</sup>X-9e<sup>-3</sup>	0.9988	1.0	3.3
NAB	Y＝9e<sup>-3</sup>X+7e<sup>-3</sup>	0.9998	0.9	3.0
					2-NA	Y＝5e<sup>-3</sup>X+4e<sup>-3</sup>	0.9995	1.4	4.7
1-NA	Y＝4.5e<sup>-1</sup>X+1.8e<sup>0</sup>	0.9994	2.7	9.0
					3/4-ABP	Y＝2e<sup>-3</sup>X+2e<sup>-3</sup>	0.9998	0.8	2.7
2-OHNap	Y＝5e<sup>-5</sup>X+1e<sup>-3</sup>	0.9998	11.3	37.7
					1-OHNap	Y＝4e<sup>-5</sup>X-8e<sup>-5</sup>	0.9989	13.1	43.7
2/3-OHFlu	Y＝2e<sup>-6</sup>X-8e<sup>-5</sup>	0.9985	7.9	26.5
					2/3-OHPhe	Y＝8e<sup>-5</sup>X+1e<sup>-3</sup>	0.9997	5.3	17.5
9-OHPhe	Y＝1e<sup>-4</sup>X+4e<sup>-4</sup>	0.9938	3.1	10.3
					1/4-OHPhe	Y＝6e<sup>-5</sup>X-9e<sup>-5</sup>	0.9986	3.4	11.2
1-OHPyr	Y＝5e<sup>-5</sup>X-3e<sup>-4</sup>	0.9995	2.9	9.7

实施例4

选取某非吸烟者的尿液样品，分别加入吸烟者中目标分析物平均含量的1/2(低)、1(中) 和2(高)倍三个水平的标准溶液，通过内标法定量，测定加标回收率。对于NAT，NAB等平均含量较低的目标物，增加加标量，使得低水平的加标浓度大于定量限，满足准确定量需求。结果如表3所示，除9-OHPhe、1-/4-OHPhe和1-OHPyr的部分回收率在80％左右，大部分的目标分析物的低、中、高三个水平的加标回收率在90-110％之间。对某尿液样品进行日内和日间各5次平行测定，测得目标分析物的日内和日间精密度分别在1.00-5.41％和2.35-5.99％之间。说明本方法具有较好的回收率和精密度，满足检测需求，可用于尿液中痕量烟气暴露生物标记物的定量分析。

表3尿液样品中目标物的加标回收率、日内和日间精密度

实施例5

1样品前处理

将收集的尿液样品在室温下解冻，取5mL样品于100mL烧杯，依次加入10mL乙酸钠-乙酸缓冲液(10mM，pH 5.1)、50μL内标溶液和50μL β-葡萄糖醛酸酶，混合均匀后封口膜密封，置于37℃的恒温水浴槽中避光酶解16h。酶解后的样品放置于-80℃超低温冰箱冷冻，随后真空冷冻干燥(隔板温度30℃)，用500μL去离子水复溶，12000rpm离心10min，取上清液进行分析。

2COT的同位素目标物含量计算

3分析条件

一维泵的流动相A为10mM甲酸铵-水溶液，B为甲醇，采用Angela Venusil XBP CN色谱柱(2.1mm×100mm，5μm)作为第一维的分离柱，柱温为30℃，DAD检测波长为260nm，进样量为20μL，0-30min流速为0.3mL/min，31-65min流速为0mL/min。梯度洗脱条件为：0-3min，3％B；10-15min，95％B；21-30min，3％B。补偿泵的流动相为去离子水，补偿流速为600μL/min。

二维泵(6)的流动相A为0.1％的甲酸-水溶液，B为乙腈，采用XBridge C18色谱柱(4.6mm×30mm，5μm)作为Trap捕集柱，Symmetry Shield RP18色谱柱(2.1mm×150mm， 3.0μm)作为第二维的分析柱。柱温为30℃，0-11min流速为0.1mL/min，11.2-65min流速为0.3mL/min。梯度洗脱条件为0-12min，5％B；15-18min，95％B；18.1-23min，5％ B；30-32min，95％B；32.1-37min,5％B；37.1-52min,35％B；54-59min,95％B；59.1- 65min，5％B。

4结果分析

第二维色谱柱的选择极大影响最终目标分析物的灵敏度和分离度。图12为第二维色谱柱选择验证时，RP18色谱柱和T3色谱柱分离多环芳烃化合物的TIC图，可知在相同的色谱条件下，RP18色谱柱对多环芳烃的分离度更好，而T3色谱柱对多环芳烃的灵敏度更高，两者都可以得到较好的分析结果。

同时，实施例5在第二维分离时采用Symmetry Shield RP18色谱柱作为分析柱，对18种化合物同样获得了较好的保留效果，检测结果见图13。图13为采用多中心切割-二维液相色谱-串联质谱系统分析实际样品获得的TIC色谱图。由图13可知，采用“天然碳同位素”的方法检测可替宁，即使尿液样品经过富集浓缩，COT的信号响应也能大幅减弱，实现与其他痕量代谢物的同时检测，因此该方法可应用于含量差异较大的化合物的同时检测，以减少分析成本和工作量。

综上所述，本发明建立了一种多中心切割二维液相色谱-串联质谱法，实现了尿液中烟碱、烟草特有亚硝胺、芳香胺和多环芳烃等多类别烟气暴露生物标志物的同时分析。方法灵敏度高，重现性好，实现了杂质的有效去除及各组分的良好分离，在复杂生物样品中多类别物质的同时分析检测方面有着广阔的应用前景。

所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，其特征在于，步骤A1)中，

所述水解为酶解或酸解；

和/或，所述复溶溶剂为去离子水、甲醇或者乙腈，优选地，所述复溶溶剂为去离子水。

3.根据权利要求2所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，其特征在于，所述酶解采用的酶为β-葡萄糖醛酸酶和芳基硫酸酯酶中的至少一种；

和/或，所述酸解采用的酸为盐酸。

4.根据权利要求1所述的一种多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，其特征在于，包括以下技术特征的一项：

1)所述多类别烟气暴露生物标志物选自可替宁、N-亚硝基假木贼碱、N-亚硝基新烟碱、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、1-羟基萘、2-羟基萘、1-羟基芘、1-羟基菲、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、2-羟基芴或3-羟基芴中的一种或多种；

2)步骤A1)中，内标物选自d₃-可替宁(d₃-COT)、d₄-N-亚硝基假木贼碱(d₄-NAB)、d₄-N-亚硝基新烟碱(d₄-NAT)、4-(甲基-d₃-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(d₃-NNAL)、d₇-1-氨基萘(d₇–1-NA)、d₇-2-氨基萘(d₇-2-NA)、d₉-3-氨基联苯(d₉-3-ABP)、d₉-4-氨基联苯(d₉-4-ABP)、d₉-1-羟基芘(d₉-1-OHPyr)、¹³C₆-3-羟基菲(¹³C₆-3-OHPhe)、¹³C₆-3-羟基芴(¹³C₆-3-OHFlu)、d₇-2-羟基萘(d₇-2-OHNap))的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，其特征在于，所述采用多中心切割二维液相色谱-串联质谱进行多类别烟气暴露生物标志物测定，包括以下步骤：

B1)配制标准样品：取可替宁、N-亚硝基假木贼碱、N-亚硝基新烟碱、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、1-羟基萘、2-羟基萘、1-羟基芘、1-羟基菲、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、2-羟基芴和3-羟基芴成分的标样中的任一种或多种，加入内标样品，再加入甲醇定容，配成标准溶液；B2)样品检测：分别将步骤B1)配制的标准样品和经样品前处理后待测样品采用多中心切割二维液相色谱-串联质谱系统分析，通过第一维液相色谱进行分离除杂，所述多类别烟气暴露生物标志物根据第一维分离的保留时间分成多组捕集，再由第二维液相色谱进行分离，通过质谱进行测定，确定待测样品中多类别烟气暴露生物标志物成分的含量。

6.根据权利要求5所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，其特征在于，步骤B2)中，所述多中心切割二维液相色谱-串联质谱系统分析条件包括以下技术特征的一项或几项：

C1)第一维色谱柱：离子交换柱、C18柱或CN柱；优选地，为CN柱。

C2)补偿泵流动相：去离子水、甲醇、乙腈、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、氨水溶液中的至少一种；优选地，为去离子水。

C3)捕集柱：C18柱、HILIC柱、PAH柱、NH2柱、PFP柱、Amino柱、CN柱、Phenyl柱中的至少一种；

C4)第二维色谱柱：C18柱、PAH柱、PFP柱或HILIC柱；进一步优选地，所述第二维色谱柱采用C18柱；更进一步优选地，所述第二维C18色谱柱为T3或RP18色谱柱。

7.根据权利要求5所述的多类别烟气暴露生物标志物同时分析的方法，其特征在于，所述多中心切割二维液相色谱-串联质谱系统分析的条件包括以下技术特征的一项或几项：

D1)一维色谱条件为：

流速：0-30min流速为0.2-0.4mL/min，31-65min流速为0.0-0.4mL/min；

补偿泵的流动相:去离子水；补偿流速：500-900μL/min；

D2)二维色谱条件为：

二维泵流动相A：甲酸-水溶液；流动相B：乙腈或甲醇溶液；

第二维色谱柱温为25-45℃；

梯度洗脱：0-12min，3-5％B；15-18min，85-95％B；18.1-23min，3-5％B；30-32min，85-95％B；32.1-37min，3-5％B；37.1-52min，35-50％B；54-59min，85-95％B；59.1-65min，3-5％B。

D3)质谱条件为：

8.一种多维液相色谱质谱联用分析系统，其特征在于，包括第一维液相色谱、补偿泵(5)、三通接口(4)、多通阀(7)、捕集柱单元、第二维液相色谱；所述第一维液相色谱包括进样器、一维柱温箱、一维泵(1)、一维色谱柱(2)、检测器(3)；所述捕集柱单元包括捕集柱和多色谱柱选择切换阀(8)；所述第二维液相色谱包括有二维泵(6)、二维柱温箱、二维色谱柱(15)、质谱(16)；所述一维泵(1)与一维色谱柱(2)相连，所述一维色谱柱(2)的出口经管线与所述检测器(3)相连，所述二维色谱柱(15)的出口经管线与质谱(16)相连；所述三通接口(4)经管线分别与检测器(3)的出口、补偿泵(5)、多通阀(7)相连，所述多通阀(7)经管线分别与二维泵(6)、二维色谱柱(15)的相连，所述多色谱柱选择切换阀(8)与多通阀(7)相连通，所述捕集柱与多色谱柱选择切换阀(8)连通。

9.根据权利要求8所述的多维液相色谱质谱联用分析系统，其特征在于，所述捕集柱单元包括第一捕集柱(9)、第二捕集柱(10)、第三捕集柱(11)、第四捕集柱(12)、第五捕集柱(13)、第六捕集柱(14)及多色谱柱选择切换阀(8)，所述第一捕集柱(9)两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第一入口(81)和多色谱柱选择切换阀第一出口(82)相连，所述第二捕集柱(10)两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第二入口(83)和多色谱柱选择切换阀第二出口(84)相连；所述第三捕集柱(11)两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第三入口(85)和多色谱柱选择切换阀第三出口(86)相连；所述第四捕集柱(12)两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第四入口(87)和多色谱柱选择切换阀第四出口(88)相连；所述第五捕集柱(13)两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第五入口(89)和多色谱柱选择切换阀第五出口(810)相连；所述第六捕集柱(14)两端经管线分别于与所述多色谱柱选择切换阀第六入口(811)和多色谱柱选择切换阀第六出口(812)相连。

10.根据权利要求8所述的一种多维液相色谱质谱联用分析系统的使用方法，包括以下步骤：

E1)捕集阶段：

E11)采用多维液相色谱质谱联用分析系统的捕集模式，通过第二捕集柱(10)捕集第一目标组分；

E13)待第二目标组分从一维色谱柱(2)上洗脱时，切换回捕集模式；多色谱柱选择切换阀(8)同步切换到下一捕集柱，用于捕集下一目标组分；

E14)第三捕集柱(11)、第四捕集柱(12)、第五捕集柱(13)、第六捕集柱(14)上分别重复步骤E11)至E13)，以使所有目标组分在捕集柱上捕集完成；

E2)分析阶段：

切换为分析模式，一维泵(1)的流动相对一维色谱柱(2)进行杂质洗脱和色谱柱再平衡，二维泵(6)的流动相对捕集单元上的所有目标组分依次进行洗脱分析。

11.根据权利要求10所述的一种多维液相色谱质谱联用分析系统的使用方法，所述捕集模式包括以下步骤：

F1)样品溶液在一维泵(1)的流动相带动下，流入一维色谱柱(2)进行初步分离得到多个目标组分，第一目标组分经检测器(3)流入三通接口第一接口(41)，同时，通过补偿泵(5)引入的补偿流动相流入三通接口第二接口(42)，使目标组分与补偿流动相混合；

F2)将步骤F1)获得的目标组分经三通接口第三接口(43)流出后，由多通阀第一接口(71)进入，经多通阀第一接口(71)进入多通阀第二接口(72)，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口(813)进入，经多色谱柱选择切换阀第二入口(83)流出，进第二捕集柱(10)捕集，流动相从第二捕集柱(10)经色谱柱选择切换阀第二出口(84)流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口(814)流出，进入多通阀第五接口(75)后，从多通阀第六接口(76)流出，进入废液；

F3)从多色谱柱选择切换阀“IN”入口(813)进入后，切换多色谱柱选择切换阀(8)的流入接口、捕集柱和流出接口，重复F2、F3)的步骤，将步骤F1)中初步分离得到多个目标组分在捕集柱上捕集完成。

12.根据权利要求10所述的一种多维液相色谱质谱联用分析系统的使用方法，所述分析模式包括以下步骤：

G1)一维色谱柱(2)洗脱液在一维泵(1)引入的流动相带动下，流入三通接口第一接口(41)，同时，通过补偿泵(5)引入的补偿流动相流入三通接口第二接口(42)；

G2)将步骤G1)获得的混合液经三通接口第三接口(43)流出后，由多通阀第一接口(71)进入，经多通阀第六接口(76)排出废液；

G3)二维泵(6)引入的流动相经多通阀第三接口(73)流入，经切换后从多通阀第二接口(72)流出，从多色谱柱选择切换阀“IN”入口(813)进入，经多色谱柱选择切换阀第二入口(83)流出，进入第二捕集柱(10)洗脱，洗脱液经多色谱柱选择切换阀第二出口(84)流出，再从多色谱柱选择切换阀“OUT”出口(814)流出，进入多通阀第五接口(75)，从多通阀第四接口(74)流出，进入二维色谱柱(15)进行进一步分离，洗脱液流入质谱(16)测定；

G4)从多色谱柱选择切换阀“IN”入口(813)进入后，切换多色谱柱选择切换阀(8)的流入接口、捕集柱和流出接口，重复G3)的操作步骤，将各个捕集柱上捕集的目标分析物洗脱下来，分别进行质谱分析。