Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN108315486A - 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108315486A
CN108315486A CN201810319745.2A CN201810319745A CN108315486A CN 108315486 A CN108315486 A CN 108315486A CN 201810319745 A CN201810319745 A CN 201810319745A CN 108315486 A CN108315486 A CN 108315486A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
lamp
mediated isothermal
isothermal amplification
loop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810319745.2A
Other languages
English (en)
Inventor
张薇
王振超
徐万果
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810319745.2A priority Critical patent/CN108315486A/zh
Publication of CN108315486A publication Critical patent/CN108315486A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及罗湖病毒治疗试剂技术领域，尤其是一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒，所述的环介导等温扩增引物组由第一引物组、第二引物组和第三引物组按照1:1:1的比例混合而成；所述的试剂盒包括：40nmol的第一引物组、5nmol的第二引物组、20nmol的第三引物组、15μL的反应浓缩液、20μL的阳性对照液、20μL的阴性对照液和1μL的逆转录酶。本发明的引物组提供有6条高特异性的引物，保证了检测反应的高度特异性；本发明提出的试剂盒，其检测快速、准确、灵敏且操作简单，可对罗非鱼是否感染罗湖病毒进行快速定性检测，简化了检测过程，降低了对操作人员的专业要求，使得非专业人员可以顺利完成检测工作。

Description

一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒
技术领域
本发明涉及罗湖病毒检测试剂技术领域，尤其涉及一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。
背景技术
罗非鱼(tilapine)是世界范围内养殖鱼类的第二重要群组，年产量531万吨(联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization)2014),并且它们作为发展中国家的主要蛋白质来源。罗非鱼是全球重要淡水养殖经济鱼种之一，可进行高密度养殖，是动物性蛋白质的重要来源。但是从2009年夏天开始，遍布以色列的养鱼场均记录到罗非鱼的大规模损失事件。鱼发病和死亡保持局限于罗非鱼及其杂种。发现与罗非鱼一个群落饲养的数个物种完全无症状，甚至在长期的共栖后也是如此。
2014年，Marina Eyngo等研究发现，导致以色列罗非鱼大量死亡的病原体是一种新型RNA病毒。2016年，Eran Bacharach等采用无偏倚高通量测序、Northern杂交、质谱分析、原位杂交、感染性研究等方法，发现导致以色列罗非鱼大量死亡的罗湖病毒是正粘病毒样病毒，为RNA单股负链病毒，由10个独特的基因片段组成，每个片段大小分别为1.641Kb、1.471kb、1.371kb、1.250kb、1.099kb、1.044kb、0.777kb、0.657kb、0.548kb和0.465kb。最大的第1片段包含一个开放阅读框，与C型流感病毒PB1有弱同源性。其他9个片段在GenBank中未发现与任何核酸、蛋白同源序列。10个片段中，在5’和3’末端均发现有长度为13个核苷酸的保守序列，与流感病毒、ISA病毒、瑟高特病毒等正粘病毒的基因结果特征一致，其中有10个核苷酸100％保守，另外3个核苷酸在5、9片段上完全一致，而且5’和3’末端的序列呈现互补的特点。高通量测序和序列分析显示，罗湖病毒PCR阳性样品与以色列样品中获得核酸序列有97％～99％相同，相应编码区对应的氨基酸序列有98.7％～100％相同。地理上分散的2个地方均出现有TILV导致的大规模死于事件，说明该病毒已经对罗非鱼养殖造成了全球性威胁。鉴于此，如何提供一种快速、准确、灵敏、操作简单的检测是否感染TiLV病毒的引物组和试剂盒是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中罗湖病毒无法准确、及时、灵敏的进行甄别的技术问题，而提出一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：设计一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，所述的环介导等温扩增引物组由第一引物组、第二引物组和第三引物组按照1:1:1的比例混合而成。
优选的，所述的第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述的第一上游引物的DNA序列为5’-GAATAATAAAGTGAGCTTAAG-3’，所述的第一下游引物的DNA序列为5’-CAGGGAAAGTACTGCATAGCG-3’，所述的第一引物组中的第一上游引物和第一下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，所述的第二上游引物的DNA序列为5’-AGCCTAGCAACTGTACAATCG-3’，所述的第二下游引物的DNA序列为5’-GACGCTACGATCAGTACACGA-3’，所述的第二引物组中的第二上游引物和第二下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，所述的第三上游引物的DNA序列为5’-CCGATTAGTCGATGAGATGCA-3’，所述的第三下游引物的DNA序列为5’-GCAATGCATACGGATCGACGA-3’，所述的第三引物组中的第三上游引物和第三下游引体积比为1:1。
设计一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述的试剂盒包括：40nmol的第一引物组、5nmol的第二引物组、20nmol的第三引物组、15μL的反应浓缩液、20μL的阳性对照液、20μL的阴性对照液和1μL的逆转录酶。
优选的，所述的反应浓缩液包括聚合酶、Buffer、dNTP、MgSO4、Betaine、荧光染料Evagreen。
优选的，所述的阳性对照液为含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒DNA。
优选的，所述的阴性对照液为不含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒DNA。
优选的，所述的试剂盒中第一引物组、第二引物组、第三引物组、反应浓缩液、阳性对照液、阴性对照液和逆转录酶在使用前分别包装在不同的包装中。
优选的，所述的试剂盒与等温扩增荧光检测仪、定量PCR仪或恒温金属浴配合使用。
本发明提出的一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒，有益效果在于：
(1)本发明的引物组提供有6条高特异性的引物：6条引物对应目标序列6个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性；
(2)本发明提出的试剂盒，其检测快速、准确、灵敏且操作简单，可对罗非鱼是否感染罗湖病毒进行快速定性检测；
(3)本发明提出的试剂盒，简化了检测过程，降低了对操作人员的专业要求，使得非专业人员可以顺利完成检测工作；
(4)本发明试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在等温扩增荧光检测仪和定量PCR仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上如金属浴等。
附图说明
图1为本发明实施例二的扩增曲线
图2为本发明实施例二的溶解曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
本发明的一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，所述的环介导等温扩增引物组由第一引物组、第二引物组和第三引物组按照1:1:1的比例混合而成。
优选的，所述的第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述的第一上游引物的DNA序列为5’-GAATAATAAAGTGAGCTTAAG-3’，所述的第一下游引物的DNA序列为5’-CAGGGAAAGTACTGCATAGCG-3’，所述的第一引物组中的第一上游引物和第一下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，所述的第二上游引物的DNA序列为5’-AGCCTAGCAACTGTACAATCG-3’，所述的第二下游引物的DNA序列为5’-GACGCTACGATCAGTACACGA-3’，所述的第二引物组中的第二上游引物和第二下游引体积比为1:1。
优选的，所述的第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，所述的第三上游引物的DNA序列为5’-CCGATTAGTCGATGAGATGCA-3’，所述的第三下游引物的DNA序列为5’-GCAATGCATACGGATCGACGA-3’，所述的第三引物组中的第三上游引物和第三下游引体积比为1:1。
本发明的一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述的试剂盒包括：40nmol的第一引物组、5nmol的第二引物组、20nmol的第三引物组、15μL的反应浓缩液、20μL的阳性对照液、20μL的阴性对照液和1μL的逆转录酶。
优选的，所述的反应浓缩液包括聚合酶、Buffer、dNTP、MgSO4、Betaine、荧光染料Evagreen。
优选的，所述的阳性对照液为含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒DNA。
优选的，所述的阴性对照液为不含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒DNA。
优选的，所述的试剂盒中第一引物组、第二引物组、第三引物组、反应浓缩液、阳性对照液、阴性对照液和逆转录酶在使用前分别包装在不同的包装中。
优选的，所述的试剂盒与等温扩增荧光检测仪、定量PCR仪或恒温金属浴配合使用。
实施例二
选取实施例一含有罗湖病毒目标序列的重组质粒的大肠杆菌作为实验用材料，使用质粒提取试剂盒提取小剂量重组质粒DNA，利用环介导等温扩增检测技术扩增总体系25ul，包括反应浓缩液15ul、环介导等温扩增引物混合液6ul、逆转录酶1ul、反应样本3ul。混匀后放入定量PCR仪。同时使用PCR方法检测，设置65℃、30s/循环，60个循环，多次试验后最终获得的扩增曲线、溶解曲线，参阅附图1-附图2所示。扩增曲线中只用罗湖病毒样品有扩增，其他病毒核酸样品并无扩增，同时扩增产生的溶解曲线峰型单一且尖锐，说明罗湖病毒检测引物组特异性好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的环介导等温扩增引物组由第一引物组、第二引物组和第三引物组按照1:1:1的比例混合而成。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，所述的第一上游引物的DNA序列为5’-GAATAATAAAGTGAGCTTAAG-3’，所述的第一下游引物的DNA序列为5’-CAGGGAAAGTACTGCATAGCG-3’；所述的第一引物组中的第一上游引物和第一下游引体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，所述的第二上游引物的DNA序列为5’-AGCCTAGCAACTGTACAATCG-3’，所述的第二下游引物的DNA序列为5’-GACGCTACGATCAGTACACGA-3’，所述的第二引物组中的第二上游引物和第二下游引体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组，其特征在于，所述的第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，所述的第三上游引物的DNA序列为5’-CCGATTAGTCGATGAGATGCA-3’，所述的第三下游引物的DNA序列为5’-GCAATGCATACGGATCGACGA-3’，所述的第三引物组中的第三上游引物和第三下游引体积比为1:1。
5.一种含有权利要求1所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：40nmol的第一引物组、5nmol的第二引物组、20nmol的第三引物组、15μL的反应浓缩液、20μL的阳性对照液、20μL的阴性对照液和1μL的逆转录酶。
6.根据权利要求5所述的一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，其特征在于，所述的反应浓缩液包括聚合酶、Buffer、dNTP、MgSO4、Betaine、荧光染料Evagreen。
7.根据权利要求5所述的一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照液为含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒DNA。
8.根据权利要求5所述的一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照液为不含有罗湖病毒目的基因的大肠杆菌质粒DNA。
9.根据权利要求5所述的一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中第一引物组、第二引物组、第三引物组、反应浓缩液、阳性对照液、阴性对照液和逆转录酶在使用前分别包装在不同的包装中。
10.根据权利要求5所述的一种含有环介导等温扩增引物组的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒与等温扩增荧光检测仪、定量PCR仪或恒温金属浴配合使用。
CN201810319745.2A 2018-04-11 2018-04-11 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒 Pending CN108315486A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810319745.2A CN108315486A (zh) 2018-04-11 2018-04-11 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810319745.2A CN108315486A (zh) 2018-04-11 2018-04-11 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108315486A true CN108315486A (zh) 2018-07-24

Family

ID=62897156

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810319745.2A Pending CN108315486A (zh) 2018-04-11 2018-04-11 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108315486A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050214823A1 (en) * 2004-01-13 2005-09-29 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in mouse
CN102727697A (zh) * 2012-07-06 2012-10-17 栾尊一 一种治疗骨伤病的中药组合物、其制备方法和质量检测方法
CN105331633A (zh) * 2009-08-21 2016-02-17 梅里亚有限公司 重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法
CN105368944A (zh) * 2015-11-23 2016-03-02 广州基迪奥生物科技有限公司 可检测疾病的生物标志物及其用途
CN107760802A (zh) * 2017-12-01 2018-03-06 广州利洋水产科技股份有限公司 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050214823A1 (en) * 2004-01-13 2005-09-29 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in mouse
CN105331633A (zh) * 2009-08-21 2016-02-17 梅里亚有限公司 重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法
CN102727697A (zh) * 2012-07-06 2012-10-17 栾尊一 一种治疗骨伤病的中药组合物、其制备方法和质量检测方法
CN105368944A (zh) * 2015-11-23 2016-03-02 广州基迪奥生物科技有限公司 可检测疾病的生物标志物及其用途
CN107760802A (zh) * 2017-12-01 2018-03-06 广州利洋水产科技股份有限公司 罗湖病毒特异性rt‑pcr检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THEERAWUT PHUSANTISAMPAN等: ""Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus"", 《JOURNAL OF VISUALIZED EXPERIMENTS》 *
戈贤平等: "《专家与成功养殖者共谈现代高效大宗淡水鱼养殖实战方》", 31 December 2015, 金盾出版社 *
戴婷婷等: ""环介导等温扩增技术在病原物检测上的应用研究进展"", 《南京农业大学学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112094948B (zh) 一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒
Chen et al. Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay
CN106957927A (zh) 非洲猪瘟荧光pcr检测试剂、非洲猪瘟荧光pcr检测试剂盒及其应用
CN104862419B (zh) 一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物、探针及试剂盒
Maan et al. A quantitative real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) assay to detect genome segment 9 of all 26 bluetongue virus serotypes
CN105018646B (zh) 一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒
CN103981286B (zh) 鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组
CN105039586A (zh) 检测鸭2型腺病毒的引物及试剂盒
CN101712973B (zh) 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法
CN107828915A (zh) 虾黄头病毒（yhv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN110564895A (zh) 猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法
CN113308577B (zh) 一种牛结节性皮肤病病毒可视化快速核酸检测方法
CN104673934A (zh) 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
CN107828914A (zh) 传染性皮下及造血组织坏死病毒（ihhnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN103397105A (zh) 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途
CN107988427A (zh) 对虾肝胰腺细小病毒（hpv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
Zhang et al. Diagnostics and detection of African swine fever virus
CN107400736A (zh) 鸭2型腺病毒环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
CN105296669A (zh) 传染性造血器官坏死病毒（ihnv）的rt-lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN110257561B (zh) 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN109628640B (zh) 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒
CN106435020A (zh) 用于检测不同基因型传染性支气管炎病毒的通用试剂盒
CN108315486A (zh) 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒
CN106521038B (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN110257560B (zh) 一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180724

RJ01 Rejection of invention patent application after publication