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CN107735104B - 组合抗hla-dr抗体或抗trop-2抗体与微管抑制剂、parp抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或磷酸肌醇3-激酶抑制剂使癌症治疗结果显著改善 - Google Patents

组合抗hla-dr抗体或抗trop-2抗体与微管抑制剂、parp抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或磷酸肌醇3-激酶抑制剂使癌症治疗结果显著改善 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用诸如微管抑制剂、PARP抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或PI3K抑制剂的药物与针对HLA‑DR或Trop‑2的抗体或免疫缀合物进行的组合疗法。当使用免疫缀合物时，它们优选地并有SN‑38或pro‑2PDOX。免疫缀合物可以介于1 mg/kg与18 mg/kg之间，优选是4、6、8、9、10、12、16或18 mg/kg，更优选是8或10 mg/kg的剂量施用。组合疗法可使实体肿瘤尺寸降低，降低或消除转移，并且有效治疗对标准疗法诸如放射疗法、化学疗法或免疫疗法具有抗性的癌症。优选地，组合疗法对抑制肿瘤生长具有累加作用。最优选地，组合疗法对抑制肿瘤生长具有协同作用。

Description

组合抗HLA-DR抗体或抗TROP-2抗体与微管抑制剂、PARP抑制 剂、布鲁顿激酶抑制剂或磷酸肌醇3-激酶抑制剂使癌症治疗 结果显著改善
相关申请
本申请是2016年3月14日提交的美国专利申请序列号15/069,208的部分连续案。本申请根据35 U.S.C. 119(e)要求美国临时专利申请62/184,331 (2015年6月25日提交)、62/201,361 (2015年8月5日提交)、62/250,715 (2015年11月4日提交)和62/263,134(2015年12月4日提交)的权益。各优先权申请的整个文本以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有已通过EFS网以ASCII格式提交，并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ASCII拷贝于2016年6月23日创建，名为IMM365WO1_SL.txt，并且大小是61,031字节。
发明背景。
发明领域
本发明涉及抗TAA抗体或免疫缀合物诸如针对HLA-DR或Trop-2的抗体或免疫缀合物与一种或多种药物组合的治疗用途，其中组合疗法比单独抗体、单独药物或单独药物和抗体的组合作用更加有效。在优选实施方案中，组合展现协同作用。在其它优选实施方案中，适用的药物可为诱导DNA链断裂的药物，诸如澳瑞他汀(auristatin)、卡奇霉素(colicheamicin)、喜树碱(camptothecin) (例如SN-38)或2-吡咯啉基多柔比星(2-pyrrolinodoxorubicine)的前药形式(P2PDox)。诱导DNA链断裂的示例性药物包括但不限于SN-38、P2PDox、拓扑替康(topotecan)、多柔比星(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、顺铂(cisplatinum)、奥沙利铂(oxaliplatin)或卡铂(carboplatin)。在替代性实施方案中，适用于组合疗法的药物属于微管抑制剂、PARP抑制剂、布鲁顿(Bruton)激酶抑制剂或磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂的种类。药物可分开或连同抗体一起施用，或可在施用之前缀合于抗体。在后述情况下，抗体和药物可通过使治疗功效增加的可在细胞内裂解的键加以连接。在其它替代性实施方案中，可使抗体缀合于不同药物(诸如SN-38)以形成免疫缀合物，并且所述免疫缀合物可与微管抑制剂、PARP抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或PI3K抑制剂组合施用。优选地，在使免疫缀合物的治疗作用最优化的特定施用剂量和/或特定施用时程下施用它们。本文公开的就供人治疗使用来说最优化的抗体-药物缀合物(ADC)施用剂量和时程显示不可从动物模型研究进行预测的出乎意料的优越功效，从而允许有效治疗对标准抗癌疗法具有抗性的癌症，所述疗法包括伊立替康(irinotecan) (CPT-11)、紫杉醇(paclitaxel)或诱导DNA链断裂的其它化合物。惊人的是，用抗体-SN38免疫缀合物和微管抑制剂或PARP抑制剂进行的组合疗法显示出乎意料的协同作用。在一特别优选实施方案中，适用的SN-38缀合抗体是抗Trop-2抗体，诸如IMMU-132 (萨希珠单抗戈维替康(sacitizumab govitecan)，也称为hRS7-CL2A-SN-38或IMMU-132)。更优选地，方法适用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)、转移性结肠直肠癌、SCLC或NSCLC以及其它表达Trop-2的癌症。当与类似类别的药物组合时，诸如具有靶向其它癌症相关的抗原(诸如CD19、CD20、CD22、CD66e (CEACAM5)、CD74、HLA-DR、IGF-1R、叶酸受体和以下列出的其它抗原)的抗体的其它SN-38缀合物也可具有协同有效性，或具有至少累加性，而不使剂量限制性毒性增加。在另一优选实施方案中，适用的抗HLA-DR抗体是人源化L243抗体(hL243)。
发明背景
多年来，特异性靶向药物疗法领域中的科学家的一目标已在于使用单克隆抗体(MAb)来将毒性剂特异性递送至人癌。已开发了靶向肿瘤相关的抗原(TAA)的MAb和适合的毒性剂的缀合物，但在对人癌症治疗方面的成效参差不齐，并且实际上在诸如感染性疾病和自体免疫疾病的其它疾病的情况下并无应用。毒性剂最通常是化学治疗药物，但粒子发射性放射性核素或细菌或植物毒素也已缀合于MAb，尤其是对于癌症治疗来说(Sharkey和Goldenberg, CA Cancer J Clin. 2006年7月-8月;56(4):226-243)，并且更新近地，有放射免疫缀合物用于对某些感染性疾病的临床前治疗(Dadachova和Casadevall, Q J Nucl Med Mol Imaging 2006;50(3):193-204)。
使用MAb-化学治疗药物缀合物的优势是(a)化学治疗药物自身在结构上是明确确定的；(b)使用极其明确确定的缀合化学，常常在远离MAb的抗原结合区的特定位点处使化学治疗药物连接于MAb蛋白；(c)相比于涉及MAb和细菌或植物毒素的化学缀合物，MAb-化学治疗药物缀合物可更可重现地以及通常以较小免疫原性制备，因此更可经受商业开发和监管核准；以及(d)MAb-化学治疗药物缀合物的全身性毒性比放射性核素MAb缀合物小数个数量级，特别是对于放射敏感性骨髓来说。
喜树碱(CPT)和它的衍生物是一类强力抗肿瘤剂。伊立替康(也被称为CPT-11)和拓扑替康是作为核准的癌症治疗剂的CPT类似物(Iyer和Ratain, Cancer Chemother. Phamacol. 42: S31-S43 (1998))。CPT通过使拓扑异构酶(topoisomerase) I-DNA复合物稳定以抑制拓扑异构酶I来起作用(Liu等 The Camptothecins: Unfolding Their Anticancer Potential, Liehr J.G., Giovanella, B.C.和Verschraegen (编), NYAcad Sci., NY 922:1-10 (2000))。CPT在制备缀合物方面呈现特定问题。一个问题是大多数CPT衍生物不溶于水性缓冲液中。其次，对于进行结构改性以缀合于大分子，CPT提供特定挑战。举例来说，CPT自身仅在环E中含有叔羟基。在CPT的情况下，必须使羟基官能团偶联于适于后续蛋白质缀合的接头；并且在强力CPT衍生物(诸如作为化学治疗性CPT-11的活性代谢物的SN-38)和其它含有C-10-羟基的衍生物(诸如拓扑替康和10-羟基-CPT)中，在C-10位置处存在酚羟基使必要C-20-羟基衍生复杂化。第三，喜树碱的E环的δ-内酯部分在生理条件下的不稳定性导致抗肿瘤效能极大降低。因此，进行缀合方案以使它在7或更低的pH下执行以避免内酯开环。然而，具有诸如活性酯的胺反应性基团的双官能CPT的缀合将通常要求pH是8或更大。第四，优选在连接CPT和抗体或其它结合部分的接头/间隔体中并入可在细胞内裂解的部分。
存在对更有效制备和施用抗体-药物缀合物诸如抗体-SN-38缀合物的方法，以及用抗体或免疫缀合物和药物诸如微管抑制剂、PARP抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或PI3K抑制剂进行的更有效组合疗法的需要。
发明概述
在优选的实施方案中，本发明涉及使用抗HLA-DR抗体或抗Trop-2抗体或其免疫缀合物与选自由微管抑制剂、PARP抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂组成的组的药物组合的组合疗法。更优选地，相比于单独抗体或免疫缀合物、单独药物、或抗体或免疫缀合物和药物的作用的总和，组合疗法更加有效。最优选地，对于治疗人受试者的疾病诸如癌症，组合展现协同作用。在涉及使用免疫缀合物的实施方案中，优选使抗体缀合于CPT部分诸如SN-38，或缀合于蒽环霉素(anthracycline)诸如pro-2PDOX。
如本文所用，除非另外明确陈述，否则缩写“CPT”可指喜树碱或它的任何衍生物诸如SN-38。本发明提供用于制备和施用CPT-抗体免疫缀合物的改进的方法和组合物。优选地，喜树碱是SN-38。所公开方法和组合物适用于治疗多种疾病和病状，所述疾病和病状为其它形式的疗法所难治的或对其它形式的疗法具有较小响应性，并且可包括针对其的适于达成选择性靶向的抗体或抗原结合抗体片段可被开发或是可用或已知的疾病。可用主题抗体或免疫缀合物治疗的优选疾病或病状包括例如癌症或自体免疫疾病。最优选地，免疫缀合物适用于治疗癌症，特别是已被证明为用标准癌症疗法进行的先前治疗所难治的癌症。
优选地，靶向部分是抗体、抗体片段、双特异性或其它多价抗体、或其它基于抗体的分子或化合物。抗体可具有各种同种型，优选是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选包含人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可为嵌合人-小鼠、嵌合人-灵长类动物、人源化(人框架和鼠高变(CDR)区)或完全人抗体以及其变型形式，诸如半IgG4抗体(被称为“单抗体”)，如由van der Neut Kolfschoten等人(Science 2007; 317:1554-1557)所述。更优选地，可设计或选择抗体或其片段以包含属于特定同种异型的人恒定区序列，此可导致在向人受试者施用抗体或免疫缀合物时免疫原性降低。用于施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，诸如G1m3、G1m3,1、G1m3,2或G1m3,1,2。更优选地，同种异型选自由nG1m1、G1m3、nG1m1,2和Km3同种异型组成的组。
适用的抗体可结合本领域中已知的任何疾病相关的抗原。当疾病状态是癌症时，举例来说，由肿瘤细胞表达或另外与肿瘤细胞相关的许多抗原在本领域中是已知的，包括但不限于碳酸酐酶IX、α-胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p (CSAp)、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1 (Trop-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、纤维母细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导性因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、IGF-1R、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、PD-1受体、PD-L1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素(survivin)、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白(tenascin)、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原(Thomson-Friedenreich antigen)、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤维连接蛋白(fibronectin)、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、致癌基因标志物和致癌基因产物(参见例如Sensi等, Clin Cancer Res2006, 12:5023-32；Parmiani等, J Immunol 2007, 178:1975-79；Novellino等 Cancer Immunol Immunother 2005, 54:187-207)。优选地，抗体结合CEACAM5、CEACAM6、EGP-1(Trop-2)、MUC-16、AFP、MUC5a,c、CD74、CD19、CD20、CD22或HLA-DR。更优选地，抗体结合Trop-2或HLA-DR。
可利用的示例性抗体包括但不限于hR1 (抗IGF-1R，2012年11月29日提交的美国专利申请序列号13/688,812)、hPAM4 (抗粘蛋白，美国专利号7,282,567)、hA20 (抗CD20，美国专利号7,151,164)、hA19 (抗CD19，美国专利号7,109,304)、hIMMU31 (抗AFP，美国专利号7,300,655)、hLL1 (抗CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2 (抗CD22，美国专利号5,789,554)、hMu-9 (抗CSAp，美国专利号7,387,772)、hL243 (抗HLA-DR，美国专利号7,612,180)、hMN-14 (抗CEACAM5，美国专利号6,676,924)、hMN-15 (抗CEACAM6，美国专利号8,287,865)、hRS7 (抗EGP-1，美国专利号7,238,785)、hMN-3 (抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、Ab124和Ab125 (抗CXCR4，美国专利号7,138,496)，各引用的专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。更优选地，抗体是IMMU-31 (抗AFP)、hRS7 (抗Trop-2)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-3 (抗CEACAM6)、hMN-15 (抗CEACAM6)、hLL1 (抗CD74)、hLL2 (抗CD22)、hL243或IMMU-114 (抗HLA-DR)、hA19 (抗CD19)或hA20 (抗CD20)。如本文所用，术语依帕珠单抗(epratuzumab)和hLL2可互换，术语维妥珠单抗(veltuzumab)和hA20、hL243g4P、hL243γ4P和IMMU-114也是如此。在一最优选实施方案中，抗体是抗Trop-2抗体诸如hRS7，或抗HLA-DR抗体诸如hL243。
适用的替代性抗体包括但不限于阿昔单抗(abciximab) (抗糖蛋白IIb/IIIa)、阿仑单抗(alemtuzumab) (抗CD52)、贝伐单抗(bevacizumab) (抗VEGF)、西妥昔单抗(cetuximab) (抗EGFR)、吉妥单抗(gemtuzumab) (抗CD33)、替伊莫单抗(ibritumomab)(抗CD20)、帕尼单抗(panitumumab) (抗EGFR)、利妥昔单抗(rituximab) (抗CD20)、托西莫单抗(tositumomab) (抗CD20)、曲妥珠单抗(trastuzumab) (抗ErbB2)、兰罗利珠单抗(lambrolizumab) (抗PD1受体)、阿特珠单抗(atezolizumab) (抗PD-L1)、MEDI4736 (抗PD-L1)、纳武单抗(nivolumab) (抗PD-1受体)、伊匹单抗(ipilimumab) (抗CTLA-4)、阿巴伏单抗(abagovomab) (抗CA-125)、阿德木单抗(adecatumumab) (抗EpCAM)、阿利珠单抗(atlizumab) (抗IL-6受体)、贝那珠单抗(benralizumab) (抗CD125)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab) (GA101，抗CD20)、CC49 (抗TAG-72)、AB-PG1-XG1-026 (抗PSMA，美国专利申请11/983,372，以ATCC PTA-4405和PTA-4406保藏)、D2/B (抗PSMA，WO 2009/130575)、托珠单抗(tocilizumab) (抗IL-6受体)、巴利昔单抗(basiliximab) (抗CD25)、达利珠单抗(daclizumab) (抗CD25)、依法珠单抗(efalizumab) (抗CD11a)、GA101 (抗CD20；GlycartRoche)、莫罗莫那(muromonab)-CD3 (抗CD3受体)、那他珠单抗(natalizumab) (抗α4整联蛋白)、奥马珠单抗(omalizumab) (抗IgE)；抗TNF-α抗体诸如CDP571 (Ofei等, 2011,Diabetes 45:881-85)、MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B、M303 (ThermoScientific, Rockford, IL)、英夫利昔单抗(infliximab) (Centocor, Malvern, PA)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol) (UCB, Brussels, Belgium)、抗CD40L(UCB,Brussels, Belgium)、阿达木单抗(adalimumab) (Abbott, Abbott Park, IL)、Benlysta(Human Genome Sciences)；用于阿尔茨海默氏病(Alzheimer' s disease)的治疗的抗体诸如Alz 50 (Ksiezak-Reding等, 1987, J Biol Chem 263:7943-47)、甘特如单抗(gantenerumab)、苏兰珠单抗(solanezumab)和英夫利昔单抗；抗纤维蛋白抗体如59D8、T2G1s、MH1；抗CD38抗体诸如MOR03087 (MorphoSys AG)、MOR202 (Celgene)、HuMax-CD38(Genmab)或达雷木单抗(daratumumab) (Johnson & Johnson)；（抗HIV抗体诸如P4/D10(美国专利8,333,971)、Ab75、Ab76、Ab77(Paulik等, 1999, Biochem Pharmacol 58:1781-90)以及由Polymun (Vienna, Austria)描述和销售的抗HIV抗体，也描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989以及Vcelar等, AIDS 2007; 21(16):2161-2170和Joos等,Antimicrob. Agents Chemother. 2006; 50(5):1773-9中，全都以引用的方式并入本文。
在一优选实施方案中，缀合于主题抗体的药物部分选自喜树碱(CPT)和它的类似物和衍生物，并且更优选是SN-38。然而，可利用的其它药物部分包括紫杉烷(taxane) (例如浆果赤霉素III (baccatin III)、紫杉醇(taxol))、澳瑞他汀(例如MMAE)、卡奇霉素、埃博霉素(epothilone)、蒽环霉素(例如多柔比星(DOX)、表柔比星(epirubicin)、吗啉代多柔比星(吗啉代-DOX)、氰基吗啉代-多柔比星(氰基吗啉代-DOX)、2-吡咯啉基多柔比星(2-PDOX)、2-PDOX的前药形式(pro-2-PDOX))、拓扑替康、依托泊苷、顺铂、奥沙利铂或卡铂；参见例如Priebe W (编), ACS symposium series 574, 由American Chemical Society出版, Washington D.C., 1995 (332pp)以及Nagy等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2464-2469, 1996。或者，药物可为布鲁顿激酶抑制剂，诸如依鲁替尼(ibrutinib) (PCI-32765)、PCI-45292、CC-292 (AVL-292)、ONO-4059、GDC-0834、LFM-A13或RN486，或PI3K抑制剂，诸如艾代拉里斯(idelalisib)、渥曼青霉素(Wortmannin)、脱甲绿胶酶素(demethoxyviridin)、哌立福辛(perifosine)、PX-866、IPI-145 (duvelisib)、BAY 80-6946、BEZ235、RP6530、TGR1202、SF1126、INK1117、GDC-0941、BKM120、XL147、XL765、帕洛米德529(Palomid 529)、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、PI-103、GNE477、CUDC-907、AEZS-136或LY294002。优选地，抗体或其片段连接于至少一个化学治疗部分；优选是1至约5个药物部分；更优选是6至8个药物部分，最优选是约6至约12个药物部分。
水溶性CPT衍生物的一个实例是CPT-11。涉及CPT-11的药理学以及它在体内向活性SN-38转化的广泛临床数据是可用的(Iyer和Ratain, Cancer Chemother Pharmacol. 42:S31-43 (1998)；Mathijssen等, Clin Cancer Res. 7:2182-2194 (2002)；Rivory,Ann NY Acad Sci. 922:205-215, 2000))。活性形式SN-38的强力性比CPT-11大约2至3个数量级。在特定优选实施方案中，免疫缀合物可为hMN-14-SN-38、hMN-3-SN-38、hMN-15-SN-38、IMMU-31-SN-38、hRS7-SN-38、hA20-SN-38、hL243-SN-38、hLL1-SN-38或hLL2-SN-38缀合物。
各种实施方案可涉及使用主题方法和组合物来治疗癌症，包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)、B细胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、急性大B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、骨癌和皮肤癌。癌瘤可包括口腔癌、食道癌、胃肠道癌、肺道癌、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、脑癌、结缔组织癌、甲状腺癌、肝癌、胆囊癌、膀胱(尿道上皮)癌、肾癌、皮肤癌、中枢神经系统癌和睾丸癌。
在涉及治疗癌症的某些实施方案中，抗体或免疫缀合物可与手术、放射疗法、化学疗法、用包括检查点抑制抗体的裸抗体进行的免疫疗法、放射免疫疗法、免疫调节剂、疫苗等组合使用。最优选地，抗体或免疫缀合物与PARP抑制剂、微管抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂和/或PI3K抑制剂组合使用。这些组合疗法可允许在所述组合的情况下给予较低剂量的各治疗剂，因此降低某些重度副作用，以及潜在缩减所需疗程。当不存在或存在最小重叠毒性时，也可给予各自的完全剂量。
免疫缀合物的优选最优给药可包括介于1 mg/kg与20 mg/kg之间，更优选是4至16mg/kg，最优选是8至10 mg/kg的剂量，优选每周、每周两次或每隔一周或每三周加以给予。最优给药时程可包括以下治疗循环：连续治疗两周继之以休息一、二、三或四周，或交替进行数周治疗和休息，或治疗一周继之以休息二、三或四周，或治疗三周继之以休息一、二、三或四周，或治疗四周继之以休息一、二、三或四周，或治疗五周继之以休息一、二、三、四或五周，或每两周一次、每三周一次或一个月一次进行施用。治疗可延伸任何数目的循环，优选至少2、至少4、至少6、至少8、至少10、至少12、至少14或至少16个循环。适用的示例性剂量可包括1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg和18mg/kg。普通技术人员将认识到在选择免疫缀合物的最优剂量时，可考虑多种因素，诸如年龄、总体健康状况、特定器官功能或重量、以及先前疗法对特定器官系统(例如骨髓)的影响，并且在疗程期间，可增加或降低施用剂量和/或频率。在少至4至8次剂量之后观察到肿瘤收缩迹象的情况下，剂量可根据需要进行重复。本文公开的最优化施用剂量和时程显示在人受试者中出乎意料的优越功效和降低的毒性，此不可从动物模型研究进行预测。惊人的是，优越功效允许治疗先前发现对一种或多种标准抗癌疗法具有抗性的肿瘤，所述疗法包括在体内从其获得SN-38的母体化合物CPT-11。
主题方法可包括以定期间隔使用CT和/或PET/CT或MRI来测量肿瘤响应。也可监测肿瘤标志物诸如CEA (癌胚抗原)、CA19-9、AFP、CA 15.3或PSA的血液水平。可根据成像和/或标志物血液水平的结果，视需要调整剂量和/或施用时程。
用本发明所要求保护的组合物和方法获得的惊人结果是当甚至以重复输注来对患者给予时，高剂量的抗体-药物缀合物具有出乎意料的可耐受性，其中仅观察到相对低等级的恶心和呕吐毒性，或可管理的嗜中性白细胞减少症。优选地，3级或更高等级副作用诸如贫血、腹泻、恶心、呕吐或嗜中性白细胞减少症的发生率限于治疗群体中的26%或更少。更优选地，3级或更高等级腹泻和嗜中性白细胞减少症的发生率存在于治疗群体中的26%或更少中。另一惊人结果是不同于使SN-38缀合于白蛋白、PEG或其它载体的其它产品，抗体-药物缀合物缺少积累于其中MAb不可到达的非靶标组织或靶标组织。缺少积累伴有可耐受性改进以及甚至在重复或增加给药之后也缺少严重毒性。这些惊人结果允许以出乎意料高的功效和低的毒性达成剂量和递送时程的最优化；即相比于当单独或与其它药物组合给予SN-38的母体药物伊立替康时，具有更高治疗指数。这由伊立替康的产品标签上的由FDA要求的黑框警告所强调，所述警告陈述由用伊立替康进行的疗法所致的高度重度早期和晚期腹泻。在这些含有SN-38的ADC的情况下，这未以相同程度和频率被经历。相比于在伊立替康疗法的情况下，在本文所述的SN-38-ADC的情况下，甚至发热性嗜中性白细胞减少症也少得多。
所要求保护的方法提供患有先前抗性癌症的个体中的实体肿瘤在尺寸方面收缩15%或更多，优选20%或更多，优选30%或更多，更优选40%或更多(如通过根据RECIST或RECIST 1.1将靶标病变的最长直径求和所测量)。普通技术人员将认识到肿瘤尺寸可通过多种不同技术来测量，诸如总体肿瘤体积、在任何维度上的最大肿瘤尺寸或在数个维度上的尺寸测量结果的组合。这可采用标准放射学程序诸如计算机断层摄影术、磁共振成像、超声波检查法和/或正电子发射断层摄影术。测量尺寸的手段的重要性小于观察用抗体或免疫缀合物治疗使肿瘤尺寸减小，优选从而导致消除肿瘤的趋势。然而，为遵循RECIST指导方针，连续CT或MRI是优选的，并且应加以重复以确认测量结果。
尽管抗体或免疫缀合物可以定期弹丸注射液形式施用，但在替代性实施方案中，抗体或免疫缀合物可通过连续输注来施用。为使抗体或免疫缀合物在血液中的Cmax增加以及延长抗体或免疫缀合物在血液中的PK，可例如通过留置导管来施用连续输注。此类装置在本领域中是已知的，诸如HICKMAN®、BROVIAC®或Port-A-Cath®导管(参见例如Skolnik等, Ther Drug Monit 32:741-48, 2010)，并且可使用任何所述已知留置导管。多种连续输注泵在本领域中也是已知的，并且可使用任何所述已知输注泵。连续输注的剂量范围可介于每天0.1与3.0 mg/kg之间。更优选地，这些免疫缀合物可历经2至5小时，更优选2-3小时的相对短暂时期，通过静脉内输注来施用。
在特别优选实施方案中，在对标准疗法具有抗性的患者中，抗体或免疫缀合物和给药时程可为有效的。举例来说，可向尚未对用SN-38的母体药剂伊立替康进行的先前疗法响应的患者施用hRS7-SN-38免疫缀合物。惊人的是，伊立替康抗性患者可显示对hRS7-SN-38的部分或甚至完全响应。免疫缀合物特异性靶向肿瘤组织的能力可由于治疗剂的靶向性改进和递送增强而克服肿瘤抗性。一特定优选受试者可为患有Trop-2阳性乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食道癌、膀胱(尿道上皮)癌、肾癌、胰腺癌、脑癌、甲状腺癌、上皮癌、或头颈部癌的患者。优选地，癌症是转移性癌症。更优选地，患者用至少一种标准抗癌疗法进行的治疗先前已失败。最优选地，患者用SN-38的母体化合物伊立替康(CPT-11)进行的疗法先前已失败。在替代性优选实施方案中，癌症是TNBC、非TNBC、子宫内膜癌、肺癌或卵巢癌。
某些优选实施方案中，抗体或免疫缀合物诸如萨希珠单抗戈维替康可在组合疗法中与至少一种微管抑制剂一起使用。许多微管抑制剂在本领域中是已知的，诸如长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine))、紫杉烷(例如紫杉醇)、类美登素(maytansinoid) (例如美坦辛(mertansine))和澳瑞他汀。其它已知微管抑制剂包括地美可辛(demecolcine)、诺考达唑(nocodazole)、埃博霉素、多西他赛(docetaxel)、圆皮海绵内酯(discodermolide)、秋水仙碱(colchicine)、康普瑞汀(combrestatin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、CI-980、苯基阿夕斯丁(phenylahistin)、斯的甘辛(steganacin)、curacin、2-甲氧基雌二醇、E7010、甲氧基苯磺酰胺、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)、长春地辛(vindesine)、多拉司他汀(dolastatin)、海绵抑制素(spongistatin)、根霉素(rhizoxin)、泰丝多汀(tasidotin)、大田软海绵素(halichondrin)、哈米特林(hemiasterlin)、念珠藻素52 (cryptophycin 52)、MMAE和甲磺酸艾日布林(eribulin mesylate) (参见例如Dumontet和Jordan, 2010, Nat Rev DrugDiscov 9:790-803)。任何所述已知微管抑制剂都可与抗体或抗体-药物缀合物(ADC)组合使用。优选地，微管抑制剂是当与抗体或ADC组合使用时展现协同作用的微管抑制剂。一个强力实例是SN-38缀合抗体诸如萨希珠单抗戈维替康或拉贝珠单抗(labetuzumab)戈维替康(靶向由许多实体癌表达的CEACAM5)。最优选地，微管抑制剂是紫杉醇或甲磺酸艾日布林。
在其它优选实施方案中，抗体或ADC可在组合疗法中与至少一种PARP抑制剂一起使用。一种所述ADC包含SN-38缀合于肿瘤靶向抗体，诸如萨希珠单抗戈维替康或拉贝珠单抗戈维替康。许多PARP抑制剂在本领域中是已知的，诸如奥拉帕尼(olaparib)、talazoparib (BMN-673)、瑞卡帕尼(rucaparib)、维利帕尼(veliparib)、尼拉帕尼(niraparib)、依尼帕尼(iniparib)、CEP 9722、MK 4827、BGB-290、ABT-888、AG014699、BSI-201、CEP-8983和3-氨基苯甲酰胺(参见例如Rouleau等, 2010, Nat Rev Cancer 10:293-301，Bao等, 2015, Oncotarget [电子出版先于印刷，2015年9月22日])。任何所述已知PARP抑制剂都可与抗体或ADC诸如像SN-38-抗体缀合物或P2PDox-抗体缀合物组合使用。优选地，PARP抑制剂是当与抗体或ADC组合使用时展现协同作用的PARP抑制剂。这已在使用SN-38缀合抗体诸如萨希珠单抗戈维替康时得以验证。最优选地，PARP抑制剂是奥拉帕尼或瑞卡帕尼。
在其它实施方案中，抗体或免疫缀合物可与布鲁顿激酶抑制剂或PI3K抑制剂组合使用。示例性布鲁顿激酶抑制剂包括但不限于依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、CC-292(AVL-292)、ONO-4059、GDC-0834、LFM-A13或RN486。示例性PI3K抑制剂包括但不限于艾代拉里斯、渥曼青霉素、脱甲绿胶酶素、哌立福辛、PX-866、IPI-145 (duvelisib)、BAY 80-6946、BEZ235、RP6530、TGR1202、SF1126、INK1117、GDC-0941、BKM120、XL147、XL765、帕洛米德529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、PI-103、GNE477、CUDC-907、AEZS-136或LY294002。本领域中已知的任何布鲁顿激酶或PI3K抑制剂都可用于所要求保护的组合疗法中。
附图简述
图1A. IMMU-132加奥拉帕尼在BRCA1/2野生型TNBC (MDA-MB-468)中的协同作用。首先测试各单独药剂的剂量/响应曲线以在96小时孵育之后确定单药剂IC10、IC20或IC30值。在组合测定中，跨越一定范围的浓度关于给定细胞系测试一种药剂(例如IMMU-132) (即剂量/响应曲线)。一组孔仅接受IMMU-132。另一组接受IMMU-132作为剂量/响应，以及恒定量的奥拉帕尼(例如IC10浓度)。其它两组使用在IC20或IC30浓度下的奥拉帕尼。对于各IMMU-132剂量/响应曲线，由这些数据确定IC50值。图1A显示当与恒定量的IMMU-132 (0.6、1.1或1.8 nM SN-38当量)组合时，奥拉帕尼的IC50值的变化。
图1B. IMMU-132加奥拉帕尼在BRCA1/2野生型TNBC (MDA-MB-468)中的协同作用。首先测试各单独药剂的剂量/响应曲线以在96小时孵育之后确定单药剂IC10、IC20或IC30值。在组合测定中，跨越一定范围的浓度关于给定细胞系测试一种药剂(例如IMMU-132)(即剂量/响应曲线)。一组孔仅接受IMMU-132。另一组接受IMMU-132作为剂量/响应，以及恒定量的奥拉帕尼(例如IC10浓度)。其它两组使用在IC20或IC30浓度下的奥拉帕尼。对于各IMMU-132剂量/响应曲线，由这些数据确定IC50值。图1B显示当与恒定量的奥拉帕尼(1、2或3 mM)组合时，相同细胞系显示IMMU-132 IC50值的变化。
图1C. IMMU-132加奥拉帕尼在BRCA1/2野生型TNBC (MDA-MB-468)中的协同作用。首先测试各单独药剂的剂量/响应曲线以在96小时孵育之后确定单药剂IC10、IC20或IC30值。在组合测定中，跨越一定范围的浓度关于给定细胞系测试一种药剂(例如IMMU-132)(即剂量/响应曲线)。一组孔仅接受IMMU-132。另一组接受IMMU-132作为剂量/响应，以及恒定量的奥拉帕尼(例如IC10浓度)。其它两组使用在IC20或IC30浓度下的奥拉帕尼。对于各IMMU-132剂量/响应曲线，由这些数据确定IC50值。图1C显示由测试IMMU-132和奥拉帕尼的相互作用的3个单独实验获得的标准化IC50值的等效线图，其明确显示协同相互作用。
图2A. 组合的IMMU-132和奥拉帕尼在TNBC的情况下的肿瘤生长抑制：BRCA1/2和PTEN缺陷性肿瘤。用奥拉帕尼(1 mg；约50 mg/kg，腹膜内，根据M-F时程；红色箭号)或IMMU-132 (每周静脉内，黑色箭号)治疗携带肿瘤的小鼠(TV约0.3 cm3)。非肿瘤靶向抗CD20 SN-38 ADC用作对照。HCC1806是一种BRCA1/2缺陷性TNBC肿瘤株系。单独奥拉帕尼不具有显著抗肿瘤作用。相较于所有对照组，单独IMMU-132显著抑制肿瘤生长(P<0.0106，AUC)。相较于所有组，IMMU-132加奥拉帕尼进一步使抗肿瘤响应显著改进(P<0.0019；AUC)。组合组中的小鼠还有待达到分别是IMMU-132或奥拉帕尼单药疗法的超过2倍和4倍长的中值存活期(>80.5天) (P<0.0083)。
图2B. 组合的IMMU-132和奥拉帕尼在TNBC的情况下的肿瘤生长抑制：BRCA1/2和PTEN缺陷性肿瘤。用奥拉帕尼(1 mg；约50 mg/kg，腹膜内，根据M-F时程；浅色箭号)或IMMU-132(每周静脉内，暗色箭号)治疗携带肿瘤的小鼠(TV约0.3 cm3)。非肿瘤靶向CD20抗体SN-38 ADC用作对照。在BRCA1/2野生型、PTEN缺陷性MDA-MB-468肿瘤中，相较于所有对照组，单独IMMU-132具有显著抗肿瘤作用(P<0.0098；AUC)。然而，IMMU-132加奥拉帕尼的组合对肿瘤生长的抑制显著好于单独IMMU-132或奥拉帕尼(P=0.004；AUC)。这意味着当相较于所有其它组时的显著存活益处(P<0.045)。
图3A. 组合的IMMU-132和微管抑制剂在人TNBC肿瘤异种移植物的情况下的肿瘤生长抑制。如所指示，用单独紫杉醇或甲磺酸艾日布林或与IMMU-132一起治疗携带肿瘤的小鼠(TV约0.3 cm3)。以每周注射来施用疗法，持续两周，在重复之前休息一周。非肿瘤靶向抗CD20 SN-38 ADC用作对照ADC。当相较于单独IMMU-132时，用IMMU-132加紫杉醇的组合治疗携带HCC1806肿瘤的小鼠显著抑制肿瘤生长(P<0.0195，AUC)。
图3B. 组合的IMMU-132和微管抑制剂在人TNBC肿瘤异种移植物的情况下的肿瘤生长抑制。如所指示，用单独紫杉醇或甲磺酸艾日布林或与IMMU-132一起治疗携带肿瘤的小鼠(TV约0.3 cm3)。以每周注射来施用疗法，持续两周，在重复之前休息一周。非肿瘤靶向抗CD20 SN-38 ADC用作对照ADC。当相较于所有其它治疗时，用IMMU-132加紫杉醇的组合治疗的携带HCC1806肿瘤的小鼠显示显著存活益处(P<0.006，对数秩)。
图3C. 组合的IMMU-132和微管抑制剂在人TNBC肿瘤异种移植物的情况下的肿瘤生长抑制。当相较于接受单药疗法的小鼠时，当使IMMU-132 (100或200 mg)与紫杉醇组合时，携带MDA-MB-468肿瘤的小鼠显示显著的抗肿瘤作用(P<0.0328，AUC)。
图3D. 组合的IMMU-132和微管抑制剂在人TNBC肿瘤异种移植物的情况下的肿瘤生长抑制。单独甲磺酸艾日布林显著抑制MDA-MB-468肿瘤生长(P=0.0019，AUC)。重要的是，IMMU-132加甲磺酸艾日布林的组合导致显著肿瘤消退，其中平均肿瘤体积消退至0.026 ±0.033 cm3 相对于分别IMMU-132和艾日布林单药疗法组的0.177 ± 0.087 cm3和0.344 ±302 cm3 (组合相对于所有其它疗法组，P<0.0009，AUC)。
图3E. 组合的IMMU-132和微管抑制剂在人TNBC肿瘤异种移植物的情况下的肿瘤生长抑制。当相较于所有其它治疗组时，IMMU-132加甲磺酸艾日布林产生显著抗肿瘤作用(P<0.0432；配对双尾t检验)。
图3F. 组合的IMMU-132和微管抑制剂在人TNBC肿瘤异种移植物的情况下的肿瘤生长抑制。相较于除甲磺酸艾日布林加对照ADC的组合之外的所有组，IMMU-132加甲磺酸艾日布林提供显著存活益处(P<0.0284)。
图4. IMMU-132加奥拉帕尼在各种人TNBC细胞系中的协同活性。显示针对各种细胞系的计算组合指数(CI)值的概述。使用下式计算CI数值：CI=Da/Dxa + Db/Dxb，其中
Da=当与恒定量的奥拉帕尼组合使用时IMMU-132的IC50剂量
Db=当与恒定量的IMMU-132组合使用时奥拉帕尼的IC50剂量
Dxa=当单独使用时IMMU-132的IC50剂量
Dxb=当单独使用时奥拉帕尼的IC50剂量
a当与奥拉帕尼组合时的IMMU-132 IC50值(nM)。
b当与IMMU-132组合时的奥拉帕尼IC50值(nM)。
cCI组合指数数值(CI<1.0指示协同作用)。
图5A. IMMU-114对依鲁替尼的IC50的影响。
图5B. IMMU-114对艾代拉里斯的IC50的影响。
图6A. 证明组合的IMMU-114与布鲁顿激酶抑制剂(依鲁替尼)在人CLL细胞系中具有累加作用的等效线图。使人慢性B细胞白血病细胞(JVM-3)与在1x10-5至3.9x10-9 M的范围内的剂量下的布鲁顿激酶抑制剂(依鲁替尼)一起在96孔板中孵育。一组细胞仅接受抑制剂，而其它组接受抑制剂加恒定量的IMMU-114 (0.25、0.5、0.75或1 nM)。使各板孵育96小时。通过MTS测定来评估细胞活力，并且产生各条件下的剂量/响应曲线。使用Prism Graph-Pad确定IC50值。使数据标准化并产生等效线图，其指示当与IMMU-114组合时依鲁替尼的累加作用。
图6B. 证明组合的IMMU-114与PI3K抑制剂(艾代拉里斯)在人CLL细胞系中具有累加作用的等效线图。如图6A的图例中所述进行研究。等效线图指示当与IMMU-114组合时艾代拉里斯的累加作用。
图7. 用MAb-CL2A-SN-38缀合物对携带Capan 1人胰腺癌的无胸腺裸小鼠的体内治疗。
图8. 用MAb-CL2A-SN-38缀合物对携带BxPC3人胰腺癌的无胸腺裸小鼠的体内治疗。
图9. 用hMN-14-CL2A-SN-38缀合物对携带LS174T人结肠癌的无胸腺裸小鼠的体内治疗。
图10. hMN14-CL-SN-38治疗的携带GW-39肺转移性疾病的小鼠的存活曲线。
图11A. hRS7-SN-38 ADC在携带人非小细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中的治疗功效。每4天，持续总计4次注射(q4dx4)，用hRS7-CL2-SN-38注射携带Calu-3肿瘤的小鼠(N =5–7)。所有ADC和对照都以指示量施用(表示为每剂SN-38的量；长箭号=缀合物注射，短箭号=伊立替康注射)。
图11B. hRS7-SN-38 ADC在携带人结肠直肠肿瘤异种移植物的小鼠中的治疗功效。携带COLO 205肿瘤的小鼠(N = 5)用ADC注射8次(q4dx8)，或每2天，持续总计5次注射(q2dx5)，用MTD的伊立替康注射。所有ADC和对照都以指示量施用(表示为每剂SN-38的量；长箭号=缀合物注射，短箭号=伊立替康注射)。
图11C. hRS7-SN-38 ADC在携带人胰腺癌异种移植物的小鼠中的治疗功效。每周两次，持续4周，用指示的药剂治疗携带Capan-1 (N = 10)肿瘤的小鼠(N = 10)。所有ADC和对照都以指示量施用(表示为每剂SN-38的量；长箭号=缀合物注射，短箭号=伊立替康注射)。
图11D. hRS7-SN-38 ADC在携带人胰腺癌异种移植物的小鼠中的治疗功效。每周两次，持续4周，用指示的药剂治疗携带BxPC-3肿瘤的小鼠(N = 10)。所有ADC和对照都以指示量施用(表示为每剂SN-38的量；长箭号=缀合物注射，短箭号=伊立替康注射)。
图11E. hRS7-SN-38 ADC在携带人鳞状细胞肺癌异种移植物的小鼠中的治疗功效。除每周两次持续4周给予ADC之外，携带SK-MES-1肿瘤的小鼠(N = 8)也接受MTD的CPT-11 (q2dx5)。所有ADC和对照都以指示量施用(表示为每剂SN-38的量；长箭号=缀合物注射，短箭号=伊立替康注射)。
图12A. 依帕珠单抗(Emab)–SN-38缀合物和维妥珠单抗(Vmab)–SN-38缀合物在皮下Ramos模型中的比较功效。每周两次，持续4周向肿瘤平均约0.35 cm3 (0.20–0.55 cm3)的裸小鼠(每组N = 10)施用0.25 mg Emab-SN-38。
图12B. 依帕珠单抗(Emab)–SN-38缀合物和维妥珠单抗(Vmab)–SN-38缀合物在皮下Ramos模型中的比较功效。每周两次，持续4周向肿瘤平均约0.35 cm3 (0.20–0.55 cm3)的裸小鼠 (每组N = 10)施用0.25 mg Vmab-SN-38。
图12C. 依帕珠单抗(Emab)–SN-38缀合物和维妥珠单抗(Vmab)–SN-38缀合物在皮下Ramos模型中的比较功效。每周两次，持续4周向肿瘤平均约0.35 cm3 (0.20–0.55 cm3)的裸小鼠(每组N = 10)施用0.5 mg Emab-SN-38。
图12D. 依帕珠单抗(Emab)–SN-38缀合物和维妥珠单抗(Vmab)–SN-38缀合物在皮下Ramos模型中的比较功效。每周两次，持续4周向肿瘤平均约0.35 cm3 (0.20–0.55 cm3)的裸小鼠(每组N = 10)施用0.5 mg Vmab-SN-38。
图13A. Emab 抗CD22–SN-38缀合物(实线)相对于无关拉贝珠单抗(Lmab)–SN-38缀合物(虚线)在携带皮下Ramos肿瘤的裸小鼠中的特异性。每周两次，持续4周，对动物腹膜内给予每剂75 μg各缀合物(基于22 g的平均重量，54.5 μg/kg的 SN-38)。存活基于达到3.0 cm3的进展时间(TTP)，其中肿瘤开始于0.4 cm3的平均尺寸。比较Emab–SN-38达成的中值存活期(所示)与Lmab–SN-38缀合物达成的中值存活期的P值显示于各图中。C，被每周给予腹膜内注射伊立替康(6.5μg/剂；SN-38当量近似与250 μg剂量的Emab–SN-38缀合物相同)的另一组动物的存活曲线(灰色实线)。
图13B. Emab 抗CD22–SN-38缀合物(实线)相对于无关拉贝珠单抗(Lmab)–SN-38缀合物(虚线)在携带皮下Ramos肿瘤的裸小鼠中的特异性。每周两次，持续4周，对动物腹膜内给予每剂125 μg各缀合物(基于22 g的平均重量，91 μg/kg的SN-38)。存活基于达到3.0cm3的进展时间(TTP)，其中肿瘤开始于0.4 cm3的平均尺寸。比较Emab–SN-38达成的中值存活期(所示)与Lmab–SN-38缀合物达成的中值存活期的P值显示于各图中。C，被每周给予腹膜内注射伊立替康(6.5μg/剂；SN-38当量近似与250 μg剂量的Emab–SN-38缀合物相同)的另一组动物的存活曲线(灰色实线)。
图13C. Emab 抗CD22–SN-38缀合物(实线)相对于无关拉贝珠单抗(Lmab)–SN-38缀合物(虚线)在携带皮下Ramos肿瘤的裸小鼠中的特异性。每周两次，持续4周，对动物腹膜内给予每剂250 μg各缀合物(基于22 g的平均重量，182 μg/kg的SN-38)。存活基于达到3.0cm3的进展时间(TTP)，其中肿瘤开始于0.4 cm3的平均尺寸。比较Emab–SN-38达成的中值存活期(所示)与Lmab–SN-38缀合物达成的中值存活期的P值显示于各图中。也显示被每周给予腹膜内注射伊立替康(6.5μg/剂；SN-38当量近似与250 μg剂量的Emab-SN-38缀合物相同)的另一组动物的存活曲线(灰色实线)。
图14. 在施用IMMU-130 (拉贝珠单抗-SN-38)之前，患者的先前治疗史。先前治疗包括IV期CRC结肠切除术/肝切除术(部分叶)，对肝转移的射频消融疗法，楔形切除肺转移，以及用伊立替康/奥沙利铂、Folfirinox、Folfirinox +贝伐单抗、贝伐单抗+ 5-FU/甲酰四氢叶酸、FolFiri、Folfiri +西妥昔单抗、和单独西妥昔单抗进行的化学疗法。患者每隔一周通过缓慢静脉内输注来接受16 mg/kg剂量的IMMU-130，持续总计17次治疗剂量。
发明详述
定义
在随后描述中，使用许多术语，并且提供以下定义以有助于理解所要求保护的主题。本文未明确定义的术语根据它们的普通和寻常含义加以使用。
除非另外规定，否则一个(种) (a/an)意指“一个(种)或多个(种)”。
术语约在本文中用于意指加上或减去某一数值的百分之十(10%)。举例来说，“约100”是指在90与110之间的任何数目。
如本文所用的抗体是指全长(即天然存在或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的抗原结合部分诸如抗体片段。抗体或抗体片段可在所要求保护的主题的范围内加以缀合或另外衍生。所述抗体包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 (和IgG4子形式)以及IgA同种型。如下所用，缩写“MAb”可互换用于指代抗体、抗体片段、单克隆抗体或多特异性抗体。
抗体片段是抗体的一部分，诸如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv (单链Fv)、单结构域抗体(DAB或VHH)等，包括以上引用的IgG4的半分子(van der Neut Kolfschoten等(Science 2007; 317(9月14日):1554-1557))。无论结构如何，适用的抗体片段与由完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”也包括通过结合特定抗原以形成复合物来充当抗体的合成或遗传工程改造的蛋白质。举例来说，抗体片段包括由可变区组成的经分离片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段或其中轻可变区和重可变区由肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。片段可以不同方式构建以产生多价和/或多特异性结合形式。
裸抗体通常是未缀合于治疗剂的完整抗体。裸抗体可例如通过Fc依赖性功能诸如补体固定(CDC)和ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒性)来展现治疗和/或细胞毒性作用。然而，其它机理诸如凋亡、抗血管生成、抗转移活性、抗粘附活性、抑制异型或同型粘附以及干扰信号传导路径也可提供治疗作用。裸抗体包括多克隆和单克隆抗体、天然存在或重组抗体，诸如嵌合、人源化或人抗体及其片段。在一些情况下，“裸抗体”也可指“裸”抗体片段。如本文所定义，“裸”与“未缀合”同义，并且意指未连接或缀合于治疗剂。
嵌合抗体是重组蛋白，其含有源于一个物种的抗体(优选是啮齿动物抗体，更优选是鼠抗体)的重抗体链与轻抗体链两者的包括互补决定区(CDR)的可变结构域，而抗体分子的恒定结构域源于人抗体的恒定结构域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可源于诸如灵长类动物、猫或狗的其它物种的恒定结构域。
人源化抗体是重组蛋白，其中将来自一个物种的抗体(例如鼠抗体)的CDR从所述鼠抗体的重可变链和轻可变链转移至人重可变结构域和轻可变结构域(框架区)中。抗体分子的恒定结构域源于人抗体的恒定结构域。在一些情况下，人源化抗体的框架区的特定残基，特别是接触或接近于CDR序列的那些，可加以修饰，例如用来自原始鼠、啮齿动物、低于人类的灵长类动物或其它抗体的相应残基替换。
人抗体是例如从已被“工程改造”以响应于抗原激发来产生人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在这个技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入源于含有内源性重链和轻链基因座的靶向破坏的胚胎干细胞系的小鼠品系中。转基因小鼠可合成对各种抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等, Nature Genet. 7:13 (1994)，Lonberg等, Nature 368:856 (1994)，以及Taylor等, Int. Immun. 6:579 (1994)描述。也可通过全都在本领域中是已知的遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建完全人抗体。对于从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变结构域基因谱系体外产生人抗体及其片段，参见例如McCafferty等, Nature348:552-553 (1990)。在这个技术中，将人抗体可变结构域基因同框克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且以功能性抗体片段形式展示在噬菌体粒子的表面上。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致对编码展现那些性质的抗体的基因的选择。以这个方式，噬菌体模拟B细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)。人抗体也可由体外活化的B细胞产生。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
治疗剂是适用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括但不限于抗体、抗体片段、免疫缀合物、药物、细胞毒性剂、促凋亡剂、毒素、核酸酶(包括DNA酶和RNA酶)、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活性剂或染料、放射性核素、寡核苷酸、干扰RNA、siRNA、RNAi、抗血管生成剂、化学治疗剂、细胞因子、趋化因子、前药、酶、结合蛋白或肽或其组合。
免疫缀合物是缀合于至少一个治疗剂的抗体、抗原结合抗体片段、抗体复合物或抗体融合蛋白。缀合可为共价或非共价的。优选地，缀合是共价的。
如本文所用，术语抗体融合蛋白是重组产生的抗原结合分子，其中一个或多个天然抗体、单链抗体或抗体片段连接于另一部分，诸如蛋白质或肽、毒素、细胞因子、激素等。在某些优选实施方案中，融合蛋白可包含两个或更多个融合在一起的相同或不同抗体、抗体片段或单链抗体，其可结合相同表位、同一抗原上的不同表位、或不同抗原。
免疫调节剂是当存在时会改变、抑制或刺激身体的免疫系统的治疗剂。通常，适用的免疫调节剂刺激免疫细胞增殖或变得在免疫应答级联中活化，所述免疫细胞诸如巨噬细胞、树突细胞、B细胞和/或T细胞。然而，在一些情况下，免疫调节剂可抑制免疫细胞的增殖或活化。如本文所述的免疫调节剂的一实例是细胞因子，其是约5-20 kDa的可溶性小蛋白质，由一种细胞群体(例如致敏T淋巴细胞)在与特定抗原接触时释放，并且充当细胞之间的细胞间介体。如熟练技术人员将了解，细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、白介素和若干相关信号传导分子诸如肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素。趋化因子是细胞因子的一个子组。某些白介素和干扰素是刺激T细胞或其它免疫细胞增殖的细胞因子的实例。示例性干扰素包括干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ和干扰素-λ。
CPT是喜树碱的缩写，并且如本申请中所用，CPT代表喜树碱自身或喜树碱的类似物或衍生物诸如SN-38。在下图1中以式1给出喜树碱和它的一些类似物的结构，其中对编号进行指示，并且用字母A-E标记各环。
图1
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一般抗体技术
用于制备针对实际上任何靶标抗原的单克隆抗体的技术在本领域中是熟知的。参见例如Köhler和Milstein, Nature256: 495 (1975)，以及Coligan等 (编), CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 第1卷, 第2.5.1-2.6.7页 (John Wiley & Sons 1991)。普通技术人员将认识到当将治疗人受试者时，抗体优选结合人抗原。简要来说，可通过以下方式来获得单克隆抗体：用包含抗原的组合物注射小鼠，移除脾以获得B淋巴细胞，使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对所述抗原的抗体的克隆，以及从杂交瘤培养物分离抗体。
可通过多种明确确定技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。所述分离技术包括用蛋白A或蛋白G琼脂糖进行的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如Coligan, 第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。也参见Baines等, “Purification ofImmunoglobulin G (IgG)”, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第10卷, 第79-104页(The Humana Press, Inc. 1992)。
在初始产生针对免疫原的抗体之后，可对抗体测序，并且随后通过重组技术制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合化为本领域技术人员所熟知，如下所讨论。
熟练技术人员将认识到所要求保护的方法和组合物可利用本领域中已知的广泛多种抗体中的任一者。适用的抗体可从广泛多种已知来源商购获得。举例来说，多种分泌抗体的杂交瘤株系可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas, VA)获得。许多针对各种疾病靶标(包括但不限于肿瘤相关的抗原)的抗体已被保藏在ATCC和/或具有公布的可变区序列，并且可用于所要求保护的方法和组合物中。参见例如美国专利号7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572;856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040、6,451,310；6,444,206；6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953、5,525,338，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文。这些仅是示例性的，并且广泛多种其它抗体和它们的杂交瘤在本领域中是已知的。熟练技术人员将认识到针对几乎任何疾病相关的抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤都可通过简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库中针对所选疾病相关的目标靶标的抗体来获得。可使用本领域中熟知的标准技术，将克隆的抗体的抗原结合结构域扩增，切除，连接至表达载体中，转染至改适的宿主细胞中并用于蛋白质产生。可使用本文公开的技术使分离的抗体缀合于诱导DNA链断裂的治疗剂，诸如喜树碱或蒽环霉素。
嵌合和人源化抗体
嵌合抗体是重组蛋白，其中人抗体的可变区已被例如小鼠抗体的包括所述小鼠抗体的互补决定区(CDR)的可变区替换。当向受试者施用时，嵌合抗体展现降低的免疫原性和增加的稳定性。用于构建嵌合抗体的方法在本领域中是熟知的(例如Leung等, 1994,Hybridoma 13:469)。
可通过将来自小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链的小鼠CDR转移至人抗体的相应可变结构域中来使嵌合单克隆抗体人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(FR)也用人FR序列替换。为保持人源化单克隆的稳定性和抗原特异性，一个或多个人FR残基可用小鼠对应残基替换。人源化单克隆抗体可用于治疗性治疗受试者。用于产生人源化单克隆抗体的技术在本领域中是熟知的。(参见例如Jones等, 1986, Nature, 321:522；Riechmann等, Nature, 1988, 332:323；Verhoeyen等, 1988, Science, 239:1534；Carter等,1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4285；Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992,12:437；Tempest等, 1991, Biotechnology 9:266；Singer等, J. Immun., 1993, 150:2844)。
其它实施方案可涉及非人灵长类动物抗体。用于产生在狒狒中具有治疗适用性的抗体的一般性技术可例如见于Goldenberg等, WO 91/11465 (1991)中以及Losman等,Int. J. Cancer 46: 310 (1990)中。在另一实施方案中，抗体可为人单克隆抗体。所述抗体可从已被工程改造以响应于抗原激发来产生特定人抗体的转基因小鼠获得，如下所讨论。
人抗体
用于使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法在本领域中是已知的(例如Mancini等, 2004, New Microbiol. 27:315-28；Conrad和Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26；Brekke和Loset,2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50；各自以引用的方式并入本文)。预期所述完全人抗体比嵌合或人源化抗体展现甚至更少副作用，并且在体内充当基本上内源性人抗体。在某些实施方案中，所要求保护的方法和程序可利用通过所述技术产生的人抗体。
在一个替代方案中，噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如，Dantas-Barbosa等, 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40，以引用的方式并入本文)。可从正常人或从展现诸如癌症的特定疾病状态的人产生人抗体(Dantas-Barbosa等, 2005)。从患病个体构建人抗体的优势在于循环抗体谱系可偏向针对疾病相关的抗原的抗体。
在这个方法学的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人 (2005)构建来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，从循环血液淋巴细胞获得总RNA(同前)。从μ、γ和κ链抗体谱系克隆重组Fab，并且插入噬菌体展示文库中(同前)。使RNA转换成cDNA，并且用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特定引物制备Fab cDNA文库(Marks等, 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97，以引用的方式并入本文)。根据Andris-Widhopf等(2000, Phage Display Laboratory Manual, Barbas等 (编), 第1版, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 第9.1至9.22页，以引用的方式并入本文)进行文库构建。用限制核酸内切酶消化最终Fab片段，并且插入噬菌体基因组中以制备噬菌体展示文库。可通过标准噬菌体展示方法来筛选所述文库。熟练技术人员将认识到这个技术仅是示例性的，并且可利用用于通过噬菌体展示来制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一替代方案中，已被遗传工程改造以产生人抗体的转基因动物可用于使用如上讨论的标准免疫方案来产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由Green等, Nature Genet. 7:13 (1994)，Lonberg等, Nature 368:856(1994)，以及Taylor等, Int. Immun. 6:579 (1994)描述。这种系统的一非限制性实例是来自Abgenix (Fremont, CA)的XENOMOUSE® (例如Green等, 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23，以引用的方式并入本文)。在XENOMOUSE®和类似动物中，小鼠抗体基因已被失活并由功能性人抗体基因替换，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
用种系构造的YAC(酵母人工染色体)转化XENOMOUSE®，所述YAC沿辅助基因和调控序列含有人IgH和Igκ基因座的各部分，包括大多数可变区序列。人可变区谱系可用于产生产生抗体的B细胞，所述细胞可通过已知技术来处理成杂交瘤。用靶标抗原免疫的XENOMOUSE®将通过正常免疫应答产生人抗体，所述抗体可通过以上讨论的标准技术来收集和/或产生。多种品系的XENOMOUSE®是可用的，其各自能够产生不同类别的抗体。已显示转基因产生的人抗体具有治疗潜力，同时保留正常人抗体的药代动力学性质(Green等,1999)。熟练技术人员将认识到所要求保护的组合物和方法不限于使用XENOMOUSE®系统，而是可利用已被遗传工程改造以产生人抗体的任何转基因动物。
抗体片段的产生
所要求保护的方法和/或组合物的一些实施方案可涉及抗体片段。所述抗体片段可例如通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得。举例来说，抗体片段可通过用胃蛋白酶酶促裂解抗体以提供表示为F(ab')2的5S片段来产生。这个片段可进一步使用硫醇还原剂以及任选使用针对由裂解二硫键产生的硫氢基的封闭基团加以裂解，以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶进行的酶促裂解会产生两个单价Fab片段和Fc片段。用于产生抗体片段的示例性方法公开于美国专利号4,036,945；美国专利号4,331,647；Nisonoff等, 1960, Arch. Biochem. Biophys., 89:230；Porter, 1959, Biochem.J., 73:119；Edelman等, 1967, METHODS IN ENZYMOLOGY, 第422页 (Academic Press)以及Coligan等 (编), 1991, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, (John Wiley & Sons)中。
也可使用裂解抗体的其它方法，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步裂解片段，或其它酶促、化学或遗传技术，只要片段结合由完整抗体识别的抗原即可。举例来说，Fv片段包含VH链和VL链的缔合。这个缔合可为非共价的，如Inbar等, 1972, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 69:2659中所述。或者，可变链可通过分子间二硫键加以连接，或通过化学物质诸如戊二醛加以交联。参见Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437。
优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH链和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建包含编码VH结构域和VL结构域DNA序列的结构基因来制备，所述DNA序列通过寡核苷酸接头序列连接。将结构基因插入随后引入宿主细胞诸如大肠杆菌(E. coli)中的表达载体中。重组宿主细胞合成以接头肽桥接两个V结构域的单一多肽链。用于产生scFv的方法在本领域中是熟知的。参见Whitlow等, 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97；Bird等, 1988, Science, 242:423；美国专利号4,946,778；Pack等,1993, Bio/Technology, 11:1271以及Sandhu, 1992, Crit. Rev. Biotech., 12:437。
另一形式的抗体片段是单结构域抗体(dAb)，有时被称为单链抗体。用于产生单结构域抗体的技术在本领域中是熟知的(参见例如Cossins等, Protein Expression and Purification, 2007, 51:253-59；Shuntao等, Molec Immunol 2006, 43:1912-19；Tanha等, J. Biol. Chem. 2001, 276:24774-780)。其它类型的抗体片段可包含一个或多个互补决定区(CDR)。可通过构建编码目标抗体的CDR的基因来获得CDR肽(“最小识别单元”)。例如通过使用聚合酶链式反应以从产生抗体的细胞的RNA合成可变区来制备所述基因。参见Larrick等, 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106；Ritter等(编), 1995, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION, 第166-179页 (Cambridge University Press)；Birch等, (编), 1995,MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, 第137-185页 (Wiley-Liss,Inc.)。
抗体变型
在某些实施方案中，可改变抗体的序列(诸如抗体的Fc部分)以使缀合物的生理特征，诸如在血清中的半衰期最优化。取代蛋白质中氨基酸序列的方法在本领域中是广泛已知的，诸如通过定点诱变(例如Sambrook等, Molecular Cloning, A laboratory manual, 第2版, 1989)。在优选实施方案中，变化可涉及添加或移除Fc序列中一个或多个糖基化位点(例如美国专利号6,254,868，其实施例部分以引用的方式并入本文)。在其它优选实施方案中，可在Fc序列中进行特定氨基酸取代(例如Hornick等, 2000, J Nucl Med 41:355-62；Hinton等, 2006, J Immunol 176:346-56；Petkova等 2006, Int Immunol 18:1759-69；美国专利号7,217,797；各自以引用的方式并入本文)。
靶标抗原和示例性抗体
在一优选实施方案中，使用识别和/或结合在靶标细胞上以高水平表达以及相对于正常组织主要或仅仅在患病细胞上表达的人抗原的抗体。更优选地，抗体在结合之后快速内化。一示例性快速内化抗体是LL1(抗CD74)抗体，具有每天每个细胞约8 x 106个抗体分子的内化速率(例如Hansen等, 1996, Biochem J. 320:293-300)。因此，“快速内化”抗体可为具有每天每个细胞约1 x 106至约1 x 107个抗体分子的内化速率的抗体。适用于所要求保护的组合物和方法中的抗体可包括具有如上叙述的性质的MAb。适用于例如癌症的疗法的示例性抗体包括但不限于LL1 (抗CD74)、LL2或RFB4 (抗CD22)、维妥珠单抗(hA20，抗CD20)、利妥昔单抗(抗CD20)、奥滨尤妥珠单抗(GA101，抗CD20)、兰罗利珠单抗(抗PD-1受体)、纳武单抗(抗PD-1受体)、伊匹单抗(抗CTLA-4)、RS7 (抗上皮糖蛋白-1(EGP-1，也称为Trop-2))、PAM4或KC4 (两者均是抗粘蛋白)、MN-14 (抗癌胚抗原(CEA，也称为CD66e或CEACAM5)、MN-15或MN-3 (抗CEACAM6)、Mu-9 (抗结肠特异性抗原p)、Immu 31 (抗α-胎蛋白)、R1 (抗IGF-1R)、A19 (抗CD19)、TAG-72 (例如CC49)、Tn、J591或HuJ591 (抗PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026 (抗PSMA二聚体)、D2/B (抗PSMA)、G250 (抗碳酸酐酶IX MAb)、L243 (抗HLA-DR)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗tiuxetan (抗CD20)；帕尼单抗(抗EGFR)；托西莫单抗(抗CD20)；PAM4 (也称为克利维珠单抗(clivatuzumab)，抗粘蛋白)和曲妥珠单抗(抗ErbB2)。所述抗体在本领域中是已知的(例如美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239；以及美国专利申请公布号20050271671；20060193865；20060210475；20070087001；各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。适用的特定已知抗体包括hPAM4 (美国专利号7,282,567)、hA20 (美国专利号7,151,164)、hA19 (美国专利号7,109,304)、hIMMU-31 (美国专利号7,300,655)、hLL1 (美国专利号7,312,318、)、hLL2(美国专利号5,789,554)、hMu-9 (美国专利号7,387,772)、hL243 (美国专利号7,612,180)、hMN-14 (美国专利号6,676,924)、hMN-15 (美国专利号8,287,865)、hR1 (美国专利申请14/061,1767)、hRS7 (美国专利号7,238,785)、hMN-3 (美国专利号7,541,440)、AB-PG1-XG1-026 (美国专利申请11/983,372，以ATCC PTA-4405和PTA-4406保藏)和D2/B (WO2009/130575)，各所述专利或申请的正文关于附图和实施例部分以引用的方式并入本文。
可使用描述的缀合物加以靶向的其它适用抗原包括碳酸酐酶IX、B7、CCL19、CCL21、CSAp、HER-2/neu、BrE3、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20 (例如C2B8、hA20、1F5 MAb)、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、CTLA-4、α-胎蛋白(AFP)、VEGF (例如Avastin®，纤维连接蛋白剪接变体)、ED-B纤维连接蛋白(例如L19)、EGP-1 (Trop-2)、EGP-2 (例如17-1A)、EGF受体(ErbB1) (例如Erbitux®)、ErbB2、ErbB3、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、Ga 733,GRO-β、HMGB-1、缺氧诱导性因子(HIF)、HM1.24、HER-2/neu、胰岛素样生长因子(ILGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、IGF-1R、Ia、HM1.24、神经节苷脂(ganglioside)、HCG、L243所结合的HLA-DR抗原、CD66抗原即CD66a-d或其组合、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、胎盘生长因子(PlGF)、PSA (前列腺特异性抗原)、PSMA、PAM4抗原、PD-1受体、NCA-95、NCA-90、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、间皮素(mesothelin)、S100、腱生蛋白、TAC、Tn抗原、托马斯-弗雷登里希抗原(Thomas-Friedenreich antigen)、肿瘤坏死抗原、肿瘤血管生成抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、Trop-2、VEGFR、RANTES、T101以及癌干细胞抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和致癌基因产物。
如通过流式细胞术显示以及可为用以选择适于药物缀合的免疫疗法的抗体的向导的对造血恶性细胞上的适合抗原(簇标号(Cluster Designation)或CD)靶标的全面分析是Craig和Foon, Blood，2008年1月15日在线提前出版；DOL 10.1182/blood-2007-11-120535。
CD66抗原由5种具有类似结构的不同糖蛋白CD66a-e组成，分别由癌胚抗原(CEA)基因家族成员BCG、CGM6、NCA、CGM1和CEA编码。这些CD66抗原(例如CEACAM6)主要在粒细胞、消化道的正常上皮细胞以及各种组织的肿瘤细胞中表达。也作为适合癌症靶标加以包括的是癌睾丸抗原诸如NY-ESO-1 (Theurillat等, Int. J. Cancer 2007; 120(11):2411-7)，以及骨髓性白血病(Kozlov等, Cancer Genet. Cytogenet. 2005; 163(1):62-7)和B细胞疾病的情况下的CD79a，和非霍奇金氏淋巴瘤的CD79b(Poison等, Blood 110(2):616-623)。许多以上提及的抗原公开于2002年11月15日提交的题为“Use of Multi-specific,Non-covalent Complexes for Targeted Delivery of Therapeutics”的美国临时申请序列号60/426,379中。归于是更具疗法抗性的前体恶性细胞群体(Hill和Perris, J. Natl. Cancer Inst. 2007; 99:1435-40)的癌干细胞具有可在某些癌症类型的情况下加以靶向的抗原，诸如在前列腺癌(Maitland等, Ernst Schering Found. Sympos. Proc. 2006;5:155-79)、非小细胞肺癌(Donnenberg等, J. Control Release 2007; 122(3):385-91)和胶质母细胞瘤(Beier等, Cancer Res. 2007; 67(9):4010-5)的情况下的CD133，以及在结肠直肠癌(Dalerba等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(24)10158-63)、胰腺癌(Li等, Cancer Res. 2007; 67(3):1030-7)和头颈部鳞状细胞癌(Prince等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104(3)973-8)的情况下的CD44。
对于多发性骨髓瘤疗法，已描述针对例如CD38和CD138 (Stevenson, Mol Med2006; 12(11-12):345-346；Tassone等, Blood 2004; 104(12):3688-96)、CD74 (Stein等, 同上)、CS1 (Tai等, Blood 2008; 112(4): 1329-37)和CD40 (Tai等, 2005; Cancer Res. 65(13):5898-5906)的适合靶向抗体。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫性和凋亡的重要调控剂。已报道CD74是MIF的内源性受体(Leng等, 2003, J Exp Med 197:1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内路径的治疗作用可适用于治疗广泛范围的疾病状态，诸如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和慢性淋巴细胞性白血病(例如Meyer-Siegler等, 2004,BMC Cancer 12:34；Shachar和Haran, 2011, Leuk Lymphoma 52:1446-54)；自体免疫疾病诸如类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮(Morand和Leech, 2005, Front Biosci 10:12-22；Shachar和Haran, 2011, Leuk Lymphoma 52:1446-54)；肾病诸如肾同种异体移植物排斥(Lan, 2008, Nephron Exp Nephrol. 109:e79-83)；和众多炎症性疾病(Meyer-Siegler等, 2009, Mediators Inflamm 2009年3月22日电子出版；Takahashi等, 2009, Respir Res 10:33)。米拉珠单抗(Milatuzumab) (hLL1)是具有治疗MIF介导的疾病的治疗用途的一示例性抗CD74抗体。
抗TNF-α抗体在本领域中是已知的，并且可适用于治疗免疫疾病，诸如自体免疫疾病、免疫功能异常(例如移植物抗宿主疾病、器官移植排斥)或糖尿病。针对TNF-α的已知抗体包括人抗体CDP571 (Ofei等, 2011, Diabetes 45:881-85)；鼠抗体MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B和M303 (Thermo Scientific, Rockford, IL)；英夫利昔单抗(Centocor, Malvern, PA)；聚乙二醇赛妥珠单抗(UCB, Brussels, Belgium)；和阿达木单抗(Abbott, Abbott Park, IL)。这些和许多其它已知抗TNF-α抗体可用于所要求保护的方法和组合物中。适用于免疫调控异常或自体免疫疾病的疗法的其它抗体包括但不限于抗B细胞抗体诸如维妥珠单抗、依帕珠单抗、米拉珠单抗或hL243；托珠单抗(抗IL-6受体)；巴利昔单抗(抗CD25)；达利珠单抗(抗CD25抗体)；依法珠单抗(抗CD11a)；莫罗莫那-CD3 (抗CD3受体)；抗CD40L(UCB, Brussels, Belgium)；那他珠单抗(抗α4整联蛋白)和奥马珠单抗(抗IgE)。
1型和2型糖尿病可使用针对B细胞抗原诸如CD22 (依帕珠单抗和hRFB4)、CD74(米拉珠单抗)、CD19 (hA19)、CD20 (维妥珠单抗)或HLA-DR (hL243)的已知抗体治疗(参见例如Winer等, 2011, Nature Med 17:610-18)。也已提出抗CD3抗体用于1型糖尿病的疗法(Cernea等, 2010, Diabetes Metab Rev 26:602-05)。
在另一优选实施方案中，使用快速内化的抗体，接着再表达，加工以及呈现在细胞表面上，从而使得能够由细胞对循环缀合物进行连续摄取和堆积。一对最优选的抗体/抗原的实例是LL1，即一种抗CD74 MAb(不变链，II类特异性伴侣蛋白，Ii) (参见例如美国专利号6,653,104；7,312,318；各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。CD74抗原在B细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T细胞淋巴瘤、黑素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、胶质母细胞瘤以及某些其它癌上高度表达(Ong等, Immunology98:296-302 (1999))。在癌症的情况下使用CD74抗体的综述含于以引用的方式并入本文的Stein等, Clin Cancer Res.2007年9月15日;13(18 Pt 2):5556s-5563s中。
优选用抗CD74抗体治疗的疾病包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、多形性胶质母细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白血病和多发性骨髓瘤。CD74抗原在靶标细胞的表面上持续短暂时期连续表达，继之以抗原内化以及抗原再表达使得靶向LL1抗体能够连同它携带的任何药物部分一起被内化。这使得较高且具有治疗性的浓度的LL1-药物缀合物积累在所述细胞内部。内化的LL1-药物缀合物穿过溶酶体和内体加以循环，并且药物部分以活性形式释放在靶标细胞内。
适用于治疗自体免疫疾病或免疫系统功能异常(例如移植物抗宿主疾病、器官移植排斥)的抗体在本领域中是已知的，并且可使用所公开方法和组合物缀合于SN-38。适用于治疗自体免疫/免疫功能异常疾病的抗体可结合包括但不限于以下的示例性抗原：BCL-1、BCL-2、BCL-6、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41a、CD43、CD45、CD55、CD74、TNF-α、干扰素和HLA-DR。结合这些和以上讨论的其它靶标抗原的抗体可用于治疗自体免疫或免疫功能异常疾病。可用抗体或免疫缀合物治疗的自体免疫疾病可包括急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肤肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺克-舍恩来因紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、ANCA相关的血管炎、阿狄森氏病(Addison's disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、类肉瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病变、多发性结节性动脉炎、僵直性脊椎炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、血栓闭塞性脉管炎、休格连氏综合征(Sjogren's syndrome)、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多软骨炎、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、膜性肾病变、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
以上讨论的抗体和针对疾病相关的抗原的其它已知抗体可在实施所要求保护的方法和组合物时用作CPT缀合物，更优选是SN-38缀合物。
双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体适用于许多生物医学应用中。举例来说，具有针对肿瘤细胞表面抗原和T细胞表面受体的结合位点的双特异性抗体可引导由T细胞对特定肿瘤细胞的溶解。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已成功用于治疗人患者中的脑肿瘤(Nitta等 Lancet. 1990; 355:368-371)。一优选双特异性抗体是抗CD3 X抗CD19抗体。在替代性实施方案中，可使抗CD3抗体或其片段连接于针对另一B细胞相关的抗原的抗体或片段，诸如抗CD3X抗CD20、抗CD3 X抗CD22、抗CD3X抗HLA-DR或抗CD3X抗CD74。在某些实施方案中，本文公开的用于治疗剂缀合的技术和组合物可与作为靶向部分的双特异性或多特异性抗体一起使用。
用以产生双特异性或多特异性抗体的众多方法是已知的，如例如于其实施例部分以引用的方式并入本文的美国专利号7,405,320中所公开。双特异性抗体可通过四源杂交瘤方法来产生，所述方法涉及使两种各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的不同杂交瘤融合(Milstein和Cuello, Nature, 1983; 305:537-540)。
用于产生双特异性抗体的另一方法使用异双官能性交联剂来化学栓系两种不同的单克隆抗体(Staerz等Nature, 1985; 314:628-631；Perez等 Nature, 1985; 316:354-356)。双特异性抗体也可通过使两种亲本单克隆抗体各自还原成相应半分子，接着混合所述半分子并使其再氧化以获得杂合结构来产生(Staerz和Bevan. ProcNatl Acad Sci U S A. 1986; 83:1453-1457)。另一替代方案涉及使用适当接头使两种或三种分别纯化的Fab’片段交联。(参见例如欧洲专利申请0453082)。
其它方法包括通过逆转录病毒源性穿梭载体将不同可选择标记基因转移至随后加以融合的相应亲本杂交瘤中(DeMonte等 Proc Natl Acad Sci U S A. 1990, 87:2941-2945)；或用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来改进产生杂合杂交瘤的效率。
可用具有适当组成和长度的肽接头(通常由超过12个氨基酸残基组成)接合同源VH结构域和VL结构域以形成具有结合活性的单链Fv (scFv)。制造scFv的方法公开于美国专利号4,946,778和美国专利号5,132,405中，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。使肽接头长度降低至小于12个氨基酸残基会阻止同一链上的VH结构域和VL结构域的配对，并且迫使VH结构域和VL结构域与其它链上的互补结构域配对，从而导致形成功能性多聚体。具有用介于3个与12个氨基酸残基之间的接头接合的VH结构域和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(被称为双链抗体)。在接头介于0个与2个氨基酸残基之间的情况下，三聚体(被称为三链抗体)和四聚体(被称为四链抗体)是有利的，但除接头长度之外，确切的寡聚样式似乎也取决于组成以及V结构域的定向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
用于产生多特异性或双特异性抗体的这些技术展现在产率较低，必需纯化，稳定性较低或技术具有劳动密集性方面的各种困难。更新近地，称为“对接和锁定(dock andlock)”(DNL)的技术已用于产生实际上任何所需抗体、抗体片段和其它效应物分子的组合(参见例如美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118；8,163,291；7,901,680；7,981,398；8,003,111和8,034,352，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。所述技术利用被称为锚定结构域(AD)和二聚化和对接结构域(DDD)的互补性蛋白质结合结构域，所述结构域彼此结合，并且允许装配在二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的范围内的复杂结构。这些结构域以高产率形成稳定复合物而不要求大量纯化。DNL技术允许装配单特异性、双特异性或多特异性抗体。本领域中已知的用于制备双特异性或多特异性抗体的任何技术都可用于实施当前所要求保护的方法。
在各种实施方案中，如本文公开的缀合物可为复合多特异性抗体的一部分。所述抗体可含有两个或更多个具有不同特异性的不同抗原结合位点。多特异性复合物可结合同一抗原的不同表位，或者可结合两种不同抗原。一些更优选的靶标组合包括表1中所列的那些。这是优选组合的实例的清单，但不意图是详尽的。
表1. 多特异性抗体的一些实例。
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诸如优选用于癌症疗法的其它组合包括CD20 + CD22抗体、CD74 + CD20抗体、CD74 + CD22抗体、CEACAM5 (CEA) + CEACAM6 (NCA)抗体、胰岛素样生长因子(ILGF) +CEACAM5抗体、EGP-1 (例如RS-7) + ILGF抗体、CEACAM5 + EGFR抗体、IL6 + CEACAM6抗体、CD74和HLA-DR抗体以及CD22和HLA-DR抗体。所述抗体无需仅用于组合中，而是可组合成各种形式的融合蛋白，诸如IgG、Fab、scFv等，如美国专利号6,083,477；6,183,744和6,962,702以及美国专利申请公布号20030124058；20030219433；20040001825；20040202666；20040219156；20040219203；20040235065；20050002945；20050014207；20050025709；20050079184；20050169926；20050175582；20050249738；20060014245和20060034759中所述，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
DOCK-AND-LOCK® (DNL®)
在优选实施方案中，二价或多价抗体以DOCK-AND-LOCK® (DNL®)复合物形式形成(参见例如美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118；8,163,291；7,901,680；7,981,398；8,003,111和8,034,352，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。通常，该技术利用发生在cAMP依赖性蛋白质激酶(PKA)的调控(R)亚基的二聚化和对接结构域(DDD)序列与源于多种AKAP蛋白中的任一者的锚定结构域(AD)序列之间的特异性和高亲和力结合相互作用(Baillie等,FEBS Letters. 2005; 579: 3264. Wong和Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004;5: 959)。DDD和AD肽可连接于任何蛋白质、肽或其它分子。因为DDD序列自发二聚化并结合AD序列，所以技术允许在可连接于DDD或AD序列的任何所选分子之间形成复合物。
尽管标准DNL®复合物包含两个DDD连接的分子连接于一个AD连接的分子的三聚体，但在复合物结构方面的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其它多聚体。在一些实施方案中，DNL®复合物可包含两个或更多个结合相同抗原决定簇或结合两种或更多种不同抗原的抗体、抗体片段或融合蛋白。DNL®复合物也可包含一种或多种其它效应物，诸如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶诸如豹蛙酶(onconase)、抑制性寡核苷酸诸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物诸如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂或任何其它分子或聚集物。
在由第二信使cAMP结合R亚基触发的一个最充分研究的信号转导路径中起主要作用的PKA首先在1968年从兔骨骼肌分离(Walsh等, J. Biol. Chem. 1968;243:3763)。全酶的结构由两个以非活性形式由R亚基保持的催化亚基组成(Taylor, J. Biol. Chem.1989;264:8443)。发现PKA的同功酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且各类型具有α和β亚型(Scott, Pharmacol. Ther. 1991;50:123)。因此，PKA调控亚基的四个亚型是RIα、RIβ、RIIα和RIIβ。R亚基已仅以稳定二聚体形式被分离，并且已显示二聚化结构域由RIIα的前44个氨基末端残基组成(Newlon等, Nat. Struct. Biol. 1999; 6:222)。如下所讨论，其它调控亚基的氨基酸序列的类似部分涉及于二聚化和对接中，各自位于调控亚基的N末端附近。cAMP结合R亚基导致释放用于达成广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基，所述亚基通过PKA与AKAP对接达成的PKA区室化来朝向所选底物进行定向(Scott等, J. Biol. Chem. 1990;265;21561)。
自从在1984年表征首个AKAP，即微管相关蛋白-2 (Lohmann等, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1984; 81:6723)以来，已在酵母至人的范围内的物种中鉴定超过50种定位于各种亚细胞部位(包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、核、线粒体和内质网)，具有不同结构的AKAP (Wong和Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004;5:959)。AKAP的针对PKA的AD是具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等, J. Biol. Chem. 1991;266:14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间十分不同，其中对RII二聚体报道的结合亲和力在2至90 nM的范围内(Alto等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003;100:4445)。AKAP将仅结合二聚R亚基。对于人RIIα，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott, Trends Cell Biol. 1999; 6:216)。因此，人RIIα的二聚化结构域与AKAP结合结构域两者均位于在本文中称为DDD的相同N末端44个氨基酸的序列内(Newlon等, Nat. Struct. Biol. 1999;6:222；Newlon等, EMBO J. 2001;20:1651)。
我们已开发用以利用人PKA调控亚基的DDD和AKAP的AD作为一对卓越接头模块来将下文称为A和B的任何两个实体对接成非共价复合物的平台技术，所述非共价复合物可通过将半胱氨酸残基引入DDD与AD两者中的策略位置处以有助于形成二硫键来进一步锁定成DNL®复合物。所述方法的一般性方法学如下。通过使DDD序列连接于A的前体，从而产生下文称为a的第一组分来构建实体A。因为DDD序列将实现自发形成二聚体，所以A将因此由a2组成。通过使AD序列连接于B的前体，从而产生下文称为b的第二组分来构建实体B。a2中含有的DDD的二聚基序将产生用于结合b中含有的AD序列的对接位点，因此有助于a2和b即时缔合以形成由a2b组成的二元三聚复合物。以用以通过二硫桥来共价固定两个实体的随后反应使得这个结合事件不可逆，因为初始结合相互作用将使放置在DDD与AD两者上的反应性硫醇基团邻近(Chmura等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001;98:8480)以进行位点特异性连接，所以基于有效局部浓度的原理，所述反应极其高效发生。使用接头、衔接头模块和前体的各种组合，可产生并使用广泛多种具有不同化学计量的DNL®构建体(参见例如U.S. No. 7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400)。
通过远离两个前体的官能团来连接DDD和AD，也预期所述位点特异性连接会保持两个前体的原始活性。这个方法在性质上是模块化的，并且潜在地可应用于位点特异性和共价连接广泛范围的具有广泛范围的活性的物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和其它效应物部分。利用以下实施例中描述的构建AD和DDD缀合效应物的融合蛋白方法，可将实际上任何蛋白质或肽并入DNL®构建体中。然而，该技术不是限制性的，并且可利用其它缀合方法。
已知多种用于制备融合蛋白的方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将所述双链核酸插入表达载体中以产生融合蛋白(参见例如Sambrook等, Molecular Cloning, A laboratory manual, 第2版, 1989)。在所述优选实施方案中，AD和/或DDD部分可连接于效应物蛋白质或肽的N末端或C末端。然而，熟练技术人员将认识到视效应物部分和效应物部分的涉及于它的生理活性中的部分的化学性质而定，AD或DDD部分连接于所述效应物部分的位点可变化。可使用本领域中已知的技术，诸如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术来进行多种效应物部分的位点特异性连接。
在各种实施方案中，抗体或抗体片段可通过例如使DDD或AD部分连接于抗体重链的C末端来并入DNL®复合物中，如以下所详述。在更优选实施方案中，可使DDD或AD部分，更优选是AD部分，连接于抗体轻链的C末端(参见例如2013年5月24日提交的美国专利申请序列号13/901,737，其实施例部分以引用的方式并入本文)。
AD和DDD部分中的结构-功能关系
对于不同类型的DNL®构建体，可利用不同的AD或DDD序列。以下提供示例性DDD和AD序列。
DDD1
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO:1)
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO:2)
AD1
QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO:3)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC (SEQ ID NO:4)
熟练技术人员将认识到DDD1和DDD2基于蛋白质激酶A的人RIIα亚型的DDD序列。然而，在替代性实施方案中，DDD和AD部分可基于蛋白质激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应AKAP序列，如在以下以DDD3、DDD3C和AD3所例示。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK (SEQ ID NO:5)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK (SEQ ID NO:6)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC (SEQ ID NO:7)
在其它替代性实施方案中，AD和/或DDD部分的其它序列变体可用于构建DNL®复合物。举例来说，仅存在人PKA DDD序列的四个变体，对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIα DDD序列是以上公开的DDD1和DDD2的基础。以下显示四个人PKA DDD序列。DDD序列代表以下残基：RIIα的1-44、RIIβ的1-44、RIα的12-61和RIβ的13-66。(应注意DDD1的序列从人PKA RIIα DDD部分加以略微修改)。
PKA RIα
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK (SEQ ID NO:8)
PKA RIβ
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA (SEQ ID NO:9)
PKA RIIα
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ (SEQ ID NO:10)
PKA RIIβ
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER (SEQ ID NO:11)
AD和DDD结构域的结构-功能关系已成为探究主题。(参见例如Burns-Hamuro等,2005, Protein Sci 14:2982-92；Carr等, 2001, J Biol Chem 276:17332-38；Alto等,2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50；Hundsrucker等, 2006, Biochem J 396:297-306；Stokka等, 2006, Biochem J 400:493-99；Gold等, 2006, Mol Cell 24:383-95；Kinderman等, 2006, Mol Cell 24:397-408，其各自的整个文本以引用的方式并入本文)。
举例来说，Kinderman等(2006, Mol Cell 24:397-408)考查AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且推断人DDD序列含有在二聚体形成或AKAP结合方面重要的许多保守氨基酸残基，在以下SEQ ID NO:1中加下划线。(参见以引用的方式并入本文的Kinderman等,2006的图1)。熟练技术人员将认识到在设计DDD序列的序列变体时，将合乎需要地避免改变任何加下划线残基，同时可能对就二聚化和AKAP结合而言的关键性较小的残基进行保守性氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO:1)
如下所更详细讨论，已表征20种常见L-氨基酸各自的保守性氨基酸取代。因此，基于Kinderman (2006)的数据和保守性氨基酸取代，基于SEQ ID NO:1的潜在替代性DDD序列显示于表2中。在设计表2时，仅考虑高度保守性氨基酸取代。举例来说，带电荷残基仅取代具有相同电荷的残基，具有小侧链的残基被具有类似大小的残基取代，羟基侧链仅被其它羟基取代等。由于脯氨酸对氨基酸二级结构的独特影响，所以无其它残基取代脯氨酸。有限数目的所述潜在替代性DDD部分序列显示于以下SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:31中。熟练技术人员将认识到可通过标准技术，例如使用商业肽合成仪或熟知定点诱变技术来构建在DDD部分的属类内的几乎无限数目的替代性物质。也可易于通过例如如Alto等(2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50)中公开的标准结合测定来确定氨基酸取代对AD部分结合的影响。
表2. DDD1(SEQ ID NO:1)中的保守性氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO:87。
Figure 423347DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Alto等(2003, Proc Natl Acad Sci USA 100:4445-50)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析以设计称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(SEQ ID NO:3)，对DDD的结合常数是0.4 nM。AKAP-IS序列被设计为AKAP结合PKA的肽拮抗剂。在以下SEQ ID NO:3中对AKAP-IS序列中其中取代倾向于降低与DDD的结合的残基加下划线。熟练技术人员将认识到在设计AD序列的序列变体时，将合乎需要地避免改变任何加下划线残基，同时可能对就DDD结合而言的关键性较小的残基进行保守性氨基酸取代。表3显示AKAP-IS的序列(AD1，SEQID NO:3)中潜在保守性氨基酸取代，类似于在上表2中对于DDD1(SEQ ID NO:1)所示的保守性氨基酸取代。
有限数目的所述潜在替代性AD部分序列显示于以下SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:49中。同样，可由熟练技术人员基于Alto等(2003)的数据制备、测试和使用在可能AD部分序列的属类内的极其大量物质。注意到Alto(2003)的图2显示可进行的十分大量潜在氨基酸取代，同时基于实际结合实验保留与DDD部分的结合活性。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO:3)
表3. AD1(SEQ ID NO:3)中的保守性氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO:88。
Figure 203084DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Gold等人(2006, Mol Cell 24:383-95)利用晶体照相术和肽筛选来产生SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO:50)，其展现相较于RI亚型，对PKA的RII亚型的选择性高5个数量级。加下划线残基指示相对于AKAP-IS序列的使与RIIα的DDD部分的结合增加的氨基酸取代的位置。在这个序列中，N末端Q残基编号为4号残基，并且C末端A残基是20号残基。其中可进行取代以影响对RIIα的亲和力的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等, 2006)。预期在某些替代性实施方案中，SuperAKAP-IS序列可取代AKAP-IS AD部分序列以制备DNL®构建体。可能取代AKAP-IS AD序列的其它替代性序列显示于SEQ ID NO:51-53中。对相对于AKAP-IS序列的取代加下划线。预期如同SEQ ID NO:4中所示的AD2序列一样，AD部分也可包括额外N末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA (SEQ ID NO:50)
替代性AKAP序列
Figure 660610DEST_PATH_IMAGE008
Gold等的图2公开来自多种AKAP蛋白的以下显示的额外DDD结合序列。
RII特异性AKAP
Figure DEST_PATH_IMAGE009
RI特异性AKAP
Figure 474983DEST_PATH_IMAGE010
双重特异性AKAP
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Stokka等人(2006, Biochem J 400:493-99)也开发AKAP结合PKA的肽竞争剂，显示于SEQ ID NO:64-66中。肽拮抗剂被指定为Ht31 (SEQ ID NO:64)、RIAD (SEQ ID NO:65)和PV-38 (SEQ ID NO:66)。Ht-31肽展现对PKA的RII亚型的较大亲和力，而RIAD和PV-38显示对RI的亲和力较高。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY (SEQ ID NO:64)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE (SEQ ID NO:65)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC (SEQ ID NO:66)
Hundsrucker等人(2006, Biochem J 396:297-306)开发AKAP结合PKA的其它肽竞争剂，对PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4 nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等的表1中，重现于下表4中。AKAPIS代表合成RII亚基结合肽。所有其它肽都源于指示的AKAP的RII结合结构域。
表4. AKAP肽序列
Figure 359762DEST_PATH_IMAGE012
在不同AKAP蛋白的AD结构域之间高度保守的残基通过关于AKAP IS序列(SEQ IDNO:3)加下划线来在以下指示。所述残基与由Alto等人(2003)所观察相同，其中添加C末端丙氨酸残基。(参见以引用的方式并入本文的Hundsrucker等(2006)的图4。)对RII DDD序列具有特别较高亲和力的肽拮抗剂的序列是AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO:3)
Carr等人(2001, J Biol Chem 276:17332-38)考查来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度，并且鉴定DDD序列中似乎在不同DDD部分之间最高度保守的残基。通过关于人PKA RIIα DDD序列SEQ ID NO:1加下划线来在以下指示这些残基。特别保守的残基用斜体进一步指示。所述残基与由Kinderman等人(2006)表明对与AKAP蛋白的结合重要的那些重叠，但不相同。熟练技术人员将认识到在设计DDD的序列变体时，将最优选的是避免改变最保守残基(斜体)，并且将优选的是也避免改变保守残基(加下划线)，同时可考虑对既未加下划线也未斜体的残基的保守性氨基酸取代。
SHIQ IP P GL TELLQGYT V EVLR Q QP P DLVEFA VE YF TR L REA R A (SEQ ID NO:1)
表5中显示基于Carr等 (2001)的数据，对DDD1 (SEQ ID NO:1)序列的一组经修改的保守性氨基酸取代。即使在这组缩减的经取代序列的情况下，也存在众多可能的替代性DDD部分序列，其可由熟练技术人员在不进行过度实验下产生、测试和使用。熟练技术人员可易于获得所述替代性DDD氨基酸序列，如上对于表2和表3所公开。
表5. DDD1(SEQ ID NO:1)中的保守性氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO:89。
Figure DEST_PATH_IMAGE013
Figure 626795DEST_PATH_IMAGE014
熟练技术人员将认识到DDD或AD氨基酸序列中的这些和其它氨基酸取代可用于使用本领域中标准技术以及仅常规实验来产生在AD或DDD部分的属类内的替代性种类。
抗体同种异型
治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加以及治疗响应的持续时间降低相关联(Baert等, 2003, N Engl J Med 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可部分地由抗体的同种异型决定(Stickler等, 2011, Genes and Immunity 12:213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置处的氨基酸序列变化相关。IgG抗体的含有重链γ型恒定区的同种异型被指定为Gm同种异型(1976, J Immunol 117:1056-59)。
对于常见IgG1人抗体，最普遍的同种异型是G1m1 (Stickler等, 2011, Genesand Immunity 12:213-21)。然而，G1m3同种异型也经常存在于白种人中(同前)。已报道G1m1抗体含有在向非G1m1 (nG1m1)接受者诸如G1m3患者施用时倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(同前)。非G1m1同种异型抗体在向G1m1患者施用时并非同样具有免疫原性(同前)。
人G1m1同种异型在重链IgG1的CH3序列中包含以下氨基酸：在Kabat位置356处的天冬氨酸和在Kabat位置358处的亮氨酸。nG1m1同种异型包含以下氨基酸：在Kabat位置356处的谷氨酸和在Kabat位置358处的甲硫氨酸。G1m1同种异型与nG1m1同种异型两者均在Kabat位置357处包含谷氨酸残基，并且同种异型有时被称为DEL和EEM同种异型。关于示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO:85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO:86)来显示G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的一非限制性实例。
利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO:85)
Figure DEST_PATH_IMAGE015
维妥珠单抗重链可变区 (SEQ ID NO:86
Figure 825696DEST_PATH_IMAGE016
Jefferis和Lefranc(2009, mAbs 1:1-7)综述为IgG同种异型所特有的序列变化以及它们对免疫原性的影响。他们报道G1m3同种异型的特征在于相较于G1m17同种异型中在Kabat 214处的赖氨酸残基，在Kabat位置214处具有精氨酸残基。nG1m1,2同种异型的特征在于具有在Kabat位置356处的谷氨酸、在Kabat位置358处的甲硫氨酸和在Kabat位置431处的丙氨酸。G1m1,2同种异型的特征在于具有在Kabat位置356处的天冬氨酸、在Kabat位置358处的亮氨酸和在Kabat位置431处的甘氨酸。除重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报道κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中Km1同种异型的特征在于具有在Kabat位置153处的缬氨酸和在Kabat位置191处的亮氨酸，Km1,2同种异型的特征在于具有在Kabat位置153处的丙氨酸和在Kabat位置191处的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于具有在Kabat位置153处的丙氨酸和在Kabat位置191处的缬氨酸。
关于治疗性抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是针对CD20的人源化和嵌合IgG1抗体，其适用于广泛多种血液学恶性肿瘤的疗法。表6比较利妥昔单抗相对于维妥珠单抗的同种异型序列。如表6中所示，利妥昔单抗(G1m17,1)是一种DEL同种异型IgG1，相对于维妥珠单抗中的精氨酸，在利妥昔单抗中在Kabat位置214 (重链CH1)处具有额外赖氨酸序列变化。已报道维妥珠单抗在受试者中的免疫原性小于利妥昔单抗(参见例如Morchhauser等,2009, J Clin Oncol 27:3346-53；Goldenberg等, 2009, Blood 113:1062-70；Robak和Robak, 2011, BioDrugs 25:13-25)，这是一种已归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异的效应。然而，EEM同种异型与DEL同种异型之间的同种异型差异可能也解释维妥珠单抗的较低免疫原性。
表6. 利妥昔单抗的同种异型相对于维妥珠单抗的同种异型
Figure DEST_PATH_IMAGE017
为降低治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，可合乎需要的是选择抗体的同种异型以对应于特征在于在Kabat 214处具有精氨酸的G1m3同种异型和特征在于具有在Kabat位置356处的谷氨酸、在Kabat位置358处的甲硫氨酸和在Kabat位置431处的丙氨酸的nG1m1,2无效同种异型。惊人的是发现历经长久时期重复皮下施用G1m3抗体不导致显著免疫应答。在替代性实施方案中，人IgG4重链与G1m3同种异型同样具有在Kabat 214处的精氨酸、在Kabat 356处的谷氨酸、在Kabat 359处的甲硫氨酸和在Kabat 431处的丙氨酸。因为免疫原性似乎至少部分地与在那些位置处的残基相关，所以将人IgG4重链恒定区序列用于治疗性抗体也是一优选实施方案。G1m3 IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可适用于治疗性施用。
氨基酸取代
在替代性实施方案中，公开的方法和组合物可涉及产生和使用具有一个或多个取代的氨基酸残基的蛋白质或肽。举例来说，用于制备DNL®构建体的DDD和/或AD序列可如上所讨论加以修改。
熟练技术人员将了解，一般来说，氨基酸取代通常涉及用具有相对类似性质的另一氨基酸替换某一氨基酸(即保守性氨基酸取代)。各种氨基酸的性质以及氨基酸取代对蛋白质结构和功能的影响已成为广泛研究的主题和本领域中的知识。
举例来说，可考虑氨基酸的亲疏水性指数(Kyte和Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132)。氨基酸的相对亲疏水性特性促成所得蛋白质的二级结构，其转而限定蛋白质与其它分子的相互作用。各氨基酸已基于它的疏水性和电荷特征被指定亲疏水性指数(Kyte和Doolittle, 1982)，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在进行保守性取代时，使用亲疏水性指数在±2内的氨基酸是优选的，在±1内是更优选的，并且在±0.5内是甚至更优选的。
氨基酸取代也可考虑氨基酸残基的亲水性(例如美国专利号4,554,101)。已对氨基酸残基指定亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5 .+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。用具有类似亲水性的其它氨基酸替换氨基酸是优选的。
其它考虑事项包括氨基酸侧链的大小。举例来说，将通常不是优选的是用具有松散侧链的氨基酸(例如色氨酸或酪氨酸)替换具有紧实侧链的氨基酸(诸如甘氨酸或丝氨酸)。各种氨基酸残基对蛋白质二级结构的影响也是一个考虑事项。通过经验研究，不同氨基酸残基对蛋白质结构域采用α螺旋、β折叠或转角二级结构的倾向的影响已被确定，并且在本领域中是已知的(参见例如Chou和Fasman, 1974, Biochemistry, 13:222-245；1978,Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276；1979, Biophys. J., 26:367-384)。
基于所述考虑事项和广泛经验研究，保守性氨基酸取代表已被构建，并且在本领域中是已知的。举例来说：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。或者：Ala (A) leu、ile、val；Arg (R) gln、asn、lys；Asn (N) his、asp、lys、arg、gln；Asp (D) asn、glu；Cys (C) ala、ser；Gln (Q)glu、asn；Glu (E) gln、asp；Gly (G) ala；His (H) asn、gln、lys、arg；Ile (I) val、met、ala、phe、leu；Leu (L) val、met、ala、phe、ile；Lys (K) gln、asn、arg；Met (M) phe、ile、leu；Phe (F) leu、val、ile、ala、tyr；Pro (P) ala；Ser (S)、thr；Thr (T) ser；Trp (W)phe、tyr；Tyr (Y) trp、phe、thr、ser；Val (V) ile、leu、met、phe、ala。
关于氨基酸取代的其它考虑事项包括残基是位于蛋白质的内部中或是暴露于溶剂的。对于内部残基，保守性取代将包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见例如在rockefeller.edu的PROWL网站)对于暴露于溶剂的残基，保守性取代将包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同前)。已构建各种矩阵来辅助选择氨基酸取代，诸如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同前)。
在确定氨基酸取代时，也可考虑分子间或分子内键的存在性，诸如在带正电荷残基(例如His、Arg、Lys)与带负电荷残基(例如Asp、Glu)之间形成离子键（盐桥）或在邻近半胱氨酸残基之间形成二硫键。
用任何氨基酸取代编码的蛋白质序列中的任何其它氨基酸的方法对于熟练技术人员是熟知的，并且是常规实验事项，例如通过定点诱变技术或通过合成和装配编码氨基酸取代的寡核苷酸以及剪接至表达载体构建体中。
高亲合性多聚体
在某些实施方案中，本文所述的结合部分可包含一个或多个高亲合性多聚体(avimer)序列。高亲合性多聚体是一类在它们对各种靶标分子的亲和力和特异性方面有点类似于抗体的结合蛋白。它们通过体外外显子改组和噬菌体展示来从人细胞外受体结构域产生。(Silverman等, 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-94；Silverman等, 2006, Nat. Biotechnol. 24:220)。所得多结构域蛋白质可包含多个独立结合结构域，其相较于单一表位结合蛋白可展现改善的亲和力(在一些情况下处于低于纳摩尔)和特异性。(同前)。在各种实施方案中，可使高亲合性多聚体连接于例如DDD和/或AD序列以用于所要求保护的方法和组合物中。涉及构建和使用高亲合性多聚体的方法的额外细节例如公开于美国专利申请公布号20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384中，所述美国专利申请公布各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
噬菌体展示
所要求保护的组合物和/或方法的某些实施方案可涉及各种靶标分子、细胞或组织的结合肽和/或肽模拟物。结合肽可通过本领域中已知的任何方法来鉴定，包括但不限于噬菌体展示技术。各种噬菌体展示方法和用于产生不同群体的肽的技术在本领域中是熟知的。举例来说，美国专利号5,223,409；5,622,699和6,068,829公开用于制备噬菌体文库的方法。噬菌体展示技术涉及遗传操作噬菌体以使小肽可在它们的表面上表达(Smith和Scott, 1985, Science 228:1315-1317；Smith和Scott, 1993, Meth. Enzymol. 21:228-257)。除肽之外，较大蛋白质结构域诸如单链抗体也可展示在噬菌体粒子的表面上(Arap等, 1998, Science 279:377-380)。
可通过淘选来分离对给定器官、组织、细胞类型或靶标分子具有选择性的靶向氨基酸序列(Pasqualini和Ruoslahti, 1996, Nature 380:364-366；Pasqualini, 1999,The Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162)。简要来说，向完整生物体或向分离的器官、组织、细胞类型或靶标分子施用含有推定靶向肽的噬菌体的文库，并且收集含有结合的噬菌体的样品。结合靶标的噬菌体可从靶标器官、组织、细胞类型或靶标分子洗脱，接着通过使它们在宿主细菌中生长来扩增。
在某些实施方案中，可在各轮淘选之间使噬菌体在宿主细菌中增殖。并非由噬菌体所溶解，细菌可改为分泌多个拷贝的展示特定插入物的噬菌体。必要时，可使扩增的噬菌体再次暴露于靶标器官、组织、细胞类型或靶标分子，并且收集以进行额外各轮淘选。可进行多轮淘选直至获得选择性或特异性结合剂的群体。肽的氨基酸序列可通过对与噬菌体基因组中的靶向肽插入物对应的DNA测序来确定。鉴定的靶向肽可接着通过标准蛋白质化学技术以合成肽形式产生(Arap等, 1998，Smith等, 1985)。
在一些实施方案中，减除方案(subtraction protocol)可用于进一步降低背景噬菌体结合。减除的目的在于从文库移除结合除目标靶标以外的靶标的噬菌体。在替代性实施方案中，可针对对照细胞、组织或器官对噬菌体文库进行预筛选。举例来说，可在针对对照正常细胞系预筛选文库之后鉴定肿瘤结合肽。在减除之后，可针对目标分子、细胞、组织或器官筛选文库。减除方案的其它方法是已知的，并且可用于实施所要求保护的方法，例如如美国专利号5,840,841、5,705,610、5,670,312和5,492,807中所公开。
适体
在某些实施方案中，适用的靶向部分可为适体。构建适体以及测定适体的结合特征的方法在本领域中是熟知的。举例来说，所述技术描述于美国专利号5,582,981、5,595,877和5,637,459中，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。用于制备和筛选结合特定目标靶标的适体的方法是熟知的，例如美国专利号5,475,096和美国专利号5,270,163，各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
适体可通过任何已知方法，包括合成、重组和纯化方法来制备，并且可单独或与对相同靶标具有特异性的其它配体组合使用。一般来说，实现特异性结合需要最少约3个核苷酸，优选至少5个核苷酸。具有短于10个碱基的序列的适体可为可行的，但具有10、20、30或40个核苷酸的适体可为优选的。
适体可如同常规DNA或RNA分子一样加以分离，测序和/或扩增或合成。或者，目标适体可包括经修饰的寡聚物。通常存在于适体中的任何羟基都可用膦酸酯基团、磷酸酯基团替换，由标准保护基保护，或经活化以制备与其它核苷酸的额外键联，或可缀合于固体载体。一个或多个磷酸二酯键可用替代性连接基团替换，诸如P(O)O用P(O)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2替换，其中R是H或烷基(1-20C)，并且R'是烷基(1-20C)；此外，可使这个基团通过O或S连接于邻近核苷酸。寡聚物中并非所有键联都需要是相同的。
亲和体和Fynomer
某些替代性实施方案可利用亲和体代替抗体。亲和体可从Affibody AB (Solna,Sweden)商购获得。亲和体是充当抗体模拟物，并且适用于结合靶标分子的小蛋白质。亲和体通过在α螺旋蛋白质骨架上进行组合工程改造来产生(Nord等, 1995, Protein Eng 8:601-8；Nord等, 1997, Nat Biotechnol 15:772-77)。亲和体设计基于包含蛋白A的IgG结合结构域的三螺旋束结构(Nord等, 1995；1997)。具有广泛范围的结合亲和力的亲和体可通过使细菌蛋白A的Fc结合活性中涉及的13个氨基酸随机化来产生(Nord等, 1995；1997)。在随机化之后，将PCR扩增的文库克隆至噬菌粒载体中以通过噬菌体展示突变蛋白质来进行筛选。可使用标准噬菌体展示筛选技术(例如Pasqualini和Ruoslahti, 1996, Nature380:364-366；Pasqualini, 1999, Quart. J. Nucl. Med. 43:159-162)针对任何已知抗原筛选噬菌体展示文库，以鉴定一种或多种针对靶标抗原的亲和体。
对HER2/neu具有特异性的经177Lu标记的亲和体已被证明在体内靶向表达HER2的异种移植物(Tolmachev等, 2007, Cancer Res 67:2773-82)。尽管归因于低分子量放射性标记化合物的积累的肾毒性最初是问题，但可逆结合于白蛋白使肾积累降低，从而使得能够实现用经标记亲和体进行的基于放射性核素的疗法(同前)。
近来已证明使用放射性标记亲和体进行体内肿瘤成像的可行性(Tolmachev等,2011, Bioconjugate Chem 22:894-902)。使顺丁烯二酰亚胺衍生化NOTA缀合于抗HER2亲和体，并且用111In进行放射性标记(同前)。向携带表达HER2的DU-145异种移植物的小鼠进行施用，随后进行γ照相机成像，允许对异种移植物显影(同前)。
Fynomer也可以与抗体类似的亲和力和特异性结合靶标抗原。Fynomer基于人FynSH3结构域作为用于装配结合分子的骨架。Fyn SH3结构域是可以高产率在细菌中产生的含63个氨基酸的完全人蛋白质。可使Fynomer连接在一起以产生对两种或更多种不同抗原靶标具有亲和力的多特异性结合蛋白。Fynomer可从COVAGEN AG (Zurich, Switzerland)商购获得。
熟练技术人员将认识到亲和体或fynomer可作为靶向分子用于实施所要求保护的方法和组合物。
缀合方案
优选缀合方案基于在中性或酸性pH下易于进行的硫醇-顺丁烯二酰亚胺、硫醇-乙烯基砜、硫醇-溴乙酰胺或硫醇-碘乙酰胺反应。这避免对如例如将在使用活性酯时所必需的较高pH缀合条件的需要。示例性缀合方案的其它细节在以下描述于实施例部分中。
治疗性治疗
在另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的方法，其包括优选与PARP抑制剂、微管抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂和/或PI3K抑制剂组合向受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗体或免疫缀合物。可用本文所述的抗体或免疫缀合物治疗的疾病包括但不限于B细胞恶性肿瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病)，使用例如抗CD22抗体诸如hLL2 MAb (依帕珠单抗，参见美国专利号6,183,744)、针对另一CD22表位的抗CD22抗体(hRFB4)，或针对其它B细胞抗原诸如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD37、CD40、CD40L、CD52、CD74、CD80或HLA-DR的抗体。其它疾病包括但不限于内胚层源性消化系统上皮的腺癌、癌症诸如乳腺癌和非小细胞肺癌、以及其它癌瘤、肉瘤、神经胶质肿瘤、骨髓性白血病等。特定来说，有利地使用针对由恶性实体肿瘤或造血性赘瘤产生或与其相关的抗原例如癌胚抗原的抗体，所述恶性实体肿瘤或造血性赘瘤例如胃肠肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤、食道肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、肝肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、睾丸肿瘤、脑肿瘤、骨肿瘤或淋巴肿瘤、肉瘤或黑素瘤。视疾病状态和缀合物的耐受性而定，所述治疗剂可一次或重复给予，并且也可任选与其它治疗形式诸如手术、外部放射、放射免疫疗法、免疫疗法、化学疗法、反义疗法、干扰RNA疗法、基因疗法等组合使用。各组合将适合于肿瘤类型、阶段、患者状况和先前疗法以及由管理医师所考虑的其它因素。
如本文所用，术语“受试者”是指包括但不限于哺乳动物(包括人)的任何动物(即脊椎动物和无脊椎动物)。不意图所述术语限于特定年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿无论雄性或雌性都由所述术语涵盖。本文给出的剂量是针对人，但可根据重量或平方米尺寸，关于其它哺乳动物的身材以及儿童加以调整。当向人受试者施用抗体或免疫缀合物时，普通技术人员将认识到所述抗体或免疫缀合物结合的靶标抗原将是人抗原。
在一优选实施方案中，包括抗EGP-1 (抗Trop-2)抗体诸如hRS7 Mab的抗体或免疫缀合物可用于治疗癌瘤，诸如食道癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌和直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌和前列腺癌，如美国专利号7,238,785；7,517,964和8,084,583中所公开，所述美国专利的实施例部分以引用的方式并入本文。hRS7抗体是包含轻链互补决定区(CDR)序列CDR1 (KASQDVSIAVA，SEQ ID NO:90)；CDR2 (SASYRYT，SEQ ID NO:91)；和CDR3 (QQHYITPLT，SEQ ID NO:92)以及重链CDR序列CDR1 (NYGMN，SEQ ID NO:93)；CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQ ID NO:94)和CDR3 (GGFGSSYWYFDV，SEQ ID NO:95)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗CEACAM5抗体(例如hMN-14，拉贝珠单抗)和/或抗CEACAM6抗体(例如hMN-3或hMN-15)的抗体或免疫缀合物可用于治疗表达CEACAM5和/或CEACAM6的多种癌症中的任一者，如美国专利号7,541,440；7,951,369；5,874,540；6,676,924和8,267,865中所公开，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。可使用抗CEACAM5、抗CEACAM6或两者的组合治疗的实体肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、口腔癌和胃癌。包括胃肠癌、呼吸道癌、泌尿道癌和乳腺癌的大多数癌瘤表达CEACAM5，并且可用主题抗体或免疫缀合物治疗。hMN-14抗体是包含轻链可变区CDR序列CDR1 (KASQDVGTSVA；SEQ ID NO:96)、CDR2(WTSTRHT；SEQ ID NO:97)和CDR3(QQYSLYRS；SEQ ID NO:98)以及重链可变区CDR序列CDR1(TYWMS；SEQ ID NO:99)、CDR2 (EIHPDSSTINYAPSLKD；SEQ ID NO:100)和CDR3(LYFGFPWFAY；SEQ ID NO:101)的人源化抗体。hMN-3抗体是包含轻链可变区CDR序列CDR1(RSSQSIVHSNGNTYLE，SEQ ID NO:102)、CDR2 (KVSNRFS，SEQ ID NO:103)和CDR3(FQGSHVPPT，SEQ ID NO:104)以及重链CDR序列CDR1 (NYGMN，SEQ ID NO:105)、CDR2(WINTYTGEPTYADDFKG，SEQ ID NO:106)和CDR3 (KGWMDFNSSLDY，SEQ ID NO:107)的人源化抗体。hMN-15抗体是包含轻链可变区CDR序列SASSRVSYIH (SEQ ID NO:108)；GTSTLAS (SEQID NO:109)；和QQWSYNPPT (SEQ ID NO:110)；以及重链可变区CDR序列DYYMS (SEQ ID NO:111)；FIANKANGHTTDYSPSVKG (SEQ ID NO:112)；和DMGIRWNFDV (SEQ ID NO:113)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗CD74抗体(例如hLL1，米拉珠单抗，公开于美国专利号7,074,403；7,312,318；7,772,373；7,919,087和7,931,903中，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文)的抗体或免疫缀合物可用于治疗表达CD74的多种癌症中的任一者，所述多种癌症包括但不限于肾癌、肺癌、肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌或卵巢癌，以及若干血液学癌症，诸如多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。hLL1抗体是包含轻链CDR序列CDR1(RSSQSLVHRNGNTYLH；SEQ ID NO:114)、CDR2 (TVSNRFS；SEQ ID NO:115)和CDR3(SQSSHVPPT；SEQ ID NO:116)以及重链可变区CDR序列CDR1 (NYGVN；SEQ ID NO:117)、CDR2(WINPNTGEPTFDDDFKG；SEQ ID NO:118)和CDR3(SRGKNEAWFAY；SEQ ID NO:119)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗CD22抗体(例如hLL2，依帕珠单抗，公开于美国专利号5,789,554；6,183,744；6,187,287；6,306,393；7,074,403和7,641,901中，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文，或嵌合或人源化RFB4抗体)的抗体或免疫缀合物可用于治疗表达CD22的多种癌症中的任一者，所述多种癌症包括但不限于无痛性形式的B细胞淋巴瘤、侵袭性形式的B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或弥漫性B细胞淋巴瘤。hLL2抗体是包含轻链CDR序列CDR1 (KSSQSVLYSANHKYLA，SEQ ID NO:120)、CDR2(WASTRES，SEQ ID NO:121)和CDR3 (HQYLSSWTF，SEQ ID NO:122)以及重链CDR序列CDR1(SYWLH，SEQ ID NO:123)、CDR2 (YINPRNDYTEYNQNFKD，SEQ ID NO:124)和CDR3 (RDITTFY，SEQ ID NO:125)的人源化抗体。
在一优选实施方案中，包括抗CSAp抗体诸如hMu-9 MAb的抗体或免疫缀合物可用于治疗结肠直肠癌以及胰腺癌和卵巢癌，如美国专利号6,962,702；7,387,772；7,414,121；7,553,953；7,641,891和7,670,804中所公开，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。此外，包括hPAM4 MAb的抗体或免疫缀合物可用于治疗胰腺癌或其它实体肿瘤，如美国专利号7,238,786和7,282,567中所公开，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。hMu-9抗体是包含轻链CDR序列CDR1 (RSSQSIVHSNGNTYLE，SEQ ID NO:126)、CDR2 (KVSNRFS，SEQ ID NO:127)和CDR3 (FQGSRVPYT，SEQ ID NO:128)以及重链可变CDR序列CDR1 (EYVIT，SEQ ID NO:129)、CDR2 (EIYPGSGSTSYNEKFK，SEQ ID NO:130)和CDR3(EDL，SEQ ID NO:131)的人源化抗体。hPAM4抗体是包含轻链可变区CDR序列CDR1(SASSSVSSSYLY，SEQ ID NO:132)；CDR2 (STSNLAS，SEQ ID NO:133)；和CDR3 (HQWNRYPYT，SEQ ID NO:134)；以及重链CDR序列CDR1 (SYVLH，SEQ ID NO:135)；CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG，SEQ ID NO:136)和CDR3 (GFGGSYGFAY，SEQ ID NO:137)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗α胎蛋白(AFP) MAb诸如IMMU31的抗体或免疫缀合物可用于使用人源化、嵌合和人抗体形式治疗肝细胞癌、生殖细胞肿瘤和其它产生AFP的肿瘤，如美国专利号7,300,655中所公开，所述美国专利的实施例部分以引用的方式并入本文。IMMU31抗体是包含重链CDR序列CDR1 (SYVIH，SEQ ID NO:138)、CDR2(YIHPYNGGTKYNEKFKG，SEQ ID NO:139)和CDR3 (SGGGDPFAY，SEQ ID NO:140)以及轻链CDR1(KASQDINKYIG，SEQ ID NO:141)、CDR2 (YTSALLP，SEQ ID NO:142)和CDR3 (LQYDDLWT，SEQID NO:143)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗HLA-DR MAb诸如hL243 (IMMU-114)的抗体或免疫缀合物可用于治疗淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、皮肤癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、睾丸癌、肾癌、肝癌、黑素瘤或其它产生HLA-DR的肿瘤，如美国专利号7,612,180中所公开，所述美国专利的实施例部分以引用的方式并入本文。hL243抗体是包含重链CDR序列CDR1 (NYGMN，SEQ ID NO:144)、CDR2 (WINTYTREPTYADDFKG，SEQ ID NO:145)和CDR3 (DITAVVPTGFDY，SEQ ID NO:146)以及轻链CDR序列CDR1 (RASENIYSNLA，SEQ ID NO:147)、CDR2 (AASNLAD，SEQ ID NO:148)和CDR3 (QHFWTTPWA，SEQ ID NO:149)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗CD20 MAb诸如维妥珠单抗(hA20)、1F5、奥滨尤妥珠单抗(GA101)或利妥昔单抗的抗体或免疫缀合物可用于治疗淋巴瘤、白血病、免疫血小板减少性紫癜、全身性红斑狼疮、休格连氏综合征、埃文斯综合征(Evans syndrome)、关节炎、动脉炎、寻常天疱疮、肾移植物排斥、心脏移植物排斥、类风湿性关节炎、伯基特淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、弥漫性B细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、I型糖尿病、GVHD或多发性硬化症，如美国专利号7,435,803或8,287,864中所公开，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。hA20 (维妥珠单抗)抗体是包含轻链CDR序列CDRL1 (RASSSVSYIH，SEQ ID NO:150)、CDRL2 (ATSNLAS，SEQ ID NO:151)和CDRL3 (QQWTSNPPT，SEQ ID NO:152)以及重链CDR序列CDRH1 (SYNMH，SEQ ID NO:153)、CDRH2 (AIYPGNGDTSYNQKFKG，SEQ ID NO:154)和CDRH3 (STYYGGDWYFDV，SEQ ID NO:155)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗抗CD19 MAb诸如hA19的抗体或免疫缀合物可用于治疗B细胞相关的淋巴瘤和白血病，诸如非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病或急性淋巴母细胞性白血病。可治疗的其它疾病状态包括自体免疫疾病，诸如急性或慢性免疫血小板减少症、皮肤肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺克-舍恩来因紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、类肉瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病变、多发性结节性动脉炎、僵直性脊椎炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、休格连氏综合征、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病变、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎，如美国专利号7,109,304、7,462,352、7,902,338、8,147,831和8,337,840中所公开，所述美国专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。hA19抗体是包含轻链CDR序列CDR1 KASQSVDYDGDSYLN (SEQ ID NO: 156)；CDR2DASNLVS (SEQ ID NO: 157)；和CDR3 QQSTEDPWT (SEQ ID NO: 158)以及重链CDR序列CDR1SYWMN (SEQ ID NO: 159)；CDR2 QIWPGDGDTNYNGKFKG (SEQ ID NO: 160)和CDR3RETTTVGRYYYAMDY (SEQ ID NO: 161)的人源化抗体。
在另一优选实施方案中，包括抗腱生蛋白抗体的抗体或免疫缀合物可用于治疗造血性肿瘤和实体肿瘤，并且包含针对腱生蛋白的抗体的缀合物可用于治疗实体肿瘤，优选是脑癌，如胶质母细胞瘤。
在一优选实施方案中，用于治疗人疾病的抗体是人或人源化(CDR移植)形式的抗体，但可使用鼠形式和嵌合形式的抗体。相同物种IgG分子作为递送剂通常优选使免疫应答最小化。这在考虑重复治疗时特别重要。对于人，人或人源化IgG抗体产生来自患者的抗IgG免疫应答的可能性较小。诸如hLL1和hLL2的抗体在结合靶标细胞上的内化抗原之后快速内化，此意味着所携带的药物也快速内化至细胞中。然而，具有较慢内化速率的抗体也可用于实现选择性疗法。
在另一优选实施方案中，抗体或免疫缀合物可用于治疗自体免疫疾病或免疫系统功能异常(例如移植物抗宿主疾病、器官移植排斥)。适用于治疗自体免疫/免疫功能异常疾病的抗体可结合包括但不限于以下的示例性抗原：BCL-1、BCL-2、BCL-6、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD41a、CD43、CD45、CD55、CD56、CCD57、CD59、CD64、CD71、CD74、CD79a、CD79b、CD117、CD138、FMC-7和HLA-DR。结合这些和以上讨论的其它靶标抗原的抗体可用于治疗自体免疫或免疫功能异常疾病。可用抗体或免疫缀合物治疗的自体免疫疾病可包括急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肤肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺克-舍恩来因紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、ANCA相关的血管炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、类肉瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病变、多发性结节性动脉炎、僵直性脊椎炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、休格连氏综合征、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多软骨炎、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病变、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
在另一优选实施方案中，与本发明的免疫缀合物组合使用的治疗剂可包括一种或多种同位素。适用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、227Th和211Pb。治疗性放射性核素优选具有在20至6,000 keV的范围内的衰变能量，优选对于俄歇发射体在60至200 keV的范围内，对于β发射体在100-2,500 keV的范围内，并且对于α发射体在4,000-6,000 keV的范围内。适用β粒子发射核素的最大衰变能量优选是20-5,000 keV，更优选是100-4,000 keV，并且最优选是500-2,500 keV。也优选的是大致上随着俄歇发射粒子而衰变的放射性核素。例如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。适用β粒子发射核素的衰变能量优选是<1,000 keV，更优选是<100 keV，并且最优选是<70 keV。也优选的是大致上随着α粒子的产生而衰变的放射性核素。所述放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227和Fm-255。适用α粒子发射放射性核素的衰变能量优选是2,000-10,000 keV，更优选是3,000-8,000 keV，并且最优选是4,000-7,000 keV。适用的额外潜在放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。
放射性核素和其它金属可例如使用连接于抗体或免疫缀合物的螯合基团来递送。大环螯合物诸如NOTA、DOTA和TETA适于与多种金属和放射性金属一起，最特定来说分别与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。可通过使环尺寸适合于目标金属来使所述金属-螯合物络合物极其稳定。可使用其它环型螯合物，诸如用于络合223Ra的大环聚醚。
与本文所述的抗体或免疫缀合物组合使用的治疗剂也包括例如化学治疗药物，诸如长春花生物碱、蒽环霉素、表鬼臼毒素、紫杉烷、抗代谢剂、酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂、微管抑制剂、PARP抑制剂、PI3K抑制剂、烷基化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促凋亡剂，特别是多柔比星、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇、其它喜树碱以及来自这些和其它抗癌剂类别的其它药物等。其它癌症化学治疗药物包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。适合化学治疗剂描述于REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第19版(Mack Publishing Co. 1995)和GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS, 第7版 (MacMillan Publishing Co. 1985)以及这些出版物的修订版中。其它适合化学治疗剂诸如实验药物为本领域技术人员所知。
适用的示例性药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿法替尼(afatinib)、aplidin、阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽环霉素(anthracycline)、阿西替尼(axitinib)、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀(bendamustine)、博莱霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、博舒替尼(bosutinib)、苔藓抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、刺孢霉素(calicheamycin)、喜树碱、卡铂(carboplatin)、10-羟基喜树碱、卡莫司汀(carmustine)、西乐葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、坎托替康(camptothecan)、克唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、达沙替尼(dasatinib)、迪那昔利布(dinaciclib)、多西他赛(docetaxel)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星(2PDOX)、pro-2PDOX、氰基-吗啉代多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷(doxorubicin glucuronide)、表柔比星葡萄糖醛酸苷(epirubicin glucuronide)、埃罗替尼(erlotinib)、雌氮芥(estramustine)、表鬼臼毒素(epidophyllotoxin)、埃罗替尼、恩替司他(entinostat)、雌激素受体结合剂、依托泊苷(etoposide) (VP16)、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、依西美坦(exemestane)、芬戈莫德(fingolimod)、氟尿苷(floxuridine) (FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺(flutamide)、法呢基(farnesyl)-蛋白质转移酶抑制剂、黄酮吡醇(flavopiridol)、福他替尼(fostamatinib)、ganetespib、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、依鲁替尼(ibrutinib)、伊达比星(idarubicin)、艾代拉里斯(idelalisib)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼(lapatinib)、来那度胺(lenolidamide)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、LFM-A13、洛莫司汀(lomustine)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、诺维本(navelbine)、来那替尼(neratinib)、尼罗替尼(nilotinib)、亚硝基脲(nitrosurea)、奥拉帕尼(olaparib)、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇、PCI-32765、喷司他汀(pentostatin)、PSI-341、雷洛昔芬(raloxifene)、司莫司汀(semustine)、索拉非尼(sorafenib)、链脲霉素(streptozocin)、SU11248、舒尼替尼(sunitinib)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temazolomide，DTIC的水溶液形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康(topotecan)、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼(vatalanib)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春花生物碱和ZD1839。所述药剂可为本文所述的缀合物的一部分，或可或者在缀合物之前，与缀合物同时，或在缀合物之后与所述缀合物组合施用。或者，一种或多种如本领域中已知的治疗性裸抗体可与所述缀合物组合使用。以上描述示例性治疗性裸抗体。
在优选实施方案中，待与DNA断裂性抗体缀合物(例如SN-38-ADC)组合使用的治疗剂是微管抑制剂，诸如长春花生物碱、紫杉烷、类美登素或澳瑞他汀。示例性已知微管抑制剂包括紫杉醇、长春新碱、长春花碱、美坦辛、埃博霉素、多西他赛、圆皮海绵内酯、康普瑞汀、鬼臼毒素、CI-980、苯基阿夕斯丁、斯的甘辛、curacin、2-甲氧基雌二醇、E7010、甲氧基苯磺酰胺、长春瑞滨、长春氟宁、长春地辛、多拉司他汀、海绵抑制素、根霉素、泰丝多汀、大田软海绵素、哈米特林、念珠藻素52、MMAE和甲磺酸艾日布林。
在一替代性优选实施方案中，待与DNA断裂性ADC诸如SN-38-抗体缀合物组合使用的治疗剂是PARP抑制剂，诸如奥拉帕尼、talazoparib (BMN-673)、瑞卡帕尼、维利帕尼、CEP9722、MK 4827、BGB-290、ABT-888、AG014699、BSI-201、CEP-8983或3-氨基苯甲酰胺。
在另一替代方案中，与抗体或免疫缀合物组合使用的治疗剂是布鲁顿激酶抑制剂，诸如依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、CC-292 (AVL-292)、ONO-4059、GDC-0834、LFM-A13或RN486。
在另一替代方案中，与抗体或免疫缀合物组合使用的治疗剂是PI3K抑制剂，诸如艾代拉里斯、渥曼青霉素、脱甲绿胶酶素、哌立福辛、PX-866、IPI-145 (duvelisib)、BAY80-6946、BEZ235、RP6530、TGR1202、SF1126、INK1117、GDC-0941、BKM120、XL147、XL765、帕洛米德529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、PI-103、GNE477、CUDC-907、AEZS-136或LY294002。
可与抗体或免疫缀合物协力使用的治疗剂也可包括缀合于靶向部分的毒素。可就此而言加以使用的毒素包括篦麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A(Staphylococcal enterotoxin)、商陆抗病毒蛋白、白树毒素(gelonin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)和假单胞菌内毒素。(参见例如Pastan.等, Cell (1986), 47:641，以及Sharkey和Goldenberg,CA Cancer J Clin. 2006年7月-8月;56(4):226-43)。适于在本文中使用的额外毒素为本领域技术人员所知，并且公开于U.S. 6,077,499中。
另一类别的治疗剂可包括一种或多种免疫调节剂。适用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红血球生成素、血小板生成素及其组合。明确适用的是淋巴毒素(诸如肿瘤坏死因子(TNF))、造血因子(诸如白介素(IL))、集落刺激因子(诸如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(诸如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ或干扰素-λ)和干细胞生长因子(诸如指定为“S1因子”的干细胞生长因子)。包括在细胞因子之中的是生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和促黄体生成激素(luteinizing hormone，LH)；肝生长因子；前列腺素、纤维母细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；红血球生成素(EPO)；骨诱导性因子；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF (M-CSF)；白介素(IL) (诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25)、LIF、kit配体或FLT-3、血管抑素(angiostatin)、血栓反应素(thrombospondin)、内皮抑素(endostatin)、肿瘤坏死因子和淋巴毒素(LT)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
适用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
普通技术人员将认识到主题抗体或免疫缀合物可单独或与一种或多种其它治疗剂组合使用，所述治疗剂诸如第二抗体、第二抗体片段、第二免疫缀合物、放射性核素、毒素、药物、化学治疗剂、放射疗法、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂、酶、激素、寡核苷酸、RNAi或siRNA。优选地，治疗剂是PARP抑制剂、微管抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或PI3K抑制剂。示例性已知PARP抑制剂包括奥拉帕尼、talazoparib (BMN-673)、瑞卡帕尼、维利帕尼、CEP 9722、MK 4827、BGB-290、ABT-888、AG014699、BSI-201、CEP-8983或3-氨基苯甲酰胺。示例性已知微管抑制剂包括但不限于长春花生物碱、紫杉烷、类美登素、澳瑞他汀、紫杉醇、长春新碱、长春花碱、美坦辛、埃博霉素、多西他赛、圆皮海绵内酯、康普瑞汀、鬼臼毒素、CI-980、苯基阿夕斯丁、斯的甘辛、curacin、2-甲氧基雌二醇、E7010、甲氧基苯磺酰胺、长春瑞滨、长春氟宁、长春地辛、多拉司他汀、海绵抑制素、根霉素、泰丝多汀、大田软海绵素、哈米特林、念珠藻素52、MMAE和甲磺酸艾日布林。示例性布鲁顿激酶抑制剂包括依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、CC-292 (AVL-292)、ONO-4059、GDC-0834、LFM-A13或RN486。示例性PI3K抑制剂包括艾代拉里斯、渥曼青霉素、脱甲绿胶酶素、哌立福辛、PX-866、IPI-145(duvelisib)、BAY 80-6946、BEZ235、RP6530、TGR1202、SF1126、INK1117、GDC-0941、BKM120、XL147、XL765、帕洛米德529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、PI-103、GNE477、CUDC-907、AEZS-136或LY294002。所述额外治疗剂可分开施用，与主题抗体或免疫缀合物组合施用，或连接于主题抗体或免疫缀合物加以施用。
配制和施用
抗体、免疫缀合物和/或药物的适合施用途径包括不限于胃肠外、皮下、经直肠、经粘膜、经肠施用、肌肉内、髓内、鞘内、直接室内、静脉内、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射。优选施用途径是胃肠外。或者，可以局部而非全身性方式，例如通过直接向实体肿瘤中注射化合物来施用化合物。某些药物诸如微管抑制剂、PARP抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂或PI3K抑制剂可被设计来口服施用。
抗体或免疫缀合物可根据用以制备药学上适用的组合物的已知方法配制，借此抗体或免疫缀合物与药学上适合的赋形剂一起组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一个实例。其它适合的赋形剂为本领域中的人士所熟知。参见例如Ansel等, PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 第5版 (Lea &Febiger 1990)，以及Gennaro (编), REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第18版(Mack Publishing Company 1990)及其修订版。
在一优选实施方案中，使用选自由以下组成的组的缓冲剂在古德氏生物缓冲液(Good's biological buffer) (pH 6-7)中配制抗体或免疫缀合物：N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)；N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)；4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(HEPES)；2-(N-吗啉代基)乙烷磺酸(MES)；3-(N-吗啉代基)丙烷磺酸(MOPS)；3-(N-吗啉基)-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)；和哌嗪-N,N'-双(2-乙烷磺酸) [Pipes]。更优选的缓冲剂是MES或MOPS，优选在20至100 mM的浓度范围内，更优选是约25 mM。最优选是25 mM MES，pH 6.5。制剂可进一步包含25 mM海藻糖和0.01%v/v聚山梨醇酯80作为赋形剂，其中由于添加赋形剂而将最终缓冲剂浓度修改至22.25 mM。优选储存方法是以缀合物的冻干制剂形式储存在-20℃至2℃的温度范围内，其中最优选在2℃至8℃下储存。
抗体或免疫缀合物可被配制以通过例如弹丸注射、缓慢输注或连续输注来静脉内施用。优选地，历经小于约4小时的时期，并且更优选历经小于约3小时的时期输注本发明的抗体。举例来说，最初25-50 mg可在30分钟，优选甚至15分钟内输注，并且其余部分历经接下来的2-3小时输注。注射用制剂可以单位剂型呈现，例如于安瓿中或在添加防腐剂的情况下于多次剂量容器中。组合物可采用诸如于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂，诸如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可呈用于在使用之前用适合媒介物例如无菌无热原水复原的粉末形式。
额外制药方法可用于控制治疗性缀合物的作用的持续时间。可通过使用聚合物以复合或吸附免疫缀合物来制备控制释放制剂。举例来说，可生物相容聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基质和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物的基质。Sherwood等, Bio/ Technology 10: 1446 (1992)。抗体或免疫缀合物从这种基质释放的速率取决于基质内的抗体或免疫缀合物的分子量、数量以及分散粒子的尺寸。Saltzman等, Biophys. J. 55:163 (1989)；Sherwood等, 上文。其它固体剂型描述于Ansel等, PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版 (Lea和Febiger 1990)；以及Gennaro (编),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版 (Mack Publishing Company 1990)及其修订版中。
通常，对于人施用的抗体或免疫缀合物的剂量将视诸如患者的年龄、重量、身高、性别、总体医学状况和先前医学史的因素而变化。可合乎需要的是以单次静脉内输注形式向接受者提供免疫缀合物的在约1 mg/kg至24 mg/kg的范围内的剂量，但根据情况所指示，也可施用更低或更高剂量。对于70 kg患者，1-20 mg/kg的剂量例如是70-1,400 mg，或对于1.7-m 患者，是41-824 mg/m2。可根据需要重复剂量，例如每周一次持续4-10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。剂量也可以较小频率给予，诸如每隔一周，持续数月，或每月或每季度，持续多月，根据维持疗法中所需要。优选剂量可包括但不限于1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg和18 mg/kg。剂量优选施用多次，一周一次或两次，或不频繁地每3或4周一次。可使用4周，更优选8周，更优选16周或更久的最短剂量时程。施用时程可包括根据选自由以下组成的组的循环一周施用一次或两次：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)治疗一周，继之以休息二、三或四周；(iv)治疗两周，继之以休息一、二、三或四周；(v)治疗三周，继之以休息一、二、三、四或五周；(vi)治疗四周，继之以休息一、二、三、四或五周；(vii)治疗五周，继之以休息一、二、三、四或五周；(viii)每月和(ix)每3周。循环可重复2、4、6、8、10、12、16或20次或更多次。
或者，抗体或免疫缀合物可每2或3周施用作为1剂，重复总计至少3剂。或者，每周两次，持续4-6周。如果剂量降低至约200-300 mg/m2 (对于1.7-m 患者是每剂340 mg，或对于70 kg患者是4.9 mg/kg)，那么所述剂量可每周施用一次或甚至两次，持续4至10周。或者，剂量时程可降低，即每2或3周，持续2-3个月。然而，已确定可通过缓慢静脉内输注来每周一次或每2-3周一次施用甚至更高剂量诸如12 mg/kg，持续重复给药循环。给药时程可任选以其它间隔重复，并且剂量可通过各种胃肠外途径来给予，伴有对剂量和时程的适当调整。
在优选实施方案中，抗体或免疫缀合物适用于癌症的疗法。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病、骨髓瘤或淋巴性恶性肿瘤。所述癌症的更特定实例在以下加以指示，并且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、威尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、胃癌(gastric cancer/stomach cancer) (包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、分化的甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈部癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如其细胞尚未向受试者的身体中除原始恶性肿瘤或肿瘤的部位以外的部位迁移的那些)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移，即恶性细胞或肿瘤细胞向不同于原始肿瘤的部位的二级部位迁移产生的那些)。
癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：急性儿童期淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关的淋巴瘤、AIDS相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童期(原发性)肝细胞癌、儿童期(原发性)肝癌、儿童期急性淋巴母细胞性白血病、儿童期急性骨髓性白血病、儿童期脑干神经胶质瘤、儿童期小脑星形细胞瘤、儿童期大脑星形细胞瘤、儿童期颅外生殖细胞肿瘤、儿童期霍奇金氏病、儿童期霍奇金氏淋巴瘤、儿童期下丘脑和视路神经胶质瘤、儿童期淋巴母细胞性白血病、儿童期神经管母细胞瘤、儿童期非霍奇金氏淋巴瘤、儿童期松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、儿童期原发性肝癌、儿童期横纹肌肉瘤、儿童期软组织肉瘤、儿童期视路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高雪氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层肿瘤、毛细胞白血病、头颈部癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高γ球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、神经管母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐匿性原发性鳞状颈部癌、转移性原发性鳞状颈部癌、转移性鳞状颈部癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合征、骨髓源性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜力肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、类肉瘤病肉瘤、西泽里综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈部癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层肿瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenström's macroglobulinemia)、韦尔姆斯氏肿瘤，以及除赘瘤形成之外，也包括任何其它位于以上所列的器官系统中的过度增生性疾病。
本文描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前病状，以及预防进展成赘生性或恶性状态，包括但不限于上述那些病症。在病状被得知或怀疑处于向赘瘤形成或癌症进展之前的情况下指示所述用途，特定来说，其中已发生由增生、组织转化组成或最特定来说由发育不良组成的非赘生性细胞生长(对于所述异常生长状况的综述，参见Robbins和Angell, Basic Pathology, 第2版, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 第68-79页 (1976))。
发育不良经常是癌症的预兆，并且主要见于上皮中。它是非赘生性细胞生长的最混乱形式，涉及个别细胞均一性和细胞的结构定向的丧失。发育不良特征性地发生在存在慢性刺激或炎症时。可治疗的发育不良病症包括但不限于无汗性外胚层发育不良、前颜面发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、子宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨头颅发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨骨干发育不良、颅腕跖骨发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育不良、骨干发育不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑-眼发育不良、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮发育不良、面-指-生殖器发育不良、家族性颌骨纤维性发育不良、家族性白色皱褶性发育不良、纤维肌性发育不良、骨纤维性发育不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾脏-视网膜发育不良、出汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌面骨发育不良、干骺端发育不良、蒙迪尼发育不良(Mondini dysplasia)、单骨性纤维性发育不良、粘膜上皮发育不良、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼脊椎发育不良、牙源性发育不良、眼下颚发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨纤维性发育不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和室径向发育不良。
可治疗的额外赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤和食道发育不良)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen's disease)、农民皮肤病(Farmer's Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选实施方案中，本发明方法用于抑制癌的生长、进展和/或转移，所述癌特别是以上所列的那些。
额外过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于进展和/或转移的恶性肿瘤和相关病症，诸如白血病(包括急性白血病；例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病[包括髓母细胞性、前髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病]和慢性白血病(例如慢性髓细胞性[粒细胞性]白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病以及实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm'stumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经管母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突神经胶质细胞瘤、脑脊髓膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可用抗体或免疫缀合物治疗的自体免疫疾病可包括急性和慢性免疫血小板减少症、皮肤肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨诺克-舍恩来因紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、ANCA相关的血管炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、类肉瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病变、多发性结节性动脉炎、僵直性脊椎炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、休格连氏综合征、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多软骨炎、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病变、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适于治疗患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种如本文所述的抗体或免疫缀合物。试剂盒也可包括选自微管抑制剂、PARP抑制剂、布鲁顿激酶抑制剂和/或PI3K抑制剂的药物。如果供施用的含有各组分的组合物并非配制来通过消化道进行递送诸如口服递送，那么可包括能够通过某一其它途径来递送试剂盒组分的装置。用于施加(诸如胃肠外递送)的一种类型的装置是注射器，其用于将组合物注射至受试者的身体中。也可使用吸入装置。
试剂盒组件可包装在一起或分入两个或更多个容器中。在一些实施方案中，容器可为含有组合物的适于复原的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒也可含有一种或多种适于复原和/或稀释其它试剂的缓冲剂。可使用的其它容器包括但不限于囊、托盘、盒、管等。试剂盒组分可被无菌包装和维持在容器内。可包括的另一组件是供使用试剂盒来达成它的用途的人士使用的说明书。
实施例
本发明的各种实施方案通过以下实施例来说明而不限制其范围。
实施例1. 用ADC IMMU-132和微管抑制剂或PARP抑制剂进行的组合疗法
在当前临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT01631552)中，在复发/难治病例的情况下，用由伊立替康的活性代谢物SN-38缀合于抗Trop-2抗体组成的IMMU-132治疗的三阴性乳腺癌(TNBC)患者显示可管理的毒性和极其令人鼓舞的响应。
合成致死性是其中具有两个可能的基因或蛋白质缺陷中的一者的细胞可存活，而含有两个缺陷的细胞不可存活的概念。BRCA1/2突变与DNA修复缺陷相关联，并且与TNBC相关。其它修复机理涉及聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶(PARP)，其可由癌细胞用于克服BRACA1/ 2的丧失。用IMMU-132或紫杉醇处理TNBC细胞导致PARP的裂解和失活，而小分子奥拉帕尼直接抑制PARP。因此，在TNBC异种移植物的情况下探究使IMMU-132与紫杉醇或奥拉帕尼组合以有效敲除PARP活性的基本原理以确定这些组合是否将导致合成致死性。
这个研究的目的在于确定在癌症(例如裸小鼠携带TNBC异种移植物)的情况下组合诱导DNA链断裂的抗体-药物缀合物诸如萨希珠单抗戈维替康(也称为IMMU-132，即抗Trop-2 hRS7-CL2A-SN-38)与微管抑制剂(例如紫杉醇或甲磺酸艾日布林)或聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶(PARP)抑制剂(例如奥拉帕尼)是否使抗肿瘤作用改进。普通技术人员将认识到抗体-SN-38缀合物与PARP或微管抑制剂的组合的出乎意料的优越作用不限于特定示例性抗体、药物、PARP抑制剂或微管抑制剂，而是为各类针对肿瘤相关的抗原(TAA)的抗体、诱导DNA链断裂的药物、PARP抑制剂和微管抑制剂所特有。
实验程序
在一非限制性实例中，携带人TNBC (三阴性乳腺癌)异种移植物(MDA-MB-468或HCC1806；约0.3 cm3)的小鼠用最大耐受剂量的紫杉醇(每周15 mg/kg x5周)和IMMU-132(在10 mg/kg或12.5 mg/kg下，在第1、8、22和29天)治疗。携带HCC1806肿瘤(约0.28 cm3)的小鼠根据21天循环持续2周每周用IMMU-132 (12.5 mg/kg)和0.5 mg/kg的甲磺酸艾日布林(等效于1.4 mg/m2的人剂量)治疗，持续2个循环。考查PARP抑制的研究使用携带MDA-MB-468肿瘤(约0.32 cm3)的小鼠，所述小鼠用奥拉帕尼(50 mg/kg，qdx5d，x4周；33%的人剂量，相当于每日800 mg)和IMMU-132 (10 mg/kg，每周两次x4周)治疗。每日以腹膜内注射液形式施用奥拉帕尼，连续持续5天，在重复之前休息2天(qdx5)。将此进行4周。每周两次腹膜内施用IMMU-132，持续4周。对照动物接受单独或与奥拉帕尼组合的非肿瘤靶向抗CD20 ADChA20-CL2A-SN-38。主要终点是中值存活时间(MST)，定义为肿瘤进展至1.0 cm3的时间。
在替代性实施方案中，可通过体外测定来确定针对协同作用的测定。克隆形成性测定可用于确定细胞的存活分数(Ibrahim等, 2012, Cancer Discovery 2:1036-47)。简要来说，将350–800个细胞一式两份涂铺在6孔平底细胞培养板中。在涂铺之后24小时，洗涤细胞，并且在存在或不存在递增剂量的单独以及呈组合形式的ADC和/或PARP或微管抑制剂(例如奥拉帕尼)下添加新鲜培养基。在第4天更新含有药物和/或的培养基。在处理7天之后，用1.5 ml 6.0%戊二醛和0.5%结晶紫将集落固定和染色，并且通过标准程序来对集落计数。如下计算细胞的存活分数(SF)：
Figure 556891DEST_PATH_IMAGE018
使用Chou和Talalay (1984, Adv Enzyme Regul 22:27-55)的多药物作用分析方法评估ADC与PARP或微管抑制剂之间的相互作用。这个方法定量描述两种或更多种药物之间的相互作用，其中数值小于1指示协同相互作用，数值大于1指示拮抗性相互作用，并且数值等于1指示累加性相互作用。
结果
相较于单独IMMU-132组的1.4倍收缩(P = 0.0003；曲线下面积，AUC)或用单独紫杉醇治疗的小鼠中的肿瘤尺寸增加11.4倍(P<0.0001；AUC)，被给予IMMU-132和紫杉醇的组合的具有MDA-MB-468肿瘤的小鼠展现优越抗肿瘤作用(图1A-1C)，伴有肿瘤收缩>11倍。
在MDA-MB-468中，当相较于所有其它组时，200 μg IMMU-132加紫杉醇的组合就曲线下面积(AUC)而言具有优越抗肿瘤作用(表7，P<0.0013)。相较于用单独紫杉醇、单独IMMU-132 (100 μg)治疗的小鼠或未治疗动物，使与紫杉醇一起施用的IMMU-132的量降低至100 μg同样产生显著抗肿瘤作用(表8，P<0.0328)。不可与紫杉醇或未治疗对照组在生长曲线之间进行进一步比较，因为截至第49治疗日，各自由于疾病进展(即TV>1.0 cm3)而开始损失小鼠。
Figure DEST_PATH_IMAGE019
Figure 550255DEST_PATH_IMAGE020
在快速进展性HCC1806异种移植物的情况下(图2A-2B)，IMMU-132加紫杉醇的组合被证明当相较于IMMU-132单药疗法时，具有优越抗肿瘤作用(P=0.0195，AUC17天)。这是一种极具侵袭性的肿瘤，未治疗对照动物的中值存活时间(MST)仅为疗法启动后10天(肿瘤细胞接种后18天)。就存活期而言，当相较于所有其它疗法时，达到它的38天MST的组合提供显著存活益处(P<0.017；对数秩)。应注意这在仅0.25 mg的低剂量下实现，所述剂量将为仅1mg/kg的人等效剂量。
相比于所有其它单药疗法组，用IMMU-132加甲磺酸艾日布林的组合治疗的小鼠(图3A-3E)展现显著更大的抗肿瘤响应(P<0.0432；配对t检验)。这导致当相较于艾日布林或IMMU-132单药疗法(分别是MST=18和14天；P<0.0044；对数秩)时，组合具有显著存活益处(MST=23天)。
同样，在携带MDA-MB-468肿瘤的小鼠中，使IMMU-132疗法与奥拉帕尼组合优于单一药剂疗法(P<0.0032；AUC) (图4)。结果概述于表9中。所有IMMU-132组合治疗都得以良好耐受。
Figure DEST_PATH_IMAGE021
药物-抗体比率(DAR)确定。通过疏水性相互作用HPLC (HIC-HPLC)来评估5个临床批次的IMMU-132，所述疏水性相互作用HPLC解析出代表DAR是6、7和8的物质的3个峰，其中最大部分包含DAR=8 (未显示)。IMMU-132通过这个制造过程来一致地产生，其中在5个临床批次之中的总DAR (DAR平均)是7.60±0.03。HIC-HPLC结果由液相色谱法-质谱测定法(LC-MS)确认。分析显示>99%的8个可用硫氢基与具有或不具有SN-38的CL2A接头偶联(未显示)。未检测到未取代(或N-乙基顺丁烯二酰亚胺封端)的重链或轻链。因此，在各物质之间的DAR差异由在制造期间SN-38从接头释放所致，而非由较低初始取代率所致。一旦制备和冻干，IMMU-132即已稳定数年。
DAR对小鼠中药代动力学和抗肿瘤功效的影响。对携带Trop-2+人胃癌异种移植物(NCI-N87)的小鼠给予2次相隔7天的治疗，各次用相等蛋白质(0.5 mg)剂量的具有6.89、3.28或1.64的DAR的IMMU-132进行。相较于被给予具有3.38或1.64 DAR的ADC的小鼠，用具有6.89的DAR的ADC治疗的动物具有显著改进的中值存活时间(MST) (MST=39天相对于分别25和21天；P<0.0014) (未显示)。在用3.28或1.64 DAR缀合物治疗的各组与盐水对照组之间不存在差异。
为进一步阐明较高DAR的重要性，每周两次持续2周向携带NCI-N87胃肿瘤的小鼠施用0.5 mg DAR是6.89的IMMU-132 (未显示)。另一组接受两倍蛋白质(1 mg)剂量的DAR是3.28的IMMU-132缀合物。尽管在各给药流程的情况下两组均接受相同总量的SN-38 (36 μg)，但相比于用3.28 DAR缀合物治疗的携带肿瘤的动物，用6.89 DAR缀合物治疗的那些更显著抑制肿瘤生长(P=0.0227；AUC) (未显示)。另外，用较低DAR的治疗并不显著不同于未治疗对照。总之，这些研究指示较低DAR使功效降低。
对在这些不同比率下制备的缀合物在非携带肿瘤的小鼠中的药代动力学行为进行考查，所述小鼠被给予0.2 mg各缀合物、未缀合hRS7 IgG、或被还原，接着用N-乙基顺丁烯二酰亚胺封端的hRS7 IgG。以0.5至168小时的5个间隔获取血清，并且通过ELISA来测定hRS7 IgG。相较于未缀合IgG，这些缀合物的清除不存在显著差异(未显示)。因此，取代水平不影响缀合物的药代动力学，并且同等重要的是，链间二硫键的还原似乎不使抗体去稳定。
IMMU-132在TNBC的情况下的作用机理。考查TNBC细胞系MDA-MB-468以及HER2+SK-BR-3细胞系中由IMMU-132利用的凋亡路径以确认ADC基于它的并入SN-38而起作用。使细胞暴露于1 μM SN-38、SN-38当量的IMMU-132、或蛋白质当量的hRS7。收集细胞，并且进行Western印迹。在MDA-MB-468中，在24小时内，单独SN-38和IMMU-132介导p21WAF1/Cip1上调>2倍，并且截至48小时，这些细胞中的p21WAF1/Cip1的量开始降低(在SN-38或IMMU-132的情况下分别是31%和43%) (未显示)。引起关注的是，在HER2+ SK-BR-3肿瘤株系中，在前24小时内，SN-38和IMMU-132均不介导p21WAF1/Cip1上调超过组成水平，但如在暴露于SN-38或IMMU-13248小时之后于MDA-MB-468细胞中所见，p21WAF1/Cip1的量降低>57% (未显示)。SN-38与IMMU-132两者均在24小时内导致前半胱天冬酶-3 (pro-caspase-3)裂解成它的活性片段，但在暴露48小时之后观察到更大程度的活性片段。值得注意的是，在两种细胞系中，当相较于暴露于SN-38的细胞时，IMMU-132介导更大程度的前半胱天冬酶-3裂解，其中在48小时之后观察到最高水平(未显示)。最后，SN-38与IMMU-132两者均介导聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解，在24小时开始，在48小时之后接近完全裂解(未显示)。总之，这些结果确认当在体外施用时，IMMU-132具有的作用机理与游离SN-38的作用机理类似。
在人肿瘤异种移植物模型中由IMMU-132相对于伊立替康对SN-38的递送。测定被施用伊立替康(773 μg；SN-38当量=448 μg)和IMMU-132 (1.0 mg；SN-38当量=16 μg)的用人胰腺癌异种移植物(Capan-1)皮下植入的小鼠的血清和肿瘤中的源于伊立替康或IMMU-132的组成性产物。在施用之后，以5个间隔，使来自各组的3个动物安乐死，提取血清以测定目标产物。
伊立替康从血清极其快速清除，在5分钟内观察到转化成SN-38和SN-38G (未显示)。在24小时未检测到产物。对于伊立替康、SN-38和SN-38G，历经6小时时期的AUC分别是21.0、2.5和2.8 μg/mL·h (小鼠中SN-38转化率= [2.5 + 2.8)/21 = 25.2%])。被给予IMMU-132的动物在血清中具有低得多的游离SN-38浓度，但它在48小时内被检测到(未显示)。游离SN-38G仅在1和6小时被检测到，并且是游离SN-38的3至7倍低(未显示)。
在从伊立替康治疗动物切除的Capan-1肿瘤中，伊立替康水平在6小时内较高，但在24小时不可检测(AUC5分钟-6小时= 48.4 μg/g·h)。SN-38低得多，并且仅在2小时内被检测到(即AUC5分钟-2小时= 0.4 μg/g·h)，其中SN-38G值是几乎3倍高(AUC = 1.1 μg/g·h) (未显示)。取自被给予IMMU-132的动物的肿瘤不具有任何可检测游离SN-38或SN-38G，而是作为替代，肿瘤中的所有SN-38都结合于IMMU-132。重要的是，因为在肿瘤中未检测到SN-38G，所以这表明结合于IMMU-132的SN-38未被葡萄糖醛酸化。这些肿瘤中的结合于IMMU-132的SN-38的AUC是54.3 μg/g·h，这是用伊立替康治疗的动物的肿瘤中历经SN-38可被检测的2小时时期的SN-38的量的135倍高，即使被给予伊立替康的小鼠接受的SN-38当量是用IMMU-132进行施用的28倍多(即分别是448相对于16 μg SN-38当量)。
结论
IMMU-132是与7.6分子的SN-38缀合的人源化抗Trop-2抗体，所述SN-38是作为拓扑异构酶I抑制剂的伊立替康的活性代谢物。在临床上，在患有复发/难治性TNBC的患者中，IMMU-132已显示可管理的毒性和令人鼓舞的响应(ClinicalTrials.gov，NCT01631552)。在人TNBC异种移植物中，在是临床使用的剂量5倍少的人等效剂量(即10 mg/kg)下，单独IMMU-132疗法显示显著抗肿瘤作用。因为临床前研究指示IMMU-132可与两种不同微管抑制剂或PARP抑制剂组合而具有显著增强的抗肿瘤活性，所以这些数据支持将IMMU-132和导致DNA断裂的其它抗体-药物缀合物(ADC)与一般来说微管抑制剂和/或PARP抑制剂、以及通过微管抑制或DNA修复机理来靶向细胞分裂的其它化学治疗剂组合使用。在患有Trop-2阳性癌症(包括但不限于TNBC、转移性结肠癌、SCLC和NSCLC)的患者的情况下，一优选ADC类别由抗Trop-2抗体缀合物表示，因为这是在许多癌中高量表达，并且在癌细胞中定位在细胞表面上和细胞质的靶标。然而，如果其它癌症抗原靶向剂携带也诸如通过靶向拓扑异构酶I来导致DNA断裂的药物如SN-38，那么它们也可在这个应用中用于ADC。
当使IMMU-132与PARP抑制剂(例如奥拉帕尼)组合时，在具有BRCA1/2缺陷以及野生型表达的TNBC肿瘤株系(包括仅具有PTEN缺陷的株系)中实现协同作用。这表明IMMU-132可在具有任何种类的DNA同源性重组路径破坏的任何肿瘤的情况下起协同作用。与奥拉帕尼进行组合，IMMU-132疗法实现超过在用各自进行的单药疗法的情况下观察到的抗肿瘤作用的显著抗肿瘤作用，从而产生显著存活益处。相较于用各药剂进行的单药疗法，IMMU-132与微管抑制剂(例如紫杉醇或甲磺酸艾日布林)组合也显著增强功效。
总之，这些数据证实用靶向癌细胞并诱导DNA链断裂的抗体-药物缀合物(ADC)(诸如IMMU-132)和微管抑制剂或PARP抑制剂进行的组合疗法具有出乎意料的显著优势。通过使IMMU-132疗法与紫杉醇或奥拉帕尼组合来靶向BRCA1/2突变TNBC肿瘤中的PARP DNA修复路径在这个疾病模型中实现合成致死性而无可观察的毒性。在一示例性实施方案中，IMMU-132和PARP或微管抑制剂的组合适用于治疗Trop-2阳性癌症诸如TNBC。这些数据提供将IMMU-132与同样靶向DNA修复机理的其它化学治疗剂组合用于患有TNBC或类似肿瘤的患者中的基本原理。
实施例2. 在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的情况下用IMMU-114 (抗HLA-DR)加布鲁顿激酶抑制剂进行的组合疗法
实验设计。
将人慢性B细胞白血病细胞(JVM-3)涂铺在96孔板中。接着使细胞与各种剂量的布鲁顿激酶抑制剂依鲁替尼(1x10-5至3.9x10-9 M)加恒定量的IMMU-114 (0.25、0.5、0.75或1nM)一起孵育96小时。通过MTS测定来评估细胞活力，并且基于相对于未处理对照细胞的生长抑制百分比产生剂量/响应曲线。使用Prism Graph-Pad确定IC50值。使数据标准化，并且产生等效线图以显示在JVM-3细胞的情况下IMMU-114对依鲁替尼的影响。
结果
IMMU-114如何改变依鲁替尼的IC50的一实例显示于图5A中。细胞与单独依鲁替尼一起孵育导致2.2x10-6 M的IC50。然而，当使0.5 nM IMMU-114与依鲁替尼组合时，IC50值下降2倍达到1.08x10-6 M。应注意在0.5 nM下的IMMU-114仅导致约22%生长抑制。同样，0.75nM IMMU-114使依鲁替尼IC50值向下改变5.7倍。
使这些数据连同来自两个其它测定的结果一起标准化以产生等效线图来确定这个相互作用是协同性的，累加性的，抑或拮抗性的(图6A)。如所示，当使JVM-3细胞与和IMMU-114组合的依鲁替尼一起孵育时，累加作用是明显的。这些数据证明尽管各单独药剂能够在体外抑制CLL的生长，但当组合时，实现累加作用，其支持在患有CLL的患者中使IMMU-114和布鲁顿激酶疗法组合。
实施例3. 在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的情况下用IMMU-114 (抗HLA-DR)加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂进行的组合疗法
实验设计。
将人慢性白血病B细胞(JVM-3)涂铺在96孔板中。接着使细胞与各种剂量的PI3K抑制剂艾代拉里斯(1x10-5至3.9x10-9 M)加恒定量的IMMU-114 (0.25、0.5、0.75或1 nM)一起孵育96小时。通过MTS测定来评估细胞活力，并且基于相对于未处理对照细胞的生长抑制百分比产生剂量/响应曲线。使用Prism Graph-Pad确定IC50值。使数据标准化，并且产生等效线图以显示在JVM-3细胞的情况下IMMU-114对依鲁替尼的影响。
结果
如同依鲁替尼一样，IMMU-114使艾代拉里斯在JVM-3细胞的情况下的IC50改变(图5B)。细胞与单独艾代拉里斯一起孵育导致1.51x10-6 M的IC50。然而，当使0.5 nM IMMU-114与艾代拉里斯组合时，IC50值下降2倍达到0.77x10-6 M (在0.5 nM下的IMMU-114仅导致约26%生长抑制)。同样，1 nM IMMU-114使依鲁替尼IC50值向下改变>18倍。
使这些数据连同来自一个其它测定的结果一起标准化以产生等效线图(图6B)。如所示，当使JVM-3细胞与和IMMU-114组合的艾代拉里斯一起孵育时实现累加作用。这些数据证明使IMMU-114与PI3K抑制剂组合具有在临床上治疗CLL的效用。
实施例4. 用IMMU-114和依鲁替尼治疗复发慢性淋巴细胞性白血病
1名具有如根据国际慢性淋巴细胞性白血病研讨会(International Workshop onChronic Lymphocytic Leukemia)和世界卫生组织(World Health Organization)分类法确定的CLL的历史的65岁妇女在用氟达拉滨、地塞米松(dexamethasone)和利妥昔单抗进行的先前疗法以及CVP方案之后呈现有复发疾病。她现时具有发热和盗汗伴有全身性淋巴结肿大、血红蛋白和血小板产生降低以及白细胞计数快速升高。她的LDH升高，并且β-2-微球蛋白(beta-2-microglobulin)几乎是正常值两倍。对患者给予用抗HLA-DR IMMU-114(IgG4 hL243)在200 mg下进行的疗法，每周两次皮下施用。将抗体与在420 mg的剂量下每日口服施用的布鲁顿激酶抑制剂依鲁替尼组合给予。在6周之后，对患者的血液学和实验室数值的评估指示她已显示对组合疗法的部分响应。
实施例5. 用IMMU-114和艾代拉里斯治疗复发/难治性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)
17名患有滤泡性NHL，尚未对利妥昔单抗和烷基化剂具有响应，或已在接受那些疗法之后6个月内复发的患者接受200 mg每周两次皮下注射的IMMU-114与在150 mg下每日两次口服施用的PI3K抑制剂艾代拉里斯组合，直至疾病进展或患者从研究退出。通过CT扫描来评估响应，伴有其它评估，包括不利事件、B细胞血液水平、血清IMMU-114水平和人抗IMMU-114 (HAHA)效价。
仅观察到偶尔轻度至中度短暂注射反应，并且除直至3级的嗜中性白细胞减少症(但在中断疗法之后可逆，直至降低至1级)之外未观察到其它安全性问题。观察到短暂B细胞消减(多达约25%)。客观响应率(部分响应加完全响应加未确认的完全响应)是47% (8/17)，完全响应/未确认的完全响应率是24% (4/17)。八个客观响应中的四个持续30周或更久。针对人抗IMMU-114抗体(HAHA)评估的所有血清样品都呈阴性。
实施例6. 双官能SN-38产物与温和还原的抗体的缀合
抗CEACAM5人源化MAb hMN-14 (也称为拉贝珠单抗)、抗CD22人源化MAb hLL2 (也称为依帕珠单抗)、抗CD20人源化MAb hA20 (也称为维妥珠单抗)、抗EGP-1人源化MAb hRS7和抗粘蛋白人源化MAb hPAM4 (也称为克利维珠单抗)用于这些研究中。各抗体采用以50至70倍摩尔过量使用的二硫苏糖醇(DTT)在37℃(浴)下在含有5.4 mM EDTA的40 mM PBS (pH7.4)中还原45分钟。还原产物通过尺寸排阻色谱法和/或透滤来纯化，并且进行缓冲液交换以进入在pH 6.5下的适合缓冲液中。硫醇含量通过埃尔曼氏测定(Ellman’s assay)来测定，并且在6.5至8.5 SH/IgG范围内。或者，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)在磷酸盐缓冲液中在处于5–7的范围内的pH下还原抗体，随后进行原位缀合。使用在7–15% v/v下的DMSO作为共溶剂，以及在环境温度下孵育20分钟来使还原MAb与约10至15倍摩尔过量的CL2A-SN-38(如美国专利号7,999,083中所公开制备)反应。缀合物通过离心SEC，穿过疏水性柱，以及最后通过超滤-透滤来纯化。通过在366 nm下的吸光度以及与标准值相关联来测定产物中的SN-38，而蛋白质浓度从在280 nm下的吸光度推导，关于在这个波长下SN-38吸光度的附属结果(spillover)加以修正。因此，确定SN-38/MAb取代比率。将纯化缀合物以冻干制剂形式储存在玻璃小瓶中，在真空下封盖，并且储存在–20℃冷冻器中。表10中显示对于这些缀合物中的一些获得的SN-38摩尔取代比率(MSR)，其通常在5至7的范围内。普通技术人员将认识到缀合方法可应用于适用于所公开方法中的任何抗体。
表10：一些缀合物中的SN-38/MAb摩尔取代比率(MSR)
MAb 缀合物 MSR
hMN-14 hMN-14-CL2A-SN-38 6.1
hRS7 hRS7-CL2A-SN-38 5.8
hA20 hA20-CL2A-SN-38 5.8
hLL2 hLL2-CL2A-SN-38 5.7
hPAM4 hPAM4-CL2A-SN-38 5.9
实施例7. 在人胰腺癌或结肠癌的临床前模型中的体内治疗功效
携带皮下人胰腺或结肠肿瘤异种移植物的免疫损害无胸腺裸小鼠(雌性)用特定CL2A-SN-38缀合物或对照缀合物治疗，或保持未治疗。观察到特定缀合物的治疗功效。图7显示Capan 1胰腺肿瘤模型，其中相比于对照hA20-CL2A-SN-38缀合物(抗CD20)和未治疗对照，hRS7 (抗EGP-1)、hPAM4 (抗粘蛋白)和hMN-14 (抗CEACAM5)抗体的特定CL2A-SN-38缀合物显示更好功效。类似地，在人胰腺癌的BXPC3模型中，相比于对照治疗，特定hRS7-CL2A-SN-38显示更好治疗功效(图8)。同样，在人结肠癌的侵袭性LS174T模型中，用特定hMN-14-CL2A-SN-38治疗比不治疗更有效(图9)。
实施例8. 使用hMN-14-[CL1-SN-38]和hMN-14-[CL2-SN-38]对裸小鼠中GW-39人结肠肿瘤的肺转移的体内治疗
通过静脉内注射GW-39人结肠肿瘤混悬液来在裸小鼠中建立结肠癌的肺转移模型，并且在14天后启动疗法。使用不同剂量，在q4d×8的剂量时程下注射特定抗CEACAM5抗体缀合物hMN14-CL1-SN-38和hMN14-CL2-SN-38以及非靶向抗CD22 MAb对照缀合物hLL2-CL1-SN-38和hLL2-CL2-SN-38，以及hMN14和SN-38的等效剂量混合物。图10 (MSR = SN-38/抗体摩尔取代比率)显示归因于hMN-14缀合物的选择性治疗作用。在250 μg的等效剂量下，用hMN14-CL1-SN-38或hMN14-CL2-SN-38治疗的小鼠显示大于107天的中值存活期。用不特异性靶向肺癌细胞的对照缀合抗体hLL2-CL1-SN-38和hLL2-CL2-SN-38治疗的小鼠显示56和77天的中值存活期，而用未缀合hMN14 IgG和游离SN-38治疗的小鼠显示45天的中值存活期，类似于未治疗盐水对照的43.5天。明确观察到缀合癌细胞靶向抗体-SN-38缀合物的有效性显著和惊人增加，所述缀合物比单独未缀合抗体和游离化学治疗剂实质上更加有效。也观察到缀合抗体的治疗作用具有剂量响应性。这些结果证明在相同体内人肺癌系统中，相较于未缀合抗体与游离SN-38两者的组合作用，SN-38-抗体缀合物具有明确优越性。
实施例9. 使用人源化抗Trop-2 IgG-SN-38缀合物有效治疗不同上皮癌
概述
这个研究的目的在于评估SN-38-抗Trop-2抗体–药物缀合物(ADC)针对若干人实体肿瘤类型的功效，以及评估它在小鼠和猴中的可耐受性，与人类似，猴具有与hRS7的组织交叉反应性。使两种SN-38衍生物CL2-SN-38和CL2A-SN-38缀合于抗Trop-2人源化抗体hRS7。在体外表征免疫缀合物的稳定性、结合和细胞毒性。在5个表达Trop-2抗原的不同人实体肿瘤异种移植物模型中测试功效。评估在小鼠中以及在食蟹猴中的毒性。
两种SN-38衍生物的hRS7缀合物在药物取代(约6)、细胞结合(K d约1.2 nmol/L)、细胞毒性(IC50约2.2 nmol/L)和体外血清稳定性(t/½约20小时)方面相等。细胞暴露于ADC显示有信号传导路径导致PARP裂解，但注意到在p53和p21上调方面相对于游离SN-38的差异。当相较于非靶向对照ADC时，由hRS7-SN-38在非毒性剂量下在携带Calu-3 (P ≤0.05)、Capan-1 (P < 0.018)、BxPC-3 (P < 0.005)和COLO 205肿瘤(P < 0.033)的小鼠中产生显著抗肿瘤作用。小鼠耐受2 × 12 mg/kg (SN-38当量)的剂量，伴有ALT和AST肝酶水平仅短期升高。以2 × 0.96 mg/kg输注的食蟹猴展现血细胞计数仅短暂降低，但重要的是，数值不下降至正常范围以下。
我们推断抗Trop-2 hRS7-CL2A-SN-38 ADC提供针对一定范围的人实体肿瘤类型的显著和特异性抗肿瘤作用。它在组织Trop-2表达与人类似的猴中良好耐受。(Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69)。
对患有实体肿瘤的患者的成功伊立替康治疗已大部分由于CPT-11前药向活性SN-38代谢物的转化率较低而受限制。别人已考查非靶向形式的SN-38作为一种用以回避对这个转化的需要以及将SN-38被动递送至肿瘤的手段。我们使SN-38共价缀合于人源化抗Trop-2抗体hRS7。这个抗体–药物缀合物在一定范围的皮下人癌异种移植物模型(包括非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和鳞状细胞肺癌)中具有特异性抗肿瘤作用，全都处于非毒性剂量下(例如≤3.2 mg/kg累积SN-38等效剂量)。
Trop-2在许多上皮癌中，但也在一些正常组织中广泛表达，因此，在食蟹猴中进行剂量逐步升高研究以评估这个缀合物的临床安全性。猴耐受24 mg SN-38当量/kg，仅伴有轻微可逆毒性。鉴于它的肿瘤靶向和安全性概况，hRS7-SN-38可在管理对伊立替康有响应的实体肿瘤方面提供改进。
引言
人滋养层细胞表面抗原(Trop-2)，也称为GA733-1 (胃抗原733-1)、EGP-1 (上皮糖蛋白-1)和TACSTD2 (肿瘤相关的钙信号转导物)，在多种人癌瘤中表达，并且在一些癌瘤的情况下具有预测意义，从而与更具侵袭性的疾病相关联(参见例如Alberti等, 1992,Hybridoma 11:539-45；Stein等, 1993, Int J Cancer 55:938-46；Stein等, 1994, IntJ Cancer 增刊8:98-102)。对Trop-2在用鼠Trop-2转染的小鼠胰腺癌细胞系中的功能性作用的研究揭示增殖(在低血清条件下)、迁移和体外锚定非依赖性生长增加，以及生长速率增强，有证据表明体内Ki-67表达增加以及转移可能性增高(Cubas等, 2010, Mol Cancer9:253)。
Trop-2抗原在许多上皮癌中分布使得它成为具有吸引力的治疗靶标。Stein和同事(1993, Int J Cancer 55:938-46)表征指定为RS7-3G11 (RS7)的抗体，其结合于存在于许多实体肿瘤中的EGP-1，但所述抗原也通常以较低强度或在限定区域中在一些正常组织中表达。使用放射性标记的RS7，在许多人肿瘤异种移植物中的靶向和治疗功效被文献记载(Shih等, 1995, Cancer Res 55:5857s-63s；Stein等, 1997, Cancer 80:2636-41；Govindan等, 2004, Breast Cancer Res Treat 84:173-82)，但呈未缀合形式的这个内化抗体不显示治疗活性(Shih等, 1995, Cancer Res 55:5857s-63s)。然而，在体外，它已显示针对Trop-2阳性癌瘤的抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)活性。
我们报道使用偶联于SN-38的若干衍生物的抗CEACAM5 (CD66e) IgG来制备抗体–药物缀合物(ADC)，所述SN-38是作为伊立替康或CPT-11的活性组分的拓扑异构酶I抑制剂(Moon等, 2008, J Med Chem 51:6916-26；Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61)。所述衍生物在它们的体外血清稳定性性质方面不同，并且体内研究发现一种形式(指定为CL2)比稳定性更大或更小的其它键联更有效阻止或遏止人结肠癌和胰腺癌异种移植物的生长。
重要的是，这些作用在非毒性剂量下发生，其中初始测试未能确定剂量限制性毒性(Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61)。这些结果令人鼓舞，但也令人惊讶，因为CEACAM5抗体不内化，这是一种被认为对ADC的成功至关重要的性质。我们推测抗CEACAM5-SN-38缀合物的治疗活性可能与在抗体定位之后SN-38在肿瘤内缓慢释放相关。因为当使细胞在它们的生长周期的S期期间进行暴露时伊立替康表现最佳，所以预期持续释放会改进响应。实际上，偶联于非靶向血浆延长剂诸如聚乙二醇(PEG)或胶束的SN-38已显示超过单独伊立替康或SN-38的功效改进(例如Koizumi等, 2006, Cancer Res 66:10048-56)，从而对这个机理提供额外支持。
鉴于RS7抗体与上皮癌的广泛反应性以及它的内化能力，我们假设RS7-SN-38缀合物可不仅受益于药物的持续释放，而且也受益于直接细胞内递送。因此，我们使用人源化形式的鼠RS7抗体(hRS7)制备SN-38缀合物并测试其功效，其中使用改进CL2A接头使SN-38连接于抗体，所述接头使缀合物的品质和它的体内功效改进而不改变它的体外稳定性。这个新型衍生物(命名为CL2A)是用于SN-38偶联于抗体的优选试剂。
在本文中，我们显示hRS7-SN-38缀合物在非毒性剂量下在植入裸小鼠中的若干上皮癌细胞系中的功效，有其它研究揭示可耐受实质上更高剂量。更重要的是，于也在与人类似的组织中表达Trop-2的猴中进行的毒性研究显示相比于小鼠中的治疗有效剂量，hRS7-SN-38在可观更高量下被耐受。
材料和方法
细胞系、抗体和化学治疗剂。这个研究中使用的所有人癌细胞系都购自美国典型培养物保藏中心。这些包括Calu-3 (非小细胞肺癌)、SK-MES-1 (鳞状细胞肺癌)、COLO 205(结肠腺癌), Capan-1和BxPC-3 (胰腺腺癌)和PC-3 (前列腺腺癌)。人源化RS7 IgG和对照人源化抗CD20 (hA20 IgG，维妥珠单抗)和抗CD22 (hLL2 IgG，依帕珠单抗)抗体在Immunomedics, Inc.制备。伊立替康(20 mg/mL)从Hospira, Inc.获得。
SN-38免疫缀合物和体外方面。先前已描述对CL2-SN-38的合成(Moon等, 2008, J Med Chem 51:6916-26)。如所描述进行使它缀合于hRS7 IgG和血清稳定性测定(Moon等,2008, J Med Chem 51:6916-26；Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61)。如先前所述进行CL2A-SN-38 (M.W. 1480)和它的hRS7缀合物制备以及稳定性、结合和细胞毒性研究(Moon等, 2008, J Med Chem 51:6916-26)。制备细胞溶解产物，并且针对p21Waf1 /Cip、p53和PARP (聚ADP-核糖聚合酶)进行免疫印迹。
体内治疗研究。对于所有动物研究，SN-38免疫缀合物和伊立替康的剂量以SN-38当量显示。基于平均SN-38/IgG取代比率6，对于20 g小鼠的500 μg ADC的剂量(25 mg/kg)含有0.4 mg/kg的SN-38。伊立替康剂量同样显示为SN-38当量(即40 mg伊立替康/kg等效于24 mg/kg的SN-38)。4至8周龄的NCr雌性无胸腺裸(nu/nu)小鼠和10周龄的雄性Swiss-Webster小鼠购自Taconic Farms。可耐受性研究由SNBL USA, Ltd.在食蟹猴(食蟹猕猴(Macaca fascicularis)；2.5–4 kg雄性和雌性)中进行。动物用不同人癌细胞系进行皮下植入。肿瘤体积(TV)通过使用测径规以2个维度进行测量来测定，其中体积定义为：L ×w 2/2，其中L是肿瘤的最长尺寸，并且w是最短尺寸。当疗法开始时，肿瘤尺寸在0.10与0.47cm3之间的范围内。各实验中的治疗方案、剂量和动物的数目描述于结果中。将冻干hRS7-CL2A-SN-38和对照ADC复原，并且根据需要在无菌盐水中稀释。所有试剂都在腹膜内施用(0.1 mL)，例外之处是伊立替康在静脉内施用。给药方案受我们的先前探究的影响，其中每4天或每周两次给予ADC，持续不同时长(Moon等, 2008, J Med Chem 51:6916-26；Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61)。这个给药频率反映对缀合物的体外血清半衰期的考虑，以允许更连续暴露于ADC。
统计学。将生长曲线测定为初始TV随时间的变化百分比。对肿瘤生长的统计分析基于曲线下面积(AUC)。通过线性曲线建模来获得个别肿瘤生长的概况。在对生长曲线的统计分析之前，f检验用于确定各组之间的方差相等性。双尾t检验用于评估各个治疗组与对照之间的统计显著性，例外之处是其中使用单尾t检验的盐水对照(在P ≤ 0.05时具有显著性)。AUC的统计比较仅进行直至组内首个动物由于进展而被安乐死的时间。
药代动力学和生物分布。将111In放射性标记的hRS7-CL2A-SN-38和hRS7 IgG注射至携带皮下SK-MES-1肿瘤(约0.3 cm3)的裸小鼠中。一组用20 μCi (250 μg蛋白质)的111In-hRS7-CL2A-SN-38静脉内注射，而另一组接受20 μCi (250 μg蛋白质)的111In-hRS7IgG。在各个时间点，使小鼠(每个时间点5只)麻醉，通过心内穿刺来放血，接着使其安乐死。移除肿瘤和各种组织，称重，并且通过γ闪烁来计数以确定每克组织的注射剂量百分比(%ID/g)。第三组在施用111In-hRS7-CL2A-SN-38之前3天用250 μg未标记hRS7-CL2A-SN-38注射，并且同样进行尸检。在使用f检验确定方差相等性之后，双尾t检验用于比较hRS7-CL2A-SN-38和hRS7 IgG摄取。使用WinNonLin软件(Parsight Corp.)对血液清除进行药代动力学分析。
在Swiss-Webster小鼠和食蟹猴中的可耐受性。简要来说，将小鼠分选成4组，各自在第0和3天接受2 mL腹膜内注射乙酸钠缓冲液对照或3个不同剂量的hRS7-CL2A-SN-38(4、8或12 mg/kg的SN-38)，随后收集血液和血清，如结果中所述。向食蟹猴(3个雄性和3个雌性；2.5–4.0 kg)施用2个不同剂量的hRS7-CL2A-SN-38。剂量、时间和被放血以评估可能的血液学毒性和血清化学的猴的数目描述于结果中。
结果
hRS7-CL2A-SN-38的稳定性和效能。两种不同键联用于使SN-38缀合于hRS7 IgG。第一键联被称为CL2-SN-38，并且先前已描述(Moon等, 2008, J Med Chem 51:6916-26；Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61)。对CL2接头的合成进行变化，因为苯丙氨酸部分被移除。这个变化使合成简化，但不影响缀合结果(例如CL2-SN-38与CL2A-SN-38两者均达成在每个IgG分子中并有约6个SN-38)。并排比较发现在血清稳定性、抗原结合或体外细胞毒性方面无显著差异(未显示)。
为确认SN-38接头从CL2变化成CL2A不影响体内效能，在携带COLO 205或Capan-1肿瘤的小鼠中比较hRS7-CL2A-SN-38和hRS7-CL2-SN-38 (未显示)，分别每周两次×4周使用0.4 mg/kg或0.2 mg/kg SN-38，并且在两个研究中起始肿瘤均具有0.25 cm3尺寸。相较于未治疗(在COLO 205模型中，相对于盐水，AUC14天 P < 0.002；在Capan-1模型中，相对于盐水，AUC21天 P < 0.001)和非靶向抗CD20对照ADC hA20-CL2A-SN-38 (在COLO-205模型中，AUC14天 P < 0.003；在Capan-1模型中，AUC35天：P < 0.002)，hRS7-CL2A-SN-38缀合物与hRS7-CL2-SN-38缀合物两者均显著抑制肿瘤生长。在研究结束时(第140天)，在Capan-1模型中，50%的用hRS7-CL2A-SN-38治疗的小鼠和40%的hRS7-CL2-SN-38小鼠无肿瘤，而仅20%的hA20-ADC治疗动物不具有可见疾病征象。
作用机理 。体外细胞毒性研究证明hRS7-CL2A-SN-38针对若干不同实体肿瘤株系具有在nmol/L范围内的IC50值(表11)。在所有细胞系的情况下，游离SN-38的IC50都低于缀合物。尽管在Trop-2表达与对hRS7-CL2A-SN-38的敏感性之间不存在关联，但ADC相对于游离SN-38的IC50比率在较高表达Trop-2的细胞的情况下较低，最可能反映当存在更多抗原时，使药物内化的能力得以增强。
Figure 632480DEST_PATH_IMAGE022
aIC50值显示为hRS7-SN-38的SN-38当量
已知SN-38使细胞中的若干信号传导路径活化，从而导致凋亡。我们的初始研究在体外考查早期信号传导事件中涉及的2种蛋白质(p21Waf1/Cip1和p53)的表达以及1个晚期凋亡事件[聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的裂解](未显示)。在BxPC-3中，SN-38导致p21Waf1/Cip1表达增加20倍，而hRS7-CL2A-SN-38仅导致10倍增加，这是与游离SN-38在这个细胞系中具有较高活性(表11)一致的研究结果。然而，hRS7-CL2A-SN-38超过游离SN-38使Calu-3中的p21Waf1/Cip1表达增加超过2倍(未显示)。
观察到hRS7-CL2A-SN-38介导的信号传导事件与游离SN-38介导的信号传导事件之间在p53表达方面的更大不一致性。在BxPC-3与Calu-3两者中，游离SN-38使p53上调直至48小时才明显，而hRS7-CL2A-SN-38在24小时内使p53上调(未显示)。此外，相较于SN-38，在两种细胞系的情况下，暴露于ADC的细胞中的p53表达更高(未显示)。引起关注的是，尽管hRS7 IgG对p21Waf1/Cip1表达不具有可观影响，但它的确诱导BxPC-3与Calu-3两者中的p53上调，不过是仅在暴露48小时之后。就稍后凋亡事件而言，当与SN-38或缀合物一起孵育时，在两种细胞系中，PARP的裂解均是明显的(未显示)。在BxPC-3中，在24小时，存在的裂解PARP较高，此与p21的高表达以及它的较低IC50相关联。游离SN-38超过ADC达成更高裂解程度与细胞毒性研究结果一致。
hRS7-SN-38的功效。因为Trop-2在若干人癌瘤中广泛表达，所以在若干不同人癌症模型中进行研究，其以评估hRS7-CL2-SN-38键联开始，但稍后，使用具有CL2A键联的缀合物。每4天×4被给予0.04 mg SN-38/kg的hRS7-CL2-SN-38的携带Calu-3的裸小鼠相较于施用等效量的hLL2-CL2-SN-38的动物具有显著改进的响应(分别是TV = 0.14 ± 0.22 cm3相对于0.80 ± 0.91 cm3；AUC42天 P < 0.026；图11A)。当使剂量增加至0.4 mg/kg SN-38时观察到剂量响应。在这个较高剂量水平下，被给予特异性hRS7缀合物的所有小鼠都在28天内被“治愈”，并且保持无肿瘤直至在第147天研究结束，而在用无关ADC治疗的动物中肿瘤再生长(特异性相对于无关AUC98天：P = 0.05)。在接受hRS7 IgG和SN-38的混合物的小鼠中，截至第56天，肿瘤进展>4.5倍(TV = 1.10 ± 0.88 cm3；相对于hRS7-CL2-SN-38，AUC56天 P <0.006)。
也考查在人结肠(COLO 205)和胰腺(Capan-1)肿瘤异种移植物中的功效。在携带COLO 205肿瘤的动物中，(图11B)，历经28天治疗时期，hRS7-CL2-SN-38 (0.4 mg/kg，q4dx8)阻止肿瘤生长，相较于对照抗CD20 ADC (hA20-CL2-SN-38)或hRS7 IgG，肿瘤显著更小(分别是TV = 0.16 ± 0.09 cm3、1.19 ± 0.59 cm3和1.77 ± 0.93 cm3；AUC28天 P <0.016)。MTD的伊立替康(24 mg SN-38/kg，q2dx5)与hRS7-CL2-SN-38同样有效，因为相比于人血清，小鼠血清可更高效使伊立替康转化成SN-38，但伊立替康中的SN-38剂量(累积2,400 μg)是在缀合物的情况下(总计64 μg)的37.5倍大。
携带Capan-1的动物显示对在以等效于hRS7-CL2-SN-38缀合物的SN-38剂量给予时的单独伊立替康无显著响应(例如在第35天，平均肿瘤尺寸是被给予0.4 mg SN-38/kghRS7-SN-38的动物中的0.04 ± 0.05 cm3相对于被给予0.4 mg/kg SN-38的伊立替康治疗动物中的1.78 ± 0.62 cm3；AUC第35天 P < 0.001；图11C)。当使伊立替康剂量增加10倍达到4mg/kg SN-38时，响应改进，但仍然不与在0.4 mg/kg SN-38剂量水平下的缀合物同样显著(TV = 0.17 ± 0.18 cm3相对于1.69 ± 0.47 cm3，AUC第49天 P < 0.001)。相较于伊立替康治疗动物，相等剂量的非靶向hA20-CL2-SN-38也具有显著抗肿瘤作用，但特异性hRS7缀合物显著好于无关ADC (TV = 0.17 ± 0.18 cm3相对于0.80 ± 0.68 cm3，AUC第49天 P <0.018)。
接着使用hRS7-CL2A-SN-38 ADC进行的研究扩展至人上皮癌的2个其它模型。在携带BxPC-3人胰腺肿瘤的小鼠中(图11D)，相较于用盐水或等效量的非靶向hA20-CL2A-SN-38(分别是TV = 0.24 ± 0.11 cm3相对于1.17 ± 0.45 cm3和1.05 ± 0.73 cm3；AUC第21天 P <0.001)或在10倍高的SN-38等效剂量下给予的伊立替康(分别是TV = 0.27 ± 0.18 cm3相对于0.90 ± 0.62 cm3；AUC第25天 P < 0.004)治疗的对照小鼠，hRS7-CL2A-SN-38再次显著抑制肿瘤生长。引起关注的是，在用0.4 mg/kg的ADC治疗的携带SK-MES-1人鳞状细胞肺肿瘤的小鼠中(图11E)，肿瘤生长抑制优于盐水或未缀合hRS7 IgG (分别是TV = 0.36 ± 0.25cm3相对于1.02 ± 0.70 cm3和1.30 ± 1.08 cm3；AUC28天，P < 0.043)，但非靶向hA20-CL2A-SN-38或MTD的伊立替康与特异性hRS7-SN-38缀合物提供相同抗肿瘤作用。在所有鼠研究中，就体重减轻而言，hRS7-SN-38 ADC都得以良好耐受(未显示)。
hRS7-CL2A-SN-38的生物分布。使用相应111In标记基质，比较hRS7-CL2A-SN-38或未缀合hRS7 IgG在携带SK-MES-1人鳞状细胞肺癌异种移植物的小鼠中的生物分布(未显示)。进行药代动力学分析以相对于未缀合hRS7确定hRS7-CL2A-SN-38的清除(未显示)。ADC比等效量的未缀合hRS7更快清除，其中ADC展现约40%短的半衰期和平均滞留时间。尽管如此，这对肿瘤摄取具有最小影响(未显示)。尽管在24小时和48小时时间点存在显著差异，但截至72小时(峰值摄取)，肿瘤中两种药剂的量是类似的。在正常组织之中，肝差异和脾差异最惊人(未显示)。在注射后24小时，肝中hRS7-CL2A-SN-38是hRS7 IgG的>2倍多。相反，在脾中，在峰值摄取时(48小时时间点)存在的亲本hRS7 IgG是hRS7-CL2A-SN-38的3倍多。在其余组织中的摄取和清除通常反映血液浓度差异。
因为给予每周两次剂量来进行治疗，所以考查在注射111In标记的抗体之前3天首先接受0.2 mg/kg (250 μg蛋白质)的hRS7 ADC的预给药的一组动物中的肿瘤摄取。相较于未接受预给药的动物，在每个时间点，预给药小鼠中肿瘤对111In-hRS7-CL2A-SN-38的摄取都实质上降低(例如在72小时，预给药肿瘤摄取是12.5% ± 3.8% ID/g相对于未给予预给药的动物中的25.4% ± 8.1% ID/g；P = 0.0123)。预给药对血液清除或组织摄取不具有可观影响(未显示)。这些研究表明在一些肿瘤模型中，肿瘤对特异性抗体的堆积可通过先前给药来降低，此可能解释为何治疗响应的特异性可随着增加ADC剂量而减弱，以及为何不指示进一步逐步升高剂量。
hRS7-CL2A-SN-38在Swiss-Webster小鼠和食蟹猴中的可耐受性。Swiss-Webster小鼠耐受在3天内的2次剂量，各自是4、8和12 mg SN-38/kg的hRS7-CL2A-SN-38，伴有最小短暂重量减轻(未显示)。未出现造血性毒性，并且血清化学仅揭示天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶升高(未显示)。在治疗之后7天，所有3个治疗组中的AST都升高超过正常水平(>298 U/L) (未显示)，其中最大比例的小鼠处于2 × 8 mg/kg组中。然而，截至治疗后15天，大多数动物在正常范围内。在治疗7天内，ALT水平也超过正常范围(>77 U/L) (未显示)，并且截至第15天具有正常化的迹象。来自所有这些小鼠的肝都不显示组织损害的组织学迹象(未显示)。就肾功能而言，在治疗组中，仅葡萄糖和氯离子水平稍微升高。在2 × 8mg/kg下，7只小鼠中的5只具有略微升高的葡萄糖水平(273–320 mg/dL的范围，正常值的上端是263 mg/dL)，其截至注射后15天恢复正常。类似地，在2个最高剂量组中，氯离子水平略微升高，在116至127 mmol/L的范围内(正常范围的上端是115 mmol/L) (2 × 8 mg/kg组中的57%，以及2 × 12 mg/kg组中的100%小鼠)，并且直至注射后15天保持升高。这也可指示胃肠毒性，因为大多数氯离子通过由消化道吸收来获得；然而，在结束时，在考查的任何器官系统中都不存在组织损害的组织学迹象(未显示)。
因为小鼠不表达由hRS7结合的Trop-2，所以确定hRS7缀合物供临床使用的潜力需要更适合模型。免疫组织学研究揭示在人与食蟹猴两者中的多个组织中具有结合(乳腺、眼、胃肠道、肾、肺、卵巢、输卵管、胰腺、甲状旁腺、前列腺、唾液腺、皮肤、胸腺、甲状腺、扁桃腺、输尿管、膀胱和子宫；未显示)。基于这个交叉反应性，在猴中进行可耐受性研究。
接受2 × 0.96 mg SN-38/kg的hRS7-CL2A-SN-38的组在输注之后以及直至研究结束不具有重大临床事件。重量减轻不超过7.3%，并且截至第15天恢复至驯化重量。注意到大多数血细胞计数数据的短暂降低(未显示)，但数值未下降至正常范围以下。未发现血清化学的异常值。在第11天(在末次注射之后8天)尸检的动物的组织病理学分析显示造血器官(胸腺、下颌淋巴结和肠系膜淋巴结、脾和骨髓)、胃肠器官(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)、雌性生殖器官(卵巢、子宫和阴道)以及在注射部位处的微观变化。这些变化在最小至中度的范围内，并且在所有组织的情况下在恢复期结束时(第32天)都完全逆转，例外之处是在胸腺和胃肠道的情况下，其倾向于在这个稍后时间点完全恢复。
在2 × 1.92 mg SN-38/kg剂量水平的缀合物下，存在1例由胃肠并发症和骨髓抑制引起的死亡，并且相比于2 × 0.96 mg/kg组，这个组内的其它动物显示类似但更重度的不利事件。这些数据指示剂量限制性毒性与伊立替康的剂量限制性毒性相同；即肠和血液学剂量限制性毒性。因此，hRS7-CL2A-SN-38的MTD处于2 × 0.96与1.92 mg SN-38/kg之间，其代表2 × 0.3至0.6 mg/kg SN-38的人等效剂量。
讨论
Trop-2是一种在包括肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌的许多上皮肿瘤上表达的蛋白质，从而使得它成为对于递送细胞毒性剂潜在重要的靶标。RS7抗体在结合于Trop-2时进行内化(Shih等, 1995, Cancer Res 55:5857s-63s)，此使得能够直接细胞内递送细胞毒素。
已探索使化学治疗药物缀合于抗体超过30年。因为大部分的ADC不由肿瘤处理，而是由正常组织处理，所以存在在肿瘤中达到治疗水平之前，这些药剂将对正常器官系统太具毒性的风险。如同任何治疗剂一样，治疗窗是决定ADC的潜力的关键因素，因此并非考查“超级毒性”药物，我们选择SN-38作为靶向Trop-2的ADC的药物组分。
SN-38是一种强力拓扑异构酶I抑制剂，在若干细胞系的情况下的IC50值在纳摩尔范围内。它是用于治疗结肠直肠癌，并且在肺癌、乳腺癌和脑癌的情况下也具有活性的前药伊立替康的活性形式。我们推断通过克服CPT-11向活性SN-38的较低以及患者可变的生物转化，呈ADC形式的直接靶向SN-38将为超过CPT-11的显著改进治疗剂。
插入原始CL2衍生物中的Phe-Lys肽允许通过组织蛋白酶B (cathepsin B)来达成可能的裂解。为试图简化合成过程，在CL2A中，苯丙氨酸被消除，因此组织蛋白酶B裂解位点被移除。引起关注的是，相较于用CL2获得的宽泛图谱，这个产物具有轮廓更加分明的色谱图谱(未显示)，但更重要的是，在并排测试中，这个变化对缀合物的结合、稳定性或效能不具有负性影响。这些数据表明CL2中的SN-38主要通过在与SN-38的内酯环的pH敏感性碳酸苯甲酯键处而非组织蛋白酶B裂解位点处进行裂解来从缀合物释放。
hRS7 ADC针对一定范围的实体肿瘤细胞系的体外细胞毒性一致具有在nmol/L范围内的IC50值。然而，相较于ADC，暴露于游离SN-38的细胞显示更低IC50值。游离SN-38与缀合SN-38之间的这个不一致性也关于ENZ-2208 (Sapra等, 2008, Clin Cancer Res 14:1888-96)和NK012 (Koizumi等, 2006, Cancer Res 66:10048-56)加以报道。ENZ-2208利用分支PEG来达成每个PEG连接约3.5至4个SN-38分子，而NK012是含有20重量% SN-38的胶束纳米粒子。在我们的ADC的情况下，这个不一致性(即游离SN-38相对于缀合SN-38的效能比率)随着肿瘤细胞中的Trop-2表达水平增加而降低，从而表明药物的靶向递送的优势。就体外血清稳定性而言，CL2-SN-38与CL2A-SN-38两种形式的hRS7-SN-38均产生约20小时的t/½，此与对于ENZ-2208报道的12.3分钟的短暂t/½ 形成对比(Zhao等, 2008, Bioconjug Chem 19:849-59)，但类似于在生理条件下在24小时之后SN-38从NK012释放57% (Koizumi等, 2006, Cancer Res 66:10048-56)。
在5个不同肿瘤模型中，用hRS7-SN-38 (采用CL2-SN-38或CL2A-SN-38)治疗携带肿瘤的小鼠显著抑制肿瘤生长。在它们中的4个中，观察到肿瘤消退，并且在Calu-3的情况下，接受最高剂量的hRS7-SN-38的所有小鼠在研究结束时都无肿瘤。不同于在人中，伊立替康在小鼠中由血浆酯酶极其高效转化成SN-38，具有大于50%转化率，并且在小鼠中比在人中产生更高功效。当在10倍高或等效SN-38水平下施用伊立替康时，hRS7-SN-38在控制肿瘤生长方面显著更好。仅当伊立替康在它的MTD 24 mg/kg q2dx5 (37.5倍多的SN-38)下施用时，它才与hRS7-SN-38具有相等有效性。在患者中，我们将预期这个优势甚至更加有利于hRS7-CL2A-SN-38，因为伊立替康的生物转化将实质上较低。
我们也显示在一些表达抗原的细胞系诸如SK-MES-1中，相比于非结合无关缀合物，使用抗原结合ADC不保证更好治疗响应。这不是不常见或出乎意料的研究结果。实际上，当相较于伊立替康时，早先提及的非结合SN-38缀合物使治疗活性增强，因此预期无关IgG-SN-38缀合物具有一定活性。这与肿瘤具有相比于正常组织，允许大分子更好穿过的不成熟渗漏血管的事实相关。在我们的缀合物的情况下，当使pH降低至模拟溶酶体水平的水平时(例如在37℃下pH 5.3；数据未显示)，50%的SN-38将在约13小时内释放，而在血清的中性pH下，释放速率降低接近2倍。如果无关缀合物进入酸性肿瘤微环境，那么预期它会局部释放一些SN-38。诸如肿瘤生理学和对药物的先天性敏感性的其它因素也将在确定这个“基线”活性方面起作用。然而，具有较长滞留时间的特异性缀合物应具有超过这个基线响应的增强的效能，只要存在充足抗原来捕集特异性抗体即可。在SK-MES-1模型中进行的生物分布研究也显示如果肿瘤抗原由于连续给药而变得饱和，那么肿瘤对特异性缀合物的摄取降低，此产生与用无关缀合物得到的治疗结果类似的治疗结果。
尽管在我们的ADC与其它SN-38递送剂的公开报道之间进行直接比较具有挑战，但可进行一些一般性观察。在我们的疗法研究中，最高个别剂量是0.4 mg/kg的SN-38。在Calu-3模型中，在20 g小鼠中给予仅4次注射以达成总累积剂量1.6 mg/kg SN-38或32 μgSN-38。使用ENZ-2208的MTD 10 mg/kg × 5，用它进行了多个研究，并且用NK012进行的临床前研究涉及它的MTD 30 mg/kg × 3。因此，相比于在ENZ-2208和NK012的情况下的报道剂量，用hRS7-SN-38分别在30倍少和55倍少的SN-38当量下获得显著抗肿瘤作用。即使在10倍少的hRS7 ADC (0.04 mg/kg)的情况下，也观察到显著抗肿瘤作用，而较低剂量的ENZ-2208未被呈现，并且当使NK012剂量降低4倍达到7.5 mg/kg时，功效丧失(Koizumi等,2006, Cancer Res 66:10048-56)。正常小鼠在24 mg/kg SN-38 (1,500 mg/kg的缀合物)历经1周达成的累积剂量的情况下不显示急性毒性，从而指示MTD较高。因此，用7.5至15倍低量的SN-38当量有效治疗携带肿瘤的动物。
作为拓扑异构酶I抑制剂，SN-38诱导对细胞的DNA的显著损害，伴有p53和p21WAF1 /Cip1的上调，从而导致半胱天冬酶活化和PARP裂解。当我们使BxPC-3和Calu-3细胞暴露于我们的ADC时，p53与p21WAF1/Cip1两者均上调超过基础水平。此外，在两种细胞系中，PARP裂解也均是明显的，从而确认这些细胞中的凋亡事件。所关注的是由游离SN-38与我们的hRS7-SN-38两者在BxPC-3和Calu-3中均达成相对于p53，p21WAF1/Cip1的上调更高。这可指示这2种细胞系中p53的突变状况，以及使用p53非依赖性路径来达成p21WAF1/Cip1介导的凋亡。
一个引起关注的观察结果是相对于游离SN-38，在BxPC-3与Calu-3两者中在24小时由hRS7-ADC介导的早期p53上调。即使裸hRS7 IgG也可在这些细胞系中使p53上调，但仅在暴露48小时之后。Trop-2过度表达以及由抗体达成的交联已与若干MAPK相关的信号传导事件以及细胞内钙释放相关联。尽管hRS7的结合不足以在BxPC-3和Calu-3的情况下诱导凋亡，如由缺乏PARP裂解所证实，但这可足以使细胞致敏，以致包括缀合于hRS7的SN-38可导致对肿瘤生长抑制的更大作用。当前正在进行研究以了解哪些路径涉及hRS7对SN-38的递送和它们可如何不同于游离SN-38，以及p53状况可在这个信号传导中起什么作用。
生物分布研究揭示hRS7-CL2A-SN-38与亲本hRS7 IgG具有类似肿瘤摄取，但以2倍高的肝摄取被实质上更快清除，此可归因于SN-38的疏水性。由于ADC通过肝来清除，所以预期肝毒性和胃肠毒性是剂量限制性的。尽管小鼠具有肝转氨酶增加的迹象，但胃肠毒性充其量是轻度的，伴有仅短暂重量减轻，并且在组织病理学检查后未注意到异常。引起关注的是，未注意到血液学毒性。然而，猴显示与对于伊立替康所预期相同的毒性概况，其中胃肠毒性和血液学毒性是剂量限制性的。
因为由hRS7识别的Trop-2不在小鼠中表达，所以极其重要的是在与人具有Trop-2的类似组织表达的猴中进行毒性研究。猴耐受0.96 mg/kg/剂(约12 mg/m2)，伴有轻度和可逆毒性，此外推至约0.3 mg/kg/剂(约11 mg/m2)的人剂量。在NK012的I期临床试验中，患有实体肿瘤的患者耐受每3周28 mg/m2的SN-38，伴有4级嗜中性白细胞减少症作为剂量限制性毒性(Hamaguchi等, 2010, Clin Cancer Res 16:5058-66)。类似地，用ENZ-2208进行的I期临床试验揭示剂量限制性发热性嗜中性白细胞减少症，推荐每3周施用10 mg/m2，或如果患者被施用G-CSF，那么施用16 mg/m2。因为猴耐受22 mg/m2的累积人等效剂量，所以有可能即使hRS7结合许多正常组织，单次hRS7 ADC治疗的MTD也可类似于其它非靶向SN-38药剂的MTD。实际上，抗Trop-2抗体的特异性似乎不在确定DLT方面起作用，因为毒性概况类似于伊立替康的毒性概况。更重要的是，如果抗肿瘤活性可如同在仅在0.03 mg SN-38当量/kg/剂下的人等效剂量的情况下有响应的小鼠中一样在人中实现，那么可在临床上实现显著抗肿瘤响应。
总之，在猴中进行的毒理学研究与体内人癌异种移植物小鼠模型联合已指示靶向Trop-2的这个ADC是在不同上皮来源的若干肿瘤的情况下的有效治疗剂。
实施例10. 缀合于2-吡咯啉基多柔比星(2-PDox)的前药形式的抗Trop-2抗体的功效
制备2-PDox的前药形式(被称为pro-2-PDox)，并且使其缀合于抗体，如美国专利申请14/175,089 (其实施例1以引用的方式并入本文)中所公开。除非以下另外陈述，否则每个抗体分子的药物部分的数目在约6.5至约7.5的范围内。
体外细胞结合研究–通过细胞结合测定，将缀合抗体的结合与未缀合抗体的结合进行比较来确认抗体结合的保留(Chari, 2008, Acc Chem Res 41:98-107)。使用适当靶标细胞，在4天MTS测定中测试缀合物的效能。在胃(NCI-N87)、胰腺(Capan-1)和乳腺(MDA-MB-468)人癌细胞系的情况下，抗Trop-2 ADC (hRS7-pro-2-PDox)展现0.35–1.09 nM的IC50值，游离药物在相同细胞系的情况下展现0.02–0.07 nM效能。在额外研究中，观察到hRS7-pro-2-PDox对MDA-MB-468、AG S、NCI-N87和Capan-1实体肿瘤细胞系具有细胞毒性(未显示)。
在未缀合hRS7与每个抗体缀合于6个pro-2-PDox分子的pro-2-PDox-hRS7之间，在抗体部分与NCI-N87胃癌细胞的结合方面未观察到显著差异(未显示)。推断pro-2-PDox缀合于抗体不影响抗体-抗原结合活性。
血清稳定性–通过在37℃下在0.2 mg/mL的浓度下在人血清中孵育来测定抗Trop-2 ADC (hRS7-pro-2-PDox)的血清稳定性。使用丁基疏水性相互作用色谱法(HIC)，通过HPLC来分析孵育物。分析显示不存在游离药物从缀合物的释放，从而表明缀合物具有高血清稳定性。当用含有与hRS7-pro-2-PDox相同的可裂解接头，并且其中游离药物被独立证实以96小时的半衰期加以释放的hRS7-多柔比星缀合物重复相同实验时，根据HIC HPLC观察到明确形成对应于游离多柔比星的峰。
惊人的是，确定pro-2-PDox缀合物紧密固持于抗体，因为它使抗体的肽链交联在一起。交联使药物与抗体的连接稳定，以致药物仅在抗体被代谢之后在细胞内释放。交联有助于使将由游离药物在循环中释放所产生的毒性例如心脏毒性最小化。因为在体内药物使肽交联于其它蛋白质或肽，所以先前对2-PDox肽缀合物的使用失败。在本发明抗Trop-2ADC的情况下，使pro-2-PDox连接于呈前药形式的链间二硫化物硫醇基团。前药保护在注射之后不久在体内被快速移除，并且缀合物的所得2-PDox部分使抗体的肽链交联，从而在抗体分子内形成分子内交联。这使ADC稳定，并且防止交联于循环中的其它分子。
体内临床前研究-通过测径规测量长度(L)和宽度(W)来测定肿瘤尺寸，其中将肿瘤体积计算为(LxW2)/2。一周两次测量肿瘤并将小鼠称重。如果小鼠的肿瘤在尺寸方面达到>1 cm3，它们的起始体重减轻大于15%，或另外变得濒死，那么使它们安乐死。对肿瘤生长数据的统计分析基于曲线下面积(AUC)和存活时间。通过线性曲线建模来获得个别肿瘤生长的概况。在对生长曲线的统计分析之前，f检验用于确定各组之间的方差相等性。双尾t检验用于评估所有各个治疗组与非特异性对照之间的统计显著性。对于盐水对照分析，单尾t检验用于评估显著性。使用Prism GraphPad Software (v4.03)软件包(AdvancedGraphics Software, Inc.；Encinitas, CA)，利用卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)图(对数秩分析)来分析存活研究。临床前实验中的所有剂量都用抗体量表示。就药物而言，当使用具有每个IgG 3–6个药物的ADC时，20 g小鼠中的100 μg抗体(5 mg/kg)例如携带1.4 μg–2.8μg (0.14–0.17 mg/kg)的pro-2-PDox等效剂量。
单次静脉内剂量≥300 μg [约10 μg的pro-2-PDox]的抗Trop-2 ADC是致死的，但在2周内给予4次45 μg剂量为所有动物所耐受。使用这个给药方案，我们考查抗Trop-2hRS7-pro-2-PDox在2个人肿瘤异种移植物模型Capan-1 (胰腺癌)和NCI-N87 (胃癌)中的治疗作用。在裸小鼠中进行肿瘤移植之后7天开始疗法。在建立的7天龄Capan-1模型中，100%的建立肿瘤快速消退，不具有再生长的迹象(未显示)。这个结果在重复实验中得以再现(未显示)。相比于缀合于针对也在胰腺癌中表达的CEACAM5的抗体(hMN-14)或针对不在胰腺癌中表达的CD20的抗体(hA20)的相同药物，pro-2-PDox的抗Trop-2缀合物有效得多。所有治疗都优于盐水对照。
在建立的NCI-N87模型中观察到类似结果(未显示)，其中在第70天之后施用的第2疗程得以安全耐受，并且导致残余肿瘤进一步消退(未显示)。相比于内化不良的抗CEACAM5抗体hMN-14的缀合物，靶向Trop-2的内化hRS7-SN-38缀合物提供更好治疗响应(未显示)。非靶向抗CD20 ADC hA20-pro-2-PDox是无效的，从而指示选择性的治疗功效(未显示)。由乳腺癌异种移植物(MDA-MB-468)和第二胰腺癌异种移植物获得的数据(未显示)显示相同样式，其中相较于非靶向ADC或盐水对照，抗Trop-2 ADC显著更加有效。在两种情况下，施用抗Trop-2 ADC均产生明确肿瘤生长抑制直至研究结束。
具有每个IgG 6.8或3.7个药物的取代度的hRS7-pro-2-PDox的PK和毒性–已知携带每个MAb多达8个超级毒性药物的抗体-药物缀合物(ADC)比未修饰MAb更快清除，并且使脱靶毒性增加，这是已导致当前倾向于使用≤4的药物取代度的研究结果(Hamblett等,2004, Clin Cancer Res 10:7063-70)。制备ADC，并且评估其具有约6:1和约3:1的平均药物/MAb取代比率(MSR)。向各组正常小鼠(n = 5)静脉内施用单次剂量的未修饰hRS7或具有6.8或3.7的药物取代度的hRS7-pro-2-PDox (蛋白质剂量相同)，并且在注射后30分钟、4小时、24小时、72小时和168小时收集血清样品。通过ELISA来分析这些样品中的抗体浓度。在各个时间，在血清浓度方面不存在显著差异，从而指示这些样品显示从血液的清除是类似的。PK参数(Cmax、AUC等)也是类似的。当在相同剂量的缀合药物下施用时，具有更高或更低药物取代度的ADC在裸小鼠中具有类似耐受性。
在最小有效剂量(MED)下的治疗功效–通过施用9 mg/kg、6.75 mg/kg、4.5 mg/kg、2.25 mg/kg或1 mg/kg的单次团注蛋白质剂量来在携带NCI-N87人胃癌异种移植物的裸小鼠中评估抗Trop-2 ADC (hRS7-pro-2-PDox)。当平均肿瘤体积(mTV)是0.256 cm3时开始疗法。在第21天，盐水对照组(非治疗组)中的mTV是0.801 ± 0.181 cm3，其显著大于用9、6.75、4.5或2.25 mg/kg剂量治疗的小鼠中的mTV，所述小鼠分别具有0.211 ± 0.042 cm3、0.239 ± 0.0.054 cm3、0.264 ± 0.087 cm3和0.567 ± 0.179 cm3的mTV (P<0.0047，单尾t检验)。根据这些结果，将最小有效剂量估计为2.25 mg/kg，而9 mg/kg代表MTD。
实施例11. 包含hRS7和紫杉醇的抗Trop-2 ADC
通过使紫杉醇(TAXOL®)缀合于hRS7抗人Trop-2抗体来制备一种新型抗体-药物缀合物(ADC) (hRS7-紫杉醇)。最终产物具有2.2的平均药物对抗体取代比率。使用以下两种不同Trop-2阳性细胞系作为靶标来在体外测试这个ADC：BxPC-3 (人胰腺腺癌)和MDA-MB-468 (人三阴性乳腺癌)。在添加ADC之前一天，从组织培养物收集细胞，并且在每孔2000个细胞下涂铺至96孔板中。次日，使细胞暴露于游离紫杉醇(6.1 x 10-11至4 x 10-6 M)或药物当量的hRS7-紫杉醇。为进行比较，也在3.84 x 10-12至2.5 x 10-7 M的范围下测试hRS7-SN-38和游离SN-38。使各板在37℃下孵育96小时。在这个孵育期之后，将MTS底物添加至所有板中，并且以半小时间隔读取显色直至未处理对照孔具有约1.0的OD492nm读数。使用Microsoft Excel和Prism软件(非线性回归以产生S形剂量响应曲线，所述曲线产生IC50值)，将生长抑制测量为相对于未处理细胞的生长百分比。
hRS7-紫杉醇ADC在MDA-MB-468乳腺细胞系中展现细胞毒性活性(未显示)，IC50值是hRS7-SN-38的约4.5倍高。游离紫杉醇比游离SN-38强力得多(未显示)。尽管游离SN-38的IC50是1.54x10-9 M，但游离紫杉醇的IC50小于6.1x10-11 M。关于BxPC-3胰腺细胞系获得类似结果(未显示)，其中hRS7-紫杉醇ADC具有的IC50值是hRS7-SN-38 ADC的约2.8倍高。这些结果显示抗Trop-2缀合的紫杉醇在体外具有功效，其中IC50值在纳摩尔范围内，这类似于hRS7-SN-38 ADC。
实施例12. 抗Trop-2 ADC (MAB650-SN-38)的细胞毒性
用SN-38和MAB650制备一种新型抗Trop-2 ADC，从而产生6.89的平均药物对抗体取代比率。使用两种不同人胰腺腺癌细胞系(BxPC-3和Capan-1)和人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-468)作为靶标，进行细胞毒性测定以比较MAB650-SN-38 ADC和hRS7-SN-38 ADC。
在添加ADC之前一天，从组织培养物收集细胞，并且涂铺至96孔板中。次日，使细胞暴露于在3.84x10-12至2.5x10-7 M的药物范围下的hRS7-SN-38、MAB650-SN-38和游离SN-38。未缀合MAB650在与MAB650-SN-38等效的蛋白质剂量下用作对照。使各板在37℃下孵育96小时。在这个孵育期之后，将MTS底物添加至所有板中，并且以半小时间隔读取显色直至未处理细胞的OD492nm达到约1.0。使用Microsoft Excel和Prism软件(非线性回归以产生S形剂量响应曲线，所述曲线产生IC50值)，将生长抑制测量为相对于未处理细胞的生长百分比。
在这些细胞系的情况下，hRS7-SN-38和MAB650-SN-38具有类似生长抑制作用(未显示)，IC50值在对于SN-38-ADC是典型的低nM范围内。在人Capan-1胰腺腺癌细胞系的情况下(未显示)，相较于MAB650-SN-38 ADC的4.1 nM和游离SN-38的1.0 nM，hRS7-SN-38 ADC显示3.5 nM的IC50。在人BxPC-3胰腺腺癌细胞系的情况下(未显示)，相较于MAB650-SN-38 ADC的3.0 nM和游离SN-38的1.0 nM，hRS7-SN-38 ADC显示2.6 nM的IC50。在人NCI-N87胃腺癌细胞系的情况下(未显示)，相较于MAB650-SN-38 ADC的4.1 nM和游离SN-38的4.3 nM，hRS7-SN-38 ADC显示3.6 nM的IC50。
总之，在这些体外测定中，两种抗Trop-2抗体hRS7和MAB650的SN-38缀合物显示针对若干肿瘤细胞系的相等功效，其类似于游离SN-38的功效。因为相比于在体外，抗Trop-2抗体的靶向功能在体内将为更加重要因素，所以数据支持抗Trop-2-SN-38 ADC作为将在体内高度有效的类别，如以上实施例中对于hRS7-SN-38所证明。
实施例13. 抗Trop-2 ADC (162-46.2-SN-38)的细胞毒性
用SN-38和162-46.2制备一种新型抗Trop-2 ADC，从而产生6.14的药物对抗体取代比率。使用两种不同Trop-2阳性细胞系作为靶标，即BxPC-3人胰腺腺癌和MDA-MB-468人三阴性乳腺癌，进行细胞毒性测定以比较162-46.2-SN-38 ADC和hRS7-SN-38 ADC。
在添加ADC之前一天，从组织培养物收集细胞，并且以每孔2000个细胞涂铺至96孔板中。次日，使细胞暴露于在3.84 x 10-12至2.5 x 10-7 M的药物范围下的hRS7-SN-38、162-46.2-SN-38或游离SN-38。未缀合162-46.2和hRS7在分别与162-46.2-SN-38和hRS7-SN-38相同的蛋白质等效剂量下用作对照。使各板在37℃下孵育96小时。在这个孵育期之后，将MTS底物添加至所有板中，并且以半小时间隔读取显色直至未处理对照孔具有约1.0的OD492nm读数。使用Microsoft Excel和Prism软件(非线性回归以产生S形剂量响应曲线，所述曲线产生IC50值)，将生长抑制测量为相对于未处理细胞的生长百分比。
当相较于hRS7-SN-38时，162-46.2-SN-38 ADC具有类似IC50值(未显示)。当针对BxPC-3人胰腺腺癌细胞系测试时(未显示)，相较于162-46.2-SN-38的10.6 nM和游离SN-38的1.6 nM，hRS7-SN-38具有5.8 nM的IC50。当针对MDA-MB-468人乳腺腺癌细胞系测试时(未显示)，相较于162-46.2-SN-38的6.1 nM和游离SN-38的0.8 nM，hRS7-SN-38具有3.9 nM的IC50。单独游离抗体显示对任一Trop-2阳性癌细胞系的少许细胞毒性。
总之，将缀合于相同细胞毒性药物的三种不同抗Trop-2抗体的体外功效进行比较，所有三种ADC都展现针对多种Trop-2阳性癌细胞系的等效细胞毒性作用。这些数据支持并入药物缀合ADC中的这类抗Trop-2抗体是针对表达Trop-2的实体肿瘤的有效抗癌治疗剂。
实施例14. 用包含hRS7抗体缀合于SN-38的IMMU-132抗Trop-2 ADC进行的临床试验
概述
本实施例报道来自用IMMU-132进行的I期临床试验和正在进行的II期延伸部分的结果，所述IMMU-132是内化人源化hRS7抗Trop-2抗体通过pH敏感性接头来缀合于SN-38的ADC (平均药物-抗体比率= 7.6)。Trop-2是一种由许多人癌瘤以高密度(约1 x 105)、频率和特异性表达的I型跨膜钙转导蛋白质，具有有限的正常组织表达。在携带Capan-1人胰腺肿瘤异种移植物的裸小鼠中进行的临床前研究已揭示相比于由最大程度耐受的伊立替康疗法获得的SN-38，IMMU-132能够将多达120倍多的SN-38递送至肿瘤。
本实施例报道多种先前疗法(一些疗法包括拓扑异构酶I/II抑制药物)已失败的25名患者(pt)的初始I期试验，以及现时报道69名患者的正在进行的II期延伸部分，包括结肠直肠癌(CRC)、小细胞肺癌和非小细胞肺癌(分别是SCLC、NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、胰腺癌(PDC)、食道癌和其它癌症。
如以下详细讨论，Trop-2未在血清中检测到，但在大多数存档肿瘤中强烈表达(≥2+)。在3+3试验设计中，以重复21天循环在第1和8天给予IMMU-132，以8 mg/kg/剂开始，接着是12和18 mg/kg(在剂量限制性嗜中性白细胞减少症之前)。为在最小延迟下使累积治疗最优化，II期集中于8和10 mg/kg (分别是n = 30和14)。在此时报告相关AE的49名患者中，≥G3嗜中性白细胞减少症发生在28% (4% G4)中。这些患者中的初始最常见非血液学毒性已有疲劳(55%；≥G3 = 9%)、恶心(53%；≥G3=0%)、腹泻(47%；≥G3 = 9%)、脱发(40%)和呕吐(32%；≥G3 = 2%)。纯合性UGT1A1 *28/*28见于6名患者中，其中2名具有更重度血液学毒性和胃肠毒性。在I期和扩展期中，现时有48名患者(排除PDC)可通过RECIST/CT评估最佳响应。7名(15%)患者具有部分响应(PR)，包括患有CRC (N = 1)、TNBC (N = 2)、SCLC (N =2)、NSCLC (N = 1)和食道癌(N = 1)的患者，并且另外27名患者(56%)具有稳定疾病，总计38名患者(79%)具有疾病响应；13名CT可评估PDC患者中的8名(62%)具有SD，相较于在他们的末个先前疗法的情况下的8.0周，具有12.7周的中值进展时间(TTP)。剩余48名患者的TTP是12.6+周(在6.0至51.4周的范围内)。血浆CEA和CA19-9与响应相关联。尽管历经数月进行给药，但未检测到抗hRS7抗体或抗SN-38抗体。缀合物在3天内从血清清除，这与体内动物研究一致，其中每日释放50%的SN-38，血清中>95%的SN-38以非葡萄糖醛酸化形式，以及相比于所报道的于被给予伊立替康的患者中的SN-38在多达100倍高的浓度下结合于IgG。这些结果显示含有hRS7-SN-38的ADC在转移性实体癌中具有治疗活性，伴有可管理的腹泻和嗜中性白细胞减少症。
药代动力学
两种ELISA方法用于测量IgG(用抗hRS7独特型抗体捕集)和完整缀合物(用抗SN-38 IgG捕集/用抗hRS7独特型抗体探测)的清除。通过HPLC来测量SN-38。总体IMMU-132部分(完整缀合物)比IgG更快速清除(未显示)，从而反映SN-38从缀合物的已知逐渐释放。SN-38(未结合和总体)的HPLC测定显示血清中>95% SN-38结合于IgG。低浓度的SN-38G表明结合于IgG的SN-38被保护免遭葡萄糖醛酸化。缀合物ELISA和SN-38 HPLC的比较揭示两者重叠，从而表明ELISA是用于监测SN-38清除的替代方法。
给药方案和患者探询的概述提供于表12中。
表12. 临床试验参数
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临床试验状况
对总计69名患有不同转移性癌症，采用中值是3种的先前疗法的患者(包括I期中的25名患者)进行报道。8名患者具有临床进展，并且在CT评估之前退出。单独报道13名CT可评估胰腺癌患者。相较于先前末个疗法的8周中值TTP，PDC患者中的中值TTP (进展时间)是11.9周(在2至21.4周的范围内)。
总计48名患有不同癌症的患者进行至少1次CT评估，由此确定最佳响应(未显示)和进展时间(TTP；未显示)。为概述最佳响应数据，在8名可评估TNBC (三阴性乳腺癌)患者中，有2名PR (部分响应)，4名SD (稳定疾病)和2名PD (进行性疾病)，总响应[PR + SD]是6/8 (75%)。对于SCLC (小细胞肺癌)，在4名可评估患者中，有2名PR，0名SD和2名PD，总响应是2/4 (50%)。对于CRC (结肠直肠癌)，在18名可评估患者中，有1名PR，11名SD和6名PD，总响应是12/18 (67%)。对于食道癌，在4名可评估患者中，有1名PR，2名SD和1名PD，总响应是3/4 (75%)。对于NSCLC (非小细胞肺癌)，在5名可评估患者中，有1名PR，3名SD和1名PD，总响应是4/5 (80%)。对于所有治疗患者，在48名可评估患者中，有7名PR，27名SD和14名PD，总响应是34/48 (71%)。这些结果证明抗TROP-2 ADC (hRS7-SN-38)在人患者中显示针对广泛范围的实体肿瘤的显著临床功效。
报道的疗法副作用(不利事件)概述于表13中。如由表13的数据显而易知，在ADC的各种剂量下实现hRS7-SN-38的治疗功效，同时显示可接受地低水平的不利副作用。
表13.
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对抗Trop-2 ADC的示例性部分响应由CT数据(未显示)确认。作为在CRC的情况下的一示例性PR，1名首次被诊断有CRC的62岁妇女经受初级半结肠切除术。4个月后，她进行对肝转移的肝切除，并且接受7个月的FOLFOX治疗和1个月的5FU。她主要在肝中呈现有多个病变(根据免疫组织学分析处于3+ Trop-2)，在初始诊断之后约1年以8 mg/kg的起始剂量是进入hRS7-SN-38试验。在她的首次CT评估时，实现PR，靶标病变降低37%(未显示)。所述患者继续治疗，在治疗10个月之后实现减少65%的最大降低(未显示)，伴有CEA从781 ng/mL降低至26.5 ng/mL，随后在3个月后进展。
作为在NSCLC的情况下的一示例性PR，1名65岁男性被诊断有IIIB期NSCLC (鳞状细胞)。卡铂/依托泊苷(3个月)与7000 cGy XRT协力进行的初始治疗导致持续10个月的响应。他接着开始塔西瓦(Tarceva)维持疗法，除经受腰部椎板切除术之外，他继续所述维持疗法直至他被考虑进行IMMU-132试验。他在5个月的塔西瓦之后接受第一剂IMMU-132，在当时在右肺中呈现有5.6 cm病变，伴有大量胸腔积液。在2个月后，他已刚好完成他的第6剂，此时首次CT显示原发性靶标病变降低至3.2 cm (未显示)。
作为在SCLC的情况下的一示例性PR，1名65岁妇女被诊断有不良分化的SCLC。在接受在2个月之后以无响应结束的卡铂/依托泊苷(Topo-II抑制剂)，继之以在2个月之后也以无响应结束的拓扑替康(Topo-I抑制剂)之后，她接受在1个月后结束的局部XRT (3000cGy)。然而，截至次月，进展已继续。所述患者在下月开始采用IMMU-132 (12 mg/kg；降低至6.8 mg/kg；Trop-2表达3+)，并且在2个月的IMMU-132之后，靶标病变降低38%，包括存在的主要肺病变的实质性减轻(未显示)。患者在接受12剂之后在3个月后进展。
这些结果是显著的，因为它们证明抗Trop-2 ADC甚至在多种先前疗法之后已失败或进展的患者中也是有效的。
总之，在所用剂量下，主要毒性是可管理的嗜中性白细胞减少症，伴有少许3级毒性。IMMU-132在患有三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌和食道癌的复发/难治性患者中显示活性迹象(PR和持久SD)，所述患者包括关于拓扑异构酶I抑制剂疗法具有先前复发史的患者。这些结果显示抗Trop-2 ADC在广泛范围的对现存疗法具有抗性的癌症的情况下具有功效。
实施例15. CD22抗体(依帕珠单抗)缀合的SN-38用于血液学恶性肿瘤的治疗
摘要
我们先前发现当用允许每24小时约50%的IgG结合的SN-38在血清中解离的接头制备时，可成功使用缀合有SN-38的缓慢内化抗体。在这个研究中，考查用分别是人源化抗CD22 IgG和抗CD20 IgG的依帕珠单抗(快速内化)和维妥珠单抗(缓慢内化)制备的SN-38缀合物用于治疗B细胞恶性肿瘤的功效。两种抗体–药物缀合物针对多种人淋巴瘤/白血病细胞系均具有类似纳摩尔活性，但SN-38的缓慢释放使甚至相对于无关缀合物进行的体外效能辨别受连累。当使SN-38稳定连接于抗CD22缀合物时，它的效能降低40至55倍。因此，仅用稳定性较小的缓慢解离接头进行进一步研究。在体内，发现尽管Ramos表达的CD20是CD22的15倍多，但在小鼠携带的Ramos异种移植物中，在CD22抗体–药物缀合物与CD20抗体–药物缀合物之间，抗肿瘤活性类似，从而表明依帕珠单抗–SN-38缀合物(Emab–SN-38)的内化使它的活性增强。在体内，Emab–SN-38比非结合无关IgG–SN-38缀合物更有效，从而在非毒性剂量下消除大多数明确产生的Ramos异种移植物。体外和体内研究显示Emab–SN-38可与未缀合维妥珠单抗组合以达成更有效治疗。因此，Emab–SN-38在充分低于毒性水平的剂量下在淋巴瘤和白血病的情况下具有活性，因此代表一种单独或与抗CD20抗体疗法组合具有治疗潜力的新型有前景的药剂。(Sharkey等, 2011, Mol Cancer Ther 11:224–34)。
引言
大量尝试已集中于对白血病和淋巴瘤的生物治疗，其中未缀合抗体(例如利妥昔单抗、阿仑单抗、奥法珠单抗(ofatumumab))、放射免疫缀合物(90Y-替伊莫单抗tiuxetan、131I-托西莫单抗)和药物缀合物(吉妥单抗奥佐米星)受到美国食品与药物管理局(FDA)核准。另外抗体–药物缀合物(ADC)布妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin) (SGN-35；CD30抗体-澳瑞他汀E)近来受到由FDA加速核准用于霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。也存在处于临床前和临床开发中的许多靶向CD19、CD22、CD37、CD74和CD79b的其它ADC。
针对所有这些靶标的抗体都是对药物的载体的合理选择，因为它们具有内化性。CD22的内化和特异性已使得它成为特别重要的白血病和淋巴瘤靶标，有至少3种不同抗CD22缀合物处于临床探究中，包括CMC-544 (酸不稳定性缀合卡奇霉素)、抗CD22-美登素缀合物(稳定连接的MCC-DM1)和CAT-3888 (正式称为BL22；假单胞菌外毒素单链融合蛋白)。所有这些缀合物中的活性剂都具有低于纳摩尔的效能(即所谓超级毒素)。
我们近来开发了用以使抗体与由前药伊立替康获得的具有低纳摩尔效能的拓扑异构酶I抑制剂SN-38缀合的方法(Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-62；Moon等, 2008, J Med Chem 51:6916-26)。初始使用用缓慢内化抗CEACAM5抗体制备的缀合物考查4种SN-38键联化学物质(Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-62；Moon等, 2008, J Med Chem 51:6916-26)。缀合物保留CEACAM5结合性，但在SN-38于人血清中的解离速率方面不同，其中半衰期从约10至67小时变化(Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-62)。最终，选择具有中等稳定性(在24–35小时内解离约50%)的指定为CL2的接头以进行进一步开发。近来对CL2进行修改，消除组织蛋白酶B可裂解二肽中的苯丙氨酸以简化和改进制造产率。新衍生物，指定为CL2A，保留与SN-38的pH敏感性碳酸酯键，但它不再由组织蛋白酶B选择性裂解。尽管如此，相较于原始CL2接头，它具有相同血清稳定性和改进的体内活性(Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69)。因为用缓慢内化抗CEACAM5-SN-38在无毒性下得到显著功效，所以我们假定它的活性由在它定位于肿瘤中之后SN-38从抗体的缓慢释放加以辅助。因此，这个报道中的主要目标在于评估使用CL2A接头与对B细胞癌具有高度特异性，但在它们的抗原表达和内化性质方面不同的两种抗体一起制备的缀合物的治疗前景。
依帕珠单抗(Emab)是一种已在淋巴瘤和白血病的情况下以未缀合或缀合形式充分评估的快速内化(例如在1小时内≥50%)人源化抗CD22 IgG1。维妥珠单抗(Vmab)是一种也在临床上研究，但缓慢内化(例如在1小时内约10%)的人源化抗CD20抗体。在非霍奇金淋巴瘤中，相比于CD22，CD20通常在高得多的水平下表达，而CD22优先在急性淋巴母细胞性白血病(ALL)的情况下而非在多发性骨髓瘤中表达。两种抗体作为未缀合药剂在患者中均有效，但仅维妥珠单抗在鼠异种移植物模型中具有活性(Stein等, 2004, Clin Cancer Res10:2868-76)。基于显示90Y-Emab与未缀合维妥珠单抗组合在NHL模型中具有增强的功效的先前研究(Mattes等, 2008, Clin Cancer Res 14:6154-60)，我们也考查Emab–SN-38 +Vmab组合，因为这可在不竞争相同靶标抗原或具有额外毒性下提供额外益处。
材料和方法
细胞系。Ramos、Raji、Daudi (伯基特淋巴瘤)和JeKo-1 (套细胞淋巴瘤)购自美国典型培养物保藏中心。REH、RS4;11、MN-60和697 (ALL)购自德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)。WSU-FSCCL (滤泡性NHL)是Mitchell R. Smith博士(Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA)的赠品。所有细胞系都于含有10至20%胎牛血清的推荐补充培养基中在37℃下在含湿气CO2孵育器(5%)中培养，并且定期检查支原体。
抗体和缀合方法。依帕珠单抗和维妥珠单抗分别是人源化抗CD22 IgG1和抗CD20IgG1单克隆抗体。人源化抗CEACAM5 IgG1拉贝珠单抗(Lmab)和人源化抗Trop-2抗体RS7(两者均来自Immunomedics, Inc.)用作非结合无关对照。在本文中，Emab–SN-38、Vmab–SN-38和Lmab–SN-38是指使用上述CL2A接头制备的缀合物。在人血清中进行的体外研究显示每天约50%的活性SN-38部分从IgG释放(Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69)。另一接头，命名为CL2E，在人血清中稳定超过14天，但它含有用以当在溶酶体中加工时促进SN-38释放的组织蛋白酶B裂解位点。用以制备CL2E的方法以及CL2A和CL2E接头的结构在以上实施例中给出。缀合物含有每个IgG约6个SN-38单元(例如1.0 mg IgG–SN-38缀合物含有约16 μg SN-38)。
体外细胞结合和细胞毒性。使用在4℃下孵育1小时的未缀合特异性和无关抗体进行流式细胞术，其中使用也在4℃下孵育1小时的异硫氰酸荧光素(FITC)-Fcγ片段特异性山羊抗人IgG (Jackson ImmunoResearch)揭示结合。使用CellQuest软件包，在FACSCALIBUR®流式细胞仪(Becton Dickinson)上测定中值荧光。
使用MTS染料还原测定(Promega)测定细胞毒性。由一式三份测定的平均值产生剂量–响应曲线[用/不用山羊抗人Fcγ F(ab′)2；Jackson ImmunoResearch]，并且使用PRISM® GraphPad软件(v5)计算IC50值，使用F检验对最佳似合曲线进行数据统计比较。将显著性设置在P < 0.05下。
免疫印迹。在暴露于测试药剂24或48小时之后，通过Western印迹来揭示早期(p21表达)和晚期(PARP裂解)凋亡的标志物。
体内研究。通过将由培养物获得的1 × 107个细胞(0.2 mL) (>95%活力)植入4至6周龄雌性裸小鼠(Taconic)中来创始皮下Ramos模型。从植入开始3周，将具有在0.4至0.8cm3 (由测径规测量，L × W × D)的范围内的肿瘤的动物分至各自具有相同肿瘤尺寸范围的各个动物组中。至少每周一次测量肿瘤尺寸和体重，其中当肿瘤生长至3.0 cm3时或如果动物经历体重减轻20%或更多，那么将它们从研究移除。通过分别在雌性重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠(Taconic)中静脉内注射2.5 × 106和1 × 107个细胞来创始静脉内WSU-FSCCL和697模型。在施用WSU-FSCCL细胞之后5天以及在697接种之后7天开始治疗。每日观察动物，使用后腿麻痹或其它发病率征象作为替代存活终点。所有治疗都以≤0.2 mL在腹膜内给予。特定剂量和频率在结果部分中给出。因为小鼠使伊立替康高效转化成SN-38，所以基于SN-38当量调整伊立替康给药；SN-38摩尔当量基于1.6%的ADC质量和60%的伊立替康质量。
用卡普兰–迈耶曲线表示功效，使用进展时间(TTP)作为替代存活终点，如上所指示。使用PRISM® GraphPad软件，通过对数秩检验来进行统计分析(显著性，P < 0.05)。
结果
体外抗原表达和细胞毒性。所有细胞系都高度易感于SN-38，其中EC50值在0.13nmol/L (针对Daudi)至2.28 nmol/L (针对RS4;11)的范围内(表14)。除697和RS4;11之外，Emab–SN-38抗CD22缀合物的有效性是SN-38的2至7倍小。这是用我们的靶向以及其它非靶向SN-38缀合物获得的共同研究结果。尽管在抗原表达方面有差异，但Emab–SN-38和Vmab–SN-38与非结合Lmab–SN-38抗CEACAM5缀合物具有类似效能，此可能由于在4天MTS测定期间SN-38解离约90%。使用较短暴露时间的其它体外程序在辨别缀合物的效能差异方面也是无效的。举例来说，在1天暴露之后膜联蛋白V (Annexin V)染色未能发现未处理细胞与处理细胞之间的差异(未显示)。p21上调和PARP裂解也分别作为早期和晚期凋亡标志物加以考查。Ramos不表达p21。然而，检测到PARP裂解，不过是仅在48小时暴露之后，其中在SN-38处理细胞中更强烈表现(未显示)。WSU-FSCCL细胞系表达p21，但p21上调和PARP裂解均不明显直至在Emab–SN-38暴露之后48小时。然而，在游离SN-38的情况下，在24小时暴露之后观察到两者(未显示)。尽管在游离SN-38的情况下凋亡事件的增强的强度和较早活化与它的EC50低于IgG缀合形式一致，但结果指示将需要至少48小时的暴露时期，不过在此时，约75%的SN-38将从缀合物释放。
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缩写：CI，置信区间；ND，未测出。aEC50表示为Emab–SN-38中的SN-38的摩尔当量。
我们再次考查PARP裂解和p21表达，这次在用Emab–SN-38 + Vmab处理的细胞中。确认了在Ramos中的早先研究，PARP裂解最初仅在暴露于缀合物48小时之后发生，在交联抗体存在下表达不变(未显示)。暴露于维妥珠单抗超过48小时对PARP裂解不具有影响，但当添加交联抗体时，裂解在24小时内是强烈的(未显示)。然而，当使单独维妥珠单抗(无交联剂)与Emab–SN-38组合时，在24小时暴露之后发生PARP裂解(未显示)，从而指示维妥珠单抗可诱导更快速的凋亡发生，即使在不存在交联下。在WSU-FSCCL细胞系的情况下的唯一值得注意的差异是组合极大增强在48小时时的p21表达(未显示)，再次表明当使维妥珠单抗与Emab–SN-38缀合物组合时，凋亡诱导得以加速。相较于Ramos，WSU-FSCCL中的凋亡诱导的延迟可能由CD22和CD20的表达较低解释。
超级毒性剂常使用在血清中高度稳定的接头，因为它们的过早释放将使毒性增加，但这些缀合物必须被内化以达成药物最优递送。因为依帕珠单抗快速内化，所以我们将CL2A连接的Emab–SN-38缀合物与血清稳定性CL2E–SN-38缀合物进行体外细胞毒性比较来考查它是否可能受益于更稳定连接的SN-38。两种缀合物均具有类似结合亲和力(未显示)，但在3种细胞系的情况下，更稳定的Emab–CL2E–SN-38的强力性是CL2A缀合物的约40至55倍小(未显示)。尽管在CL2A缀合物的情况下缺乏特异性，但Emab–CL2E–SN-38的强力性始终是非结合Lmab–CEACAM5抗体–CL2E–SN-38缀合物的约2倍大(未显示)。我们推断不可能的是更稳定连接的缀合物将适于缓慢内化维妥珠单抗缀合物，因此仅用CL2A连接的SN-38缀合物继续我们的探究。
由于体外测定的限制，所以在异种移植物模型中评估功效。如表14中所指示，相比于CD22，所有淋巴瘤细胞系都具有高得多的CD20表达。Daudi具有最高CD22和CD20表达，但它在体内对未缀合维妥珠单抗极其敏感，并且体外测试揭示对SN-38的敏感性最高(表14)。这些性质将可能使得难以相对于未缀合抗体来评估归因于SN-38缀合物的活性差异，特别是当未缀合依帕珠单抗在动物中不是有效治疗剂时。因为Ramos先前已用于显示使90Y-Emab与维妥珠单抗组合的优势(Mattes等, 2008, Clin Cancer Res 14:6154-60)，所以我们决定以在Ramos人伯基特细胞系中比较Emab–SN-38缀合物和Vmab–SN-38缀合物开始。尽管流式细胞术显示CD20表达是CD22的15倍高，但对Ramos异种移植物的免疫组织学分析显示有充足CD22和CD20，其中CD22似乎比CD20更均一表达(未显示)。
未治疗动物中的Ramos异种移植物快速进展，在6天内从它们的起始尺寸0.4 cm3达到3.0 cm3终末尺寸(未显示)，并且如先前所报道，维妥珠单抗和依帕珠单抗均不可观影响明确建立的Ramos异种移植物的进展(Sharkey等, 2009, J Nucl Med 50:444-53)。与使用其它SN-38缀合物获得的先前研究结果一致，用4周每周两次0.5 mg/剂治疗方案治疗的动物都不具有可观重量减轻。两种缀合物均高度有效控制肿瘤生长，其中到4周治疗结束时，80%或更多的动物不具有肿瘤迹象(图12A-12D)。0.25 mg Vmab–SN-38剂量历经前4周在控制生长方面更好，但在0.5 mg下，观察到两种缀合物达成类似早期生长控制。因此，尽管CD20表达是CD22的15倍高，但Emab–SN-38有利地与Vmab–SN-38相匹敌。因此，剩余研究集中于单独或与未缀合维妥珠单抗组合的Emab–SN-38。
Emab–SN-38剂量–响应和特异性。观察到特异性Emab–SN-38和无关Lmab–SN-38缀合物的剂量–响应关系，但Emab–SN-38在3个测试水平中的2个下具有显著更好生长控制，并且在中等剂量下伴有有利于特异性缀合物的强烈趋势(图13A-13C)。再次，0.25 mg Emab–SN-38使大多数肿瘤去除；此处，10个动物中的7个在12周监测时期结束时无肿瘤，不具有体重变化。被给予单独伊立替康(6.5 μg/剂；与0.25 mg缀合物具有近似相同的SN-38当量)的动物具有1.9周的中值存活期，其中11个动物中的3个在研究结束时无肿瘤，此不显著不同于无关Lmab–SN-38缀合物达成的3.45周中值存活期(P = 0.452；图13C)。
在697散播白血病模型中，盐水治疗的动物的中值存活期仅是从肿瘤接种开始17天。被给予未缀合依帕珠单抗加伊立替康(与0.5 mg缀合物具有相同摩尔当量的SN-38)的动物具有相同中值存活期，而从肿瘤接种7天开始每周两次给予0.5 mg Emab–SN-38的动物存活至24.5天，显著长于未治疗动物(P < 0.0001)或未缀合依帕珠单抗与伊立替康一起给予的动物(P = 0.016)。然而，Emab–SN-38不显著好于无关缀合物(中值存活期= 22天；P =0.304)，最可能反映这个细胞系中的CD22表达较低。
Emab–SN-38与未缀合Vmab CD20抗体组合。我们先前报道当在皮下Ramos模型中使90Y-Emab与未缀合维妥珠单抗组合时，响应改进(Mattes等, 2008, Clin Cancer Res14:6154-60)，因此用Emab–SN-38考查这个可能性。在探索性研究中，对5个携带平均是约0.3 cm3的皮下Ramos肿瘤的动物给予维妥珠单抗(0.1 mg)、0.1 mg Emab–SN-38或Emab–SN-38 + Vmab (所有药剂都每周两次持续4周给予)。达到2.0 cm3的中值TTP分别是22、14和超过77天(维妥珠单抗相对于单独Emab–SN-38，P = 0.59；Emab–SN-38 + Vmab相对于Emab–SN-38，P = 0.0145)，从而提供维妥珠单抗与Emab–SN-38的组合使总治疗响应改进的初始指示。在也使用每周两次4周治疗方案的追踪研究中，11个被给予0.1 mg Emab–SN-38加0.1 mg维妥珠单抗的动物中的6个从治疗开始16周不具有肿瘤迹象，而接受单独维妥珠单抗或采用0.1 mg对照Lmab–SN-38的动物的中值存活期分别是1.9和3.3周，其中在这些组的各自中，在16周，11个动物中的3个无肿瘤(未显示)。尽管中值TTP更长以及存活者更多，但在各组之间未见显著差异。因此，在具有充足CD20和中等水平的CD22的Ramos模型中，在非毒性剂量水平下给予的Emab–SN-38缀合物不显著好于未缀合抗CD20疗法，但向未缀合抗CD20疗法添加Emab–SN-38似乎使响应改进而无毒性。重要的是强调SN-38缀合物是在远小于它们的最大耐受剂量的水平下给予，因此，这些结果不应解释为未缀合CD20抗体疗法与Emab–SN-38缀合物的疗法等同。
使用具有低表达的CD20和CD22的WSU-FSCCL滤泡性NHL细胞系，在静脉内植入模型中进行两项额外研究(未显示)。盐水治疗动物的中值存活时间是从肿瘤植入开始40至42天。以与0.3 mg ADC含有相同SN-38当量的剂量给予的单独伊立替康(未显示)使中值存活期增加(分别是49天相对于40天；P = 0.042)，但15个动物中的14个在第49天死于疾病进展，在同一天盐水组中15个动物中的最终4个被去除(未显示)。尽管它的CD20表达相对较低，但单独维妥珠单抗(35 μg每周两次×4周)在这个模型中是有效的。在第一研究中，中值存活期增加至91天，有2例治愈(第161天)，并且在第二研究中，中值存活期增加至77天，但在89天之后无存活者(单独维妥珠单抗相对于盐水治疗，在两个研究中，P < 0.001)。未缀合依帕珠单抗(0.3 mg/剂)与伊立替康和维妥珠单抗组合与单独维妥珠单抗具有相同中值存活期，从而表明依帕珠单抗和伊立替康均不促成净响应。
如所预期，由于由WSU-FSCCL达成的CD22表达较低，所以单独Emab–SN-38不如同Ramos中一样有效。在0.15 mg剂量下，未观察到超过盐水组的显著益处，但在0.3 mg下，中值存活期增加至63天，从而相较于盐水治疗动物提供显著改进(P = 0.006)。使用0.3 mgEmab–SN-38进行的第二研究确认相较于盐水组，存活期增加(75天相对于40天；P <0.0001)。在第一研究中，这个响应的特异性不明显，其中在0.15或0.3 mg剂量水平下，无关Lmab–SN-38缀合物和Emab–SN-38达成的中值存活期并不不同(对于Emab–SN-38相对于抗CEACAM5–SN-38缀合物，在2个剂量水平下分别是42天相对于49天以及63天相对于63天)。然而，在第二项研究中，0.3 mg剂量的Emab–SN-38提供超过无关缀合物的显著改进存活期(75天相对于49天；P < 0.0001)。再次，在这个模型中难以显示特异性最可能与CD22表达较低相关。
组合特异性Emab–SN-38与维妥珠单抗使存活期实质上增加，有迹象表明响应比对照Lmab–SN-38更稳健。举例来说，在第一项研究中，用维妥珠单抗加0.15或0.3 mg对照缀合物治疗的动物分别具有98和91天的中值存活期，此类似于单独维妥珠单抗达成的中值存活期(91天；未显示)。然而，维妥珠单抗加0.15 mg特异性Emab–SN-38缀合物使中值存活期增加至140天。尽管这个改进不显著高于单独维妥珠单抗(P = 0.257)，但当使Emab–SN-38剂量增加至0.3 mg与维妥珠单抗一起时，10个动物中的6个在研究结束时保持存活，从而提供超过对照缀合物加维妥珠单抗的显著存活优势(P = 0.0002)。在第二项研究中，单独维妥珠单抗达成的中值存活期短于第一研究中(77天相对于91天)，但对照缀合物与维妥珠单抗一起达成的中值存活期再次是91天，此现时产生超过单独维妥珠单抗的显著存活优势(P <0.0001)。组合特异性Emab–SN-38缀合物与维妥珠单抗使中值存活期延长至126天，此显著长于单独Emab–SN-38和维妥珠单抗达成的分别是75和77天的中值存活期(对于各自，P <0.0001)。然而，在这个研究中，它不十分满足超过与对照CEACAM5抗体–SN-38缀合物的组合而达成统计改进的要求(P = 0.078)。
讨论
在过去10年，ADC已在癌症治疗方面取得实质性进步，但也已存在一些阻碍。进步主要出现在研究者选择考查以下药剂时：所述药剂太具毒性以致不能单独使用，但当偶联于抗体时，这些所谓超级毒素在临床前测试中产生实质上改进的响应。新近核准作为澳瑞他汀缀合物的布妥昔单抗维多汀用于霍奇金淋巴瘤以及用曲妥珠单抗–DM1 抗HER2美登素缀合物作为单一药剂在为未缀合曲妥珠单抗所难治的乳腺癌的情况下获得的临床成功表明携带超级毒性剂的这些ADC正变为接受的治疗形式。然而，用自身强力性在皮体积摩尔浓度范围内的药剂制备的缀合物可具有增加的毒性风险，如新近决定从市场撤回抗CD33-卡奇霉素缀合物吉妥单抗奥佐米星所表明(Ravandi, 2011, J Clin Oncol 29:349-51)。因此，ADC的成功可取决于鉴定适当化学物质来使药物和抗体结合在一起，以及确定经充足表达以允许充分和选择性递送细胞毒性剂的适合靶标。
我们开发一种用于使SN-38偶联于IgG的接头，其允许SN-38在血清中从缀合物缓慢释放(每天约50%)。采用这个接头，缓慢内化的抗体可为有效治疗剂，也许因为定位于肿瘤的缀合物局部释放足量药物，即使在未被内化的情况下。CL2A接头近来也与据报道快速内化的针对Trop-2的抗体一起使用(Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69.)。因此，似乎缓慢释放机理有益于内化抗体和非内化抗体。
在这个报道中，我们通过关于治疗B细胞恶性肿瘤来比较用快速内化抗CD22 IgG依帕珠单抗和缓慢内化抗CD20 IgG维妥珠单抗制备的SN-38缀合物来扩大我们对CL2A接头的评估，并且我们现时已发现与显示协同抗肿瘤作用的DNA断裂剂诸如微管抑制剂和PARP抑制剂的组合。用依帕珠单抗的鼠亲本抗体进行的先前研究已指示大多数抗体在1小时内内化，并且50%的CD22在5小时内在细胞表面上再表达(Shih等, 1994, Int J Cancer 56:538-45)。这个内化和再表达过程将容许可能弥补CD22的较低表面表达的细胞内递送。因为许多B细胞恶性肿瘤表达的CD20比CD22更多，所以靶向CD20的缀合物通过在定位于肿瘤中之后释放它的毒性有效载荷而可能递送更多摩尔的药物。
由于SN-38从缀合物释放至培养基中，所以体外细胞毒性研究不可辨别特异性缀合物或甚至无关缀合物的效能。实际上，单独SN-38比缀合物稍微更强力，此可反映它加速进入细胞并衔接拓扑异构酶I的能力。因为其它研究揭示在可观察到早期凋亡征象之前缀合物需要48小时暴露，所以我们推断体外测试将不能辨别这2种缀合物的效能，因此借助于体内研究。
在异种移植物模型中，两种缀合物针对Ramos肿瘤均具有类似抗肿瘤活性，流式细胞术已指示所述Ramos肿瘤表达的CD20是CD22的接近15倍多。这支持选择Emab抗CD22–SN-38缀合物，尤其是因为它可与未缀合Vmab CD20抗体疗法组合，而不涉及任一药剂将干扰另一药剂的结合。实际上，如果使用抗CD20–SN-38缀合物，那么可能给予的总IgG蛋白剂量将低于通常为有效未缀合抗CD20抗体治疗所需的水平，因为剂量限制性毒性将由SN-38含量驱动。向抗CD20–SN-38缀合物中添加更多未标记CD20抗体将有降低缀合物的摄取以及潜在减弱它的功效的风险。然而，如我们先前在使用放射性标记依帕珠单抗与未缀合维妥珠单抗进行的组合研究中所显示，可由在它们的最大有效和安全剂量下给予的两种药剂获得益处。体外研究显示即使在不存在用于增强信号传导的交联下，维妥珠单抗也使以Emab–SN-38引发的凋亡事件加速。因此，只要Emab–SN-38缀合物与抗CD20缀合物同样有效，那么选择Emab–SN-38缀合物就是合理选择，因为它允许达成更有效的组合疗法，即使在其中所述抗原中的一者或两者在表达方面较低的肿瘤的情况下。
因为使用超级毒性药物的大多数ADC经稳定连接，所以我们也测试具有血清稳定性，但在细胞内可裂解的抗CD22–SN-38缀合物，但确定相比于CL2A接头，它的强力性是40至55倍小。其他人已考查缀合于抗CD20抗体或抗CD22抗体的多种超级毒性药物，发现内化缀合物通常更具有活性，但也观察到如果释放的药物穿透细胞膜，那么即使缓慢内化抗体也可有效。尽管CL2A型接头可适于SN-38，但它对于其中即使在血清中少量持续释放也将使毒性增加并损害治疗窗的更具毒性的药剂可能不是最优的。
Emab–SN-38在0.6 mg的累积剂量下在携带Ramos的小鼠中具有活性(75 μg每周两次，持续4周)，此外推至人剂量仅2.5 mg/kg。因此，Emab–SN-38在患者中应具有宽大治疗窗。此外，使有效和安全剂量的Trop-2抗体–SN-38缀合物与最大耐受剂量的90Y标记的抗体组合，而无可观毒性增加，但伴有功效改进(Sharkey等, 2011, Mol Cancer Ther 10:1072-81)。因此，这些SN-38抗体缀合物的安全性和功效概况极其有利于其它组合疗法。
尽管伊立替康不常规用于治疗造血性癌症，但SN-38在淋巴瘤和白血病细胞系中与在实体肿瘤中同样强力(Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69.)。在WSU-FSCCL细胞系中，特异性IgG缀合物和无关IgG缀合物显著好于伊立替康，而在Ramos中，相比于伊立替康，用无关缀合物达成的中值TTP更久但不显著更好。这些结果与已显示非特异性IgG是卓越药物载体，并且相比于游离药物或用白蛋白或聚乙二醇(PEG)-Fc制备的缀合物，在体内更强力的其它研究一致。尽管PEG–SN-38缀合物具有显著抗肿瘤作用，但它是在它的于10至30 mg/kg SN-38当量的范围内的最大耐受量下给予(Sapra等, 2009,Haematologica 94:1456-9)。相比之下，历经4周对携带Ramos的动物给予的SN-38的最大累积剂量仅是1.6 mg/kg (即用每周两次历经4周给予的0.25 mg Emab–SN-38给药)，并且这是非毒性的。
Emab–SN-38的特异性治疗活性似乎在具有较高CD22表达的细胞系中改进。举例来说，在Ramos中，在考查的3个不同剂量水平中的2个下记录到单独Emab–SN-38的特异性治疗作用，并且相当大数目的肿瘤被完全去除。相比之下，在具有约2.5倍低的CD22表达的WSU-FSCCL中，在2个研究中的1个中，相较于无关CEACAM5抗体–SN-38缀合物，Emab–SN-38使存活期显著改进。然而，重要的是强调当与未缀合CD20抗体疗法组合使用时，Emab–SN-38使治疗响应放大。因此，这两种治疗的组合可甚至在其中CD22不高度表达的情况下使响应加强。
总之，使用稳定性较小的CL2A–SN-28接头，Emab CD22抗体–SN-38缀合物在体内在非毒性剂量下与类似抗CD20–SN-38缀合物同等具有活性，尽管CD20表达是CD22的超过对数倍高。即使在CD22表达较低时，治疗响应也受益于Emab–SN-38与未缀合Vmab抗CD20疗法的组合，从而表明当两种抗原均存在时，组合疗法可在许多B细胞恶性肿瘤的情况下使响应改进。当前研究表明这个组合在不同淋巴瘤和白血病临床前模型中极其强力，又似乎具有较小宿主毒性。此外，这个ADC与微管抑制剂和PARP抑制剂的组合可在抑制肿瘤生长和延长携带肿瘤的宿主的存活期方面协同。这个结果是惊人的，因为先前已报道PARP抑制剂依尼帕尼未能使癌细胞对与标准抗癌剂诸如顺铂、吉西他滨或紫杉醇的组合疗法敏感(Bao等,2015, Oncotarget [电子出版先于印刷,2015年9月22日])。
实施例16. CD74抗体(米拉珠单抗)SN-38缀合物用于治疗CD74+人癌症
摘要
CD74是抗体-药物缀合物(ADC)的具有吸引力的靶标，因为它在抗体结合之后内化并再循环。CD74主要与血液学癌症相关联，但也在实体癌中表达。因此，考查用人源化抗CD74抗体米拉珠单抗制备的ADC用于治疗表达CD74的实体肿瘤的效用。用在它们于血清中的稳定性以及它们如何在溶酶体中释放SN-38方面不同的可裂解接头(CL2A和CL2E)制备米拉珠单抗-多柔比星和两种米拉珠单抗-SN-38缀合物。通过流式细胞术和免疫组织学分析来测定CD74表达。在人癌细胞系A-375 (黑素瘤)、HuH-7和Hep-G2 (肝细胞瘤)、Capan-1(胰腺癌)和NCI-N87 (胃癌)和Raji伯基特淋巴瘤的情况下进行体外细胞毒性和体内治疗研究。将米拉珠单抗-SN-38 ADC与用抗Trop-2抗体和抗CEACAM6抗体制备的SN-38 ADC在表达它们的靶标抗原的异种移植物中进行比较。
米拉珠单抗-多柔比星在淋巴瘤模型中最有效，而在A-375和Capan-1中，仅米拉珠单抗-CL2A-SN-38显示治疗益处。尽管CD74的表面表达比Trop-2或CEACAM6低得多，但米拉珠单抗-CL2A-SN-38在Capan-1中与抗Trop-2 CL2A-SN-38具有类似功效，但在NCI-N87中，抗CEACAM6缀合物和抗Trop-2缀合物是优越的。在单次剂量水平下在2种肝细胞瘤细胞系中进行的研究显示超过盐水治疗动物的显著益处，但相对于无关IgG缀合物并非如此。CD74是一些实体肿瘤异种移植物中适于ADC的靶标，其中功效主要受CD74表达的均一性的影响，并且CL2A连接的SN-38缀合物提供最佳治疗响应。
引言
CD74，被称为不变链或Ii，是一种与HLA-DR缔合，并且抑制抗原肽结合II类抗原递呈结构的II型跨膜糖蛋白。它充当伴侣蛋白分子将不变链复合物引导至内体和溶酶体中，在使用由NF-kB介导的路径达成的B细胞成熟中以及在通过与CD44相互作用达成的T细胞应答中充当辅助分子(Naujokas等, 1993, Cell 74:257-68)，并且它是活化性细胞增殖和存活路径中涉及的促炎性细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子的受体(Leng等, 2003, J Exp Med 197:1467-76)。
在正常人组织中，CD74主要在B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans cell)、各个子组的活化的T细胞以及胸腺上皮中表达(未显示)，并且它在超过90%的B细胞肿瘤中表达(Burton等, 2004, Clin Cancer Res 10:6606-11；Stein等,2004, Blood 104:3705-11)。早期研究关于CD74是否存在于膜上具有冲突数据，部分地因为针对不变链的抗体对分子的细胞质部分具有特异性，但也因为在表面上存在相对少许拷贝，并且它在细胞表面上的半衰期极短。细胞表面上约80%的CD74与MHC II抗原HLA-DR缔合(Roche等, 1993, PNAS USA 90:8581-85)。使用鼠抗CD74抗体LL1，估计Raji伯基特淋巴瘤细胞系具有4.8 x 104个拷贝/细胞，但由于快速细胞内转运，每天约8 x 106个抗体分子被内化和分解代谢(Hansen等, 1996, Biochem J 320:293-300)。因此，CD74内化是高度动态的，其中抗体被从表面快速移动，并且在细胞内部卸载，继之以CD74在表面上再表达。Fab’内化就如IgG结合一样快速发生，从而指示不需要二价结合。用CDR移植形式的鼠LL1米拉珠单抗(hLL1)进行的稍后研究发现抗体可改变B细胞增殖、迁移和粘附分子表达(Stein等,2004, Blood 104:3705-11；Qu等, 2002, Proc Am Assoc Cancer Res 43:255；Frolich等, 2012, Arthritis Res Ther 14:R54)，但抗CD74抗体的卓越内化性质使得它成为用于细胞内递送癌症治疗剂的高效载体(例如Griffiths等, 2003, Clin Cancer Res 9:6567-71)。基于临床前功效和毒理学结果，已启动用米拉珠单抗-多柔比星在多发性骨髓瘤(Kaufman等, 2008, ASH Annual Meeting Abstracts, 112:3697)以及非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病的情况下进行的I期临床试验。
引起关注的是，CD74也在非造血性癌诸如胃癌、肾癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、某些肉瘤以及胶质母细胞瘤中表达(例如Gold等, 2010, Int J Clin Exp Pathol 4:1-12)，因此它可为针对表达这个抗原的实体肿瘤的治疗靶标。因为米拉珠单抗-多柔比星缀合物在血液学癌症的模型中高度具有活性，所以它是用于这个评估的合理选择。然而，我们近来开发用于使高度强力拓扑异构酶I抑制剂SN-38偶联于抗体的程序。SN-38是伊立替康的活性形式，其药理学和代谢是熟知的。这些缀合物在实体肿瘤细胞系的情况下具有纳摩尔效能，并且发现其在抗体不主动内化的情况下具有活性。先前研究指示对允许SN-38在血清中以约1天的半衰期从缀合物解离的接头(CL2A)，而非在血清中的稳定性更大或更小的其它接头的偏好。然而，鉴于米拉珠单抗的卓越内化能力，开发一种在血清中高度稳定，但在被带入溶酶体中时可释放SN-38的新型接头。
当前探究考查使用这三种米拉珠单抗抗CD74缀合物(一种与多柔比星，并且两种是SN-38缀合物)主要针对实体肿瘤来达成有效治疗的前景。
材料和方法
人肿瘤细胞系。Raji伯基特淋巴瘤、A-375 (黑素瘤)、Capan-1 (胰腺腺癌)、NCI-N87 (胃癌)、Hep-G2肝细胞瘤和MC/CAR骨髓瘤细胞系购自美国组织培养物保藏中心(Manassas, VA)。HuH-7肝细胞瘤细胞系购自日本健康科学研究资源库(Japan HealthScience Research Resources Bank，Osaka, Japan)。所有细胞系都于含有10%至20%胎牛血清和补充剂的推荐培养基中在37℃下在含湿气CO2孵育器(5%)中培养。使细胞传代<50次，并且定期检查支原体。
抗体和缀合方法。米拉珠单抗(抗CD74 MAb)、依帕珠单抗(抗CD22)、维妥珠单抗(抗CD20)、拉贝珠单抗(抗CEACAM5)、hMN15 (抗CEACAM6)和hRS7 (抗Trop-2)是人源化IgG1单克隆抗体。如以上实施例中所述制备CL2A和CL2E接头以及它们的SN-38衍生物，并且使其缀合于抗体。如先前所述制备米拉珠单抗-多柔比星缀合物(Griffiths等, 2003, Clin Cancer Res 9:6567-71)。所有缀合物都通过对IgG进行二硫化物还原，随后与这些接头的相应顺丁烯二酰亚胺衍生物反应来制备。分光光度分析估计药物:IgG摩尔取代比率是5-7(1.0 mg蛋白质含有约16 μg SN-38或25 μg多柔比星当量)。
体外细胞结合和细胞毒性。各种测定用以比较未缀合米拉珠单抗和缀合米拉珠单抗对抗原阳性细胞的细胞结合，并且细胞毒性测试使用MTS染料还原法(Promega,Madison, WI)。
流式细胞术和免疫组织学分析。以提供对仅膜结合抗原或膜和细胞质抗原的评估的方式进行流式细胞术。对皮下肿瘤异种移植物的福尔马林固定、石蜡包埋切片进行免疫组织学分析，在不采用抗原修复方法下染色，在10 μg/mL下使用用抗人IgG缀合物揭示的抗体。
体内研究。雌性裸小鼠(4-8周龄)或雌性SCID小鼠(7周龄)购自Taconic(Germantown, NY)，并且在1周隔离之后使用。包括盐水对照的所有药剂都每周两次持续4周在腹膜内施用。特定剂量在结果中给出。通过每周重量测量来评估毒性。对于Raji伯基特淋巴瘤模型，用含2.5×106个Raji细胞的0.1 mL培养基静脉内注射SCID小鼠。5天后，动物接受单次静脉内注射(0.1 mL)缀合物或盐水(N = 10/组)。每日观察小鼠的痛苦和麻痹征象，并且当显现后肢麻痹，初始重量减轻>15%，或如果另外濒死(替代存活终点)时使其安乐死。
皮下肿瘤通过测径规在两个维度中测量，并且将肿瘤体积(TV)计算为L × w 2 /2，其中L是最长直径，并且w是最短直径。至少每周一次进行测量，其中当肿瘤生长至1.0 cm3(即替代存活终点)时，使动物终止。将A-375黑素瘤细胞系(6 x 106个细胞于0.2 mL中)植入裸小鼠中，并且当肿瘤平均是0.23 ± 0.06 cm3 (N = 8/组)时启动疗法。使用由连续传代肿瘤获得的肿瘤混悬液(0.3 mL 15% w/v肿瘤混悬液)与由组织培养获得的8×106个细胞组合所达成的组合在裸小鼠中皮下植入Capan-1。当TV平均是0.27 ± 0.05 cm3 (N =10/组)时启动治疗。通过皮下注射基质胶和由终末培养获得的1×107个细胞的0.2 mL 1:1(v/v)混合物来创始NCI-N87胃肿瘤异种移植物。当TV平均是0.249 ± 0.045 cm3 (N = 7/组)时开始疗法。遵循相同程序以在裸小鼠中产生Hep-G2和HuH-7肝细胞瘤异种移植物。当Hep-G2平均是0.364 ± 0.062 cm3 (N = 5/组)，以及HuH-7平均是0.298 ± 0.055 cm3 (N= 5/组)时开始疗法。
用卡普兰-迈耶存活曲线表示功效，使用以上提及的替代终点来确定中值存活时间。使用Prism GraphPad软件(LaJolla, CA)，通过对数秩(曼特尔-考克斯(Mantel-Cox))检验来进行分析，其中在P <0.05时具有显著性。
结果
人肿瘤细胞系和异种移植物中的CD74表达。主要基于对可渗透化细胞的分析将源于4种不同实体肿瘤类型的6个细胞系鉴定为CD74阳性(表15)，因为实体肿瘤细胞系中的仅膜CD74的MFI极其经常是背景MFI的<2倍高(除A-375黑素瘤细胞系之外)。Raji中的表面CD74表达是实体肿瘤细胞系的>5倍高，但可渗透化Raji细胞中的总CD74与大多数实体肿瘤细胞系类似。
Figure 892878DEST_PATH_IMAGE026
免疫组织学分析显示Raji皮下异种移植物具有主要均一和强烈染色，伴有突出细胞表面标记(未显示)。Hep-G2肝细胞瘤细胞系具有最均一的实体肿瘤摄取，伴有中等强烈但主要在细胞质中的染色(未显示)，随后是A-375黑素瘤细胞系具有均一性稍微较小的染色，伴有更强烈但主要在细胞质中的表达(未显示)。Capan-1胰腺癌(未显示)和NCI-N87(未显示)胃癌细胞系具有中度(Capan-1)至强烈(NCI-N87)CD74染色，但这未均一分布。HuH-7肝细胞瘤细胞系(未显示)具有均一性最小和最弱染色。
缀合物的免疫反应性。未缀合米拉珠单抗、米拉珠单抗-CL2A-SN-38缀合物和米拉珠单抗-CL2E-SN-38缀合物的K d值不显著不同，分别平均是0.77 nM、0.59 nM和0.80 nM。未缀合米拉珠单抗和多柔比星缀合的米拉珠单抗的在MC/CAR多发性骨髓瘤细胞系的情况下测量的K d值分别是0.5 ± 0.02 nM和0.8 ± 0.2 nM (Sapra等, 2008, Clin Cancer Res14:1888-96)。
缀合物的体外药物释放和血清稳定性。在部分模拟溶酶体条件(即低pH (pH5.0))的环境中，以及在存在或不存在组织蛋白酶B下确定SN-38从巯基乙醇封端的CL2A和CL2E接头释放的机理。CL2E-SN-38底物在不存在酶下在pH 5下是惰性的(未显示)，但在存在组织蛋白酶B下，快速进行在Phe-Lys位点处的裂解，具有34分钟的半衰期(未显示)。活性SN-38的形成需要在SN-38的第10位置处进行氨基甲酸酯键的分子内环化，此更缓慢发生，具有10.7小时的半衰期(未显示)。
如所预期，组织蛋白酶B对CL2A接头中的活性SN-38的释放不具有影响。然而，CL2A具有可裂解碳酸苯甲酯键，在pH 5.0下在与CL2E接头类似的速率下释放活性SN-38，具有约10.2小时的半衰期(未显示)。具有pH敏感性酰腙键的米拉珠单抗-多柔比星缀合物在pH5.0下具有7至8小时的半衰期(未显示)。
尽管所有这些接头都在溶酶体相关条件下在相对类似速率下释放药物，但它们在血清中具有极其不同稳定性。米拉珠单抗-CL2A-SN-38在21.55±0.17小时内释放50%的游离SN-38 (未显示)，这与其它CL2A-SN-38缀合物一致。然而，CL2E-SN-38缀合物是高度惰性的，具有外推至约2100小时的半衰期。米拉珠单抗-多柔比星缀合物在98小时内释放50%的多柔比星，此类似于2种其它抗体-多柔比星缀合物(未显示)。
细胞毒性。与评估这些缀合物相关的一重大问题是游离多柔比星和SN-38在造血性肿瘤和实体肿瘤细胞系中的相对效能。我们的小组先前报道SN-38在若干B细胞淋巴瘤和急性白血病细胞系中具有活性，其中效能在0.13至2.28 nM的范围内(Sharkey等, 2011,Mol Cancer Ther 11:224-34)。SN-38在稍后用于体内疗法研究的4个实体肿瘤细胞系中的效能在2.0至6 nM的范围内(未显示)。多柔比星具有混合响应，在Raji淋巴瘤和A-375黑素瘤细胞系中具有3-4 nM效能，但它针对Capan-1、NCI-N87和Hep G2细胞系具有接近10倍小的强力性。将SN-38的效能与多柔比星的效能进行比较的其它研究发现：LS174T结肠癌，18相对于18 (分别是SN-38相对于多柔比星的nM效能)；MDA-MB-231乳腺癌，2 nM相对于2 nM；SK-OV-4卵巢癌，18 nM相对于90 nM；Calu-3肺腺癌，32 nM相对于582 nM；Capan-2胰腺癌，37 nM相对于221 nM；以及NCI-H466小细胞肺癌，0.1 nM相对于2 nM。因此，在这6个细胞系中的4个中，SN-38的强力性是多柔比星的5至20倍多，在LS174T和MDA-MB-231中具有类似效能。总之，这些数据指示多柔比星针对实体肿瘤的有效性小于SN-38，而在实体肿瘤和造血性肿瘤中，SN-38似乎同等有效。
如所预期，在体外，3种缀合物形式的强力性常常是游离药物的某一数量级小，因为预期两种药物均易于转运至细胞中，而药物缀合物需要抗体结合以在细胞内部转运药物(未显示)。CL2A连接的SN-38缀合物是例外，因为历经4天测定时期，超过90%的SN-38从缀合物释放至培养基中(Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69；Sharkey等,2011, Mol Cancer Ther 11:224-34)。因此，即使缀合物被快速内化，也将难以辨别游离药物与CL2A连接的药物之间的差异。
相较于游离SN-38，稳定CL2E连接的SN-38在Raji细胞系的情况下表现相对良好，但它在4个实体肿瘤细胞系中具有实质上(7至16倍)较低效能，从而表明CD74的相对低表面表达可在使药物在这些实体肿瘤中的转运最小化方面起作用。在所有细胞系中，相较于游离多柔比星，米拉珠单抗-多柔比星缀合物在它的效能方面都具有实质性差异，此与在实体肿瘤细胞系中CL2E-SN-38缀合物相对于游离SN-38具有类似量级。
在以上提及的6个额外细胞系中，米拉珠单抗-CL2A-SN-38缀合物的强力性是米拉珠单抗-多柔比星缀合物的9至60倍大(未显示)，但再次，这个结果主要受以下事实影响：历经4天孵育期，CL2A连接的缀合物使它的大多数SN-38释放至培养基中，而多柔比星缀合物历经这个相同时间将至多释放它的50%药物。未在这些其它细胞系的情况下考查CL2E连接的米拉珠单抗。
人肿瘤异种移植物的体内疗法。用米拉珠单抗-多柔比星或以各种抗体制备的SN-38缀合物进行的先前体内研究已指示它们在远低于它们的最大耐受剂量的剂量下是有效的(Griffiths等, 2003, Clin Cancer Res 9:6567-71；Sapra等, 2005, Clin Cancer Res 11:5257-64；Govindan等, 2009, Clin Cancer Res 15:6052-61；Cardillo等, 2011,Clin Cancer Res 17:3157-69；Sharkey等, 2011, Mol Cancer Ther 11:224–34)，因此体内测试集中于在得以良好耐受的水平下比较类似但固定量的各缀合物。
初始研究首先在散播Raji淋巴瘤模型中考查多柔比星和SN-38缀合物以相较于2种SN-38缀合物测定米拉珠单抗-多柔比星缀合物表现(未显示)。所有特异性缀合物都显著好于非靶向拉贝珠单抗-SN-38缀合物或盐水治疗动物，其具有仅20天的中值存活期(P <0.0001)。尽管体外研究指示在Raji中SN-38缀合物具有多达8倍优势，但在米拉珠单抗-多柔比星缀合物的情况下观察到最佳存活期，其中被给予单次17.5 mg/kg (350 μg)剂量的所有动物以及被给予2.0 mg/kg (40 μg)的7/10动物在研究结束时(第112天)存活 (例如17.5 mg/kg剂量米拉珠单抗-多柔比星相对于米拉珠单抗-CL2A-SN-38，P = 0.0012)。更稳定CL2E-SN-38缀合物达成的存活期显著更低(CL2A相对于CL2E，在17.5和2.0 mg/kg剂量下分别是P< 0.0001和P = 0.0197)，尽管体外研究表明两种缀合物将在内化时以类似速率释放活性SN-38。
考查5个实体肿瘤细胞系，以A-375黑素瘤细胞系开始，因为它对多柔比星与SN-38两者均具有最佳体外响应。A-375异种移植物快速生长，盐水治疗的对照动物具有仅10.5天的中值存活期(未显示)。12.5 mg/kg (每个动物0.25 mg)每周两次剂量的米拉珠单抗-CL2A-SN-38缀合物使存活期延长至28天(P = 0.0006)，此显著好于具有17.5天的中值存活期的对照依帕珠单抗-CL2A-SN-38缀合物(P = 0.0089)，所述对照缀合物不显著不同于盐水治疗动物(P = 0.1967)。相比于与它的对照依帕珠单抗-CL2E-SN-38缀合物具有14天的相同中值存活期的米拉珠单抗-CL2E-SN-38缀合物，米拉珠单抗-CL2A缀合物提供显著更久存活期(P = 0.0014)。尽管给予的米拉珠单抗-多柔比星剂量是SN-38缀合物的2倍高，但中值存活期并未好于盐水治疗动物(10.5天)。
如同A-375黑素瘤模型一样，在Capan-1中，仅CL2A连接的SN-38缀合物是有效的，伴有35天的中值存活期，此显著不同于未治疗动物(P <0.036) (未显示)，即使在较低剂量(5 mg/kg；每个动物100 μg)下也是如此(P<0.02)。米拉珠单抗-CL2E和非靶向依帕珠单抗-CL2A-SN-38缀合物或2倍高剂量的米拉珠单抗-多柔比星缀合物都不提供任何存活优势(相对于盐水，P = 0.44)。值得注意的是在用被给予相同剂量的内化抗Trop-2 CL2A-SN-38缀合物(hRS7-SN-38；IMMU-132)的动物进行的相同研究中，中值存活期等于米拉珠单抗-CL2A-SN-38(未显示)。hRS7-CL2A-SN-38缀合物先前已被鉴定为用于治疗多种实体肿瘤的目标ADC (Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69)。相较于米拉珠单抗的22(参见表15)，Capan-1上的表面结合hRS7的MFI是237 (未显示)。因此，尽管具有实质上更低表面抗原表达，但在这个模型中，米拉珠单抗-CL2A-SN-38缀合物表现与hRS7-CL2A-SN-38缀合物同样良好。
由于米拉珠单抗-多柔比星缀合物在2个实体肿瘤异种移植物中具有次等治疗结果，所以焦点转向将米拉珠单抗-SN-38缀合物与用针对在许多实体肿瘤的表面上更高度表达的Trop-2 (hRS7)或CEACAM6 (hMN-15) (Blumenthal等, 2007, BMC Cancer 7:2；Stein等, 1993, Int J Cancer 55:938-46)的其它人源化抗体制备的SN-38缀合物进行比较。考查3种额外异种移植物模型。
在胃肿瘤模型NCI-N87中，被给予17.5 mg/kg/剂(350 μg)的米拉珠单抗-CL2A-SN-38的动物提供一定存活改进，但这相较于盐水治疗动物(31天相对于14天；P = 0.0760)或非结合维妥珠单抗抗CD20-CL2A-SN39缀合物(21天；P = 0.3128)未能满足统计显著性(未显示)。然而，hRS7-CL2A缀合物和hMN-15-CL2A缀合物分别使中值存活期显著改进至66和63天(P = 0.0001)。表面表达的Trop-2和CEACAM6的MFI分别是795和1123，比仅是5的CD74 (参见表15)高得多。免疫组织学分析显示在这个细胞系的异种移植物中，CD74的细胞质表达相对强烈，但重要的是它是分散的，仅出现在肿瘤内的确定口袋中(未显示)。CEACAM6和Trop-2比CD74更均一表达(未显示)，其中CEACAM6更强烈存在于细胞质中和膜上，并且Trop-2主要见于膜上。因此，用抗CEACAM6和抗Trop-2缀合物获得的改进存活期最可能反映NCI-N87中抗原密度较高与表达更均一两者。
在Hep-G2肝细胞瘤细胞系中(未显示)，免疫组织学分析显示CD74极其均一表达，伴有中度细胞质染色，并且流式细胞术分析指示表面表达相对较低(MFI = 9)。在hMN-15的情况下的MFI是175，并且免疫组织学分析显示CEACAM6的膜和细胞质表达相当均一，伴有膜染色极其强烈的孤立口袋(未显示)。在携带Hep-G2异种移植物的动物中进行的研究发现相较于盐水治疗组中的21天，米拉珠单抗-CL2A-SN-38使存活期延长至45天(P = 0.0048)，而hMN-15-CL2A-SN-38缀合物使存活期改进至35天。存在超过hMN-15-CL2A-SN-38而有利于米拉珠单抗缀合物的趋势，但这未实现统计显著性(46天相对于35天；P = 0.0802)。然而，非结合维妥珠单抗-CL2A-SN-38缀合物提供与米拉珠单抗缀合物类似存活优势。我们先前观察到用非结合缀合物获得的治疗结果可类似于特异性CL2A连接的缀合物，特别是在较高蛋白质剂量下，但特异性缀合物和对照缀合物的滴定通常有选择性地进行揭示。因此，在这个细胞系中，在这些剂量下，特异性缀合物均不提供选择性治疗优势。
使用与Hep-G2具有类似表面表达，但细胞质水平略微更低的HuH-7肝细胞瘤细胞系(参见表15)的另一研究(未显示)发现相比于米拉珠单抗-CL2A缀合物，hMN-15-SN-38缀合物提供即使不显著不同，但也更久(35天相对于18天)的存活优势(P = 0.2944)。尽管hMN-15缀合物与米拉珠单抗缀合物两者均显著好于盐水治疗动物(分别是P = 0.008和0.009)，但再次，在这个剂量水平下，缀合物均不显著不同于非靶向维妥珠单抗-SN-38缀合物(分别是P = 0.4602和0.9033)。在这个细胞系中，CEACAM6表面表达相对较低(MFI =81)，并且免疫组织学分析显示CD74(未显示)与CEACAM6(未显示)两者均极其微弱并高度分散。
讨论
用于肿瘤选择性化学疗法的抗体-药物缀合物(ADC)方法是当前受到大量关注的领域(例如Govindan等, 2012, Expert Opin Biol Ther 12:873-90；Sapra等, 2011,Expert Opin Biol Ther 20:1131-49)。新近临床成功(Pro等, 2012, Expert Opin Biol Ther 12:1415-21；LoRusso等, 2011, Clin Cancer Res 17:437-47)已大部分地在采用超级毒性药物而非先前已使用的常规化学治疗剂下发生。然而，靶标选择、抗体和药物接头全都是影响ADC的最优性能的因素。举例来说，在曲妥珠单抗-DM1的情况下，HER2在表达这个抗原的肿瘤上是充足的，抗体被内化，并且抗体自身具有抗肿瘤活性，其全都可组合以增强治疗结果。形成鲜明对比的是，CD74在细胞表面上以低得多的水平表达，但它的独特内化和表面再表达性质已使得米拉珠单抗抗CD74 ADC在造血性癌症异种移植物模型中有效，即使在中等毒性药物诸如多柔比星的情况下也是如此(Griffiths等, 2003, ClinCancer Res9:6567-71；Sapra等, 2005, Clin Cancer Res 11:5257-64)。尽管多柔比星更经常用于造血性癌症，而向患有实体肿瘤的患者施用SN-38和其它喜树碱，但我们决定评估米拉珠单抗的多柔比星缀合物和SN-38缀合物在实体肿瘤中的效用。米拉珠单抗-多柔比星缀合物在各种血液学癌症的异种移植物模型中是有效的，从而导致它的临床测试(NCT01101594和NCT01585688)，而若干SN-38缀合物在实体和血液学肿瘤模型中是有效的，从而导致2种新型SN-38缀合物在结肠直肠癌和不同上皮癌的I期临床试验(NCT01270698和NCT01631552)中被追踪。
在体外，针对Raji淋巴瘤细胞系，未缀合多柔比星和SN-38与多柔比星具有类似效能，但SN-38在许多不同实体肿瘤细胞系中更强力。引起关注的是，在体内，相较于米拉珠单抗-SN-38缀合物，米拉珠单抗-多柔比星缀合物在Raji中提供最佳响应。然而，在Capan-1和A-375中，米拉珠单抗-多柔比星的有效性小于CL2A连接的SN-38米拉珠单抗缀合物，尽管体外测试已指示A-375对游离多柔比星与对游离SN-38同等敏感。在体外，游离多柔比星与SN-38对2个其它细胞系MDA-MB-231乳腺癌和LS174T结肠癌也具有类似效能，但因为体外测试指示SN-38在实体癌和血液学癌中同等有效，并且SN-38在评估的大多数实体肿瘤细胞系中具有的效能是多柔比星的5至20倍高，所以我们决定集中于2种米拉珠单抗-SN-38缀合物用于实体肿瘤疗法。然而，为更好测定米拉珠单抗-SN-38缀合物的效用，我们包括与用针对存在于多种实体肿瘤中的其它抗原的抗体制备的SN-38 ADC的比较评估。
我们先前已探究内化hRS7 Trop-2抗体CL2A连接的SN-38缀合物在Capan-1细胞系中的治疗响应(Cardillo等, 2011, Clin Cancer Res 17:3157-69)，因此，将米拉珠单抗SN-38缀合物和hRS7 SN-38缀合物的功效进行比较。在这个研究中，两种缀合物相较于对照抗体均显著改进存活，其中各自的CL2A连接的SN-38缀合物优于CL2E连接的缀合物。因为流式细胞术分析已指示在Capan-1中Trop-2表达高于CD74，所以这个结果表明已知是卓越的CD74转运能力比Trop-2更高效。然而，熟知的是抗原可及性(即膜相对于细胞质，生理和“结合位点”屏障)和在肿瘤内的细胞之中的分布是影响每个靶向疗法形式，特别是依赖于向个别细胞充分细胞内递送产品的那些形式的关键因素(Thurber等, 2008, Adv Drug Del Rev 60:1421-34)。在其中抗原不在肿瘤内的所有细胞中均一表达的情况下，采用在定位于肿瘤中之后缓慢释放它的有效载荷的靶向剂诸如CL2A连接的缀合物将允许药物扩散至非靶向旁邻细胞，由此增强它的功效范围。实际上，根据结合位点屏障效应，高抗原表达可潜在妨碍肿瘤渗透，但细胞外释放机理可提供药物在肿瘤内扩散的机理。这个机理也被认为有助于我们已使用本文所用的不良内化性抗体诸如抗CEACAM5和抗CEACAM6考查的其它缀合物的功效。基于米拉珠单抗的缀合物更着重依赖于抗体直接与肿瘤细胞相互作用，利用CD74的可弥补它在细胞表面上的较低丰度的快速内化和再表达。然而，当CD74在肿瘤内高度分散时，这个优势将被削弱，并且没有机理用以使缀合物保留在肿瘤内，药物从缀合物缓慢释放的益处将丧失。由我们的小组先前对人胃肠肿瘤的综述表明它们常常具有高表达水平，伴有良好均一性(Gold等, 2010, Int J Clin Exp Pathol 4:1-12)。
实施例17. 使用hRS7-SN-38 (IMMU-132)来治疗疗法难治性转移性乳腺癌
患者是1名患有IV期三阴性乳腺癌(ER/PR阴性，HER-neu阴性)的57岁妇女，最初在2005年被确诊。她在2005年经受对她的左侧乳房的乳房肿瘤切除术，随后在2005年9月在辅助环境下经受剂量密集ACT。她接着接受放射疗法，所述疗法在11月完成。当患者在2012年早期在对侧(右侧)乳房中摸触到团块时，局部疾病复发被鉴定，并且接着用CMF (环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶)化学疗法治疗。她的疾病在同年复发，在胸壁的皮肤中具有转移性病变。她接着接受卡铂+ TAXOL®化学疗法方案，在此期间导致血小板减少症。她的疾病进展，并且她开始每周采用多柔比星，此持续6次剂量。皮肤疾病也在进展。2012年9月26日的FDG-PET扫描显示胸壁上的疾病进展，并且存在增大的实体腋窝结节。对患者给予羟考酮(oxycodone)以达成疼痛控制。
从2012年10月直至2013年2月对她给予IXEMPRA® (每2周，持续4个月)，此时胸壁病变打开并流血。接着使她采用XELODA®，其由于在她的手和足中的神经病变以及便秘而未得以良好耐受。皮肤病变具有进行性，接着她在给出知情同意书之后被招募于IMMU-132试验中。患者也具有甲状腺机能亢进和视力障碍的病史，具有高CNS疾病风险(然而，脑MRI呈CNS疾病阴性)。在招募至这个试验中时，她的右侧乳房中的皮肤病变(靶标)测量为最大直径是4.4 cm和2.0 cm。她具有在右侧乳房中的另一非靶标病变以及在右侧腋窝和左侧腋窝中各一个增大淋巴结。
在2013年3月12日开始首次IMMU-132输注(12 mg/kg)，其耐受良好。由于1周后在预定输注日3级绝对嗜中性白细胞计数(ANC)降低(0.9)，所以她的第二输注被延迟。在延迟1周之后以及在接受NEULASTA®之后，施用她的第二IMMU-132，其中剂量降低25%在9 mg/kg下。此后，她已根据方案按照时程每周一次持续2周接受IMMU-132，接着休息1周。在3个疗法循环之后，在2013年5月17日她的首次响应评估显示靶标病变的长直径的总和减少43%，从而根据RECIST准则构成部分响应。她在9 mg/kg剂量水平下持续治疗。自从她开始用IMMU-132治疗，她的总体健康状况和临床症状显著改进。
实施例18. 使用hRS7-SN-38 (IMMU-132)来治疗难治性转移性非小细胞肺癌
这是1名被诊断有非小细胞肺癌的60岁男子。患者被给予卡铂、贝伐单抗的化学疗法方案6个月，并且显示响应，接着在进展之后，历经接下来2年接受用卡铂、依托泊苷、TAXOTERE®、吉西他滨进行的进一步化学疗法过程，伴有持续至多2个月的偶尔响应。患者接着呈现有测量为6.5 x 4 cm的左侧纵隔肿块和胸腔积液。
在签署知情同意书之后，以18 mg/kg的剂量每隔一周对患者给予IMMU-132。在前两次注射期间，经历短期嗜中性白细胞减少症和腹泻，其中在4小时内大便4次，但这些在2天内消除或响应于对症性药物。在总计6次输注IMMU-132之后，对指标病变的CT评估显示22%降低，恰好低于部分响应，但肿瘤收缩明确。患者继续再用这个疗法2个月，此时通过CT指示就指标病变的直径的总和而言具有45%肿瘤收缩的部分响应，因此根据RECIST准则构成部分响应。
实施例19. 使用hRS7-SN-38 (IMMU-132)加奥拉帕尼来治疗难治性转移性小细胞肺癌
这是1名诊断有小细胞肺癌的65岁妇女，所述小细胞肺癌涉及她的左肺、纵隔淋巴结，并且MRI证实向左侧顶骨脑叶的转移。先前化学疗法包括卡铂、依托泊苷和拓扑替康，但未注意到响应。放射疗法也未能控制她的疾病。接着根据21天循环对她给予用IMMU-132加奥拉帕尼进行的组合疗法。一天两次在循环的第1-10天以200 mg施用奥拉帕尼。在循环的第1和8天以8 mg/kg施用IMMU-132。在3个循环之后，根据CT，肺和淋巴结肿瘤的最长直径的总和存在31%收缩，同时推定脑转移不再被检测到。这根据RECIST 1.1构成PR，因为4周后确认收缩(所有靶标病变的总和收缩35%。她再继续她的每3周IMMU-132给药持续3个月，并且继续显示她的病状的客观和主观改进。
实施例20. 用hRS7-SN-38 (IMMU-132)加紫杉醇对患有IV期转移性疾病的胃癌患者的治疗
这个患者是1名60岁男性，具有历经40年时期的吸烟史和数段时期的过度酒精摄取。他经历重量减轻，未由抗酸剂缓解的进食不适和疼痛，频繁腹部疼痛，下背部疼痛，以及最近在两个腋窝中的可触结节。他寻求医学建议，并且在检查之后，基于通过胃镜进行的活检，显示其在胃-食道接合处患有腺癌，包括一些鳞状特征。放射学研究(CT和FDG-PET)也揭示在右侧腋窝和左侧腋窝、纵隔区域、腰脊柱和肝(2个肿瘤在右叶中以及1个肿瘤在左叶中，全都测量为直径在2与4 cm之间)中的转移性疾病。切除他的胃肿瘤，并且接着使他采用用表柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶进行的化学疗法过程。在4个月和休息6周时期之后，使他转向多西他赛化学疗法，基于通过CT测量转移性肿瘤所确认的进展和一定总体恶化，所述化学疗法也未能控制他的疾病。
接着根据21天循环对患者给予用IMMU-132 (hRS7-SN-38)和紫杉醇进行的组合疗法。在循环的第1、7和14天，以175 mg/m2的剂量施用紫杉醇。在循环的第1和8天以10 mg/kg施用IMMU-132。在3个循环之后，进行CT研究以评估他的疾病的状况。输注耐受良好，伴有一定轻度恶心和腹泻，并且也伴有3级嗜中性白细胞减少症，其用对症性药物以及用针对嗜中性白细胞减少症的G-CSF (Neulasta®)加以控制。CT研究揭示他的指标转移性病变的总和已减少28%，因此他继续再用这个疗法5个循环。追踪CT研究显示根据RECIST准则，疾病保持从他在组合疗法之前的基线测量结果减轻约35%，并且他的总体状况也似乎已改进，患者重新获得对他的疾病受到控制的乐观态度。
实施例21. 仅使用IMMU-130 (拉贝珠单抗-SN-38)治疗为先前化学免疫疗法所难治的晚期结肠癌患者
患者是1名具有IV期转移性结肠癌史的50岁男子，于2008年首次确诊，并且针对原发性结肠癌和转移性结肠癌分别给予结肠切除术和部分肝切除术。他接着接受如图14所指示的化学疗法，其包括伊立替康、奥沙利铂、FOLFIRINOX (5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂)和贝伐单抗以及贝伐单抗与5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸组合将近2年。此后，在接下来1年或更久期间对他给予单独或与FOLFIRI (甲酰四氢叶酸、5-氟尿嘧啶、伊立替康)化学疗法组合的西妥昔单抗的疗程。在2009年，他在进行化学免疫疗法的同时接受针对他的肝转移的射频消融疗法，并且在2010年晚期，他经受对他的肺转移的楔形切除，在数月后在2011年早期重复所述切除。尽管在2011年进行化学免疫疗法，但在2011年结束时出现新的肺转移，并且在2012年，肺转移与肝转移两者均可见。就在经受用IMMU-130进行的抗体-药物疗法之前，他的基线血浆癌胚抗原(CEA)效价是12.5 ng/mL。由放射科医师选择用于通过计算机断层摄影术来测量肿瘤尺寸变化的指标病变是右肺的中叶和肝转移，两者在IMMU-130 (CEACAM5抗体-SN-38)疗法之前在基线时它们的最长直径的总和均总计为91mm。
这个患者每隔一周通过缓慢静脉内输注来接受16 mg/kg剂量的IMMU-130，持续总计17次治疗剂量。患者良好耐受疗法，在首次治疗之后仅具有1级恶心、腹泻和疲劳，其在第4和5次治疗之后发生，但此后不发生，因为他接受针对这些副作用的药物。在第3次治疗之后，他显示脱发(2级)，其存在于后续疗法期间。恶心、腹泻和偶尔呕吐持续仅2-3天，并且他在首次输注之后的疲劳持续2周。在其它方面，患者良好耐受疗法。由于接受与SN-38缀合的这个人源化(CDR移植)抗体的持续时间较久，所以测量他的血液中的抗拉贝珠单抗抗体，并且即使在16次剂量之后也都未检测到。
在4次治疗之后进行首次计算机断层摄影术(CT)测量，并且显示从在这个疗法之前在基线时于指标病变中进行的测量的总和变化28.6%。在8次治疗之后，这个降低变为40.6%，因此根据RECIST准则构成部分缓解。这个响应又维持2个月，此时他的CT测量结果指示指标病变比基线测量结果小31.9%，但稍微高于先前测量的40.6%减少。因此，基于对肺和肝中的指标病变的仔细CT测量，当通过抗CEACAM5人源化抗体拉贝珠单抗(hMN-14)来靶向时，包括伊立替康(SN-38的母体分子)的先前化学疗法和免疫疗法已失败的这个患者显示对伊立替康(或喜树碱)的活性代谢物SN-38的客观响应。惊人的是尽管伊立替康(CPT-11)在体内通过释放SN-38来起作用，但SN-38缀合的抗CEACAM5抗体由于在患者早先未能对他的末个含有伊立替康的疗法有响应之后诱导部分响应而被证明在结肠直肠癌患者中有效。患者的血浆CEA效价降低也证实CT研究结果：它从12.6 ng/mL的基线水平下降至在第3次疗法剂量之后的2.1 ng/mL，并且在第8次剂量与第12次剂量之间处于1.7与3.6 ng/mL之间。通常考虑CEA的正常血浆效价在2.5与5.0 ng/mL之间，因此这个疗法实现他在血液中的CEA效价的正常化。
实施例22. 用IMMU-130加甲磺酸艾日布林治疗患有晚期结肠癌的患者
这个患者是1名最初被诊断有转移性结肠癌(IV期)的75岁妇女。她进行右侧部分半结肠切除术和切除她的小肠，接着接受FOLFOX、FOLFOX +贝伐单抗、FOLFIRI +雷莫芦单抗(ramucirumab)、以及FOLFIRI +西妥昔单抗疗法一年半，此时她显示疾病进展，其中疾病扩散至后陷凹、网膜，在她的骨盆中具有腹水，并且在她的胸腔的右侧具有胸腔积液。就在这个疗法之前，她的基线血浆CEA效价是15 ng/mL。对她给予用甲磺酸艾日布林(1.4 mg/m2)和10 mg/kg IMMU-130 (抗CEACAM5-SN-38)进行的组合疗法，两者均在21天循环的第1和8天施用，此得以极其良好耐受，无任何重大血液学或非血液学毒性。在治疗的2个月内，她的血浆CEA效价适度缩减至1.3 ng/mL，但在8周评估时，她显示指标肿瘤病变收缩21%，所述指标肿瘤病变在13周时增加至27%收缩。惊人的是，此时患者的腹水和胸腔积液均减少(其中后者消失)，因此使患者的总体状况显著改进。患者继续她的探究性疗法。
实施例23. 用IMMU-130加瑞卡帕尼治疗患有IV期转移性疾病的胃癌患者
患者是1名由于持续约6年的与进食相关的胃不适和疼痛，以及在过去12个月期间伴有重量减轻而寻求医疗照护的52岁男性。对胃区域的触诊揭示坚硬团块，其接着经胃镜检查，从而揭示在他的胃的下部具有溃疡性肿块。对此进行活检，并且诊断为胃腺癌。实验室测试揭示无特定异常变化，例外之处是肝功能测试结果、LDH和血浆CEA得以升高，CEA是10.2 ng/mL。患者接着经受全身PET扫描，其揭示除胃肿瘤之外，在左侧腋窝中以及在肝的右叶中存在转移性疾病(2个小转移)。患者进行他的胃肿瘤切除，接着进行他的转移性肿瘤的基线CT测量。在手术之后4周，他接受3个疗程的由顺铂和5-氟尿嘧啶(CF)的方案组成的组合化学疗法，但对此不良好耐受，因此转向用多西他赛治疗。基于CT扫描，似乎疾病得以稳定约4个月，但接着患者对进一步重量减轻、腹部疼痛、食欲不振和极端疲劳的诉说导致重复CT研究，其显示转移的尺寸增加合计20%，并且在原始胃切除的部位存在可疑病变。
接着根据每周时程对患者给予用IMMU-130 (CEACAM5抗体-SN-38，8 mg/kg)和PARP抑制剂瑞卡帕尼(12 mg/m2)进行的组合疗法。他对此良好耐受，但在3周之后显示3级嗜中性白细胞减少症和1级腹泻。他的第4次输注被推迟1周，接着重新建立每周输注，接下来4次注射不具有腹泻或嗜中性白细胞减少症的迹象。患者接着经受CT研究以测量他的转移性肿瘤尺寸和观察原始胃切除区域。根据RECIST准则，放射科医师测量到相较于在组合疗法之前的基线，转移性病变的总和降低23%。在原始胃切除的区域中似乎不存在任何明确病变。此时，患者的血浆CEA效价是7.2 ng/mL，其从14.5 ng/mL的基线值降低许多。患者继续以相同剂量采用每周组合疗法，并且在总计13次输注之后，他的CT研究显示一个肝转移已消失，并且所有转移性病变的总和降低41%，从而根据RECIST构成部分响应。患者的总体状况改进，并且他恢复他的惯常活动，同时继续每三周接受8 mg/kg IMMU-130的维持疗法，再进行4次注射。在末次测量血液CEA时，值是4.8 ng/mL，其在吸烟者(对于这个患者，情况就是这样)的正常范围内。HAHA血清测量未揭示抗抗体抗体或抗SN-38抗体，因此疗法似乎不具有免疫原性。
实施例24. 用IMMU-130加维利帕尼治疗复发三阴性转移性乳腺癌
1名先前用贝伐单抗加紫杉醇治疗而无响应的患有三阴性转移性乳腺癌的58岁妇女呈现有向若干肋骨、腰椎的转移，在她的左肺中呈现有直径测量为3 cm的孤立病变，伴有可观骨疼痛和疲劳。对她给予用抗CEACAM5 IMMU-130 (hMN-14-SN-48)加维利帕尼进行的组合疗法。在21天循环的第1和8天以12 mg/kg施用IMMU-130，而每日一次以60 mg施用维利帕尼。除短暂2级嗜中性白细胞减少症和一定初始腹泻之外，她对疗法良好耐受，接着在休息2个月之后再重复所述疗法1个疗程。放射学检查指示根据RECIST准则她具有部分响应，因为指标病变的直径的总和降低39%。她的总体状况(包括骨疼痛)也改善，并且她恢复到与在她的疾病之前几乎相同的活动水平。
实施例25. 用hMN-15-SN-38加紫杉醇治疗复发的通常难治性转移性结肠癌
1名46岁妇女患有IV期转移性结肠癌，具有切除也同步向肝的两叶进行肝转移的原发性病变的先前史，以及具有向右肺的单一扩散病灶；通过CT测量的这些转移的直径在2与5 cm之间。她历经3年的时期经受各种化学疗法过程，包括5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、西妥昔单抗和贝伐单抗。在两种情况下，存在疾病稳定化或短期响应的迹象，但她的测量病变不降低30%或更多。在组合疗法之前，她在基线时的血浆CEA效价是46ng/mL，并且她的总体指标病变测量为92 mm的总和。
根据21天循环建立用hMN-15-SN-38和紫杉醇进行的组合疗法。在循环的第1和8天以12 mg/kg施用hMN-15-SN-38，并且在循环的第1、7和14天以135 mg/m2的剂量施用紫杉醇。重复这个循环3次，伴有仅短暂嗜中性白细胞减少症和胃肠副作用(恶心、呕吐、腹泻)。惊人的是，尽管未能对FOLFIRI疗法(其包括伊立替康或CPT-11)有响应，但患者在完成她的疗法之后根据RECIST准则显示部分响应。接着将她置于这个疗法的维持时程下，每个月一次，持续接下来6个月。追踪扫描显示她的疾病以部分响应(PR)保持受到控制，并且患者大体上处于良好情况，伴有90%卡诺夫斯库(Karnofsky)表现状况。
实施例26. 用IMMU-130加奥拉帕尼治疗复发转移性卵巢癌
1名患有FIGO IV期BRCA1突变阳性卵巢癌的66岁妇女经受初级手术以及手术后紫杉醇和卡铂(TC)。在20个月的无铂间隔之后，且通过CT确认CA125水平升高和腹膜中的复发。在用TC再治疗之后，发生对卡铂的过敏反应，将卡铂变换成奈达铂(nedaplatin)。通过CT确认完全响应。在8个月的PFI之后，血清CA125水平升高，并且确认腹膜和肝中的复发。
接着对她给予用抗CEACAM5 IMMU-130 (hMN-14-SN-38)加奥拉帕尼进行的组合疗法。在21天循环的第1和8天以10 mg/kg施用IMMU-130，而在循环的第1-10天一天两次以200mg施用奥拉帕尼。除短暂2级嗜中性白细胞减少症和一定初始腹泻之外，她对疗法良好耐受，接着在休息2个月之后再重复所述疗法1个疗程。放射学检查指示根据RECIST准则她具有部分响应，因为指标病变的直径的总和降低45%。她的总体状况也改进，并且她恢复到与在她的疾病之前几乎相同的活动水平。
实施例27. 用CSAp抗体-SN-38缀合物加紫杉醇治疗患有IV期转移性疾病的结肠癌患者
在切除9 cm乙状结肠腺癌，随后用FOLIFIRI和西妥昔单抗持续6个月，接着FOLFOX，继之以贝伐单抗再持续约9个月的时期进行化学免疫疗法之后，这个患者呈现有向肝的左叶以及两肺的结肠癌转移。在初始切除接着开始疗法之后10个月，由于病变增长以及在左侧肾上腺中出现新的转移，被认为存在的稳定疾病显示进展。此时，她的血浆CEA是52 ng/mL，并且她的总体状况似乎已恶化，伴有腹部疼痛、疲劳和边界贫血，从而表明有可能内部出血。
接着根据21天循环对她给予用hMu-9 (抗CSAp)抗体的SN-38缀合物和紫杉醇进行的组合疗法。在循环的第1和8天以12 mg/kg的剂量施用抗体或免疫缀合物，并且在循环的第1、7和14天以175 mg/m2的剂量施用紫杉醇，将此再重复2个治疗循环，每周测量她的血细胞计数，并且接受阿托品(atropine)药物以控制胃肠反应。在首个治疗循环之后注意到2级脱发，但仅有1级嗜中性白细胞减少症。在3个治疗循环之后，她的血浆CEA效价降低至19ng/ml，并且此时她的CT测量结果显示肝和肺中的指标病变减少24.1%。在额外3个疗程之后，她显示31.4%的指标病变CT降低，并且肾上腺肿块的尺寸降低约40%。这个患者被视为对组合疗法有响应，并且继续采用这个疗法。她的总体状况似乎改进，伴有较小程度疲劳，无腹部疼痛或不适，并且大体上更具活力。
实施例28. 用抗MUC5ac-SN-38免疫缀合物加瑞卡帕尼治疗转移性胰腺癌
这个44岁患者具有转移性胰腺癌史，在胰腺头部中具有不可手术的胰腺导管腺癌，并且显示向肝的左叶和右叶的转移，前者测量为3 x 4 cm，并且后者测量为2 x 3 cm。对患者给予吉西他滨疗程，但不显示客观响应。4周后，对他给予用每周两次持续2周休息1周8 mg/kg的剂量的静脉内hPAM4-SN-38加一周一次瑞卡帕尼(12 mg/m2)进行的组合疗法。将此再重复2个循环。CT研究在1周后进行，并且显示肿瘤肿块(所有部位)总体降低32%(部分响应)，伴有他的血液CA19-9效价从基线时的220下降至放射学评估时的75。患者显示在各次治疗之后仅1级恶心和呕吐以及在末个治疗循环结束时2级嗜中性白细胞减少症，其在4周后消除。未给予用于预防输注反应的前驱用药。
实施例29. 使用抗CD74 hLL1-SN-38加奥拉帕尼来治疗疗法难治性转移性结肠癌(mCRC)
患者是1名呈现有转移性结肠癌的67岁男子。在诊断之后不久进行横向结肠切除术之后，患者接着在新辅助环境下接受4个循环的FOLFOX化学疗法，随后进行部分肝切除术以移除肝的左叶中的转移性病变。这继之以辅助FOLFOX方案，持续总计10个循环的FOLFOX。
CT显示向肝转移。他的靶标病变是肝的左叶中的3.0 cm肿瘤。非靶标病变包括肝中的若干低衰减肿块。基线CEA是685 ng/mL。
患者接着用SN-38缀合的抗CD74米拉珠单抗(hLL1-SN38)与奥拉帕尼组合治疗。在21天循环的第1和8天给予hLL1-SN-38 (10 mg/kg)，而在循环的第1-10天一天两次以200mg施用奥拉帕尼。在首个循环期间，患者经历恶心(2级)和疲劳(2级)，并且继续治疗而无重大不利事件。进行的首次响应评估(在3个循环之后)显示根据计算机断层摄影术(CT)，靶标病变收缩26%，并且他的CEA水平降低至245 ng/mL。在第二次响应评估时(在8个循环之后)，靶标病变已收缩35%。他的总体健康状况和临床症状得以显著改进。
实施例30. 用IMMU-114-SN-38和紫杉醇治疗复发慢性淋巴细胞性白血病
1名具有如根据国际慢性淋巴细胞性白血病研讨会和世界卫生组织分类法确定的CLL的历史的67岁男子在用氟达拉滨、地塞米松和利妥昔单抗进行的先前疗法以及CVP方案之后呈现有复发疾病。他现时具有发热和盗汗伴有全身性淋巴结肿大、血红蛋白和血小板产生降低以及白细胞计数快速升高。他的LDH升高，并且β-2-微球蛋白几乎是正常值两倍。根据21天循环对患者给予用抗HLA-DR IMMU-114-SN-38 (IgG4 hL243-SN-38)缀合物与紫杉醇组合进行的疗法。在循环的第1和8天以8 mg/kg施用IMMU-114-SN-38，并且在循环的第1、7和14天以175 mg/m2的剂量施用紫杉醇，接着重复所述循环。在4个循环之后，评估显示患者的血液学参数改善，并且他的循环CLL细胞的数目似乎降低。将疗法再继续另外3个循环，此后他的血液学和实验室数值指示他具有部分响应。
实施例31. 用hA19-SN-38、瑞卡帕尼和紫杉醇治疗滤泡性淋巴瘤患者
1名60岁男性呈现有腹部疼痛以及存在可触肿块。患者的CT和FDG-PET研究确认存在肿块，在纵隔、腋窝和颈部结节中有病理性腺病变。实验室测试结果是普通的，例外之处是LDH和β-2-微球蛋白升高。骨髓活检揭示若干小梁旁和血管周围淋巴聚集体。根据免疫染色，这些是淋巴细胞性的，具有CD20、CD19和CD10的表达。最终诊断是2级滤泡性淋巴瘤，IVA期，具有FLIPI评分4。最大涉及结节的最长直径是7 cm。根据21天循环对患者给予用与SN-38缀合的人源化抗CD19单克隆抗体IgG (hA19)加瑞卡帕尼和紫杉醇进行的组合疗法。在循环的第7和14天以6 mg/kg给予ADC，在循环的第1、8和15天以10 mg/m2施用瑞卡帕尼，并且在循环的第1、7和14天以125 mg/m2下用紫杉醇。在5个循环之后，骨髓和成像(CT)评估显示部分响应，其中可测量病变减少约60%，并且骨髓的浸润程度小得多。此外，LDH和β-2-微球蛋白效价也降低。
实施例32. 用hA20-SN-38加奥拉帕尼治疗复发前体B细胞ALL
这个51岁妇女已经历针对前体费城染色体(Philadelphia chromosome)阴性B细胞ALL的疗法，所述ALL显示针对CD19、CD20、CD10、CD38和CD45的ALL细胞染色。超过20%的骨髓和血液淋巴母细胞表达CD19和CD20。患者已接受用氯法拉滨(clofarabine)和阿糖胞苷进行的先前疗法，导致可观血液学毒性，但无响应。也开始高剂量阿糖胞苷(ara-C)的疗程，但不可由患者耐受。根据21天循环对她给予hA20-SN-38 (维妥珠单抗-SN-38)和奥拉帕尼，其中在循环的第7和14天通过输注来给予各剂6 mg/kg的hA20-SN-38，以及在循环的第1-10天一天两次以200 mg给予奥拉帕尼。
在3个循环之后，惊人的是，她显示她的血液和骨髓计数改善，足以达成待确定的部分响应。在由于嗜中性白细胞减少症(3级)而休息2个月之后，疗法再继续另外4个过程。此时，她得以改善许多，并且考虑进行维持疗法以试图使她达到她可为干细胞移植的候选者所处的阶段。
实施例33. 用抗CD22 -SN-38加紫杉醇治疗淋巴瘤
患者是1名患有复发弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的62岁男性。在6个R-CHOP化学免疫疗法过程之后，他现时呈现有在纵隔、腋窝和腹股沟淋巴结中存在广泛淋巴结散布。根据21天循环对他给予抗CD22依帕珠单抗-SN-38加紫杉醇。在循环的第1和7天以12 mg/kg的剂量施用ADC，并且在循环的第1、7和14天以175 mg/m2施用紫杉醇。在3个循环之后，通过CT成像来评估患者，并且测量他的总体肿瘤块体，并且其显示降低35%(部分响应)，此在接下来3个月内似乎得以维持。副作用仅是在疗法之后的血小板减少症以及1级恶心和呕吐，其在2周内消除。未给予用于减轻输注反应的预先疗法。
实施例34. 使用维妥珠单抗-SN-38和瑞卡帕尼对滤泡性淋巴瘤的一线治疗
患者是1名呈现有低等级滤泡性淋巴瘤的41岁妇女，具有可测量双侧性子宫颈和腋窝淋巴结(各自2-3 cm)、直径是4 cm的纵隔肿块以及脾肿大。对她给予维妥珠单抗-SN-38 (抗CD20-SN-38)与瑞卡帕尼组合，在第1天以10 mg/kg施用ADC，并且在第1、8和15天以12 mg/m2施用瑞卡帕尼。在4个循环之后，她的根据CT的肿瘤测量结果显示降低80%。接着对她给予2个额外疗程，并且CT测量结果指示实现完全响应。这由FDG-PET成像确认。
实施例35. 前2-吡咯啉基多柔比星(P2PDox)的产生和使用
前2-吡咯啉基多柔比星(P2PDox)如美国专利号8,877,202中所述进行合成并缀合于抗体，所述美国专利的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。示例性P2PDox ADC公开于下表16中。
表16. 示例性P2PDox-抗体缀合物
Figure DEST_PATH_IMAGE027
也制备缀合物hPAM4-P2PDox、hLL2-P2PDox和RFB4-P2PDox，其具有类似的蛋白质回收率和纯度(未显示)。
体外细胞结合研究–通过细胞结合测定，将缀合抗体的结合与未缀合抗体的结合进行比较来确认抗体结合性的保留(Chari, 2008, Acc Chem Res 41:98-107)。使用适当靶标细胞，在4天MTS测定中测试缀合物的效能。在胃(NCI-N87)、胰腺(Capan-1)和乳腺(MDA-MB-468)人癌细胞系的情况下，hRS7-P2PDox缀合物展现0.35-1.09 nM的IC50值，游离药物在相同细胞系的情况下展现0.02-0.07 nM效能。
血清稳定性–通过在37℃下在0.2 mg/mL的浓度下在人血清中孵育来测定原型P2PDox缀合物hRS7-P2PDox的血清稳定性。使用丁基疏水性相互作用色谱法(HIC)柱，通过HPLC来分析孵育物，其中在归因于游离药物的峰与归因于缀合物或较高分子量物质的峰之间存在良好保留时间分离。这个分析显示不存在游离药物从缀合物的释放，从而表明缀合物具有高血清稳定性。当用含有与hRS7-P2PDox相同的可裂解接头，并且其中游离药物被独立证实以96小时的半衰期加以释放的hRS7-多柔比星缀合物重复相同实验时，根据HICHPLC观察到明确形成游离药物峰，即多柔比星峰。
惊人的是，确定P2PDox缀合物紧密固持于抗体，因为它使抗体的肽链交联在一起。交联使药物与抗体的连接稳定，以致药物仅在抗体被代谢之后在细胞内释放。交联有助于使将由游离药物在循环中释放所产生的毒性例如心脏毒性最小化。因为在体内药物使肽交联于其它蛋白质或肽，所以先前对2-PDox肽缀合物的使用失败。在本发明缀合物的情况下，使P2PDox连接于呈前药形式时的链间二硫化物硫醇基团。前药保护在注射之后不久在体内被快速移除，并且缀合物的所得2-PDox部分使抗体的肽链交联，从而在抗体分子内形成分子内交联。这使ADC稳定，并且防止交联于循环中的其它分子。
实施例34. 体内研究
概要-通过测径规测量长度(L)和宽度(W)来测定肿瘤尺寸，其中将肿瘤体积计算为(LxW2)/2。一周两次测量肿瘤并将小鼠称重。如果小鼠的肿瘤在尺寸方面达到>1 cm3，它们的起始体重减轻大于15%，或另外变得濒死，那么使它们安乐死。对肿瘤生长数据的统计分析基于曲线下面积(AUC)和存活时间。通过线性曲线建模来获得个别肿瘤生长的概况。在对生长曲线的统计分析之前，f检验用于确定各组之间的方差相等性。双尾t检验用于评估所有各个治疗组与非特异性对照之间的统计显著性。对于盐水对照分析，单尾t检验用于评估显著性。使用Prism GraphPad Software(v4.03)软件包(Advanced Graphics Software,Inc.；Encinitas, CA)，利用卡普兰-迈耶图(对数秩分析)来分析存活研究。临床前实验中的所有剂量都用抗体量表示。就药物而言，当使用具有每个IgG 3-6个药物的ADC时，20 g小鼠中的100 μg抗体(5 mg/kg)例如携带1.4 μg–2.8 μg (0.14-0.17 mg/kg)的P2PDox等效剂量。
单次静脉内剂量≥300 μg [约10 μg的P2PDox]的缀合物是致死的，但在2周内给予4次45 μg剂量为所有动物所耐受。使用这个给药方案，我们考查hRS7-P2PDox在2个人肿瘤异种移植物模型Capan-1 (胰腺癌)和NCI-N87(胃癌)中的治疗作用。在裸小鼠中进行肿瘤移植之后7天开始疗法。在建立的7天龄Capan-1模型中，100%的产生肿瘤快速消退，不具有再生长的迹象(未显示)。这个结果在重复实验中得以再现(未显示)。在建立的NCI-N87模型中获得类似研究结果(未显示)，其中在第70天之后施用的第2疗程得以安全耐受，并且导致残余肿瘤进一步消退(未显示)。相比于内化不良的抗CEACAM5抗体hMN-14的缀合物，靶向Trop-2的内化hRS7-SN-38缀合物提供更好治疗响应(未显示)。非靶向抗CD20 ADC hA20-P2PDox是无效的，从而指示治疗功效具有选择性(未显示)。由乳腺癌异种移植物(MDA-MB-468)和第二胰腺癌异种移植物获得的数据(未显示)重复缀合物具有特异性和显著抗肿瘤作用的相同趋势。
具有每个IgG 6.8或3.7个药物的取代度的hRS7-P2PDox的PK和毒性–已知携带每个MAb多达8个超级毒性药物的抗体-药物缀合物(ADC)比未修饰MAb更快清除，并且使脱靶毒性增加，这是已导致当前倾向于使用≤4的药物取代度的研究结果(Hamblett等, 2004,Clin Cancer Res 10:7063-70)。制备缀合物，并且以约6:1和约3:1的平均药物/MAb取代比率(MSR)进行评估。向各组正常小鼠(n = 5)静脉内施用单次剂量的未修饰hRS7或具有6.8或3.7的药物取代度的hRS7-P2PDox (蛋白质剂量相同)，并且在注射后30分钟、4小时、24小时、72小时和168小时收集血清样品。通过ELISA来分析这些样品中的抗体浓度(未显示)。在各个时间，在血清浓度方面不存在显著差异，从而指示这些样品类似地被清除。PK参数(Cmax、AUC等)是类似的。当在相同剂量的缀合药物下施用时，具有更高或更低药物取代度的缀合物在裸小鼠中具有类似可耐受性。
在最小有效剂量(MED)下的治疗功效–通过施用9 mg/kg、6.75 mg/kg、4.5 mg/kg、2.25 mg/kg或1 mg/kg的单次团注蛋白质剂量来在携带NCI-N87人胃癌异种移植物的裸小鼠中评估抗TROP-2抗体缀合物hRS7-P2PDox。当平均肿瘤体积(mTV)是0.256 cm3时开始疗法。在第21天，盐水对照组(非治疗组)中的mTV是0.801 ± 0.181 cm3，其显著大于用9、6.75、4.5或2.25 mg/kg剂量治疗的小鼠中的mTV，所述治疗小鼠分别具有0.211 ± 0.042cm3、0.239 ± 0.0.054 cm3、0.264 ± 0.087 cm3和0.567 ± 0.179 cm3的mTV (P<0.0047，单尾t检验)。根据这些结果，将最小有效剂量判断为2.25 mg/kg，而9 mg/kg代表MTD。
抗体-P2PDox的MTD-在小鼠中进行的比较原型抗体hLL1的2-PDox缀合物和P2PDox缀合物的MTD研究证明P2PDox缀合物更加强力(未显示)。单次静脉内注射的MTD在100与300μg之间。接着使用在每次注射25 μg至150 μg之间的蛋白质剂量来确定在每四天、持续总计4次注射的时程(q4dx4)下的多次注射的MTD。在这些剂量下，对动物给予在100与600 μg之间的累积剂量。下表17概述各个组。
表17. 用于获得抗体-P2PDox的MTD的剂量和时程
Figure 119460DEST_PATH_IMAGE028
仅有用25 μg P2PDox-ADC治疗的那些小鼠持续不显示毒性迹象(未显示)。这是100 μg的累积剂量，其也是在以单次注射施用时耐受的剂量(未显示)。因此，根据这个实验，在小鼠中多次注射P2PDox-ADC的MTD是25 μg q4dx4。对数据的更详细分析以及对实验的重复确定分级给药的MTD是45 μg蛋白质剂量的缀合物，每4天施用，持续2周(45 μg，q4dx4时程)。
结合研究-在未缀合hRS7与每个抗体缀合于6个P2PDox分子的P2PDox-hRS7之间，在抗体部分与NCI-N87胃癌细胞的结合方面未观察到显著差异(未显示)。对于P2PDox-hMN-15 (抗CEACAM6)、P2PDox-hLL2 (抗CD22)和P2PDox-hMN-24 (抗CEACAM5)缀合物，确认缀合对抗体结合靶标抗原缺乏影响。推断P2PDox缀合于抗体不影响抗体-抗原结合活性。
细胞毒性研究-考查P2PDox-mAb缀合物对靶标细胞的细胞毒性。hRS7-P2PDox和hMN-15-P2PDox对MDA-MB-468、AG S、NCI-N87和Capan-1实体肿瘤细胞系具有细胞毒性(未显示)。hMN-14-P2PDox对Capan-1、BxPC-3和AsPC-1人胰腺肿瘤株系以及AGS、NCI-N87和LS147T人胃和结肠肿瘤株系具有细胞毒性(未显示)。hLL2-P2PDOx对Daudi、Raji、Ramos和JVM-3造血性肿瘤株系具有细胞毒性(未显示)。缀合物的IC50值在纳摩尔浓度范围内(未显示)。
实施例35. 进一步体内研究
在用NCI-N87人胃癌异种移植物植入的裸小鼠中进行进一步体内功效研究(未显示)。用4 x 45 μg的hRS7-P2PDox进行的1个治疗循环使所有肿瘤都快速消退(未显示)。在首个循环结束之后约2个月启动第二治疗循环，从而导致除一个外的所有hRS7-P2PDox治疗动物的完全消退。hA20、hLL1和hMN-14缀合物对肿瘤进展具有少许作用(未显示)。施用P2PDox-hMN-15导致延迟的胃癌消退，其具有的有效性小于hRS7缀合物。
考查不同剂量时程对抗肿瘤功效的影响(未显示)。在肿瘤植入之后9天，当所有组的平均肿瘤体积是0.383 cm3时开始实验，并且在第93天(在启动疗法之后84天)结束。在这个研究中，单次180 μg剂量、两次每周90 μg剂量以及q4dx4 45 μg全都导致存活期显著增加(未显示)。对于盐水对照，9只小鼠中的0只存活(未显示)。对于接受45μg q4dx4的hRS7-P2PDox的小鼠，9只小鼠中的8只在第94天存活(未显示)。对于接受90 μg每周x2的hRS7-P2PDox的小鼠，9只小鼠中的9只在第94天存活(未显示)。对于接受单次180 μg剂量的hRS7-P2PDox的小鼠，9只小鼠中的8只在第94天存活(未显示)。在相同剂量时程下，对照hA20缀合物对存活不具有影响(未显示)。毒性研究显示hRS7-P2PDox的3个剂量时程导致类似地低毒性水平(未显示)。
hRS7-P2PDox缀合物也在Capan-1胰腺癌中有效(未显示)，并且比hRS7-SN-38缀合物更有效抑制肿瘤生长(未显示)。相比于hPAM4-SN-38缀合物，hPAM4-P2PDox缀合物也更有效抑制Capan-1人胰腺癌生长(未显示)。在Capan-1肿瘤注射之后63天(其中疗法在接种后1天开始)，盐水对照中10只小鼠中的0只存活，每周两次x2周用45 μg hPAM4-P2PDox治疗的小鼠中10只小鼠中的10只存活，每周两次x2周用45 μg hA20-P2PDox治疗的小鼠中10只小鼠中的2只存活，每周两次x4周用250 μg hPAM4-SN-38治疗的小鼠中10只小鼠中的0只存活，并且每周两次x4周用250 μg h20-SN-38治疗的小鼠中10只小鼠中的0只存活。
hRS7-P2PDox比hRS7-SN-38实质上更有效抑制PxPC-3胰腺癌生长(未显示)，并且比hRS7-SN-38略微更有效抑制MDA-MB-468乳腺癌生长(未显示)。
考查不同单次剂量的hRS7-P2PDox对NCI-N87胃癌异种移植物的生长的影响。使用单次剂量，在90 μg或更高下观察到对肿瘤生长的最大影响(未显示)。单次剂量45 μg是为观察到相较于盐水对照的显著存活益处所需的最小剂量(未显示)。
相较于hRS7 IgG来测定各种hRS7-ADC缀合物的ADCC活性(未显示)。从购自新泽西血液中心(Blood Center of New Jersey)的血液纯化PBMC。Trop-2阳性人胰腺腺癌细胞系(BxPC-3)用作靶标细胞系，其中效应物与靶标比率100:1。将由hRS7 IgG介导的ADCC与hRS7-Pro-2-PDox、hRS7-CL2A-SN-38以及还原和封端的hRS7-NEM进行比较。所有都以33.3nM使用。总体活性较低，但显著(未显示)。hRS7 IgG达成8.5%特异性溶解，此不显著不同于hRS7-Pro-2-PDox。两者均显著好于hLL2对照以及hRS7-NEM和hRS7-SN-38(P<0.02，双尾t检验)。在hRS7-NEM与hRS7-SN-38之间不存在差异。
实施例36. 用抗CD22 P2PDox-依帕珠单抗加奥拉帕尼治疗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)
如上所述制备P2PDox-依帕珠单抗ADC。17名患有先前未治疗NHL或复发NHL的患者接受4次剂量的在28天循环的第1和14天静脉内注射的70、100或150 mg P2PDox-依帕珠单抗。在循环的第1-7和14-21天以1天200 mg施用奥拉帕尼。通过CT扫描来评估响应，伴有其它评估，包括不利事件、B细胞血液水平、血清依帕珠单抗水平和人抗依帕珠单抗(HAHA)效价。
仅观察到偶尔轻度至中度短暂注射反应，并且除直至3级的嗜中性白细胞减少症(但在中断疗法之后可逆，直至降低至1级)之外未观察到其它安全性问题。在所有剂量水平的P2PDox-依帕珠单抗与奥拉帕尼组合下都观察到短暂B细胞消减(多达约25%)。客观响应率(部分响应加完全响应加未确认的完全响应)是47% (8/17)，其中完全响应/未确认的完全响应率是24% (4/17)。八个客观响应中的四个持续30周或更久。在所有剂量水平的P2PDox-依帕珠单抗加奥拉帕尼下都观察到客观响应。针对人抗依帕珠单抗抗体(HAHA)评估的所有血清样品都呈阴性。
实施例37. 用P2PDox-hRS7加紫杉醇治疗三阴性乳腺癌
如以上中所述制备抗Trop-2 P2PDox-hRS7 ADC。至少两种标准疗法已失败的患有三阴性乳腺癌的患者接受在21天循环的第1天静脉内注射的70 mg P2PDox-hRS7，其中紫杉醇在循环的第1、7和14天以175 mg/m2施用。在3个循环之后，观察到客观响应，伴有肿瘤体积平均降低35%。针对人抗hRS7抗体(HAHA)评估的所有血清样品都呈阴性。
实施例38. 用P2PDox-hMN-14加奥拉帕尼治疗转移性结肠癌
用抗CEACAM5 hMN-14-P2PDox加奥拉帕尼的组合治疗1名52岁男子，其患有向他的左侧和右侧肝叶中的转移性结肠癌(3-5 cm直径)，以及向他的右肺中的5 cm转移，并且升高的血液CEA值是130 ng/mL。在28天循环的第1和14天施用150 mg剂量的hMN-14-P2PDox。一天两次在循环的第1-10天以200 mg施用奥拉帕尼。在2个循环之后的CT评估后，测量到3个靶标病变的总平均直径降低25%，因此根据RECIST1.1准则构成良好稳定疾病响应。同时，他的血液CEA效价降低至30 ng/mL。当他的嗜中性白细胞减少症正常化时继续重复疗程。
实施例39. 免疫缀合物储存
将ADC缀合物纯化并与2-(N-吗啉代基)乙烷磺酸(MES) (pH 6.5)进行缓冲液交换，并且进一步与海藻糖(25 mM最终浓度)和聚山梨醇酯80 (0.01% v/v最终浓度)一起配制，其中由于添加赋形剂，最终缓冲剂浓度变为22.25 mM。使经配制缀合物冻干并储存在密封小瓶中，在2℃–8℃下储存。冻干免疫缀合物在储存条件下是稳定的，并且维持它们的生理活性。
Figure DEST_PATH_IMAGE029
根据先前描述，本领域技术人员可易于确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围下，在不进行过度实验下，可对本发明进行各种变化和修改以使它适合于各种用途和条件。本文引用的所有专利、专利申请和出版物都以引用的方式并入。
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Claims (21)

1.结合Trop-2的免疫缀合物与至少一种治疗剂的组合在制备用于一种治疗癌症的方法的药物中的用途，其中所述方法包括：
a) 向患有癌症的人受试者施用所述免疫缀合物；和
b) 向所述受试者施用至少一种选自由PARP抑制剂和微管抑制剂组成的组的治疗剂，
其中所述免疫缀合物包含缀合至SN-38的抗Trop-2抗体，
其中所述PARP抑制剂是奥拉帕尼，其中所述微管抑制剂是紫杉醇或甲磺酸艾日布林，
其中所述癌症是三阴性乳腺癌,
其中所述抗Trop-2抗体是hRS7。
2.如权利要求1所述的用途，其中免疫缀合物和治疗剂的组合在抑制肿瘤生长方面具有协同作用。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述SN-38通过CL2A接头缀合于所述抗Trop-2抗体。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述免疫缀合物是萨希珠单抗戈维替康。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述免疫缀合物以介于1 mg/kg与18 mg/kg之间的剂量施用，并且其中所述受试者在用所述免疫缀合物治疗之前已未能对至少一种其它疗法有响应。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述剂量选自由以下组成的组：1 mg/kg、3 mg/kg、4mg/kg、6 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、12 mg/kg、16 mg/kg和18 mg/kg。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述免疫缀合物以介于8与10 mg/kg之间的剂量施用。
8.如权利要求1所述的用途，其中所述癌症是实体肿瘤，并且所述治疗导致肿瘤尺寸降低至少15%。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述治疗导致肿瘤尺寸降低至少20%。
10.如权利要求8所述的用途，其中所述治疗导致肿瘤尺寸降低至少30%。
11.如权利要求8所述的用途，其中所述治疗导致肿瘤尺寸降低至少40%。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述癌症是转移性的。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述治疗进一步导致尺寸降低或消除转移。
14.如权利要求1所述的用途，其中所述癌症为其它疗法所难治的，但对免疫缀合物和治疗剂的组合有响应。
15.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者在用所述免疫缀合物治疗之前已未能对用伊立替康进行的疗法有响应。
16.如权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自由治疗性肽组成的组的额外治疗形式。
17.如权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自由以下组成的组的额外治疗形式：未缀合抗体、药物缀合抗体、基因疗法、化学疗法、细胞因子疗法、寡核苷酸、局部放射疗法和手术。
18.如权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自由放射性标记抗体组成的组的额外治疗形式。
19.如权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自由毒素缀合抗体组成的组的额外治疗形式。
20.如权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自由干扰RNA疗法组成的组的额外治疗形式。
21.如权利要求1所述的用途，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自由以下组成的组的药剂：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环霉素、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、博莱霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、卡奇霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、克拉屈滨、坎托替康、环磷酰胺、克唑替尼、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、迪那昔利布、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星(2P-DOX)、氰基-吗啉代多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星葡萄糖醛酸苷、埃罗替尼、雌氮芥、表鬼臼毒素、恩替司他、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、黄酮吡醇、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR (FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白质转移酶抑制剂、福他替尼、ganetespib、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他汀、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。
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