CN108102945B - 包含戈氏梭菌的衍生细菌菌株的组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及无毒非致病性戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的衍生细菌菌株，其能抑制一种或多种实体瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体瘤。本发明还涉及包含所述衍生细菌菌株的组合物，用于靶向实体瘤的溶解。
Description
发明领域
本发明涉及无毒非致病性戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的衍生细菌菌株，其能抑制一种或多种实体瘤的生长、逆转一种或多种实体瘤，或几乎或完全破坏一种或多种实体瘤。本发明还涉及包含所述衍生细菌菌株的组合物，用于靶向实体瘤的溶解。
发明背景
癌症的形成是一个包括一系列分子和结构改变的多阶段过程。实体瘤，如黑素瘤、肺癌、结肠癌、头/颈癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌以及前列腺癌等，占所有癌症的90％。在晚期，发生大量血管生成、坏死和低氧，这是这些癌症的所有标志。与其存在相关联，这些实体瘤形成具有中心区的多个区域，所述中心区具有高组织间压力、低细胞外pH、肿瘤细胞异质性以及厌氧代谢(包括高葡萄糖浓度和乳酸盐状态的糖酵解)，而外周区域具有快速分裂的典型的癌细胞。
肿瘤中心环境对目前的化学疗法和放射疗法是不利的，因为由于拙劣的血管形成和高组织间压力，它们拒绝被动扩散的化疗药物。此外，氧自由基的缺乏也促进化疗和放疗抗性并降低治疗过程中DNA损伤。
当在早期进行诊断时，有效策略是首先选择移除癌症的疗法，然后进行放疗和/或化疗以预防复发。然而，由于在临床环境中缺少具体症状，高达85％的实体瘤患者在有效的外科手术不再是选择的晚期出现。化疗/放疗或两者的组合经常用作缓解性治疗，这不能提高这些患者的总体存活率。已经在临床前动物中试验了抗体和信号转导抑制剂形式的化学品/药物，用于晚期癌症的治疗，但是它们不能渗透实体瘤，不能聚积成高浓度、不能有效到达足够数量的癌细胞，并保持非癌基质细胞、干细胞以及肿瘤组织结构完整。此外，抗性的频繁出现使得这些分子疗法多数无效。
治疗癌症的基因疗法，被认为是比上述药物疗法更好的选择。活病毒疗法被视为用于治疗晚期实体瘤的目前现有的最佳方法，但是其具有诸如通过肿瘤的传播不良(Shayakhmetov et al.,2002)以及在静脉内送递后被肝从循环中快速清除等缺点。总之，迄今为止，所有目前可用的减小实体瘤的抗癌疗法都未能满足有效治疗晚期癌症的需要。
当肿瘤中心环境(又称为微环境)对目前的化疗、放疗以及病毒疗法不利时，这类环境可能为使用厌氧细菌及其固有的溶瘤特性的基于细菌的疗法提供了独特的机会。已经研究了多种厌氧细菌，包括属于梭菌属(Clostridium)的菌株。天然地，梭菌具有两种生长状态，一种是营养杆菌(vegetative rod)，另一种是圆形芽孢。后者是梭菌的坚硬保护性形式，其有助于它们存活度过困难时期。芽孢具有坚硬的外被，包裹在细菌内部的关键重要部分之外。另外，还有衬于包裹物内部的膜层。坚硬的外被和膜衬能使梭菌在不适合营养杆菌的严峻环境中存活。当诸如厌氧环境和更多的养分等生长环境变充足时，芽孢会增加基因表达并促进营养杆菌的再生长。
已经证明，严格的厌氧蛋白水解的诺威氏梭菌(Clostridium novyi)和索氏梭菌(C.sordellii)特异性靶向独特的低氧/坏死的肿瘤内部(参见图8)，从而当与血管破坏剂联合时，在几种癌症中引起适度溶瘤作用。然而，这些菌株是致病性微生物，自然引起多种人类疾病，其中，它们对人类的固有毒性已经导致了严重问题。这些问题是，(1)毒性水平太高，难以作为用于人类治疗的适当治疗模型而被接受，以及(2)与致病性细菌用于人类相关的生物安全难以克服。此外，诺威氏梭菌和索氏梭菌的野生型菌株表现出快速的毒性，但较不显著的溶瘤作用。
本发明基于对衍生的严格厌氧戈氏梭菌菌株的发现，其已适应而具有较低但是确定的溶瘤作用，而重要且令人惊讶的是，与其他梭菌菌株相比，该衍生的菌株相对而言是无毒的。新发现的菌株是戈氏梭菌的无毒非致病性菌株的衍生物。戈氏梭菌的这些衍生菌株不仅是现有技术中梭菌菌株(如破伤风梭菌(C.teteni)、诺威氏梭菌以及索氏梭菌)的有用替代品，而且比那些其他梭菌菌株表现出更小的毒副作用。在不受限于任何生物机制或过程的情况下，在静脉内注射本发明的梭菌芽孢后，本发明人所研发且本文所述的新的适应方法(adaption process)能使新的衍生的细菌菌株获得如下额外能力：渗过实体瘤的血管生成/低氧/坏死区域中的缺陷血管(defect vessel)、萌发成杆菌、有效且不加区别地溶解/液化肿瘤内的各种细胞以及肿瘤结构(纤连蛋白和胶原蛋白)，从而从根本上破坏并改变肿瘤微环境。这种肿瘤微环境的破坏有效抑制肿瘤生长，随后可能是肿瘤逆转，且在某些情况下，最终导致整个肿瘤的几乎完全或完全破坏。本发明为联合使用可注射芽孢的方法和现有方法创造了机会，从而确保肿瘤的完全消除。作为非限制性实例，一个这种机会是使用靶向单克隆抗体，否则其不能有效治疗实体瘤。当靶向单克隆抗体用于部分或所有微环境已被本发明的新的衍生细菌菌株破坏的肿瘤中时，所述抗体由于新改变的肿瘤微环境而变得有效得多。无论是采用单种癌症疗法形式还是与另一种癌症疗法组合，本文所限定和本文所述的本发明的芽孢的使用，对现有技术具有明确的贡献。
发明概述
根据第一方面，本发明提供了从戈氏梭菌的无毒非致病性菌株衍生的细菌菌株，其中衍生的细菌菌株能抑制实体瘤的生长。本发明还提供了从戈氏梭菌的无毒非致病性菌株衍生的细菌菌株，其中衍生的细菌菌株能逆转或破坏实体瘤。菌株对肿瘤微环境所含的细胞具有溶瘤作用。本发明还通过存在于新菌株的细菌细胞中的一种或多种酶而提供了对微环境所含的组织结构的溶瘤作用，所述酶如蛋白酶、脂酶以及胶原蛋白酶。
在一实施方案中，溶解肿瘤微环境内的约20％至约90％、或约20％至约70％、或约20％至约40％、或约20％至约35％、或约25％至约35％的细胞。在另一实施方案中，衍生的细菌菌株引起的毒性比参照梭菌菌株小。
在另一实施方案中，戈氏梭菌的无毒非致病性菌株可以选自ATCC登录号25757、BCRC登录号14548、CCUG登录号9282、DSM登录号15049、NCIMB登录号10636、PEV、PrevotPEV、VPI登录号4897以及VTT登录号E-042451。
本发明的细菌菌株可以选自MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_LCv13、MW-DCG_LCv14、MW-DCG_LCv15、MW-DCG_LCv16、MW-DCG_LCv17、MW-DCG_LCv18、MW-DCG_LCv19、MW-DCG_LCv20、MW-DCG_LCv21、MW-DCG_LCv22、MW-DCG_LCv23、MW-DCG_LCv24、MW-DCG_LCv25、MW-DCG_LCv26、MW-DCG_CCv13、MW-DCG_CCv14、MW-DCG_CCv15、MW-DCG_CCv16、MW-DCG_CCv17、MW-DCG_HNCv13、MW-DCG_HNCv14、MW-DCG_HNCv15、MW-DCG_HNCv16、MW-DCG_HNCv17以及MW-DCG_HNCv18。
细菌菌株MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、DCG_HNCv13、MW-DCG_HNCv14、MW-DCG_HNCv15、MW-DCG_HNCv16、MW-DCG_HNCv17和MW-DCG_HNCv18对头颈癌实体瘤具有特异性，并且在治疗上对头颈癌实体瘤有效。MW-DCG_HNCv18是优选的菌株，并且由登录号V12/001485表示。
细菌菌株MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_CCv13、MW-DCG_CCv14、MW-DCG_CCv15、MW-DCG_CCv16以及MW-DCG_CCv17对结肠癌实体瘤具有特异性，并且在治疗上对结肠癌实体瘤有效。MW-DCG_CCv17是优选的菌株，并且由登录号V12/001487表示。
细菌菌株MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_LCv13、MW-DCG_LCv14、MW-DCG_LCv15、MW-DCG_LCv16、MW-DCG_LCv17、MW-DCG_LCv18、MW-DCG_LCv19、MW-DCG_LCv20、MW-DCG_LCv21、MW-DCG_LCv22、MW-DCG_LCv23、MW-DCG_LCv24、MW-DCG_LCv25以及MW-DCG_LCv26对肺癌的实体瘤具有特异性，并且在治疗上对肺癌的实体瘤有效。MW-DCG_LCv26是优选的菌株，由登录号V12/001486表示。
根据第二方面，本发明提供了第一方面的一种或多种细菌菌株的梭菌芽孢。在一实施方案中，第二方面的梭菌芽孢可以与生理上可接受的载体和/或赋形剂组合。
根据第三方面，本发明提供了抑制个体中一种或多种实体恶性肿瘤生长、逆转或破坏所述肿瘤的方法，其中所述方法包括将治疗有效量的第二方面的梭菌芽孢给予有需要的个体。
根据第四方面，本发明提供了第二方面的梭菌芽孢在个体中抑制一种或多种实体瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体瘤的用途，其中将治疗有效量的第二方面的梭菌芽孢给予有需要的个体。
根据第五方面，本发明提供了治疗个体中一种或多种实体恶性肿瘤的方法，其中一种或多种肿瘤的生长抑制、肿瘤逆转或肿瘤破坏表示治疗，其中所述方法包括给予患者：
(1)治疗有效量的第二方面的梭菌芽孢和
(2)治疗有效量的抗癌剂。
根据第六方面，本发明提供了第二方面的梭菌芽孢和抗癌剂在治疗个体中一种或多种实体恶性肿瘤的联合疗法中的用途，其中一种或多种肿瘤的生长抑制、肿瘤逆转或肿瘤破坏表示治疗，其中给予有需要的个体(1)治疗有效量的第二方面的梭菌芽孢和(2)治疗有效量的抗癌剂。
在第五和第六方面的实施方案中，给予个体(1)和(2)顺序或同时发生。可以将(1)和(2)作为一种药物组合物给予个体。可以将(1)和(2)作为一种组合物或分开，重复给予一次或多次，以确保肿瘤逆转。例如给予个体(1)和(2)，作为第一剂量，随后给予(2)，作为第二剂量。可以以任意数量的剂量，给予多于一种抗癌剂。
在另一实施方案中，(1)是MW-DCG_HNCv18的梭菌芽孢，而(2)是嵌合抗EGFR单克隆抗体。在另一实施方案中，(2)是西妥昔单抗。还在另一实施方案中，同时给予个体MW-DCG_HNCv18的梭菌芽孢和西妥昔单抗，随后第二次单独给予西妥昔单抗。
在第三、第四、第五以及第六方面的一个实施方案中，第二方面的梭菌芽孢的治疗有效量为每一剂量约106菌落形成单位(CFU)至约1014CFU。在另一实施方案中，第二方面的梭菌芽孢的治疗有效量为每一剂量约108-1012或约109-1011CFU。在另一实施方案中，第二方面的梭菌芽孢的治疗有效量为每一剂量约1010-1011CFU。还在另一实施方案中，第二方面的梭菌芽孢的治疗有效量为每一剂量约1010.5CFU。对个体的治疗有效量的第二方面的梭菌芽孢的给药可以通过静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内。例如，给药可以是静脉内。
根据第七方面，本发明提供了药物组合物，其包含第二方面的梭菌芽孢和生理上可接受的载体和/或赋形剂。组合物还可以包含抗癌剂。抗癌剂可以是第五和第六方面所定义的药剂。
抗癌剂是可以用于化疗、放疗或基于抗体疗法或其组合的任何药剂。药剂可以是一种或多种化学品、一种或多种RNA分子或一种或多种抗体或以上的任意组合。
例如，一种或多种化学品可以是二氯乙酸钠、紫杉醇、阿霉素、拓扑替康、改变DNA的药物、卡铂、抗代谢药、吉西他滨、防止细胞分裂的药物、长春新碱、抗血管生成剂以及帕唑帕尼。
一种或多种RNA分子的实例是小干扰RNA(siRNA)。siRNA可以是乳酸脱氢酶A(LDHA)特异性的或是CD147特异性的。
一种或多种抗体的实例是抗癌单克隆抗体。抗癌抗体可以是抗免疫刺激抗体或抗T reg单克隆抗体。抗免疫刺激抗体的实例是抗CD40单克隆抗体。抗CD40单克隆抗体可以是FGK45。抗T reg单克隆抗体的实例是抗CD25单克隆抗体。抗CD25单克隆抗体可以是PC61。在另一实施方案中，药剂靶向表皮生长因子受体(EGFR)。
抗癌单克隆抗体可以是缀合的或裸露的。裸抗体例如具有诸如补体介导的溶胞作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的效应。缀合的抗体包括与放射性同位素或药物激活酶缀合的抗体。放射性缀合抗体可以用于放射免疫疗法中。放射性缀合抗体的实例是钇90(90Y)-缀合的抗CD20抗体Y90-替伊莫单抗和碘131(131I)缀合的抗CD20抗体I131-托西莫单抗。与药物激活酶缀合的抗体可以用于抗体导向酶前药疗法(ADEPT)中。抗癌单克隆抗体可以与脂质体或纳米颗粒缀合，并包括脂质体或纳米颗粒中的各种药物和治疗性核苷酸，如siRNA。
作为给予一种或多种抗癌剂的替代方案或除了给予一种或多种抗癌剂之外，第五方面的方法和第六方面的用途，还可以包括激素疗法、热疗、外科手术、放射或以上的任意组合。放射可以是电离辐射。
根据第八方面，本发明提供了由戈氏梭菌的无毒非致病性菌株衍生细菌菌株的方法，其中通过所述方法产生的衍生的细菌菌株能通过对一种或多种肿瘤微环境内细胞的溶瘤作用，抑制一种或多种实体瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体瘤，其中通过所述方法产生的衍生的细菌菌株引起的毒性比参照梭菌菌株小。
在一实施方案中，由戈氏梭菌的无毒非致病性菌株衍生细菌菌株的方法包括：
(1)由戈氏梭菌的无毒非致病性菌株制备可注射的梭菌芽孢，包括
(a)将(1)的细菌菌株的营养杆菌接种到芽孢形成培养基中，
(b)允许足够的时间和条件，用于杆菌的芽孢形成，以及
(c)纯化芽孢；
(2)将(1)的纯化的梭菌芽孢注射到支持实体瘤生长的动物中；
(3)评估参数以确定溶瘤作用的速率与程度以及毒性；
(4)通过收获肿瘤，从(2)的肿瘤收集营养杆菌；
(5)将(4)的杆菌划线分离到琼脂平板上；
(6)从(5)的平板选择两个或更多个单菌落，并接种肉汤培养物以使营养杆菌生长；以及
(7)重复步骤(1)(a)-(6)约10至约35次。
在另一实施方案中，(6)的两个或多个单菌落是三个单菌落。
在另一实施方案中，重复步骤(1)(a)-(6)约15至约30次，或约17至约26次。
在另一实施方案中，(3)的参数可以包括芽孢建群时间、溶瘤作用、脓形成和破裂、肿瘤体积、全身毒性、动物存活、在静脉内给予芽孢后分离自肿瘤的芽孢/杆菌的数量或以上的任意组合。
在另一实施方案中，细菌菌株溶解肿瘤微环境内的约20％至约90％、或约20％至约70％、或约20％至约40％、或约20％至约35％、或约25％至约35％的的细胞。在另一实施方案中，戈氏梭菌的无毒非致病性菌株可以选自ATCC登录号25757、BCRC登录号14548、CCUG登录号9282、DSM登录号15049、NCIMB登录号10636、PEV、Prevot PEV、VPI登录号4897以及VTT登录号E-042451。
根据第九方面，本发明提供了用于治疗一种或多种实体恶性肿瘤的试剂盒，其包含第一方面的细菌菌株、第二方面的梭菌芽孢或第七方面的药物组合物，还包含抗癌剂及使用说明书。
在任一个或多个前述方面的实施方案中，个体可以是哺乳动物。哺乳动物可以是人。
在任一个或多个前述方面的实施方案中，实体恶性肿瘤选自呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、黑素瘤、绒毛膜癌，和宫颈癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、卵巢癌、脑癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌，骨瘤、脂肪瘤以及软骨瘤，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、亲上皮性淋巴瘤、复合性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、胃和非胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、淋巴增生性疾病、T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。
据此，本申请还涉及以下方面或保护的主题。
主题1.从戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株衍生的细菌菌株，其中所述衍生的细菌菌株能抑制实体瘤的生长。
主题2.从戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株衍生的细菌菌株，其中所述衍生的细菌菌株能逆转或破坏实体瘤。
主题3.如主题1或2所述的菌株，其中所述菌株对所述肿瘤微环境内所含的细胞具有溶瘤作用。
主题4.如主题1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株溶解所述肿瘤微环境内的约20％至约90％的细胞。
主题5.如主题1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株溶解所述肿瘤微环境内的约20％至约70％的细胞。
主题6.如主题1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株溶解所述肿瘤微环境内的约20％至约40％的细胞。
主题7.如主题1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株溶解所述肿瘤微环境内的约20％至约35％的细胞。
主题8.如主题1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株溶解所述肿瘤微环境内的约25％至约35％的细胞。
主题9.如主题1-3中任一项所述的菌株，其中所述菌株引起的毒性比参照梭菌菌株小。
主题10.如主题1-9中任一项所述的菌株，其中所述戈氏梭菌(Clostridiumghonii)的无毒非致病性菌株选自ATCC登录号25757、BCRC登录号14548、CCUG登录号9282、DSM登录号15049、NCIMB登录号10636、PEV、Prevot PEV、VPI登录号4897以及VTT登录号E-042451。
主题11.如主题1-10中任一项所述的菌株，其中所述菌株选自MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_LCv13、MW-DCG_LCv14、MW-DCG_LCv15、MW-DCG_LCv16、MW-DCG_LCv17、MW-DCG_LCv18、MW-DCG_LCv19、MW-DCG_LCv20、MW-DCG_LCv21、MW-DCG_LCv22、MW-DCG_LCv23、MW-DCG_LCv24、MW-DCG_LCv25、MW-DCG_LCv26、MW-DCG_CCv13、MW-DCG_CCv14、MW-DCG_CCv15、MW-DCG_CCv16、MW-DCG_CCv17、MW-DCG_HNCv13、MW-DCG_HNCv14、MW-DCG_HNCv15、MW-DCG_HNCv16、MW-DCG_HNCv17以及MW-DCG_HNCv18。
主题12.如主题11所述的菌株，其中所述菌株选自MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_HNCv13、MW-DCG_HNCv14、MW-DCG_HNCv15、MW-DCG_HNCv16、MW-DCG_HNCv17以及MW-DCG_HNCv18，其中所述菌株对头颈癌实体瘤具有特异性，并且在治疗上对所述头颈癌实体瘤有效。
主题13.如主题12所述的菌株，其中所述菌株是登录号V12/001485所代表的MW-DCG_HNCv18。
主题14.如主题11所述的菌株，其中所述菌株选自MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_CCv13、MW-DCG_CCv14、MW-DCG_CCv15、MW-DCG_CCv16和MW-DCG_CCv17，其中所述菌株对结肠癌实体瘤具有特异性，且在治疗上对所述结肠癌实体瘤有效。
主题15如主题14所述的菌株，其中所述菌株是登录号V12/001487所代表的MW-DCG_CCv17。
主题16如主题11所述的菌株，其中所述菌株选自MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_LCv13、MW-DCG_LCv14、MW-DCG_LCv15、MW-DCG_LCv16、MW-DCG_LCv17、MW-DCG_LCv18、MW-DCG_LCv19、MW-DCG_LCv20、MW-DCG_LCv21、MW-DCG_LCv22、MW-DCG_LCv23、MW-DCG_LCv24、MW-DCG_LCv25和MW-DCG_LCv26，其中所述菌株对肺癌实体瘤具有特异性，且在治疗上对所述肺癌实体瘤有效。
主题17如主题16所述的菌株，其中所述菌株是登录号V12/001486所代表的MW-DCG_LCv26。
主题18.如主题1-3中任一项所述菌株的梭菌芽孢。
主题19.如与生理上可接受的载体和/或赋形剂组合的主题18所述的梭菌芽孢。
主题20.如在个体中抑制一种或多种实体恶性肿瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体恶性肿瘤的方法，其中所述方法包括给予有需要的所述个体治疗有效量的主题18所述的一种或多种梭菌芽孢。
主题21.如主题18所述的一种或多种梭菌芽孢在个体中抑制一种或多种实体瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体瘤的用途，其中给予有需要的所述个体治疗有效量的所述一种或多种芽孢。
主题22.如治疗个体中一种或多种实体恶性肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长抑制、肿瘤逆转或肿瘤破坏表示所述治疗，其中所述方法包括给予所述个体：
(1)治疗有效量的主题18所述的一种或多种梭菌芽孢，和
(2)治疗有效量的抗癌剂
主题23.如主题18所述的一种或多种梭菌芽孢和抗癌剂在用于治疗个体中的一种或多种实体恶性肿瘤的联合疗法中的用途，其中一种或多种肿瘤的生长抑制、肿瘤逆转或肿瘤破坏表示所述治疗，其中给予有需要的所述个体(1)治疗有效量的所述一种或多种梭菌芽孢和(2)治疗有效量的所述抗癌剂。
主题24.如主题22所述的方法，其中顺序或同时给予所述个体(1)和(2)。
主题25.如主题22所述的方法，其中将(1)和(2)作为一种药物组合物给予所述个体。
主题26.如主题22所述的方法，其中重复给予(1)和(2)一次或多次，以确保肿瘤逆转。
主题27.如主题22所述的方法，其中给予所述个体(1)和(2)，作为第一剂量，随后给予(2)，作为第二剂量。
主题28.如主题22所述的方法，其中给予所述个体多于一种抗癌剂。
主题29.如主题22所述的方法，其中一种或多种梭菌芽孢的治疗有效量为每一剂量约106菌落形成单位(CFU)至约1014CFU。
主题30.如主题22所述的方法，其中对所述个体的治疗有效量的所述一种或多种梭菌芽孢的给药是通过静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内给药。
主题31.如药物组合物，包含主题18所述的一种或多种梭菌芽孢和生理上可接受的载体和/或赋形剂。
主题32.如主题31所述的组合物，还包含一种或多种抗癌剂。
主题33.如主题32所述的组合物，其中所述抗癌剂选自化学品、RNA分子、抗体或以上的任意组合。
主题34.如主题33所述的组合物，其中所述化学品选自二氯乙酸钠、紫杉醇、阿霉素、拓扑替康、改变DNA的药物、卡铂、抗代谢药、吉西他滨、防止细胞分裂的药物、长春新碱、抗血管生成剂以及帕唑帕尼。
主题35.如主题33所述的组合物，其中所述RNA分子是小干扰RNA(siRNA)。
主题36.如主题35所述的组合物，其中所述siRNA是乳酸脱氢酶A(LDHA)特异性的或是CD147特异性的。
主题37.如主题33所述的组合物，其中所述抗体是抗癌单克隆抗体。
主题38.如主题37所述的组合物，其中所述抗癌抗体是抗免疫刺激抗体或抗T reg单克隆抗体。
主题39.如主题38所述的组合物，其中所述抗免疫刺激抗体是抗CD40单克隆抗体。
主题40.如主题39所述的组合物，其中所述抗CD40单克隆抗体是FGK45。
主题41.如主题38所述的组合物，其中所述抗T reg单克隆抗体是抗CD25单克隆抗体。
主题42.如主题41所述的组合物，其中所述抗CD25单克隆抗体是PC61。
主题43.如主题37所述的组合物，其中所述抗体靶向表皮生长因子受体(EGFR)。
主题44.如主题37所述的组合物，其中所述抗癌单克隆抗体是缀合的。
主题45.如主题44所述的组合物，其中所述抗体缀合于放射性同位素或药物激活酶。
主题46.如主题45所述的组合物，其中所述抗体是钇90(90Y)缀合的抗CD20抗体Y90替伊莫单抗或碘131(131I)缀合的抗CD20抗体I131托西莫单抗。
主题47.如主题44所述的组合物，其中所述抗体缀合于脂质体或纳米颗粒。
主题48.如由戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株衍生细菌菌株的方法，其中所述方法所产生的衍生的细菌菌株能通过对一种或多种实体瘤的微环境内的细胞的溶瘤作用，抑制所述实体瘤的生长、逆转或破坏所述实体瘤，其中所述方法所产生的所述衍生的细菌菌株引起的毒性比参照梭菌菌株小。
主题49.如主题48所述的方法，包括：
(1)由戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株制备可注射的梭菌芽孢，包括：
(a)将(1)的所述细菌菌株的营养杆菌接种到芽孢形成培养基中，
(b)允许足够的时间和条件，用于所述杆菌的芽孢形成，以及
(c)纯化所述芽孢；
(2)将(1)的纯化的梭菌芽孢注射到支持实体瘤生长的动物中；
(3)评估参数以确定溶瘤作用的速率与程度以及毒性；
(4)通过收获肿瘤，从(2)的肿瘤收集营养杆菌；
(5)将(4)的所述杆菌划线分离到琼脂平板上；
(6)从(5)的所述平板选择两个或更多个单菌落，并接种肉汤培养物以使营养杆菌生长；以及
(7)重复步骤(1)(a)-(6)约10至约35次。
主题50.如主题49所述的方法，其中(6)的所述两个或更多个单菌落是3个单菌落。
主题51.如主题49所述的方法，其中重复步骤(1)(a)-(6)约15至约30次。
主题52.如主题49所述的方法，其中重复步骤(1)(a)-(6)约17至约26次。
主题53.如主题49所述的方法，其中(3)的参数包括芽孢建群时间、溶瘤作用、脓形成和破裂、肿瘤体积、全身毒性、动物存活、在静脉内给予芽孢后从所述肿瘤分离的芽孢/杆菌的数量或以上的任意组合。
主题54.如主题49所述的方法所产生的梭菌菌株，其中所述菌株溶解肿瘤微环境内的约20％至约90％、或约20％至约70％、或约20％至约40％、或约20％至约35％、或约25％至约35％的细胞。
主题55.如用于治疗一种或多种实体恶性肿瘤的试剂盒，包含主题18所述的一种或多种梭菌芽孢或主题31所述的药物组合物，还包含抗癌剂和使用说明书。
主题56.如主题22所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
主题57.如主题56所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
主题58.如主题22所述的方法，其中所述一种或多种实体恶性肿瘤选自呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、黑素瘤、绒毛膜癌，和宫颈癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、卵巢癌、脑癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、骨瘤、脂肪瘤和软骨瘤，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、亲上皮性淋巴瘤、复合性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、胃和非胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、淋巴增生性疾病、T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。
主题59.如(1)治疗有效量的主题18所述的一种或多种梭菌芽孢和(2)治疗有效量的抗癌剂，在制备用于治疗个体中一种或多种实体恶性肿瘤的药物中的用途，其中肿瘤的生长抑制、肿瘤逆转或肿瘤破坏表示所述治疗，其中所述方法包括给予所述个体所述药物。
主题60.如主题59所述的用途，还包含两种或更多种抗癌剂。
主题61.如主题13所述的菌株，其中所述菌株还能通过对所述微环境内所含的组织结构的溶瘤作用而破坏或抑制所述实体瘤的生长。
主题62.如主题61所述的菌株，其中溶瘤作用利用所述新菌株的细胞中的一种或多种酶。
主题63.如主题62所述的菌株，其中所述一种或多种酶选自蛋白酶、脂酶和胶原蛋白酶。
定义
在本说明书的上下文中，术语“包含(comprising)”表示“主要包括但并非一定唯一包括”。此外，词语“包含”的变体如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”具有相应改变的涵义。
术语“菌株”表示细菌种类的子集，其与相同种类的其他细菌的不同在于一个或多个微小但可辨别的差异。菌株是一群起源于单个生物体或纯培养分离物的生物体。物种内的菌株可以以多种方式彼此略微不同(p.392,Prescott et al.,1996)。在实验室内，经常通过诱变细菌种类的现有菌株或野生型菌株而产生菌株。
本文所用术语“衍生物”是从无毒非致病性戈氏梭菌衍生的任何细菌菌株，例如但不限于ATCC登录号25757、BCRC登录号14548、CCUG登录号9282、DSM登录号15049、NCIMB登录号10636、PEV、Prevot PEV、VPI登录号4897以及VTT登录号E-042451，由此利用动物内的异种移植实体瘤，通过连续选择、分离和接种步骤，实现衍生，由此观察到肿瘤的溶瘤作用，并且对动物的毒性不明显。
本文所用术语“坏死区”、“低氧区”、“中心环境”以及“微环境”可互换，指实体瘤的具有一种或多种下述特征的内部：具有高组织间压力、低细胞外pH、肿瘤细胞异质性以及厌氧代谢，包括高葡萄糖浓度和乳酸盐状态的糖酵解。
本文所用术语“分离的”或“分离”表示，已经从培养板或从其天然环境或宿主(如肿瘤)中移除或收集了的细菌细胞。
本文所用短语“毒性比参照梭菌菌株小”和“引起的毒性比参照梭菌菌株小”，表示与已经接种了参照梭菌菌株的个体相比，衍生的梭菌菌株在个体的实体瘤内的生长和随后的溶瘤作用对个体产生较小的毒性，由此参照菌株可以是但不限于糖化菌种类、蛋白水解生孢梭菌(C.sporogenes)、蛋白水解诺维氏梭菌NT和索氏梭菌，甚至是未通过本发明的方法衍生或仅仅通过适应方法衍生一次的戈氏梭菌。利用综合评分表，定义毒性水平并对其评分，包括如下4种水平：表观、临床体征、无端行为以及对外部刺激的行为反应。
术语“癌症”包括以失调的或不受控的细胞生长为特征的恶性肿瘤，包括可以形成癌、肉瘤或淋巴瘤的实体恶性肿瘤。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤和继发性恶性肿瘤，所述原发性恶性肿瘤如细胞还没有迁移到除了最初肿瘤的位点以外的个体身体的其他位点的肿瘤，所述继发性恶性肿瘤如由转移即肿瘤细胞向不同于最初肿瘤位点的次级位点的迁移而引起的肿瘤。
本文所用术语“实体瘤”是通常不含有囊肿或液体区的异常组织团块。实体瘤可以是良性的或恶性的。本文所考虑的实体瘤是恶性肿瘤。肉瘤、癌以及淋巴瘤可以与实体瘤相关。白血病通常不形成实体瘤。
本文所用术语“癌”表示上皮或内分泌组织的任何恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、黑素瘤、绒毛膜癌，和宫颈癌、肺癌、头颈癌、结肠癌以及卵巢癌。
本文所用术语“肉瘤”表示中胚层结缔组织的任何恶性肿瘤，例如骨瘤、脂肪瘤和软骨瘤。
本文所用术语“淋巴瘤”表示骨髓的造血细胞的任何恶性肿瘤。这些恶性肿瘤通常表现为实体瘤。淋巴瘤的实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、亲上皮性淋巴瘤、复合性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、胃和非胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、淋巴增生性疾病、T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。
本文所用术语“抑制”表示肿瘤生长停止。
本文所用术语“肿瘤逆转”表示单独或与抗癌剂和/或其他抗癌疗法组合给予本发明的梭菌芽孢后，实体瘤收缩。为了确定肿瘤逆转，在具体的时间点获取治疗的和未治疗的(对照)肿瘤的大小，并将其彼此比较。“抑制”和“逆转”两者都可以或可以不最终导致肿瘤破坏。
本文所用术语“个体”表示能患有癌症特别是实体瘤形式的癌症的生物体。生物体可以是哺乳动物，并且包括人和各种非人类动物，如灵长类、狗和猫。优选的人类动物包括人类个体。如本文所考虑的，与群体的普通成员相比，个体可以处于其体内发展出实体恶性肿瘤的较大风险中。
本文所用术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和其变型指治疗疾病状态或症状、预防疾病建立或无论以任何方式预防、阻碍、延迟或逆转疾病的进程或其他不良症状的任何和所有用途。如本文所考虑的，实体瘤的治疗表示肿瘤的生长抑制、逆转或几乎完全或完全破坏。
本文所用术语“有效量”在其含义内包括实体本身无毒但足以提供期望的治疗或预防效果的量。所需的准确量会因个体不同而不同，取决于诸如以下的因素：治疗的种类、个体的年龄和一般状况、治疗的疾病状态的严重程度、所给予的具体实体和给药模型等。因此，指定准确的“有效量”是不可能的。然而，对于任何给定的情况，本领域技术人员仅利用常规实验就可以确定适当的“有效量”。特别是，术语“有效量”和“治疗有效量”以含义相同的方式表示在患者群体中具有下述作用的组合物的量或剂量单位：(1)减小肿瘤的大小；(2)抑制(即在一定程度上减缓优选终止)肿瘤转移；(3)在一定程度上抑制(即在一定程度上减缓优选抑制)肿瘤生长；和/或(4)在一定程度上缓解(或优选消除)一种或多种与癌症相关的症状；(5)几乎完全或完全破坏肿瘤；(6)延长疾病进展的时间；和/或(7)提高总体存活率。
本文所用的“药物组合物”是指本文所述的单独的或一种或多种组合形式的梭菌芽孢。在一实施方案中，组合是本发明的衍生的细菌菌株的梭菌芽孢和一种或多种本领域已知的抗癌剂。本文也考虑了其他化学组分，如生理上可接受的载体和赋形剂。
本文所用术语“药学上可接受的”表示，药剂或赋形剂通常视为可以接受用于药物组合物中。
本文所用“生理上可接受的载体”指不对生物体引起明显刺激且不废除给予的组合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。示例性药学上可接受的载体包括固体和液体稀释剂。水、乙醇、丙二醇以及甘油都是示例性的药学上可接受的液体稀释剂；在这些稀释剂中，在某些实施方案中，水是优选的。
本文所用“赋形剂”指添加于药物组合物中以进一步促进本发明药物组合物的给药的药学上惰性的物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油以及聚乙二醇。在药学领域中，很多赋形剂和活性药物组分被视为是相互排斥的。
附图简要说明
图1.芽孢产生的示意图。示意图显示了，在厌氧条件下，将梭菌芽孢悬浮液的新的等分试样接种于强化梭菌琼脂平板中，持续24小时。然后获取高达5个菌落，将其接种于10ml HI肉汤，并进行厌氧培养。24小时后，将培养物转移至100改良的芽孢形成培养基并培养于厌氧条件下。7天后，准备收获芽孢。在收获时，短暂摇动瓶子，接着使其静置几分钟，随后将培养物的顶端部分吸入旋转桶瓶中，并以5000g离心，以洗涤芽孢。滴定纯化的芽孢，以确定菌落形成单位(CFU)的滴度。这项工作将花费2-4天。
图2.衍生的细菌菌株的溶瘤能力。将小鼠随机分成3组。在第15天，不注射组1，将其作为对照(图例中以“无(none)表示”)，给予组2磷酸盐缓冲盐水(在图例中以“PBS”表示)，给予组3衍生的细菌菌株的芽孢(在图例中以“DCG”表示)。每隔一天，记录肿瘤体积。就肿瘤体积而言，DCG组表现出肿瘤生长延迟。
图3.芽孢送递和梭菌芽孢重复适应的示意图。具有不同大小的肿瘤的小鼠(n＝3)(可检测至0.45cm3)被静脉内注射108CFU芽孢。利用超声以及数显游标卡尺，每隔一天评估小鼠的肿瘤生长和体积。另外，评估肿瘤皮肤颜色发生变化、肿瘤坏死/液体/脓形成和液体/脓肿瘤皮肤破裂前的时间长度、肿瘤内芽孢的次数和数量、肿瘤生长/收缩/消失以及任何毒性迹象和动物行为变化。仅切除表现出80％液体/脓/肿瘤皮肤破裂或坏死/液体/脓形成的肿瘤并匀浆。用这些肿瘤的溶解产物接种琼脂平板，用于进一步梭菌培养。适应进展的重复，取决于肿瘤的类型。
图4.MW-DCG_LCv26(在图中称为DCGnv26)在肺癌(NSCLC)(A549)模型中的溶瘤能力。将小鼠随机分成4组。在第15天，不注射组1而将其作为对照，给予组2PBS，给予组3DCG，并给予组4MW-DCG_LCv26芽孢。每隔一天，记录肿瘤体积。
图5.MW-DCG_CCv17(在图中称为DCGv17)在结肠癌模型中的溶瘤能力。将小鼠随机分成4组。在第15天，不注射组1而将其作为对照，给予组2PBS，给予组3DCG，并给予组4MW-DCG_CCv17芽孢。每隔一天，记录肿瘤体积。
图6.MW-DCG_HNCv18(在图中称为DCGhv18)在头颈癌模型中的溶瘤能力。将小鼠随机分成4组。在第15天，不注射组1而将其作为对照，给予组2PBS，给予组3DCG，并给予组4MW-DCG_HNCv18芽孢。每隔一天，记录肿瘤体积。
图7.(I).抗癌治疗效果。将小鼠随机分组。在第16天，给予组1PBS，给予组2和组3DCG芽孢。进一步给予组3西妥昔单抗。每隔一天，记录肿瘤体积。(II).动物存活百分比。呈现了3组。
图8.表示从里面液化肿瘤并从外部杀伤活癌细胞(在边缘)的示意图。该方法是研发癌症疗法时的概念变化。
详细描述
下文的描述全面支持和披露本发明，本发明涉及从戈氏梭菌衍生的新菌株的鉴定，所述新菌株是有效但适度的溶瘤剂(oncolyser)。这些菌株的独特性使得它们解决了其他菌株的快速溶瘤作用的问题，该问题导致明显的毒性和在临床环境中无用。通过使无毒的戈氏梭菌菌株适应异种移植(人类癌症)和同基因的小鼠癌的实体实验癌(例如但不限于肺癌、结肠癌、头颈癌、乳腺癌以及黑素瘤)的新方法，发现了戈氏梭菌的新的衍生菌株，所述衍生的菌株在上文提到的癌症中表现出适应的戈氏梭菌的溶瘤治疗功效。
新菌株的最大效力在于实体恶性肿瘤微环境(中心区)的溶瘤作用同时引起很少的毒性或不引起毒性。在新菌株范围内，新菌株具有溶解活的癌性细胞以及溶解微环境中所含的组织结构的溶瘤能力。新菌株细菌细胞中的酶提供了微环境组织结构的溶解。例如，新菌株的细菌蛋白酶、脂酶以及胶原蛋白酶有效溶解包含尤其是纤连蛋白和胶原蛋白的组织结构。相对于病毒溶瘤作用，这显然是有利的，因为病毒不具有溶解组织结构的这类酶并因此仅限于活细胞的溶瘤作用。
如本文所考虑的，实体瘤在形式上可以是癌、肉瘤或淋巴瘤。这些实体瘤可以是原发性的，如处于还没有迁移至除了最初肿瘤的位点以外的个体身体的位点的细胞团中，或可以是继发性的，即起因于转移的细胞团，其中肿瘤细胞向不同于最初肿瘤位点的次级位点迁移。本文考虑了在溶瘤作用、微环境破坏、生长抑制、肿瘤逆转以及几乎完全或完全肿瘤破坏方面受到本发明的新的衍生细菌菌株的梭菌芽孢影响的任何实体瘤。本文所定义的实体瘤视为通常不包含囊肿或液体区的异常组织团块。如本文所考虑的，实体瘤的形式可以为呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、黑素瘤、绒毛膜癌，宫颈癌、肺癌、头颈癌、结肠癌和卵巢癌、骨瘤、脂肪瘤以及软骨瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、亲上皮性淋巴瘤、复合性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、胃和非胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、淋巴增生性疾病、T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。
本发明的治疗方法和用途可适用于间充质来源的癌性细胞，如产生肉瘤(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤或软骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤(endotheliosardcoma)、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤或间皮肉瘤)；白血病和淋巴瘤，如粒细胞性白血病、单核细胞白血病、淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、网状细胞肉瘤或霍奇金病；肉瘤，如平滑肌肉瘤或横纹肌肉瘤，上皮来源的肿瘤，如鳞状细胞癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、未分化癌、支气管癌、黑素瘤、肾细胞癌、肝癌-肝细胞癌、胆管癌(bile duct carcinoma)、胆管癌(cholangiocarcinoma)、乳头状癌、移行细胞癌、绒毛膜血管癌(chorioaencinoma)、精原细胞瘤或胚胎性癌；以及神经系统肿瘤，包括胶质瘤、脊膜瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤或室管膜细胞瘤的细胞。适合根据本文所述方法治疗的其他细胞类型包括引起以下癌症的细胞类型：乳腺癌，胃肠癌如结肠癌，膀胱癌，前列腺以及头颈区鳞状细胞癌。适合根据本文所述方法治疗的实例包括阴道癌、宫颈癌以及乳腺癌。
实施例所提出的实验数据证明并支持了新的衍生细菌菌株的效力。例如，将来自本发明的新的衍生细菌菌株的梭菌芽孢注射到小鼠中，在30％的具有晚期肺癌、结肠癌、头颈癌以及黑素瘤的小鼠中导致几乎完全的溶解。溶解包括肿瘤结构和细胞团的破坏，将实体团块变成液体(在白细胞渗透后，其就变成脓样液体)。这些肿瘤通常消失。剩余的小鼠在其肿瘤中表现出广泛的中心溶瘤作用，皮肤颜色变成红色，接着变成黑色，其中的一些最终冲破皮肤。但是由于肿瘤的富氧边缘，这些并非是完全的，从而留下含有活的典型的快速分裂的癌细胞的一薄层外周边缘。因此，本发明人已经发现，联合治疗方法会增大溶瘤作用，并且考虑了使用其他疗法来增强溶瘤效率。如本文所考虑的，联合疗法包括给予需要治疗实体瘤的个体本发明的梭菌芽孢和抗癌剂。可选地或另外，给予的抗癌剂是激素疗法、热疗、外科手术、放射或以上的任意组合。本文所述和所定义的联合方法导致实体恶性肿瘤(如肺瘤、结肠癌和头颈癌)的生长抑制，，肿瘤的肿瘤逆转，以及最终的肿瘤破坏。
衍生的细菌菌株
如本文所考虑的，本发明提供了从戈氏梭菌的无毒非致病性菌株衍生的细菌菌株，其中所述细菌菌株能通过对实体瘤微环境所含的细胞的溶瘤作用而抑制所述实体瘤的生长。肿瘤微环境内的约20％至约90％、或约20％至约70％、或约20％至约40％、或约20％至约35％、或约25％至约35％的细胞被本发明的细菌菌株溶解，本发明的细菌菌株引起的毒性比参照梭菌菌株小。戈氏梭菌的无毒非致病性菌株可以是允许本发明可行并且本发明的精神所考虑的任何菌株。例如，所用的无毒菌株可以是ATCC登录号25757、BCRC登录号14548、CCUG登录号9282、DSM登录号15049、NCIMB登录号10636、PEV、Prevot PEV、VPI登录号4897或VTT登录号E-042451。
本发明细菌菌株的非限制性实例是MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_LCv13、MW-DCG_LCv14、MW-DCG_LCv15、MW-DCG_LCv16、MW-DCG_LCv17、MW-DCG_LCv18、MW-DCG_LCv19、MW-DCG_LCv20、MW-DCG_LCv21、MW-DCG_LCv22、MW-DCG_LCv23、MW-DCG_LCv24、MW-DCG_LCv25、MW-DCG_LCv26、MW-DCG_CCv13、MW-DCG_CCv14、MW-DCG_CCv15、MW-DCG_CCv16、MW-DCG_CCv17、MW-DCG_HNCv13、MW-DCG_HNCv14、MW-DCG_HNCv15、MW-DCG_HNCv16、MW-DCG_HNCv17以及MW-DCG_HNCv18。细菌菌株MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、DCG_HNCv13、MW-DCG_HNCv14、MW-DCG_HNCv15、MW-DCG_HNCv16、MW-DCG_HNCv17以及MW-DCG_HNCv18对头颈癌实体瘤具有特异性，并且在治疗上对头颈癌实体瘤有效。MW-DCG_HNCv18是优选的菌株。MW-DCG_HNCv18于2012年4月18日保藏于具有国际保藏单位资格的NationalMeasurement Institute,1/153Bertie Street,Port Melbourne,Victoria,Australia3207中，并给予登录号V12/001485。
细菌菌株MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_CCv13、MW-DCG_CCv14、MW-DCG_CCv15、MW-DCG_CCv16以及MW-DCG_CCv17对结肠癌实体瘤具有特异性，并且在治疗上对结肠癌实体瘤有效。MW-DCG_CCv17是优选的菌株。MW-DCG_CCv17于2012年4月18日保藏于具有国际保藏单位资格的NationalMeasurement Institute,1/153Bertie Street,Port Melbourne,Victoria,Australia3207，并给予了登录号V12/001487。
细菌菌株MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_LCv13、MW-DCG_LCv14、MW-DCG_LCv15、MW-DCG_LCv16、MW-DCG_LCv17、MW-DCG_LCv18、MW-DCG_LCv19、MW-DCG_LCv20、MW-DCG_LCv21、MW-DCG_LCv22、MW-DCG_LCv23、MW-DCG_LCv24、MW-DCG_LCv25和MW-DCG_LCv26对肺癌的实体瘤具有特异性，并且在治疗上对肺癌的实体瘤有效。MW-DCG_LCv26是优选的菌株。MW-DCG_LCv26于2012年4月18日保藏于具有国际保藏单位资格的，并给予了登录号V12/001486。
梭菌芽孢
如本文所考虑的，本发明提供了整个说明书所描述的一种或多种细菌菌株的梭菌芽孢。这些梭菌芽孢可以与生理上可接受的载体和/或赋形剂组合。本文考虑了任何已知的载体或赋形剂。
抑制肿瘤生长、肿瘤逆转以及肿瘤破坏
如本文所考虑的，本发明提供了在个体中抑制一种或多种实体恶性肿瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体恶性肿瘤的方法，其中所述方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本文所述的梭菌芽孢。还以相同或相似的方式考虑了梭菌芽孢的用途。
联合疗法
考虑了用于治疗个体中一种或多种实体恶性肿瘤的联合疗法，其中生长抑制、肿瘤逆转或肿瘤破坏表示治疗，其中所述方法包括给予所述个体(1)治疗有效量的第二方面的梭菌芽孢和(2)治疗有效量的抗癌剂。还以相同或相似的方式考虑了梭菌芽孢和抗癌剂的用途。顺序或同时给予个体(1)和(2)。可以将(1)和(2)作为一种药物组合物给予个体。可以将(1)和(2)作为一种组合物或分开，重复给予一次或多次，以确保肿瘤逆转。例如，可以给予个体(1)和(2)，作为第一剂量，随后给予(2)，作为第二剂量。可以以任何剂量数量给予多于一种抗癌剂。例如，(1)是MW-DCG_HNCv18的梭菌芽孢，而(2)是嵌合抗EGFR单克隆抗体。在另一实例中，(2)是西妥昔单抗。在另一实例中，根据实施例3，所考虑的是，同时给予个体MW-DCG_HNCv18的梭菌芽孢和西妥昔单抗，随后第二次单独给予西妥昔单抗，然而，本发明的芽孢与任何剂量数量和剂型的抗癌剂的组合都落入本发明的范围和精神内。作为本文所述联合疗法的一部分，本领域已知的其他抗癌治疗的使用，也落入本发明的精神和范围内，这类治疗包括激素疗法、热疗、外科手术以及放射。
衍生细菌菌株的方法(适应)
如本文所考虑的，本发明提供了由戈氏梭菌的无毒非致病性菌株衍生细菌菌株的方法，其中所述方法所产生的衍生的细菌菌株能通过对实体瘤微环境内细胞的溶瘤作用，抑制所述实体瘤的生长、逆转或破坏所述实体瘤，其中所述方法所产生的衍生的细菌菌株引起的毒性比参照梭菌菌株小。所述方法包括：(1)由戈氏梭菌的无毒非致病性菌株制备可注射的梭菌芽孢，包括：
(a)将(1)的细菌菌株的营养杆菌接种到芽孢形成培养基中，
(b)允许足够的时间和条件，用于杆菌的芽孢形成，以及
(c)纯化芽孢；
(2)将(1)的纯化的梭菌芽孢注射到支持实体瘤生长的动物中；
(3)评估参数以确定溶瘤作用的速率与程度以及毒性；
(4)通过收获肿瘤，从(2)的肿瘤收集营养杆菌；
(5)将(4)的杆菌划线分离到琼脂平板上；
(6)从(5)的平板选择两个或更多个单菌落，并接种肉汤培养物以使营养杆菌生长；以及
(7)重复步骤(1)(a)-(6)约10至约35次。
在实例中，(6)的两个或更多个单菌落是3个单菌落。同样，步骤(1)(a)-(6)重复约15至约30次、或约17至约26次，并且(3)的参数可以包括芽孢建群时间、溶瘤作用、脓形成和破裂、肿瘤体积、全身毒性、动物存活、在静脉内给予芽孢后分离自肿瘤的芽孢/杆菌的数量以及以上的任意组合。
所述方法产生的细菌菌株溶解肿瘤微环境内的约20％至约90％、或约20％至约70％、或约20％至约40％、或约20％至约35％、或约25％至约35％的细胞。
试剂盒
如本文所考虑的，本发明提供了用于治疗一种或多种实体恶性肿瘤的试剂盒，包含本文所述和所定义的细菌菌株、梭菌芽孢或药物组合物，还包含抗癌剂。还提供了使用试剂盒的说明书。
本发明的其他特征
本发明可用于任何可能生长和/或具有实体瘤的个体。个体可以是哺乳动物，例如人，但是本文考虑了任何哺乳动物，并且其落入本发明的范围内。
如本文所考虑的，可以用本发明治疗的实体恶性肿瘤的实例是但不限于呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、黑素瘤、绒毛膜癌，和宫颈癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、卵巢癌、脑癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、骨瘤、脂肪瘤以及软骨瘤，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、亲上皮性淋巴瘤、复合性淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、胃和非胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、淋巴增生性疾病、T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤以及多发性骨髓瘤。
组合物、剂量以及给药途径
本发明的衍生的细菌菌株(及其芽孢)可以用作治疗实体瘤癌症的治疗剂，并且被考虑作为单一疗法或联合疗法的组成。通过给予个体治疗有效量的细菌菌株的芽孢，这些细菌菌株可用于例如在所述个体中抑制一种或多种实体瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体瘤。实体瘤可见于例如头颈、背部、结肠和肺中。
可通过标准途径给予衍生的细菌菌株的芽孢，并且本领域技术人员应当认识到，利用具体给药模式，能够有效靶向具体癌症类型。通常，衍生的细菌菌株(其芽孢)可以通过肠胃外，例如静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内给予。优选地，将芽孢注射到动物体内。对于芽孢作为可注射溶液或悬浮液的给药，非毒性肠胃外可接受的稀释剂或载体可以包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇以及1,2丙二醇。
制备可肠胃外给予的组合物(包括本发明的芽孢)的方法，对本领域技术人员而言是显而易见的，并且比较详细地描述于例如Remington's Pharmaceutical Science(雷明顿药物学),15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.中，据此通过引用将其并入本文。
在联合疗法中，可以将本发明的芽孢和其他抗癌剂如抗体作为组合物/组分给予个体。在治疗应用中，以足以破坏或至少抑制肿瘤生长的量，将组合物给予已经具有实体瘤癌症的个体。组合物所提供的芽孢和其他抗癌剂如抗体的量，应足以有效治疗个体。
抗癌剂是可以用于化疗、放射或基于抗体疗法或以上组合中的任何药剂。药剂可以是一种或多种化学品、一种或多种RNA分子、一种或多种抗体或以上任意组合。
例如，一种或多种化学品可以是二氯乙酸钠、紫杉醇、阿霉素、拓扑替康、改变DNA的药物、卡铂、抗代谢药、吉西他滨、防止细胞分裂的药物、长春新碱、抗血管生成剂以及帕唑帕尼。
一种或多种RNA分子的实例是小干扰RNA(siRNA)。siRNA可以是乳酸脱氢酶A(LDHA)特异性的或是CD147特异性的。
一种或多种抗体的实例是抗癌单克隆抗体，其在下文中有描述。
对于任何具体患者或个体而言，治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括实体瘤的类型、实体瘤的大小，若有的话，在联合疗法中使用的其他药剂；以及医药领域熟知的其他相关因素。
根据常规实验，结合本公开的内容，本领域技术人员应当能确定抑制一种或多种实体瘤的肿瘤生长、逆转或破坏所述实体瘤所需的梭菌芽孢和其他药剂的有效非毒性量。
通常，治疗人的诸如结肠和肺的实体瘤的本发明的梭菌芽孢的治疗有效量为每一剂量约106菌落形成单位(CFU)至约1014CFU，或每一剂量约108-1012CFU，或每一剂量约1010-1011CFU，或每一剂量约1010.5CFU。在非限制性实例中，治疗有效量的梭菌芽孢的给药是静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内。例如，优选的给药是静脉内。
通常，在治疗应用中，治疗应持续疾病状态的持续时间。
还考虑了用于治疗个体中一种或多种实体恶性肿瘤的药物，其包含：
(1)治疗有效量的一种或多种主题16的梭菌芽孢，和
(2)治疗有效量的抗癌剂，
其中肿瘤逆转表示治疗，其中所述方法包括给予所述个体所述药物。还考虑了所述药物的制备。
此外，对本领域技术人员显而易见的是，个体剂量的最佳量和间隔，应由肿瘤形成的特性和程度以及肿瘤类型确定。同样，这类最佳条件可以通过常规技术确定。
对于联合疗法而言，可以在同一时间或以任何顺序依次或在不同时间给予联合疗法的每一组分，以便提供期望的效果。可选地，可以将组分一起配制于单个剂量单位中，作为组合产品。当单独给予时，优选通过相同的给药途径给予组分，尽管并非必须如此。
抗体
本发明提供了联合本发明新的衍生细菌菌株的梭菌芽孢给予个体的抗体。治疗实体瘤的有效联合疗法(借此肿瘤逆转表示本文所考虑的治疗)可以包括本发明新的衍生细菌菌株的梭菌芽孢和抗癌单克隆抗体，，尽管本文考虑了任何合适的抗体，其包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段以及Fab表达文库。还考虑了抗体片段及其类似物。
本文所考虑的抗癌抗体包括抗免疫刺激抗体或抗T reg单克隆抗体。抗免疫刺激抗体的实例是是抗CD40单克隆抗体。抗CD40单克隆抗体可以是FGK45。抗T reg单克隆抗体的实例是抗CD25单克隆抗体。抗CD25单克隆抗体可以是PC61。在另一实施方案中，药剂靶向表皮生长因子受体(EGFR)。
抗癌单克隆抗体可以是缀合的或裸露的。裸抗体例如具有诸如补体介导的溶胞作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的效应。缀合的抗体包括与放射性同位素或药物激活酶缀合的抗体。放射性缀合抗体可以用于放射免疫疗法中。放射性缀合抗体的实例是钇90(90Y)-缀合的抗CD20抗体Y90-替伊莫单抗和碘131(131I)缀合的抗CD20抗体I131-托西莫单抗。与药物激活酶缀合的抗体可以用于抗体导向酶前药疗法(ADEPT)中。抗癌单克隆抗体可以与脂质体或纳米颗粒缀合，并包括脂质体或纳米颗粒中的各种药物和治疗性核苷酸，如siRNA。
抗癌单克隆抗体可以通过几种机制靶向恶性细胞。如本文所考虑的，这类机制包括(1)放射免疫疗法(RIT)，其涉及使用针对细胞抗原的放射性缀合鼠抗体，(2)抗体导向酶前药疗法(ADEPT)，其涉及应用癌症相关单克隆抗体，所述抗体连接于药物激活酶，由此导致随后全身给予的非毒性药剂转化为毒性药物，导致可以靶向恶性细胞的细胞毒性作用，以及(3)免疫脂质体，其是携带药物或治疗性核苷酸的抗体缀合的脂质体，并且当与单克隆抗体缀合时，可以定向恶性细胞。
本领域技术人员应当容易地意识到产生合适抗体的方法。例如，单克隆抗体可以利用下述文献所述的杂交瘤技术制备：Antibodies-A Laboratory Manual(抗体，实验室手册),Harlow and Lane,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1988)。
实质上，在制备单克隆抗体、其片段或类似物时，可以使用通过处于培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何技术。这些技术包括最初由Kohler et al.,Nature,256:495-497(1975)研发的杂交瘤技术，以及三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术[Kozbor et al.,Immunology Today,4:72(1983)]，和产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术[Cole et al.,inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症疗法),pp.77-96,AlanR.Liss,Inc.,(1985)]。通过除了融合以外的技术，如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒(Epstein-Barr virus)转染，可以创造产生抗体的永生细胞系。参阅例如M.Schreier et al.,"Hybridoma Techniques(杂交瘤技术)"(1980)；Hammerling etal.,"Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)"(1981)；Kennett et al.,"Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)"(1980)。
总之，制备产生单克隆抗体的杂交瘤的方式是，将骨髓瘤或其他自永生化细胞系与从哺乳动物的脾获得的淋巴细胞融合，所述哺乳动物已经用其识别因子结合部分或识别因子或其来源特异性DNA结合部分超免疫。可通过杂交瘤与本识别因子发生免疫反应的能力和抑制靶细胞中指定的转录活性的能力，来鉴定产生可以用于实施本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
用于实施本发明的单克隆抗体可以通过启动单克隆杂交瘤培养物而产生，所述培养物包含含有杂交瘤的营养培养基，所述杂交瘤分泌适当抗原特异性的抗体分子。将培养物维持在杂交瘤足以将抗体分子分泌到培养基中的条件下和时间内。然后收集含有抗体的培养基。接着可通过本领域已知的技术，进一步分离抗体分子。
同样，有各种本领域已知的可以用于产生多克隆抗体或其片段或类似物的方法。为了产生多克隆抗体，可通过注射抗原或其片段或其类似物，免疫各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。
筛选期望的抗体，也可以通过本领域已知的多种技术实现。抗体免疫特异性结合测定可以包括但不限于，放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白A测定以及免疫电泳测定等(参阅例如Ausubel etal.,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术),Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。在免疫测定中检测结合的多种方法是本领域已知的，并且在本发明的范围内。
用于实施本发明的抗体或其片段的结合亲和性或亲和力大于约105M-1更优选大于约106M-1，更优选大于约107M-1，最优选大于约108M-1。
若产生在联合疗法中与本发明新的衍生细菌菌株的梭菌芽孢一种使用的抗体，可以利用无血清培养基进行批量发酵来制备抗体。发酵后，抗体可以通过并入层析和病毒失活/除去步骤的多步骤方法纯化。例如，首先通过蛋白A亲和层析分离抗体，随后用溶剂/去污剂处理，以失活任何脂质包被的病毒。通常通过阴离子和阳离子交换层析进行的进一步纯化，可以用于除去残留的蛋白、溶剂/去污剂和核酸。可以利用凝胶过滤柱进一步纯化纯化的抗体并将其配制成0.9％的盐水。配制的批量制剂随后可以灭菌并进行病毒过滤和分配。
本文考虑了允许有效治疗实体瘤癌症和减小对实体瘤癌症的毒性的任何抗体设计和去免疫化技术。本文还考虑了放射性同位素、小分子细胞毒性药物以及蛋白毒素与引导抗体(targeting antibody)的缀合和抗体依赖性细胞毒性增强抗癌抗体功效的效应子功能的增强。通常，毒性是研发癌症和抗癌疗法的治疗性抗体的主要障碍。对于抗体而言，与正常组织的交叉反应性可以引起明显的副作用，包括肺毒性作用引起的呼吸困难、偶发性中枢和周围神经系统并发症、肝功能降低、肾损伤、以及偶尔意外的毒性作用，如与使用例如曲妥珠单抗相关的心肌损伤。另外，利用同位素缀合抗体的放射免疫疗法也可以引起骨髓抑制。使用新的衍生细菌菌株的梭菌芽孢与诸如抗体的抗癌剂的联合治疗方法，可以减少具有治疗效果所需的抗体剂量，因此减轻毒性作用。
本文考虑了将化学品、药物、毒性等与抗体复合的缀合程序。与抗体的缀合物包括上文所考虑的放射性同位素和药物激活酶，但还包括真菌来源的有效毒素吉妥单抗和美登醇(maytansinoid)(DM-1)。
其他治疗
本文考虑了放射疗法，作为逆转实体瘤的联合治疗方法的一部分，包括使用本发明的细菌菌株的梭菌芽孢。通常，电离辐射用作联合癌症治疗的组成部分来控制恶性细胞。存在两种不同的将辐射送递到待治疗的组织的方式：
·称为直线加速器的机器，其从身体外送递辐射
·从身体内发出辐射束的材料的小球或辐射盒(seed)
待治疗的组织的实例可以包括乳腺区、淋巴结或身体的另一部分，但考虑了可以受到辐射影响的任何实体瘤。考虑到每日安排和内部肿瘤运动的不确定性，必须包括肿瘤周围正常组织的边缘。这些不确定性可以由内部移动(例如呼吸和膀胱填充)和外部皮肤标记相对于肿瘤位置的移动引起。放射疗法以及接种本发明的梭菌芽孢，可以与外科手术、化疗、激素疗法、免疫疗法或上述4种的某些混合联合。在某种程度上，最常见的癌症类型可以用放射疗法治疗。明确的治疗意图(药品、佐剂、新佐剂、治疗剂或缓和剂)取决于肿瘤类型、位置和阶段，以及患者的总体健康。全身辐射(TBI)是用于使身体准备接受骨髓移植的放射治疗技术。短距离放射治疗(Brachytherapy)，是另一种形式的放射疗法，其使治疗乳腺癌、前列腺癌和其他器官癌症的过程中对健康组织的暴露最小化，其中放射源置于需要治疗的区域内或邻近所述区域。
本文还考虑了激素疗法，作为用于治疗实体恶性肿瘤的联合疗法的可能方面。激素疗法涉及通过具体激素特别是类固醇激素或抑制此类激素的产生或活性的药物(激素拮抗剂)的外源给药而操纵内分泌系统。因为在模型癌症细胞中类固醇激素是基因表达的有力驱动剂，从而改变某些激素的水平或活性可以使某些癌症停止生长，或者甚至是经历细胞死亡。手术除去内分泌器官，如睾丸切除术和卵巢切除术，也可以作为一种激素疗法形式使用。
激素疗法用于几种来源于激素应答组织的癌症类型，所述组织包括但不限于乳腺、前列腺、子宫内膜以及肾上腺皮质。激素疗法也可以用于治疗副肿瘤综合征或改善某些癌症和化疗相关症状，如厌食。或许肿瘤学中激素疗法最常见的实例是，使用选择性雌激素应答调节剂它莫西芬，用于治疗乳腺癌，尽管另一类激素药剂即芳香酶抑制剂目前在该疾病中的作用正在扩大。
现在参考具体实施例描述本发明，无论如何不应将实施例理解为限制本发明的范围。
实施例
下述实施例证明了新的衍生梭菌菌株作为溶瘤药剂与其他梭菌菌株相比的优势，如极好的特异性、安全性以及功效特征。根据实施例显而易见的是，其他梭菌菌株，包括诺威氏梭菌和索氏梭菌，都具有引起溶瘤作用的潜力，但是毒性高，因为它们的溶瘤作用太快，从而引起明显的副作用/毒性作用，包括造成荷瘤动物的死亡。这限制了它们作为临床形式的用途。
实施例1：新的衍生的梭菌菌株的鉴定、分离和建群
在晚期黑素瘤、结肠癌和肺癌(0.45cm3)模型中，如在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的异种移植和同基因小鼠模型中，本发明人检测了诺威氏梭菌-NT和索氏梭菌以及两种糖化菌种类即丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)和拜氏梭菌(C.beijerinckii)，并将它们与其他可获得的蛋白水解梭菌(索氏梭菌的6种临床变种，两种C.bifermentas以及ATCC号25757(即以前未报道的戈氏梭菌的无毒蛋白水解菌株，其是实体瘤的有效抗癌剂)进行了比较。
首先，本发明人制备了可注射的梭菌芽孢来给予所述模型(参阅图1–芽孢产生的示意图)。本发明人发明了有效培养和收获梭菌芽孢的方法，其包括如下步骤：
●使用改良的芽孢形成培养基，其包含例如：
о来自OXOID的心浸液培养基和强化梭菌培养基。
о1升pH 7.4的芽孢形成培养基含有：
оNa2HPO4(Sigma)5g
оL半胱氨酸(Sigma)0.5g
о麦芽糖一水合物(Chem-Supply)10g
о示蛋白胨(OXOID)30g
о疱肉培养基(OXOID)10％
●使用50-100mL等分试样，最适合芽孢产生；
●将细菌杆菌接种到试管所含的芽孢形成培养基中，并在35℃下孵育，使培养物生长；
●在10天内芽孢形成会为收获做好准备。
●短暂震荡试管，以便培养基中较重的干肉沉于底部。使培养物静置几分钟，接着用移液管除去试管中培养物的顶部部分，然后置于旋转桶瓶中，
●利用5000g的速度离心瓶子。
其次，将梭菌芽孢注射到模型中，并且评估各种参数，如芽孢建群和溶瘤作用的时间、脓形成和破裂、肿瘤体积(即生长、收缩或消失)、全身毒性、动物存活以及静脉内给予芽孢后从肿瘤分离的芽孢/杆菌的数量。
结果表明，尽管两种糖化菌种类和蛋白水解产孢梭菌(C.sporogenes)并未表现出明显的建群和溶瘤作用，但蛋白水解诺威氏梭菌-NT和索氏梭菌确实效率很高。50％的荷晚期肿瘤的动物在静脉内注射后12小时开始出现溶瘤作用，并在24小时之前完成。肿瘤经历坏死，同时皮肤颜色从紫色变为黑色，伴随脓/液体形成和肿瘤皮肤破裂，同时宿主动物看起来嗜睡且病态，这是由于快速肿瘤溶解所导致的明显毒性迹象。
相比之下，ATCC编号25757在建群和溶瘤作用方面较慢，但是在NSCLC的异种移植和同基因小鼠模型中，在溶瘤作用上更为有效。芽孢建群在给予芽孢后48小时时是明显的，而溶瘤作用在72小时时是明显的，其持续超过10天。然而，野生型戈氏梭菌的溶瘤能力是多变的，因此平均而言，其与戈氏梭菌的无毒菌株(ATCC编号25757)并无明显不同，但显而易见的是，无毒菌株具有溶瘤作用和肿瘤生成延迟(参见图2)。重要且令人惊讶的是，与其他梭菌菌株相比，该菌株与毒性无关。
与野生型菌株一样，注射到小鼠模型中的无毒菌株的芽孢，具有多变的溶瘤作用。为了提高戈氏梭菌溶瘤作用的一致性，本发明人发明了通过重复适应、选择、再分离菌株达26个循环来提高一致性的方法(此方法的示意图，参见下文的实施例2和图3)。最终，本发明人分离了无毒戈氏梭菌菌株的新的衍生物，与考虑用于治疗癌症的其他已知梭菌菌株相比，其具有渗透黑素瘤、结肠癌和肺癌并在所述癌症中建群和繁殖的极好能力。
实施例2：实现新的衍生的梭菌菌株的适应
在3种肿瘤模型中，重复适应无毒的戈氏梭菌菌株：(1)晚期NSCLC(A549)(2)结肠癌模型(HCT116)和(3)头颈(HN5)癌。在每组(n＝6)中用于适应的肿瘤完成了溶瘤作用。通过以下方式从接种了无毒戈氏梭菌菌株ATCC编号25757的芽孢的肿瘤内收集梭菌杆菌：收获实体瘤，随后将肿瘤组织匀浆，然后将其划线分离至强化梭菌培养基/琼脂平板上。然后，将来自平板的三个单菌落汇集于40ml强化梭菌培养基肉汤培养物中，并在厌氧条件下于37℃孵育过夜。对于芽孢形成，将40ml细菌培养物添加于1升芽孢形成培养基(0.5％Na2HPO4、3％硫蛋白E胨、0.05％L半胱氨酸、1％麦芽糖、5％干庖肉粒(dried cooked meatparticle),pH 7.4)中，并在厌氧条件下于37℃孵育2周。在此时间点，梭菌形成内芽孢，并且准备好纯化。为了纯化芽孢，首先于4℃、以12,000rpm将200ml芽孢悬浮液离心15分钟。随后重悬浮所得沉淀，并用200ml冷PBS洗涤两次，接着进行离心。洗涤后，用冷PBS重悬浮芽孢沉淀，并在冰上超声5分钟，以释放内芽孢并耗尽营养细胞。超声后，利用冷PBS再次洗涤芽孢6-10次，直到清除了芽孢悬浮液的细胞碎片。最后利用相差显微镜证实芽孢悬浮液的纯度，其具有<1％的营养细胞材料，并称为菌株MW-DCG_LCv12。
将以适当浓度例如5x 107-1x 108CFU重悬浮的MW-DCG_LCv12的芽孢注射到模型的尾静脉中，用于随后再接种NSCLC(即肺癌)、结肠癌和头颈癌的新肿瘤，同时再分离新的变异菌株。
在17-26次这样重复的循环后，本发明人分离了7种新的衍生细菌菌株，其具有优于非适应的无毒戈氏梭菌的优越特性，如在NSCLC、结肠癌和头颈癌中确定的渗透、建群、繁殖和引起明显的溶瘤作用的能力，而无任何可见的毒性作用。根据图4-6，溶瘤作用伴随肿瘤明显的生长延迟，但是没有与利用诸如诺威氏梭菌-NT和索氏梭菌的梭菌的以前的研究相关的毒性/毒性迹象。这非常有意义，因为重复分离和适应方案并未以这种方式使用过。
这些新的衍生细菌菌株通过溶瘤作用(坏死)在30％荷晚期黑素瘤和肺癌的小鼠中引起几乎完全的肿瘤破坏。再监测这些小鼠3个月，它们并未表现出肿瘤复发的证据。在剩余的小鼠中，也有各种程度的溶瘤作用和肿瘤生长延迟。新的衍生细菌菌株在治疗实体瘤的联合疗法中最有效，并且对实体瘤(如结肠癌)类型是特异性的，从而当测量并与参照梭菌菌株相比时，导致超过20％的位于肿瘤内的癌细胞坏死，并且低毒或无毒性。下文描述了满足这些标准的菌株，所述标准是NSCLC、结肠癌和头颈癌的实体瘤特异性的且对所述实体瘤有效。
NSCLC
对NSCLC(肺癌)特异适应了总计26种分离物(菌株)，其包括MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_LCv13、MW-DCG_LCv14、MW-DCG_LCv15、MW-DCG_LCv16、MW-DCG_LCv17、MW-DCG_LCv18、MW-DCG_LCv19、MW-DCG_LCv20、MW-DCG_LCv21、MW-DCG_LCv22、MW-DCG_LCv23、MW-DCG_LCv24、MW-DCG_LCv25以及MW-DCG_LCv26。在这26种分离物中，在下文表中提供了3种优选的分离物的数据。利用综合评分表定义了毒性水平并进行了评分，综合评分表包括下述4种水平：表观、临床体征、无端行为以及对外部刺激的行为反应。MW-DCG_LCv26是在小鼠模型中导致NSCLC实体瘤产生高坏死百分比的菌株，同时除了肿瘤溶解综合征(这是小鼠模型的表现)之外无毒性。
结肠癌
对结肠癌特异适应了总计17种分离物(菌株)，其包括MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、MW-DCG_CCv13、MW-DCG_CCv14、MW-DCG_CCv15、MW-DCG_CCv16以及MW-DCG_CCv17。在这17种分离物中，下文的表提供了4种优选的分离物的数据。利用综合评分表定义了毒性水平并进行了评分，综合评分表包括下述4种水平：表观、临床体征、无端行为以及对外部刺激的行为反应。MW-DCG_CCv17是在小鼠模型中导致结肠癌的实体瘤产生高百分比坏死的菌株，同时除了肿瘤溶解综合征(这是小鼠模型的表现)之外无毒性。
头颈癌
对头颈癌特异适应了总计18种分离物(菌株)，其包括MW-DCG_LCv1、MW-DCG_LCv2、MW-DCG_LCv3、MW-DCG_LCv4、MW-DCG_LCv5、MW-DCG_LCv6、MW-DCG_LCv7、MW-DCG_LCv8、MW-DCG_LCv9、MW-DCG_LCv10、MW-DCG_LCv11、MW-DCG_LCv12、DCG_HNCv13、MW-DCG_HNCv14、MW-DCG_HNCv15、MW-DCG_HNCv16、MW-DCG_HNCv17以及MW-DCG_HNCv18。在这18种分离物中，下文的表提供了3种优选的分离物的数据。利用综合评分表定义了毒性水平并进行了评分，综合评分表包括下述4种水平：表观、临床体征、无端行为以及对外部刺激的行为反应。MW-DCG_HNCv18是在小鼠模型中导致头颈癌的实体瘤产生高百分比坏死的菌株，同时除了肿瘤溶解综合征(这是小鼠模型的表现)之外无毒性。
总之，菌株MW-DCG_HNCv18是头颈癌实体瘤特异性的并对头颈癌实体瘤有效，菌株MW-DCG_CCv17是结肠癌实体瘤特异性的，并且对头颈癌实体瘤有效，菌株MW-DCG_LCv26是NSCLC实体瘤特异性的，并且对NSCLC实体瘤有效，这些菌株都具有优于非适应的无毒戈氏梭菌的优越特性，如在NSCLC、结肠癌和头颈癌的实体瘤中，确定的渗透、建群、繁殖和引起明显溶瘤作用的能力，而无任何可见的毒性作用。
实施例3：联合疗法
本发明人检测了在添加了西妥昔单抗的情况下，将新的衍生梭菌菌株之一给予异种移植的小鼠模型。
西妥昔单抗是嵌合(小鼠/人)单克隆抗体(抗EGFR mAb)，其抑制表皮生长因子受体(EGFR)。通过静脉内输注以常规方式给予患者西妥昔单抗，用于治疗转移性结肠直肠癌和头颈癌。
将MW-DCG_HNCv18和抗EGFR mAb(西妥昔单抗-3x i.p)给予晚期实体头颈癌的异种移植小鼠模型。根据图7，这种新的衍生梭菌菌株渗透晚期实体头颈癌模型。这些芽孢萌发，并定位于低氧/坏死区域，在该区域它们复制至高数量，从而在所有实体瘤中导致两步类型的溶瘤作用。第一步是芽孢注射和建群后全部肿瘤生长的立即停止，接着是在第4天开始，并在约第10天完成的缓慢但确定的溶瘤作用。在超过40％的动物中，观察到明显完全的肿瘤逆转。这种溶瘤作用和肿瘤生长抑制在所有小鼠晚期NSCLC中会持续一段明显的时期(与可能在20天内死亡的没有治疗或伪治疗的小鼠相比，长达另外的34天，图7)。在第二剂量的西妥昔单抗治疗后，肿瘤几乎完全根除。用联合疗法治疗的小鼠的存活延长至超过80天，几乎是其寿命的4倍。
根据本公开的内容，在无需大量实验的情况下，可以制备并实施本文所公开和请求保护的所有组合物和方法。尽管根据优选的实施方案，描述了本发明的组合物、方法、用途和过程，但是对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对本文所述和限定的组合物、方法以及方法和过程的步骤或步骤顺序进行改变。具体而言，显而易见的是，化学或生理上都相关的某些药剂，可以用来替代本文所述的药剂，同时会获得相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这类相似的替代和修改，被视为落入所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。
Claims (32)
1.治疗有效量的戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株和/或由其衍生的细菌菌株在制备用于在个体中抑制一种或多种实体瘤的生长、逆转或破坏一种或多种实体瘤的药物中的用途，其中所述衍生的细菌菌株包括将所述戈氏梭菌的芽孢注射到支持实体瘤生长的动物中，通过重复适应、选择、再分离菌株而得到的具有溶瘤作用的戈氏梭菌细菌菌株，其中所述衍生的细菌菌株引起的毒性比所述戈氏梭菌的无毒非致病性菌株小，其中所述衍生的细菌菌株选自由登录号V12/001485所代表的菌株MW-DCG_HNCv18、由登录号V12/001487所代表的菌株MW-DCG_CCv17以及由登录号V12/001486所代表的菌株MW-DCG_LCv26，其中MW-DCG_HNCv18抑制头颈癌的生长、逆转或破坏头颈癌，MW-DCG_CCv17抑制结肠癌的生长、逆转或破坏结肠癌，并且MW-DCG_LCv26抑制肺癌的生长、逆转或破坏肺癌，并且其中所述戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株选自ATCC登录号25757，其中所述ATCC登录号25757抑制肺癌的生长、逆转或破坏肺癌。
2.如权利要求1所述的用途，其中顺序或同时给予所述个体所述药物和抗癌剂。
3.如权利要求1所述的用途，其中将所述药物和抗癌剂作为一种药物组合物给予所述个体。
4.如权利要求1所述的用途，其中重复给予所述药物和抗癌剂一次或多次，以确保肿瘤逆转。
5.如权利要求1所述的用途，其中给予所述个体所述药物和抗癌剂，作为第一剂量，随后给予所述抗癌剂，作为第二剂量。
6.如权利要求1所述的用途，其中给予所述个体多于一种抗癌剂。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述治疗有效量为每一剂量106菌落形成单位(CFU)至1014CFU。
8.如权利要求1所述的用途，其中向所述个体给予所述药物通过静脉内、脊柱内、皮下或肌肉内给药。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述个体是哺乳动物。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
11.药物组合物，其包含戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株和/或由其衍生的细菌菌株以及生理上可接受的载体和/或赋形剂，其中所述衍生的细菌菌株包括将所述戈氏梭菌的芽孢注射到支持实体瘤生长的动物中，通过重复适应、选择、再分离菌株而得到的具有溶瘤作用的戈氏梭菌细菌菌株，其中所述衍生的细菌菌株引起的毒性比所述戈氏梭菌的无毒非致病性菌株小，其中所述衍生的细菌菌株选自由登录号V12/001485所代表的菌株MW-DCG_HNCv18、由登录号V12/001487所代表的菌株MW-DCG_CCv17以及由登录号V12/001486所代表的菌株MW-DCG_LCv26，并且其中所述戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株选自ATCC登录号25757。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其还包含一种或多种抗癌剂。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述抗癌剂为化学品。
14.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述抗癌剂选自RNA分子、抗体或以上的组合。
15.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述化学品选自改变DNA的药物抗代谢药、防止细胞分裂的药物以及抗血管生成剂。
16.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述化学品选自二氯乙酸钠、紫杉醇、阿霉素、拓扑替康、卡铂、吉西他滨、长春新碱以及帕唑帕尼。
17.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述RNA分子是小干扰RNA(siRNA)。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述siRNA是乳酸脱氢酶A(LDHA)特异性的或是CD147特异性的。
19.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述抗体是抗癌单克隆抗体。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述抗体是抗免疫刺激抗体或抗T reg单克隆抗体。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述抗免疫刺激抗体是抗CD40单克隆抗体。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其中所述抗CD40单克隆抗体是FGK45。
23.如权利要求20所述的药物组合物，其中所述抗T reg单克隆抗体是抗CD25单克隆抗体。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述抗CD25单克隆抗体是PC61。
25.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述抗体靶向表皮生长因子受体(EGFR)。
26.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述抗癌单克隆抗体是缀合的。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述抗体缀合于放射性同位素或药物激活酶。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其中所述抗体是钇90(90Y)缀合的抗CD20抗体Y90替伊莫单抗或碘131(131I)缀合的抗CD20抗体I131托西莫单抗。
29.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述抗体缀合于脂质体或纳米颗粒。
30.用于治疗一种或多种实体恶性肿瘤的试剂盒，其包含(1)戈氏梭菌(Clostridiumghonii)的无毒非致病性菌株和/或由其衍生的细菌菌株或(2)权利要求15所述的药物组合物，其还包含抗癌剂和使用说明书，其中所述衍生的细菌菌株包括将所述戈氏梭菌的芽孢注射到支持实体瘤生长的动物中，通过重复适应、选择、再分离菌株而得到的具有溶瘤作用的戈氏梭菌细菌菌株，其中所述衍生的细菌菌株引起的毒性比所述戈氏梭菌的无毒非致病性菌株小，其中所述衍生的细菌菌株选自由登录号V12/001485所代表的菌株MW-DCG_HNCv18、由登录号V12/001487所代表的菌株MW-DCG_CCv17以及由登录号V12/001486所代表的菌株MW-DCG_LCv26，并且其中所述戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株选自ATCC登录号25757。
31.(1)治疗有效量的戈氏梭菌(Clostridium ghonii)的无毒非致病性菌株和/或由其衍生的细菌菌株和(2)治疗有效量的抗癌剂，在制备用于治疗个体中一种或多种实体恶性肿瘤的药物中的用途，其中肿瘤的生长抑制、肿瘤逆转或肿瘤破坏表示所述治疗，其中所述衍生的细菌菌株包括将所述戈氏梭菌的芽孢注射到支持实体瘤生长的动物中，通过重复适应、选择、再分离菌株而得到的具有溶瘤作用的戈氏梭菌细菌菌株，其中所述衍生的细菌菌株引起的毒性比所述戈氏梭菌的无毒非致病性菌株小，其中所述衍生的细菌菌株选自由登录号V12/001485所代表的菌株MW-DCG_HNCv18、由登录号V12/001487所代表的菌株MW-DCG_CCv17以及由登录号V12/001486所代表的菌株MW-DCG_LCv26，其中MW-DCG_HNCv18抑制头颈癌的生长、逆转或破坏头颈癌，MW-DCG_CCv17抑制结肠癌的生长、逆转或破坏结肠癌，并且MW-DCG_LCv26抑制肺癌的生长、逆转或破坏肺癌，并且其中所述戈氏梭菌(Clostridiumghonii)的无毒非致病性菌株选自ATCC登录号25757，其中所述ATCC登录号25757抑制肺癌的生长、逆转或破坏肺癌。
32.如权利要求31所述的用途，所述药物包含两种或更多种抗癌剂。
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