CN104940902B - 一种聚乙二醇集成干扰素变异体的稳定溶液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇集成干扰素变异体稳定溶液，以组氨酸盐作为缓冲系统，通过控制pH在5.0‑5.5，可以有效控制制剂中片段断裂的问题，4℃下18个月片段含量不超过0.5％。

Description

一种聚乙二醇集成干扰素变异体的稳定溶液

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇集成干扰素变异体的稳定溶液，即一种稳定的注射制剂，属于药物制剂技术领域。

背景技术

干扰素是由灭活的或活的病毒作用于易感细胞后，由易感细胞基因组编码而产生的一组糖蛋白。其活性及抗原性皆取决于分子中的蛋白质，而与其糖基无关。根据其来源和结构，可将IEN分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λs，它们分别由白细胞、纤维母细胞和活化T细胞产生。IFN-α为多基因产物，有十余种不同亚型，但它们的生物活性基本相同。IFN除有抗病毒作用外，还有抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖及引起发热等作用。目前临床上使用的干扰素大多是通过基因重组技术得到的。

为提高天然干扰素的活性，美国Amgen公司首次合成了一种非天然的干扰素(Consensus interferon,集成干扰素，商品名为干复津)。干复津是一种经计算机优化组合的非天然的重组α-干扰素，其序列由20种天然α-干扰素亚型序列优化组合而成，其抗病毒活性比天然干扰素提高了5～10倍。

与其它蛋白一样，使用α干扰素作为药物通常受到一些缺点的限制，包括抗原性和半衰期较短，其抗原性导致中和抗体的形成以及临床响应的损失，半衰期较短意味着需要频繁给药以维持蛋白质的治疗有效浓度。这些问题可以通过将干扰素与聚合物如聚乙二醇缀合来克服。然而，尽管干扰素-聚乙二醇缀合物在临床上有效，但是该类缀合物在临床实践中的广泛使用，需要能够在一段储运时间内稳定存在，以便利于在使用时的安全有效，因此需要制成利于储存的稳定制剂。

美国专利6180096公开聚乙二醇化干扰素α缀合物注射液在储存中可导致PEG与干扰素α性质和缀合度的改变。这些改变包括缀合物降解(或称“结构断裂”)成游离PEG和干扰素α，接着游离的PEG连接至另一个聚乙二醇化干扰素分子上，或PEG分子从缀合物的一个位点经分子内位移转移至相同分子内的另一个位点，解决这种降解问题是将PEG干扰素α缀合物制成冻干制剂。WO1999/048535、WO2006/020720也公开了一种类似的以冻干形式解决降解问题的方案。

聚乙二醇化重组人集成干扰素变异体的氨基酸序列具有特殊性(见专利ZL01102915.3),在常规的集成干扰素N末端添加了若干氨基酸(GSGGG)，并通过对末端氨基酸(甘氨酸，G)的氨基进行单一位点的聚乙二醇化修饰，对其溶液的研究发现结构断裂通常发生在上述添加的N末端的GSGGG序列中(包括PEG连接位点处)。专利CN201110189858.3中公开了一种聚乙二醇化集成干扰素变异体注射液，处方中包括缓冲液、山梨醇、聚山梨酯80，pH为4.5-7.5，其中在断裂片段研究中，储存过程最为稳定的是以磷酸盐缓冲液(缓冲的pH为6.5-7.5)而配置的稳定注射溶液，该配方在储存过程中结构断裂后的游离IFN-SA片段也在5.4％以上。

然而，影响聚乙二醇化重组集成干扰素变异特注射液稳定性的因素，不仅仅是只有结构断裂这一种，干扰素类产品发生氧化降解已有很多报道，聚乙二醇化重组人集成干扰素变异体的氨基酸序列中同时含有若干个甲硫氨酸(M)，因此理论上可能发生氧化降解。并且在长期或加速稳定性研究中证实，氧化杂质的增加也是注射液纯度下降的主要原因。

显然，在有众多影响注射液稳定的因素中，仅结构断裂后产生的游离片段就存在如此多的降解片段对产品的质量显然是很不利的，因此需要提供一种在长期储存过程中更为稳定、降解杂质含量更少的聚乙二醇化重组集成干扰素变异体注射液。

发明目的

本发明的目的是提供一种长期储存过程中降解杂质更为少的稳定的聚乙二醇重组集成干扰素变异体注射剂。

研究人员在制剂研究过程中惊奇地发现，用组氨酸盐为缓冲剂，并将溶液的pH控制在6.0以下(如4.5-6.0)，更为优选地将pH控制在5.5以下(如5.0-5.5)，在制剂储存过程中可以更为有效地控制制剂中的断裂片段及氧化降解杂质的形成。

本发明描述的稳定的制剂处方在长期储存过程中(4℃下，18个月)，可以将断裂片段控制在5％以下，优选的是控制在3％以下，1％以下，或者0.5％以下，更为优选地是控制在0.1％以下，相对于201110189858.3专利中的注射制剂片段含量显著降低，对制剂的质量可以明显提高。此外，还可将氧化杂质控制在3％以下，更优选为控制的2％一下，最优选为控制在1.5％以下。

具体地，本发明涉及一种聚乙二醇集成干扰素变异体的稳定溶液配方，所述稳定溶液包括：治疗有效量的聚乙二醇集成干扰素变异体、组氨酸、保护剂及稳定剂，所述溶液的pH为4.5-6.0，优选为5.0-6.0。

本发明稳定溶液中，所述组氨酸的浓度可以是5-50mmol/L的任意范围，优选地，5-10mmol/L的组氨酸即可实现本发明的目的，更大浓度的组氨酸虽然可能更有利于聚乙二醇集成干扰素注射液的稳定，但更大的浓度实现更稳定的效果已经不那么显著，却会增加制剂成本。

本发明中，保护剂可以是选自糖类，如山梨醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、葡聚糖、海藻糖，或者是氯化钠，优选为山梨醇、蔗糖或海藻糖，更优选山梨醇，保护剂的浓度可以是1％-15％(重量/体积，g/100ml溶液)。

本发明中，所述的稳定剂选自聚山梨酯类，如聚山梨酯20或聚山梨酯80，优选为聚山梨酯80，所述稳定剂的浓度为0.001％-0.01％(重量/体积，g/100ml溶液)。

本发明中，所述稳定溶液的pH为4.5-6.0，优选为5.0-6.0，更优选为5.0-5.5。

进一步地，为更好地控制聚乙二醇集成干扰素变异体溶液在长期储存过程中因氧化而导致质量下降，本发明所述稳定溶液还可以包括至少一种选自甲硫氨酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、EDTA、维生素C或二丁基苯酚的抗氧剂，优选为甲硫氨酸，所述抗氧剂的浓度为0.01％-0.5％(重量/体积，g/100ml溶液)。

在本发明的一实施方式中，涉及一种如下组成的聚乙二醇集成干扰素变异体溶液，包括：50-500μg/ml的聚乙二醇化集成干扰素变异体、5-50mmol/L的组氨酸、重量体积比为1％-10％的山梨醇、重量体积比为0.001％-0.005％的聚山梨酯80、重量体积比为0.05％-0.15％的甲硫氨酸，所述稳定溶液的pH为5.0-6.0。

在本发明的一实施例中，通过对不同保护剂考察，发现当选用氯化钠时，是不利于制剂稳定的，储存过程中有更多的断裂片段，山梨醇及蔗糖相对更少。

在本发明的又一实施例中，选用不同的缓冲系统来评价其对制剂稳定性的影响，在同样的pH条件下，发现醋酸盐缓冲系统不利于控制制剂的断裂情况，而磷酸盐缓冲系统缺有更多的氧化杂质形成，然而，组氨酸盐缓冲系统(也可称为组氨酸缓冲系统，通过用盐酸或氢氧化钠调控最终制剂的pH值)对制剂的中的片段断裂及氧化杂质的控制更为有利。

在本发明的又一实施例中，在选中组氨酸盐作为制剂的缓冲系统后，通过考察不同pH值对制剂稳定性影响，发现高pH(比如6.7，或7.2以上)，对制剂的片段断裂及氧化杂质的控制都不利，而将pH控制在6.0或以下，可以更为有效地控制制剂中的片段断裂及氧化杂质的形成。优选的是，当将pH控制在5.5时，其对制剂的稳定性又更为有利。

在一更具体的实施例中，涉及一种如下组成的聚乙二醇集成干扰素变异体溶液，包括：权利要求8所述的稳定溶液，所述溶液包括150μg/ml的聚乙二醇化集成干扰素变异体、10mmol/L的组氨酸、重量体积比为4％的山梨醇、重量体积比为0.004％的聚山梨酯80、重量体积比为0.1％的甲硫氨酸，所述稳定溶液的pH为5.0-5.5。

本发明中，还涉及到所述稳定溶液的制备方法，包括：

(a)将组氨酸、山梨醇、甲硫氨酸、聚山梨酯80溶解于水中制得第一溶液；

(b)将聚乙二醇集成干扰素变异体原液溶解于组氨酸缓冲液制得第二溶液；

(c)将第一溶液和第二溶液混合均匀；并

(d)将(c)步骤中混合溶液的pH调节至5.0-5.5。

本发明中，组氨酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液可互换使用，用组氨酸作为缓冲液，其在配置过程中，最终需要使用氢氧化钠和/或盐酸来调节缓冲所需的pH值。

附图说明

图1、2分别为不同稳定剂对聚乙二醇集成干扰素变异体注射剂中断裂片段和氧化杂质的影响。

图3、4为不同缓冲系统对聚乙二醇集成干扰素变异体注射剂中断裂片段和氧化杂质的影响。

图5、6为以组氨酸为缓冲体系，不同pH条件对聚乙二醇集成干扰素变异体注射剂中断裂片段和氧化杂质的影响。

具体实施方式

以下从具体的实施方式来说明本发明的有益效果，需要指出的是，所列举的实施例并不是为了限制本发明，本领域技术人员在本发明技术方案的教导下，并结合现有技术中的常规知识，是容易做出不同变换的。

本发明通过设计不同处方，包括不同缓冲系统，不同蛋白稳定剂，不同pH等条件，考察加速条件下(40C)的稳定性，比较不同处方中断裂杂质与氧化杂质的变化情况，从而筛选中可以控制这两种降解的最佳处方。由于大分子药物在不同温度下的降解机理及动力学经常不相同，因此在加速条件下筛选出候选处方后，需要进行长期稳定性考察以确认控制效果。

实施例1不同保护剂对聚乙二醇集成干扰素变异体溶液稳定性影响

处方设计(表1)

	缓冲系统	保护剂	抗氧化剂	表面活性剂	pH
						处方3	磷酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.0
处方4	磷酸盐	蔗糖	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.0
						处方5	磷酸盐	氯化钠	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.0

氧化杂质及断裂片段结果见图1和图2。从图1、2可以看出，氧化杂质受处方中保护剂的影响较小，而断裂在含有氯化钠处方中的增加比其它处方更快。

实施例2不同缓冲系统对聚乙二醇集成干扰素变异体溶液稳定性影响

处方设计(表2)

	缓冲系统	保护剂	抗氧化剂	表面活性剂	pH
						处方3	磷酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.0
处方6	醋酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.0
						处方7	组氨酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.0

处方的缓冲系统对氧化杂质和断裂杂质影响各不相同，磷酸盐处方中氧化杂质增加最快，组氨酸盐处方中氧化杂质增加最慢(图3)；而醋酸盐处方中的断裂杂质增加最块，磷酸盐及组氨酸处方中断裂杂质均相对较慢(图4)，综合氧化杂质及断裂片段考虑，选择组氨酸盐作为缓冲系统最有利于聚乙二醇集成干扰素变异体溶液的稳定性。

实施例3同一缓冲系统的不同pH对聚乙二醇集成干扰素变异体溶液稳定性影响

处方设计(表3)

	缓冲系统	保护剂	抗氧化剂	表面活性剂	pH
						处方2	组氨酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	7.2
处方8	组氨酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.7
						处方3	组氨酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	6.0
处方9	组氨酸盐	山梨醇	甲硫氨酸	聚山梨酯80	5.5

处方的pH对氧化杂质和断裂杂质都有明显的影响，随着pH的降低，氧化与断裂杂质的增加都明显减慢，但是当pH降低至6.0或5.5时两者对断裂杂质的影响没有明显差别(图5、6)，表明pH对控制处方中聚乙二醇化集成干扰素的降解起着至关重要的作用。

实施例4制备稳定的聚乙二醇集成干扰素变异体稳定溶液

制剂的制备方法

将组氨酸溶解于水中，并边搅拌边加入山梨醇、甲硫氨酸、聚山梨酯80，使用氢氧化钠和/或盐酸将pH调节至目标值，再将所制备得到溶液通过0.22μm的滤器过滤，制备得到第一溶液；

取检定合格的聚乙二醇集成干扰素变异体原液，用适量组氨酸缓冲液混匀，制备得到第二溶液；

将第一溶液和第二溶液混匀，并用氢氧化钠和/或盐酸调pH至目标值，无菌过滤、分装即得。

上所有操作均在无菌环境中进行。

将制备得到的稳定溶液于2-8℃保存。

制剂组成如下(表4)：

实施例5制剂稳定性考察

分析制剂中断裂片段的含量及氧化杂质的含量，制剂于4℃条件下放置18个月，使用反相高效色谱检测氧化杂质，使用凝胶色谱高效液相检测断裂的片段。并同等条件下测定专利201110189858.3实施例4中的制剂处方A的断裂及氧化杂质的情况。

表5室温4℃条件下放置18个月断裂片段考察

表6室温4℃条件下放置18个月氧化降解杂质考察

从上表(表5、表6)结果可以看出，在4℃长期储存18个月后，各项稳定性指标明显都要好于专利201110189858.3中的最优处方(即专利实施例4中的制剂A)。

Claims (4)

1.一种聚乙二醇集成干扰素变异体稳定溶液，其包括150μg/ml的聚乙二醇化集成干扰素变异体、10mmol/L的组氨酸、重量体积比为4％的山梨醇、重量体积比为0.004％的聚山梨酯80、重量体积比为0.1％的甲硫氨酸，而且所述稳定溶液的pH为5.0-5.5，其中所述稳定溶液4℃放置18个月后，断裂形成的集成干扰素变异体片段不超过1％。

2.根据权利要求1所述的稳定溶液，其中所述稳定溶液4℃放置18个月后，断裂形成的集成干扰素变异体片段不超过0.5％。

3.根据权利要求2所述的稳定溶液，其中所述稳定溶液4℃放置18个月后，断裂形成的集成干扰素变异体片段不超过0.1％。

4.一种制备权利要求1-3中任意一权利要求所述稳定溶液的方法，包括：

(a)将组氨酸、山梨醇、甲硫氨酸、聚山梨酯80溶解于水中制得第一种溶液；

(b)将聚乙二醇集成干扰素变异体原液溶解于组氨酸缓冲液中制得第二溶液；

(c)将第一种溶液和第二种溶液混合；并

(d)将(c)步骤中混合溶液的pH调节至5.0-5.5。