CN107596349A - 一种稳定的红细胞生成素制剂配方 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稳定的红细胞生成素(EPO)制剂配方，其包括：红细胞生成素，透明质酸酶，缓冲剂，稳定剂和非离子表面活性剂。本发明制备的EPO制剂配方用于皮下或肌肉注射，剂型是水针剂或冻干粉针剂。本发明的EPO可用于治疗因肾功能衰竭引起的贫血、癌症患者因放化疗引起的贫血、手术前自体输血、新生儿贫血等疾病；也可用于美容等。

Description

一种稳定的红细胞生成素制剂配方

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种红细胞生成素(EPO)的制剂配方，它可代替传统的静脉给药途径，采用皮下或肌肉注射的方式给患者给药。

背景技术

红细胞生成素(Erythopoietin，EPO)自1989年6月上市以来，其治疗的适应症在不断增加，在大多数情况下，EPO是经静脉内(IV)注射的，但对于肾衰竭引起的尿毒症患者来说，他们需要边工作，边接受治疗，静脉注射需要在医护人员指导下完成，耗时较长。通过改变给药途径，如皮下注射或肌肉注射，可极大方便患者或医护人员使用，缩短给药时间，特别对于透析需要维持剂量的患者来说，培训他们自己使用，给患者带来极大的方便。

至目前为止，中国市场销售的EPO规格有2000IU/mL/瓶、3000IU/mL/瓶、4000IU/mL/瓶、5000IU/mL/瓶、6000IU/mL/瓶、10000IU/mL/瓶等多种规格，有水针剂和冻干粉针剂两种剂型。配方中以人血白蛋白作为保护剂为主，沈阳三生等也发明不含人血白蛋白作为保护剂的制剂配方(专利CN1247257C)。这些市售EPO来自中国的EPO生产厂家和国外厂家，如Amgen公司的Epogen，强生子公司Ortho Biotech的Procrit产品(与Epogen实际为同一产品)和日本Kyowa Hakko Kirin(日本协和麒麟公司)的ESPO等。此外,中国市场还有Amgen公司生产的长效EPO Aranesp，Aranesp是Amgen公司于2001年9月获得FDA批准上市的一种“高糖基化”的长效rhEPO--α产品，长效原理是将人促红细胞生成素经部分修饰的氨基酸序列并在其分子中加附了新的糖链、由此使之呈现更长的血清半衰期和持续的促红细胞生成活性；而Mircera(聚乙二醇倍他依泊汀)是Roche公司在2007年11月上市的另一种长效rhEPO-β，其本质为聚乙二醇化的倍他依泊汀，通过聚乙二醇修饰的倍他依泊汀大大延长了药物作用时间。上述EPO均需患者静脉给药，其配方中含有活性成分EPO(2000-10000IU/mL)、缓冲剂、保护剂等。

但红细胞生成素至目前为止，市场上没有一种剂型用于皮下或肌肉注射，本发明的目的是要解决EPO用于皮下注射或肌肉注射的新的剂型，便于医护人员和患者使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定的可供皮下或肌肉注射的含高活性单位EPO的制剂配方。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种稳定的红细胞生成素EPO制剂配方，其包括：红细胞生成素，pH7.0±0.5的透明质酸酶，缓冲剂，稳定剂和非离子表面活性剂。

优选地，所述红细胞生成素是经细菌、酵母或动物细胞表达的重组蛋白；或从动物组织中提取的天然蛋白；或这些蛋白与一些小分子化合物偶联所形成的EPO偶联物，它们均具有促进红细胞生成的生物学活性。

优选地，所述的透明质酸酶为细胞表达或从动物组织(体液)提取的可溶性蛋白，进一步地，所述的透明质酸酶为rPH20。

优选地，所述稳定剂选自人血白蛋白、蔗糖、海藻糖二水合物、甘露糖中的一种或几种混合物。

优选地，所述缓冲剂选自柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液或其他可用于人体注射的缓冲液，缓冲剂浓度为1-100mM。

优选地，非离子表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80或聚乙烯-聚丙烯聚合物。

优选地，红细胞生成素含量为20ug/mL-50mg/mL,优选为20ug/mL-10mg/mL，再优选地100ug/mL-5mg/mL，更优选地为500ug/mL-3mg/mL。为方便医护人员和患者选择使用，如100ug/ml/瓶(支)，200ug/ml/瓶(支)，300ug/ml/瓶(支)，4 00ug/ml/瓶(支)，500ug/ml/瓶(支)等，也可以1mg/ml/瓶(支)，2mg/ml/瓶(支)，3mg/ml/瓶(支)，4mg/ml/瓶(支)，5mg/ml/瓶(支)或10mg/ml/瓶(支)等,EPO的比活性约为100000IU/mg，则换算成国际单位，对应为10000IU/ml/瓶(支)，20000IU/ml/瓶(支)，30000IU/ml/瓶(支),40000IU/ml/瓶(支),50000IU/ml/瓶(支)。也可以是100000IU/ml/瓶(支)，200000IU/ml/瓶(支)，300000IU/ml/瓶(支)，400000IU/ml/瓶(支)，500000IU/ml/瓶(支)或1000000IU/ml/瓶(支)。

优选地，透明质酸酶含量为100IU-20000IU/mL，优选为300IU/mL至2000IU/mL，更优选地为500-1500IU/mL。

优选地，非离子表面活性剂含量为0.01至0.1％(w/v)，优选为0.01-0.08％，更优选地为0.02-0.04％。

优选地，稳定剂浓度为5-200mM范围，优选为5-150mM，更优选地为10-100mM。

在一些实施方案中，用于皮下或肌肉注射的EPO稳定的剂型有：

含有300ug-1000ug/mL的EPO活性成分，10-100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH5-8)，150-300IU/mL的透明质酸酶，0.5mg/mL-5mg/mL的人白蛋白，0.01-0.05％的非离子表面活化剂。透明质酸酶已经公认是安全和有效的，添加的含量有较大的范围，如150-1500IU/mL均可以；

含有300ug-1000ug/mL的EPO活性成分，10-100mM柠檬酸盐缓冲剂(pH5-8)，150-300IU/mL的透明质酸酶，5-100mM的海藻糖二水合物或蔗糖，0.01-0.05％的非离子表面活化剂；

含有1.2mg-2mg/mL的EPO活性成分，10-100mM柠檬酸盐缓冲液(pH5-8)或磷酸盐缓冲液(pH5-8),150-1000IU/mL透明质酸酶，5-200mM蔗糖或海藻糖二水合物作为稳定剂，0.02-0.2％的非离子表面活化剂；

含有3mg-5mg/mL的EPO活性成分，10-100mM柠檬酸盐缓冲液(pH5-8)或磷酸盐缓冲液(pH5-8),150-1500IU/mL透明质酸酶，5-200mM蔗糖或海藻糖二水合物作为稳定剂，0.02-0.2％的非离子表面活化剂；

含有5mg-10mg/mL的EPO活性成分，10-100mM柠檬酸盐缓冲液(pH5-8)或磷酸盐缓冲液(pH5-8),150-2000IU/mL透明质酸酶，5-200mM蔗糖或海藻糖二水合物作为稳定剂，0.02-0.2％的非离子表面活化剂；

为特殊情况下方便医务人员使用EPO，可以采取更高的EPO浓度，如10-50mg/mLEPO，10-100mM柠檬酸盐缓冲液(pH5-8)或磷酸盐缓冲液(pH5-8),150-15000IU/mL透明质酸酶，5-200mM蔗糖或海藻糖二水合物作为稳定剂，0.02-0.2％的非离子表面活化剂。

本发明的稳定的红细胞生成素制剂配方，用于皮下或肌肉注射，其剂型为液体或冻干剂型。用于治疗因肾功能衰竭引起的贫血、癌症患者因放化疗引起的贫血、手术前自体输血、新生儿贫血等疾病；也可用于美容等。

皮下或肌肉注射的体积一般小于2ml，这是由于大体积注射后产生的反压导致皮下组织水肿，因此需要提高单位体积的蛋白浓度或采用多点注射的方法来解决这个矛盾。

大分子蛋白药物肌肉或皮下注射，在抗体中比较普遍，如高浓度的抗HER2单抗(用于治疗乳腺癌等肿瘤，专利CN1025789A)；高浓度的贝伐珠单抗(用于治疗肺癌等肿瘤，专利CN201410093781)；高浓度的阿达木单抗(治疗自身免疫疾病)等，这些单抗用于皮下注射时均需提高单位体积的蛋白浓度，减少因降解和吸收效率低引起的有效药物不足。通过使用少量的可溶性的透明质酸酶，降解皮下组织内的透明质酸，提高组织中液体渗透能力，增加组织的通透性，有利于药物的吸收。

添加透明质酸酶的浓度取决于本发明中提供的配方中活性成分EPO的含量。本发明的技术方案为了提供足够量的透明质酸酶，能有效促进EPO的吸收，因此，透明质酸酶的最小使用量一般不会低于100IU/mL。更具体地讲，透明质酸酶的有效量在150IU/ml到20000IU/ml,如果我们假定透明质酸酶的比活性为100000IU/mg，则添加的透明质酸酶的浓度约为0.015mg/ml至0.2mg/mL。根据一般的常识，透明质酸酶与EPO的配比为1:1000或1:2000或1:3000或1:4000或1:5000或更高比例等。

本发明提供了一种高浓度红细胞生成素和少量可溶性透明质酸酶组合的形式，对于本领域的技术人员，可以容易理解高浓度EPO制剂和透明质酸酶单独使用也可达到相同的效果。如在注射高浓度EPO前或后，在紧密相邻部位注射透明质酸酶，也可达到相同的效果。

本发明在制剂中增加了非离子表面活化剂，这对于含有高浓度的EPO来讲，是必需的，因为大多数蛋白在高浓度下容易形成聚体，聚体会引起治疗性蛋白的免疫原性，致使治疗的失败。为减少因高浓度引起的蛋白聚集，配方中还需要添加一些少量的非离子表面活性剂，阻止或降低蛋白的聚集，使制剂在一定时间内，如2年或更长时间是稳定的。

词语：红细胞生成素(Erythopoietin，EPO)，指具有抑制骨髓红系祖细胞凋亡、刺激网状红细胞释放进入血液循环、并刺激细胞内蛋白质合成；是体内红细胞增殖、分化以及维持外周循环红细胞数量正常的最主要的造血生长因子。EPO可以为动物细胞表达的重组蛋白，或从动物组织或体液中提取的蛋白，一般含有160-170个氨基酸序列，一般重组的rHuEPO的氨基酸序列为165个氨基酸，而天然EPO则有166个氨基酸，其蛋白结构中，一般含有3个N-型和1个O-型糖链结构，但技术人员也可以对其氨基酸序列进行改造，增加1-3个N-型糖基化位点，以增加EPO在体内的半衰期，减少静脉注射的频率，或者采用另外的方式延长EPO在体内的半衰期，如与不同分子量的PEG(聚乙二醇)化合物偶联，如PEG4000、PEG6000、PEG8000、甚至更大分子的PEG等形成PEG-EPO偶联物，这些不同形式的EPO均可应用本发明提供的新配方实施皮下或肌肉注射。

透明质酸酶是具有将透明质酸降解的活性物质。同样，透明质酸酶可以是动物细胞表达的重组蛋白，或从人体组织或体液中提取的蛋白，其特征含有400-480个氨基酸序列，分子量约50k-70kDalton，具有将透明质酸降解的活性,典型的重组透明质酸酶是rHP20。所述的透明质酸酶其氨基酸序列中含有6个N-型糖基化位点和1个O-型糖基化位点。

本发明制备的EPO制剂配方用于皮下或肌肉注射，剂型是水针剂或冻干粉针剂。本发明的EPO制剂配方用于治疗因肾功能衰竭引起的贫血(血透)、癌症患者因放化疗引起的贫血、手术前自体输血、新生儿贫血等疾病；也可用于美容等。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据研究者的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

介绍和概述

本发明通过举例而非给出限制的方式来进行说明。应注意的是，在本公开文件中所述的“一”或“一种”实施方式未必是指同一种具体实施方式，而是指至少有一种。

下文将描述本发明的各个方面。然而，对于本领域中的技术人员显而易见的是，可根据本发明的仅一些或所有方面来实施本发明。为说明起见，本文给出具体的编号、材料和配置，以使人们能够透彻地理解本发明。然而，对于本领域中的技术人员将显而易见的是，本发明无需具体的细节即可实施。在其他例子中，为不使本发明费解而省略或简化了众所周知的特征。

将各种操作作为多个分立的步骤而依次进行描述，且以最有助于理解本发明的方式来说明；然而，不应将按次序的描述理解为暗示这些操作必然依赖于顺序。

将根据典型种类的反应物来说明各种实施方式。对于本领域中的技术人员将显而易见的是，本发明可使用任意数量的不同种类的反应物来实施，而不只是那些为说明目的而在这里给出的反应物。此外，也将显而易见的是，本发明并不局限于任何特定的混合示例。

具体实施例

实例1：

一种稳定的红细胞生成素制剂配方由如下组分构成：500ug/mL EPO,10mM柠檬酸缓冲液,pH7.0，2.5mg/mL人白蛋白，150IU/mL透明质酸酶，0.01％聚山梨酯20。

实施例2

一种稳定的红细胞生成素制剂配方由如下组分构成：1.5mg/mLEPO，10mM柠檬酸缓冲液，pH7.0，100mM海藻糖二水合物，500IU/mL透明质酸酶，0.04％聚山梨酯20。

实施例3

一种稳定的红细胞生成素制剂配方由如下组分构成：5mg/mL EPO,10mM磷酸盐缓冲液，pH6.8,150mM海藻糖二水合物，1000IU/mL透明质酸酶，0.04％聚山梨酯20。

实施例4.

一种稳定的红细胞生成素制剂配方由如下组分构成：10mg/mL EPO,10mM磷酸盐缓冲液，pH6.8,200mM海藻糖二水合物，1500IU/mL透明质酸酶，0.04％聚山梨酯20。

以上所述具体实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进或替换，这些改进或替换也应当视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，其包括：

(1)红细胞生成素，

(2)透明质酸酶，

(3)pH7.0±0.5的缓冲剂，

(4)稳定剂，

(5)非离子表面活性剂。

2.根据权利要求1所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，所述的红细胞生成素是经细菌、酵母或动物细胞表达的重组蛋白；或从动物组织中提取的天然蛋白；或这些蛋白与一些小分子化合物偶联所形成的EPO偶联物。

3.根据权利要求1所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，所述稳定剂选自人血白蛋白、蔗糖、海藻糖二水合物、甘露糖中的一种或几种混合物。

4.根据权利要求1所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，所述缓冲剂选自柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，缓冲剂浓度为1-100mM。

5.根据权利要求1所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，所述非离子表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80或聚乙烯-聚丙烯聚合物。

6.根据权利要求1-5任一项所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，红细胞生成素含量为20ug/mL-50mg/mL。

7.根据权利要求1-5任一项所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，所述透明质酸酶含量为100-20000IU/mL。

8.根据权利要求1-5任一项所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，所述稳定剂浓度为5-200mM。

9.根据权利要求1-5任一项所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，所述非离子表面活性剂含量为0.01至0.1％(w/v)范围内。

10.根据权利要求1所述的稳定的红细胞生成素制剂配方，其特征在于，其剂型为液体或冻干剂型。