CN107915785A - 一种提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，步骤包括提取、纯化贞芪多糖，用氯磺酸‑吡啶法进行硫酸化修饰，得到硫酸化贞芪多糖，并以产物的免疫活性为指标，用L₉(3⁴)正交实验对试剂配比、反应温度和反应时间3因素进行优选，确定最佳修饰条件为氯磺酸与吡啶的质量比1：8，反应温度60℃，反应时间1h，所得硫酸化贞芪多糖的免疫活性最强。本发明能显著提高贞芪多糖的免疫活性。

Description

一种提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法

技术领域

本发明涉及中药多糖结构改造技术领域，具体涉及一种提高贞芪多糖免疫活性的硫酸化修饰方法。

背景技术

多糖广泛存在于动物、植物和微生物组织中，是由单糖聚合而成的天然高分子化合物，是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等生物活性。多糖的生物活性与其结构有着密切的关系，特别是当引入某些化学基团时，使糖链的柔韧性和空间结构发生变化，从而引起多糖的生物学活性改变或使多糖产生新的活性。因此，对多糖结构进行适当的化学修饰是多糖领域研究的热点。

多糖的化学修饰主要有硫酸化、磷酸化的、硒化等方法。由于硫酸化修饰能显著提高多糖的免疫活性而倍受关注。常用硫酸化修饰方法有浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法、三氧化硫-吡啶法等。其中氯磺酸-吡啶法以其试剂易制备、反应条件相对简单、产物回收方便等优点而最为常用。影响氯磺酸-吡啶法修饰的主要因素有氯磺酸-吡啶配比、反应温度、反应时间。

贞芪多糖是以传统中药黄芪和女贞子为原料制成，具有补气养阴的功能，用于久病虚损，气阴不足，配合手术、放射治疗、化学治疗，促进正常功能的恢复。国内已有很多专利表明其具有很好的免疫活性，根据现代药理学实验表明，其药理作用有：1、提高机体免疫功能；2、升高血细胞，保护骨髓、肾上腺皮质和肝脏功能；3、促进干扰素产生。大都是通过多糖类活性物质发挥作用的。通过发明人进行的检索，虽然我国贞芪多糖制剂已有胶囊剂、颗粒剂、片剂等多种剂型，大多采用常规的提取方法，通过水煮、醇提或一些简单的精制处理，在已有中国专利申请中，专利申请号为“200310118934.7”，名为“贞芪多糖药物制备方法改进”的申请、专利申请号为“200510038192.6”名称为“注射用贞芪多糖冻干粉针制剂及其制备方法”的申请以及专利申请号为“200510012502.7”，名称为“贞芪多糖注射用制剂及其制备方法”的申请，其产品虽然有一定的临床效果，只是对女贞子、黄芪中的提取物进行精制，到目前为止，尚未见到选用通过化学修饰的方法提高贞芪多糖免疫活性的文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明针对贞芪多糖生物活性低的问题，提供一种提高贞芪多糖增强免疫活性的硫酸化修饰方法，达到显著提高贞芪多糖的免疫活性的目的。

本发明提供了一种提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，步骤包括：提取、纯化贞芪多糖，将贞芪多糖混悬于DMF后，加入到酯化试剂中，60～95℃下振荡反应1～3h，反应结束后加入冰水终止反应，冷却，后处理得到硫酸化贞芪多糖；所述酯化试剂制备步骤包括：将氯磺酸滴加至吡啶中，搅拌反应得酯化试剂，所述氯磺酸与吡啶的质量比为1:4～1:8。

本发明的有益效果是：

1.建立了贞芪多糖的硫酸化修饰方法，以产物的免疫活性为指标，通过正交实验优化了贞芪多糖的硫酸化修饰条件。

2.证明硫酸化修饰能够显著提高贞芪多糖的免疫活性，并筛选出一种免疫活性最好的硫酸化贞芪多糖，为研制免疫增强剂提供材料。

与现有技术相比，本发明还具备如下优点：

1.贞芪多糖的硫酸化修饰国内外未见报道，本发明提供了一种提高贞芪多糖免疫活性的硫酸化修饰方法及其优化的修饰条件，填补了国内外研究的空白。

2.通过本发明的实施，证明天然贞芪多糖的免疫作用微弱，通过硫酸化修饰能够显著提高其免疫活性，并筛选出一种活性最好的硫酸化贞芪多糖，可以作为新型增强免疫药物的材料。

附图说明

图1为多糖单独刺激时各组外周血淋巴细胞的增殖率，a-c标注不同字母者差异显著(P<0.05)；

图2为多糖协同PHA刺激时各组外周血淋巴细胞的增殖率，a-b标注不同字母者差异显著(P<0.05)；

图3为多糖单独刺激时各组脾淋巴细胞的增殖率，a-c标注不同字母者差异显著(P<0.05)；

图4为多糖协同LPS刺激时脾淋巴细胞的增殖率，a-d标注不同字母者差异显著(P<0.05)；

具体实施方式

本发明提供了一种提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，步骤包括：提取、纯化贞芪多糖，将贞芪多糖混悬于DMF后，加入到酯化试剂中，60～95℃下振荡反应1～3h，反应结束后加入冰水终止反应，冷却，后处理得到硫酸化贞芪多糖；所述酯化试剂制备步骤包括：将氯磺酸滴加至吡啶中，搅拌反应得酯化试剂，所述氯磺酸与吡啶的质量比为1:4～1:8。

本发明首次对两种混合多糖(贞芪多糖)进行硫酸化修饰，并建立了硫酸化修饰方法，基于产物的增强免疫活性优化了修饰条件，发现硫酸化修饰能显著增强贞芪多糖的免疫活性。

优选的，所述振荡反应温度为60℃，所述振荡反应时长为1h，所述氯磺酸与吡啶的质量比为1:4。

优选的，所述后处理步骤包括：将冷却后的反应体系调节pH至7～8，加入无水乙醇，静置22～26h，离心，沉淀用自来水透析后再用蒸馏水透析，透析液冷冻干燥，得到硫酸化贞芪多糖。

更加优选的，所述无水乙醇添加量为反应体系体积的三倍量，所述自来水透析时长为2天，所述蒸馏水透析时长为1天。

优选的，所述提取步骤包括：将黄芪饮片、女贞子饮片加入乙醇中浸泡，于75～85℃下回流，过滤收集滤液，药渣晾后加水煎煮，过滤合并滤液，离心后上清液加乙醇，静置后回收乙醇，离心，收集沉淀，干燥得贞芪多糖粗品。

更加优选的，所述黄芪饮片与女贞子饮片的质量比为1.5:1～2:1。

更加优选的，所述浸泡采用质量浓度为85％的乙醇；所述回流次数为两次，每次回流0.8～1.2h；所述煎煮次数为两次，煎煮时长依次为80～100min、55～65min；所述离心后上清液加乙醇至乙醇质量百分比为78％～82％，于3～5℃下静置22～26h。

优选的，所述纯化步骤包括：将贞芪多糖用三氯乙酸法去蛋白，然后用蒸馏水溶解，上DEAE-纤维素-52层析柱，用蒸馏水洗脱，流速1mL·min-1，收集洗脱液，合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的贞芪多糖。

下面将结合具体实施例对本发明提供的一种提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法予以进一步说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

本实施例以黄芪饮片、女贞子饮片为原料制备并纯化得到贞芪多糖(ZQP)，进一步的的对贞芪多糖进行硫酸化修饰，并在预实验的基础上，以氯磺酸与吡啶的体积比(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平的L₉(3⁴)正交试验设计9种修饰条件，对9钟修饰条件下制备的硫酸化贞芪多糖的免疫活性进行了比较。

1.贞芪多糖的提取

取黄芪饮片666g、女贞子饮片337g，加85％乙醇2000mL浸泡12h，80℃水浴回流2次，每次1h，药渣晾12h后加10倍量水煎煮2次，时间依次为90、60min，合并滤液，浓缩至1000mL，2500rpm离心20min，上清液加入95％乙醇使醇含量达80％，4℃静置24h，回收乙醇，离心，沉淀干燥，得到粗的贞芪多糖。

2.贞芪多糖的纯化

将粗贞芪多糖用三氯乙酸法去蛋白，用蒸馏水溶解成50mg·mL^-1，上DEAE-纤维素-52(2.5cm×30cm)层析柱，用蒸馏水洗脱，流速1mL·min^-1，自动部分收集器收集洗脱液，每管5mL，用苯酚-硫酸法检测多糖，绘制洗脱曲线。合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的贞芪多糖(ZQP)。

3.贞芪多糖的硫酸化修饰

(1)修饰条件优化由于试剂配比、反应温度、反应时间是影响多糖硫酸酯化的主要因素，在预实验的基础上，以氯磺酸与吡啶的体积比(A)、反应温度(B)和反应时间(C)为因素，按3因素3水平的L₉(3⁴)正交试验设计9种修饰条件(表1)。

表1 L₉(3⁴)正交试验设计因素水平表

(2)酯化试剂制备将带有搅拌和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中，按表1设定的试剂配比加入预冷的无水吡啶25mL，快速搅拌，充分冷却后，逐滴加入氯磺酸，于40min内加完，见烧瓶中出现大量淡黄色固体时停止反应。共制备9种酯化试剂。

(3)修饰操作取贞芪多糖(ZQP)3.6g平均分成9份，分别混悬于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后，加入到酯化试剂中，按表1设定的反应温度和时间在水浴中振荡反应。反应结束后加入100mL冰水终止反应，冷却至室温，用饱和氢氧化钠溶液中和pH至7～8，边搅拌边缓慢加入3倍体积的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀用自来水透析2d、蒸馏水透析1d，透析液冷冻干燥，分别得到9个硫酸化贞芪多糖(sulfated ZQPs，sZQPs)，依次标记为sZQP₁～sZQP₉。用苯酚-硫酸法测定多糖含量，氯化钡-明胶法测定硫酸根含量，按下式计算取代度(DS)：DS＝(1.62×S％)/(32-1.02×S％)。

正交试验结果显示，sZQP₈的产物量最高，为829mg，其次是sZQP₉、sZQP₇和sZQP₃；sZQP₇的取代度最高，为1.54％，其次是sZQP₉、sZQP₈、sZQP₄和sZQP₆；sZQP₅的糖含量最高，为49.4％，其次是sZQP₉、sZQP₁和sZQP₃(表2)。

表2 L₉(3⁴)正交试验结果

4.硫酸化贞芪多糖的增强免疫活性比较

用MTT法。首先测定9个sZQPs和未修饰的ZQP对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度，然后比较它们对外周和脾脏淋巴细胞的增殖能力的影响。

(1)sZQPs对CEF的安全浓度

取9～11日龄SPF鸡胚，消毒蛋壳气室后打开，取出鸡胚，剪去头和四肢，除去内脏，用Hank’s液洗净，剪成1～2mm3的碎块，用Hank’s液洗涤3遍，加入5mL的0.25％胰蛋白酶溶液，轻轻摇匀后37℃消化30min，每隔10min轻轻摇荡1次，吸去胰蛋白酶溶液，用Hank’s液洗3遍，加入细胞生长液，以细口吸管吹打，轻轻吸取细胞悬液，3层纱布过滤，细胞计数调至1×10⁶个·mL^-1，接种到96孔细胞培养板，每孔100μL，5％CO₂培养箱38.5℃培养。

将9个sZQPs和未修饰的ZQP分别用MM自625μg·mL^-1稀释至1.220μg·mL^-1共11个浓度。待鸡胚成纤维细胞(CEF)长成单层时，分别加入各浓度的多糖，每孔100μL，每个浓度重复4孔，38.5℃、5％CO²继续培养，按MTT法用酶联免疫检测仪测定570nm波长处的吸光值(A₅₇₀值)。选择A₅₇₀值不显著低于细胞对照组的多糖最大浓度作为该多糖的最大安全浓度。测得各多糖的最大安全浓度在9.166～3.125μg·mL^-1，为了便于同水平比较，将11个多糖的最大安全浓度统一设为9.766μg·mL^-1。

(2)sZQPs对外周血淋巴细胞增殖的测定

60日龄以上蛋公鸡，无菌条件下心脏采血20mL，肝素抗凝，血样先用Hank’s液稀释1倍，然后小心加在淋巴细胞分离液上层(体积比为1：1)，以2000rpm的速度离心20min，吸取中间白色云雾状的细胞层，用Hank's液洗2遍，均以1500rpm的速度离心15min。细胞计数时活细胞大于90％，再用RPMI1640培养液调整细胞浓度为2.5×10⁶个·mL^-1，备用。96孔细胞培养板的一半加入20μLPHA(终浓度为10μg·mL^-1)，一半不加PHA，再将刚才制备好的淋巴细胞80μL/孔加入到中细胞培养板中，再加20μL RPMI1640至不加PHA的孔里，使其补足到100μL，然后每孔加入各浓度的多糖100μL，每个浓度重复4孔，另设细胞对照孔(CC)和PHA对照孔(PC)，38.5℃、5％CO₂条件下培养44h，取出后每孔加入MTT 30μL，继续培养4h后，每孔加裂解液DMSO 100μL，将细胞板置于微量震荡器上震荡5min使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪上检测570nm处的吸光度值(A₅₇₀值)，作为T淋巴细胞增殖的指标。当试验组A₅₇₀值显著大于对照组时，表明多糖显著促进T淋巴细胞增殖。并按公式计算各多糖的淋巴细胞增殖率：淋巴细胞增殖率(％)＝(ā_(多糖组)－ā_(对照组))/ā_(对照组)×100％。结果如下：

①多糖单独刺激时淋巴细胞增殖的变化

sZQP₂在0.610～2.441μg·mL^-1、sZQP₃、sZQP₆、sZQP₈和ZQP在0.610μg·mL^-1、sZQP₄和sZQP₅在1.220μg·mL^-1，sZQP₇在0.610和1.220μg·mL^-1、sZQP₉在0.610～9.766μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著大于细胞对照组(P＜0.05)，说明它们有单独刺激淋巴细胞增殖的作用(P<0.05)(见表3)。

表3多糖单独刺激时各组外周血淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

注：同列指标数据标注不同字母者差异显著(p<0.05)，CC，细胞对照。以下表同。

sZQP₉的外周淋巴细胞增值率最大，为27.80％，显著大于其余各组(P＜0.05)，其次为sZQP₂(10.83％)组，最小的为sZQP₁(1.45％)组，如附图1所示。

②多糖协同PHA刺激时淋巴细胞增殖的变化

sZQP₁、sZQP₈和sZQP₉在0.610～9.766μg·mL^-1，sZQP₂在0.610和2.441μg·mL^-1，sZQP₃在0.610～2.441和9.766μg·mL^-1，sZQP₄在1.220～9.766μg·mL^-1，sZQP₅在0.610～2.441μg·mL^-1，sZQP₆在0.610和9.766μg·mL^-1，sZQP₇在0.610μg·mL^-1，ZQP在0.610～1.220μg·mL^-1的A₅₇₀值显著大于PHA对照组，说明它们能够协同PHA促进淋巴细胞增殖(P<0.05)(见表4)。

表4多糖协同PHA刺激时外周血淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

注：同列指标数据标注不同字母者差异显著(p<0.05)，PC，PHA对照。

淋巴细胞增殖率：sZQP₉的外周淋巴细胞增值率最大，为24.48％，显著大于其余各组(P＜0.05)，其次为sZQP₄(15.30％)组，最小的为sZQP₁(8.91％)组，如附图2所示。

(3)sZQPs对脾脏淋巴细胞的测定

取60日龄蛋公鸡(购于南京汤泉种鸡场)颈静脉放血处死，在无菌环境中将脾脏取出后放入盛有75％酒精的100mL烧杯中，先用灭菌的PBS缓冲液冲洗3次，再放入盛有Hank’s液的平皿中清洗后，装入100目网孔的尼龙网筛中，用玻璃注射器芯研磨过滤，一边研磨一边少量多次地滴加Hank’s液，收集细胞滤液，然后缓慢加入淋巴细胞分离液上层(体积比为1：1)，2000rpm·min^-1离心20min，吸取中间白色云雾状的细胞层，用Hank’s液洗2次，用RPMI1640营养液稀释成1×10⁷个·mL^-1细胞的细胞悬液，备用。96孔细胞培养板的一半加入20μL LPS(终浓度为10μg·mL^-1)，一半不加LPS，再将刚才制备好的脾脏淋巴细胞悬液80μL/孔，分别加入到中细胞培养板中，再加20μL RPMI1640至不加LPS的孔里，使其补足到100μL，然后每孔加入各浓度的多糖100μL，每个浓度重复4孔，另设细胞对照(CC)和LPS对照(LC)。将细胞板放入5％CO₂、38.5℃培养箱中培养44h，每孔加入30μL MTT液，继续培养4h后取出，吸出每孔上清液，加入100μL DMSO，在微量震荡器上混匀使其溶液变澄清，用酶联免疫仪检测570nm下的吸光度值(A₅₇₀值)，并作为B淋巴细胞增殖的指标^[8,9]。

并按公式计算上述两种方法中各多糖的淋巴细胞增殖率：淋巴细胞增殖率＝(多糖组A₅₇₀值-对照组A₅₇₀值)/对照组A₅₇₀值×100％。结果如下：

①多糖单独刺激脾淋巴细胞增殖的变化

sZQP₂在9.766和2.441μg·mL^-1、sZQP₃和sZQP₆在0.610～1.220μg·mL^-1、sZQP₄在1.220和4.833μg·mL^-1、sZQP₅和sZQP₈在0.610μg·mL^-1、sZQP₇在4.833μg·mL^-1、sZQP₉在0.610～4.833μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著大于细胞对照组(P＜0.05)，说明它们有单独刺激淋巴细胞增殖的作用(P<0.05)(见表5)。

表5多糖单独刺激时各组脾淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

淋巴细胞增殖率：sZQP₉的脾脏淋巴细胞增值率最大，为15.51％，显著大于其余各组(P＜0.05)，其次为sZQP₄(8.86％)组，最小的为sZQP₁(-0.82％)组，如附图3所示。

②多糖协同LPS刺激时脾淋巴细胞增殖的变化

sZQP₁在4.833μg·mL^-1、sZQP₃和sZQP₆在1.220μg·mL^-1、sZQP₅和sZQP₇在0.610μg·mL^-1、sZQP₉在0.610～9.766μg·mL^-1时的A₅₇₀值显著大于LPS对照组，说明它们能够协同LPS促进淋巴细胞增殖(P<0.05)(见表6)。

表6多糖协同LPS刺激时各组脾脏淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值)

注：同列指标数据标注不同字母者差异显著(p<0.05)，LC，LPS对照。

淋巴细胞增殖率：sZQP₉的脾脏淋巴细胞增值率最大，为16.90％，显著大于其余各组(P＜0.05)，其次为sZQP₁(6.78％)组，最小的为sZQP₄(-4.29％)组(图4)。

从淋巴细胞增殖率可以看出，在多糖单独刺激和与PHA协同刺激外周血淋巴细胞时，sZQP₉的淋巴细胞增殖率均为最高；在多糖单独刺激和与LPS协同刺激脾淋巴细胞时，sZQP₉的淋巴细胞增殖率也均为最高；以上结果表明。sZQP₉为9个sZQP中增强免疫活性最好的硫酸化多糖，其对应的修饰条件为氯磺酸-吡啶配比为1：8，反应温度60℃，反应时间1h。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：步骤包括：提取、纯化贞芪多糖，将贞芪多糖混悬于DMF后，加入到酯化试剂中，60～95℃下振荡反应1～3h，反应结束后加入冰水终止反应，冷却，后处理得到硫酸化贞芪多糖；所述酯化试剂制备步骤包括：将氯磺酸滴加至吡啶中，搅拌反应得酯化试剂，所述氯磺酸与吡啶的质量比为1:4～1:8。

2.如权利要求1所述的提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：所述振荡反应温度为60℃，所述振荡反应时长为1h，所述氯磺酸与吡啶的质量比为1:4。

3.如权利要求1所述的提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：所述后处理步骤包括：将冷却后的反应体系调节pH至7～8，加入无水乙醇，静置22～26h，离心，沉淀用自来水透析后再用蒸馏水透析，透析液冷冻干燥，得到硫酸化贞芪多糖。

4.如权利要求3所述的提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：所述无水乙醇添加量为反应体系体积的三倍量，所述自来水透析时长为2天，所述蒸馏水透析时长为1天。

5.如权利要求1所述的提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：所述提取步骤包括：将黄芪饮片、女贞子饮片加入乙醇中浸泡，于75～85℃下回流，过滤收集滤液，药渣晾后加水煎煮，过滤合并滤液，离心后上清液加乙醇，静置后回收乙醇，离心，收集沉淀，干燥得贞芪多糖粗品。

6.如权利要求5所述的提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：所述黄芪饮片与女贞子饮片的质量比为1.5:1～2:1。

7.如权利要求5所述的提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：所述浸泡采用质量浓度为85％的乙醇；所述回流次数为两次，每次回流0.8～1.2h；所述煎煮次数为两次，煎煮时长依次为80～100min、55～65min；所述离心后上清液加乙醇至乙醇质量百分比为78％～82％，于3～5℃下静置22～26h。

8.如权利要求1所述的提高贞芪多糖免疫活性的修饰方法，其特征在于：所述纯化步骤包括：将贞芪多糖用三氯乙酸法去蛋白，然后用蒸馏水溶解，上DEAE-纤维素-52层析柱，用蒸馏水洗脱，流速1mL·min^-1，收集洗脱液，合并含糖管洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯化的贞芪多糖。