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CN107438485A - 生物样品收集器和其处理中以及与其相关的改进 - Google Patents

生物样品收集器和其处理中以及与其相关的改进 Download PDF

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CN107438485A CN201680020074.9A CN201680020074A CN107438485A CN 107438485 A CN107438485 A CN 107438485A CN 201680020074 A CN201680020074 A CN 201680020074A CN 107438485 A CN107438485 A CN 107438485A
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R.约翰
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Abstract

本申请公开了包含固相支持体12的生物样品收集器500，所述支持体具有用于接收生物样品的多个离散的区域(22、24、26、28，图1)，每个区域例如通过具有吸附到固相支持体上的不同的化学处理被化学区分。封套530包绕固相支持体。盖部分520可在收集后覆盖生物样品以防止感染。UV光可应用于收集的样品以降低感染的风险。

Description

生物样品收集器和其处理中以及与其相关的改进
发明领域
本发明涉及生物样品收集器及其处理。特别而非排外的是，本发明涉及来自潜在感染的受试者如感染埃博拉病毒性疾病(EVD)的那些受试者的生物样品的收集和处理。
发明背景
依据世界卫生组织，到2014年10月1日为止，从西非(几内亚、利比里亚、塞拉利昂、塞内加尔、尼日利亚)报道了总数7,203例EVD (包括3,340例死亡)。在那时，来自WHO和ImperialCollege London的专家预测感染数将继续呈指数增长，除非快速加强在西非的埃博拉控制措施。
要知道的是，虽然有效的干预策略如新的治疗和疫苗正在探索中，EVD的准确诊断是一个对爆发作出反应的关键要素，并对未来的爆发将是关键的。目前，控制这样一种流行病在很大程度上依赖于实验室测试，以适当地指导患者至埃博拉治疗中心或者另一个场所。目前的实验室能力依赖于移动式实验室装置和其它指定的实验室以进行分子测定如PCR测定，或基于ELISA/抗体的试验如侧向流试验，以证实EVD。这些实验室在理论上应与埃博拉治疗中心相通。越来越多地认识到，虽然这些实验室是非常重要的，但在2014年EVD爆发时，它们不可能解决所有的诊断需要，特别是在只有很少或没有卫生保健基础设施的那些受影响的非洲国家；因此对新的快速的、用于不需要广泛生物安全要求的分散的卫生保健设施的接触/护理点EVD试验，仍有着迫切的需求。除了EVD，对于其它疾病如其它出血性疾病爆发和流感新毒株，以及更多确定的疾病如HIV的诊断，毫无疑问地在未来将出现相同的需求。
这样的快速的EVD试验将允许早期诊断并分派到埃博拉治疗中心或其它护理点，通过患者和家庭的早期支持、接触追踪和隔离，增强患者和社区结果。
在受影响区域中接触EVD的恐惧可大大地减少患者样品收集的普遍性和有效性。这进而可不仅对诊断，而且也对遗传研究和着眼于影响患者后果的因素的其它研究可利用的研究材料具有有害的影响。
目前对于诊断EVD的优选的方法是使用基于抗体的试验如侧向流测定，基于分子技术进行的。然而，还已注意到，基于不同的技术和生物标记的许多方法可潜在用于EVD的检测。例如，抗原检测试验可在控制这种EVD爆发中起着有用的作用，如果它们可以是高度敏感的话。许多自动化的半便携式核酸扩增试验平台也已被开发出来用于其它疾病如HIV、TB和疟疾，并可潜在地用于EVD检测，如果适合于适当的生物安全要求的话。然而，无论选择什么样的技术和生物标记，待用的样品类型和收集要求在实现用于传播地点可行的测试中将是至关重要的。对当地工作人员进行测试所需的培训量也应保持到最少。
WHO已对有效诊断EVD指定了某些重要的考量，特别是考虑了在这样的诊断很可能发生的临床环境：
在没有/具有最小的实验室基础设施的情况下，通过分散的卫生保健设施是可用的；
在不需要验证性测试的情况下，需要在急性埃博拉病毒性感染和非-埃博拉病毒性感染的有症状的患者之间进行鉴别；
大于99%的分析特异性；
仅从指尖血液采样诊断，优先于来自静脉切开术的静脉血；
需要很少或没有样品制备；
任何试剂使用的稳定性 - 于90% RH、室温(5-50摄氏度)贮存，保存期> 24个月。
本发明人已认识到改进的样品收集器和样品处理可解决至少上面刚刚提及的关键考虑。
虽然WHO聚集于有效诊断和治疗患者，但对本文描述的改进的患者样品收集器和样品处理设备的实施方案有其它优点。特别是，由于不愿意与EVD携带者接触，样品未与它们可能的那样频繁地被收集。因此，如上所述，更受限制的研究样品材料被获得。当样品可在伴有感染的较低风险下获得、转运和贮存，并以允许以大量测定进行的方式贮存时，则本发明人已认识到，这将有利于推进对采样的EVD和其它感染性疾病的理解。
感染EVD
虽然EVD的感染机制尚未完全理解，但对于病毒经由蛋白进入宿主细胞，认为有两个可能的候选物：
1. 第一个是胆固醇转运蛋白，宿主-编码的Niemann–Pick C1 (NPC1)，其对于埃博拉病毒体进入宿主细胞和对于其最终复制似乎是必要的。在一项研究中，具有一个拷贝的NPC1基因去除的小鼠在暴露于小鼠-适应的埃博拉病毒后15天后显示出80%的存活率，而仅有10%的未修饰小鼠生存这样长。在另一项研究中，小分子显示通过防止病毒被膜糖蛋白(GP)结合NPC1，抑制EVD感染。因此，NPC1显示对这种纤丝病毒的进入是至关重要的，因为它通过直接结合病毒GP介导感染。
当来自缺乏这种转运蛋白的Niemann–Pick C型患者的细胞暴露于实验室中的埃博拉病毒时，细胞存活并且似乎不受病毒的影响，进一步表明埃博拉依赖于NPC1进入细胞。推测人类NPC1基因的突变为一种使得一些个体对这种致命的病毒疾病有抗性的可能模式。相同的研究描述了有关NPC1在马尔堡病毒(一种相关纤丝病毒)的病毒进入中的作用的类似结果。进一步的研究还已提出了以下的证据：NPC1是经由其直接结合病毒GP而介导埃博拉感染的关键受体，以及NPC1的第二"溶酶体"结构域介导这种结合。
2. 第二个候选物是TIM-1 (即HAVCR1)。TIM-1显示结合于EVD糖蛋白的受体结合结构域，以增加Vero细胞的感受性。用siRNA沉默其作用防止了Vero细胞的感染。TIM1在已知受EVD溶胞严重影响的组织(气管、角膜和结膜)中表达。针对TIM-1的IgV结构域的单克隆抗体ARD5阻断EVD的结合和感染。
总之，这些研究提示NPC1和TIM-1可以是埃博拉抗-病毒药物的潜在治疗靶，并可作为快速现场诊断测定的基础。
EVD复制
作为非细胞的病毒如埃博拉不通过任何类型的细胞分裂复制；更确切地说，它们采用宿主和病毒编码的酶的组合，与宿主细胞结构一起，产生自身的多个拷贝。然后这些在宿主细胞中自我-装配成病毒大分子结构。当感染每个单独的细胞时，病毒完成一系列步骤。病毒通过糖蛋白(GP)表面膜粒附着于宿主受体开始其攻击，并被内吞进入宿主细胞中的巨吞饮体。为穿透细胞，病毒膜与囊泡膜融合，核衣壳被释放进入细胞质。壳体化的反义基因组ssRNA被用作模板，用于合成(3'-5')多聚腺苷酸化的、单顺反子mRNA，并使用宿主细胞的核糖体、tRNA分子等，将mRNA翻译为各个病毒蛋白。
这些病毒蛋白被加工：糖蛋白前体(GP0)被裂解为GP1和GP2，然后使用细胞酶和底物将其高度糖基化。这两个分子首先装配成异二聚体，然后装配成三聚体，得到表面膜粒。分泌的糖蛋白(sGP)前体被裂解为sGP和δ肽，其二者从细胞释放。随着病毒蛋白水平升高，从翻译至复制发生转换。使用反义基因组RNA作为模板，合成互补的+ssRNA；然后其被用作模板，合成新的基因组(-)ssRNA，其快速地被壳体化。新形成的核衣壳和被膜蛋白在宿主细胞的质膜处缔合；发生出芽，破坏所述细胞。
鉴于上述，本发明人已经认识到需要多格式样品收集装置，其可以安全、非-感染性方式捕获和贮存DNA、RNA (mRNA、病毒RNA、ssRNA)和蛋白，从而提供可不仅用于诊断，而且还用于未来的研究的样品，其具有较低的来自处理贮存样品的后续感染风险。
发明概述
本发明提供一种样品处理方法、样品收集器和样品收集器设备，全部依据独立权利要求，具有由从属权利要求限定的优选特征。本发明还延伸至如要求保护的感染性样品收集方法。
本发明延伸至本文公开的特征的任何组合，无论这样的组合在本文是否被明确地提及或要求保护。此外，在两个或更多个特征在组合中被提及时，其意指在不扩展本发明的范围的情况下，这样的特征可被独立地要求保护。
附图简述
本发明可以很多方式实施，其示例性的实施方案在下面参照附图描述，其中：
图1显示第一样品收集器的一个实施方案；
图2a显示在封套中使用的图1的样品收集器，其中封套以分解和在预装配的条件下显示；
图2b和2c分别显示图2a所示的样品收集器在装配的条件下的侧视图和顶视图，以形成样品收集器的第二个实施方案；
图3a、3b和3c显示样品收集器的第三个实施方案，和用于处理在样品收集器上收集的样品和用于样品测定的设备的示意图；和
图4-13显示涉及实验结果的图，其在下文更详细地描述。
参考图1，其中显示了包含固相支持体材料12的样品收集器10，在这种情况下，纤维素纤维基质，例如形成一种纸材料。固相支持体包括多个离散的区域20，其可以是经化学处理的，或未处理的。在这种情况下，固相支持体的区域包括第一区22、第二区24、第三区26和第四区28，如下所定义。
这些区域22、24、26和28由齿孔30划界，所述齿孔限制例如所述区域之间的样品液体的毛细抽吸作用。在使用中，样品收集器10的这个实施方案可被用来收集来自手指刺破的全血，其可被从一侧到另一侧抹在固相支持体12上，以在多个区域22-28的每一个上提供生物样品。
区域22用商业上称为FTA的专有制剂经化学涂布；所述制剂包含弱碱、螯合剂和阴离子型表面活性剂。这种制剂允许收集器10/100的一部分从收集器冲孔，并在单一容器中接收用于进一步的处理。作为一个例子，为了研究目的，冲孔的样品可被用来执行STR和遗传分析，以确认患者的身份和促进病毒的细胞进入的结合受体的DNA序列。例如，可鉴定涉及EVD结合的受体的遗传分析，以及显示有利于进入的突变的遗传分析。相反地，也可获得表现出一些形式的抵抗的个体的遗传分析。重要的是，该化学处理允许生物样品的室温干燥贮存，而没有显著的变质。
区域24用商业上称为FTA Elute或FTAe的化学制剂经化学处理，所述制剂包含蛋白变性剂，例如，硫氰酸胍鎓，其允许分离液体形式的DNA。作为对FTA的一种替代方案，对于下游应用，例如克隆，这是有利的，并提供贮存DNA的方法，其中简单的洗脱步骤用于提取所述DNA。
区域26用商业上称为RSM的专有化学涂层经化学处理；所述RSM包含蛋白变性剂、还原剂和缓冲剂，和优选地，抗氧化剂和/或自由基捕获剂。例如，蛋白变性剂可包括硫氰酸胍鎓(GuSCN)、盐酸胍鎓、精氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、脲，或其任何组合。还原剂可以是三(2-羧基乙基)膦(TCEP)，缓冲剂可以是3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)，和抗氧化剂可以是氢醌单甲醚(MEHQ)、氢醌(HQ)、甲苯氢醌(THQ)或抗坏血酸。涂层允许受试者的mRNA以及病毒RNA的长期室温贮存和稳定化。RSM有利于完整的RNA分子在不同的温度范围内的长期贮存和稳定化。由于EVD是ssRNA病毒，RSM将适合于这种感染性物质的贮存。
区域28是商业上称为Whatman 903或Whatman 31ETF纸的未涂布的(未经化学处理的普通纸)区域，并被用来促进天然蛋白的分离和分析用于应用，如酶活性和结构研究。所述纸允许研究：宿主抗体；病毒糖蛋白；宿主NPC1表达；宿主TIM-1表达；和酶。
用抗氧化剂涂布区域22、24、26或28的一些或全部以保护核酸避免被UV光降解是可能的。
吸附到各个区域的上述化学涂层提供在室温下保护和稳定呈干燥(或可干燥的)状态的目的物质的样品收集器。区域22、24、26和28可因此是化学上区分的，即使所述区域之一未经化学处理。吸收剂涂层轮上的涂层优选连续地施用于固相支持体材料的连续网状物上，其被齿孔处理，然后通过已知的技术定长切割。
图2a显示样品收集器100的第二个实施方案的分解图，其采用样品收集器10和另外的封套110。封套110，在这种情况下，包含在折线134处折叠成两半的卡支持体130，用于包封样品收集器10，所述封套110包含窗口132以暴露下面区域22、24、26和28各自的部分。封套还包含透明的盖部分120，其在折线122处折叠。一旦组装，收集器10和盖部分120的一部分被夹心在卡支持体130的上页138和下页136之间，仅留下暴露的盖120的翼板124，并且一旦样品被置于一个或多个区域上并干燥后，便准备完成以在窗口132上折叠并覆盖它们。下页136具有与窗口132互补的窗口137，其允许一部分区域被移去，如下所述。
图2b和2c显示装配的样品收集器100的不同的视图。卡支持体130的上页和下页138和136被固定在一起，例如通过粘合剂。上页138包括压敏粘合剂条140。在样品被施用于区域22、24、26和28并有时间干燥后，翼板124可被压向条140，翼板124将粘附于条并使其保持在适当位置，以覆盖窗口132并防止样品的污染和感染。
图3a显示第三样品收集器500，其包括在封套520/530中的如上所述的固相支持体12。EVD可在环境中存活至多48小时，因此设想固相支持体12经受来自UV LED库200的UV光处理，例如发射约100-300nm的UV光数秒钟以灭活任何病毒活性。封套包括暴露的区域540，其允许识别标记，和/或条形码，和/或RFID标签。
图3b显示收集器500的贮存位置，其中封套的翼板520折叠在固相支持体12上，以保护固相支持体避免污染并进一步减少病毒感染的风险，在UV光处理后，应该有任何残留的病毒活性。翼板520可通过压敏粘合剂510保持在适当位置。
图3c显示收集器500打开的位置，供进行多次直接冲孔测定之一。在固相支持体12的区域22、24、26和/或28的样品被冲孔机240打孔，导致固相支持体12的部分250从支持体的剩余部分切出，并被迫直接进入含有试剂310的接收容器300。样品处理的这个阶段可能在离开初始样品收集点很远处发生，因此避免处理固相支持体12的能力是避免感染风险的显著优点。特别是，直接冲孔进入反应容器，并进行必要的测定的能力是有利的。获取全部区域22、24、26、28并在全部区域进行测定是可能的。因此，术语“部分”在此应视为包括全部区域。
与上面刚刚描述的相同的处理程序可应用于样品收集器10和100。如果使用收集器100，则翼板140可从允许UV光通过的塑料材料，例如0.25mm厚的PMMA或聚碳酸酯(无改性剂)制得。UV处理提供病毒灭活，特别是对于无化学处理以帮助灭活的Whatman 903纸区。
以下描述涉及测定来自生物样品的DNA、RNA、蛋白和酶信息的实施例，其表明有可能从上述类型的样品收集器上包含的样品(在样品已收集后长时间，没有使样品和样品收集器经受任何特殊的环境，或生物样品材料的任何特殊的多步骤处理)获得重要的信息。
实施例
1. 蛋白回收和检测
a. 白介素-2的直接测定——重组IL-2 ±载体(R & D Systems；分别为Cat. 202-IL-CF-10μg；lot AE4309112和Cat. 202-IL-10μg；lot AE4309081)以50 pg或100 pg/μl溶于血中(TCS Biosciences)。等分试样[1 μl，含有50 (B)或100 (A) pg的IL-2]被施用于GEHealthcare 903滤纸。这些纸是未用任何核酸或蛋白稳定化学物质浸渍的固相支持体的实例。生物样品允许在环境温度和湿度下干燥过夜。一部分施用的样品使用3 mm直径的Harris冲孔机(GE Healthcare)移去。含有生物样品的单一圆片用来自完整配置的IL-2Quantikine ELISA试剂盒(R & D Systems, Cat. D2050, lot 273275)的试剂直接分析IL-2。直接测定“在孔中的冲孔/圆片”进行。测定完成后，于450 nm监测光密度。IL-2的回收率通过与已知的IL-2浓度的标准曲线的值比较确定。
结果表明施用于固相支持体的大多数IL-2可按照直接/冲孔方法回收。
图4显示在非-化学处理的903纸固相支持体上存在的模型蛋白质(IL-2)的测定。A和B分别表示施用于固相支持体的100和50 pg的IL-2。结果表明施用于固相支持体的大多数IL-2可按照直接/冲孔方法回收。
b. 从细胞或回收的酶检测的酶活性
蛋白和酶测试依据生产商的指示，用完整配置的DNase和RNase污染试剂盒(DNase &RNase Alert QC Systems，目录编码AM1970 & AM1966, Life Technologies)进行。
双脱氧核糖核酸酶(DNase)
在第一系列的实验中，从人胚胎干细胞(GE Healthcare; 细胞系ref: WCB307 GEHC28)获取1.2 mm的冲孔，所述干细胞已如上以10 µl体积施用于未经化学处理的903纸。DNAse和RNase活性如下文所述测定。
在第二系列的实验中，从人胚胎干细胞(GE Healthcare;细胞系ref: WCB307GEHC 28) (含有加入到这些细胞中的0.5 U DNase或10 µU RNase)获取1.2 mm的冲孔，所述干细胞已以10 µl体积施用于903纸。
DNase活性的检测如下使用可裂解的荧光-标记的DNase底物进行。每个冲孔被喷出到96-孔板的单独的孔中。使冻干的DNase Alert底物溶于TE缓冲液(1 ml)并分配(10 μl)到96-孔板的试验孔中。加入10X DNase Alert缓冲液(10 μl)和无核酸酶的水(80 µl)并将试验溶液(100 µl)于37℃温育60分钟。DNase Alert QC系统底物是修饰的DNA寡核苷酸，其在被DNase裂解时发出粉红色的荧光。对于这种测定，荧光在Tecan Ultra (激发/发射535/595 nm，使用中间增益)上测量。含有DNase活性的溶液产生粉红色的荧光，而无DNase活性的溶液不发荧光。因此，较高水平的DNase对应于光输出量的增加。阴性对照由代替样品的无核酸酶的水(80 µl)组成。DNAase活性可使用化学上未处理的903纸，以速率依赖方式检测和定量。
图5显示源自基于纸的固相支持体的模式酶(DNase)的测量；903是化学上未处理的基于纤维素的固相支持体的实例。
参考附图
2. 核糖核酸酶(RNase)回收率和检测
RNase的检测如下使用可裂解的荧光-标记的RNase底物进行。每次冲孔被喷出到96-孔板的单独的孔中。使冻干的RNase Alert底物溶于TE缓冲液(1 ml)并分配(10 μl)到96-孔板的试验孔中。加入10X RNase Alert缓冲液(10 μl)和无核酸酶的水(80 µl)并将试验溶液(100 µl)于37℃温育60分钟。RNase Alert QC系统底物是修饰的RNA寡核苷酸，其在被RNase裂解时发出绿色荧光。对于这种测定，荧光在Tecan Ultra (激发/发射485/535 nm，使用中间增益)上测量。含有RNase的溶液产生绿色荧光，而无RNase活性的溶液不发荧光。因此，较高水平的RNase对应于光输出量的增加。阴性对照由代替样品的无核酸酶的水(80µl)组成。
这些数据表示RNAase活性可从施用于Whatman (GE Healthcare) 903纸的生物样品，以速率依赖方式检测和定量。图6显示源自基于纸的固相支持体的模式酶(RNase)的测量；FTA是化学上处理的纸的实例，而903是未处理的纸。
3. 在直接扩增工作流程中使用FTA样品收集卡的基因组DNA分析
a. 从Whatman FTA样品收集卡上保存的血液进行直接PCR
Thermo Scientific Phusion血液直接PCR试剂盒被证实支持直接来自在Whatman FTA样品收集卡上贮存的血液样品的DNA的扩增(Chum和Andre 2013；Thermo FisherScientific)。FTA卡是基于化学涂层纸的卡的实例。在直接扩增工作流程中，不需要预先的DNA提取或纯化步骤，且所述卡被简单地加入到PCR反应混合物中。
样品准备：按照生产商的指示，将新鲜血液或用肝素(1.4 IU/ml)、K2EDTA (1.8mg/ml)，或柠檬酸钠(109 mM)保存的血液施用于Whatman FTA基因卡并干燥。对于直接PCR，将卡中样品冲切出1 mm直径的圆片并在50 μl PCR反应体积中使用。当使用较大的冲孔或较小的反应体积时，于50℃，用20 μl H2O洗涤冲孔3分钟。除去H2O后，将PCR组分直接加入到淋洗的冲孔上，如在下表1中所示。
表1
然后使所述组分经受PCR热-循环方案。在这种情况下，当引物Tm值是69-72℃时，如下表2详述的采用2-步骤方案。该表也显示备选的3步骤方案。
表2
研究证实DNA可从Whatman FTA样品收集卡上贮存的血液直接扩增，然而，观察到不同水平的抑制作用。无需任何预处理，FTA基因卡的1 mm冲孔仅在50 μl反应体积中工作良好。对于较小的反应体积，非常简单的洗涤方案足以除去抑制剂。用H2O洗涤卡冲孔3分钟后，样品具有足够的纯度，用于在所有测试的反应体积下使用Phusion血液直接PCR试剂盒进行直接PCR反应。
洗涤的FTA冲孔(直径1 mm)被用于含有对1 kb、3.8 kb和7.5 kb扩增子特异性的引物的50 μl反应体积。在所有的情况下，PCR反应生成适当大小的扩增产物。Phusion血液直接PCR试剂盒与得自各类物种的血液相容。SOX21基因上游的高度保守的237 bp区域(A.Woolfe, M. Goodson, PLoS Biol. 3, e7；2004)被成功地从在FTA基因卡上干燥的许多脊椎动物物种的血液扩增(见图7)。
图7显示来自用肝素处理并保存在Whatman FTA样品收集卡上的人血的500 bp基因组DNA片段的直接扩增。从淋洗或直接置于50、25或10 μl体积的PCR反应物中的1 mm冲孔进行反应。采用在材料和方法中描述的2-步骤PCR方案。1 = 未-洗涤的FTA卡，2 = 洗涤的FTA卡，(-) = 阴性对照和(+) = 阳性对照(纯化的人基因组DNA)。
图8. 来自用EDTA处理并保存在FTA样品收集卡上的人血的1 kb、3.8 kb和7.5 kbgDNA扩增子的直接PCR。从在50 μl反应物中的1 mm冲孔进行反应(对于7.5 kb片段，如在材料和方法中所述对FTA冲孔进行淋洗)。对于1 kb和7.5 kb片段采用2-步骤方案和对于3.8kb扩增子采用3-步骤方案。1 = FTA卡，(-) = 阴性对照，(+) = 阳性对照(纯化的人基因组DNA)和M = DNA分子量标记。
图9显示对来自用EDTA处理并在洗涤的FTA基因卡上保存的几种哺乳动物物种的血液进行直接PCR。使用包括在Phusion血液直接PCR试剂盒中的通用对照引物和20 μl反应体积，从1 mm冲孔进行反应。M = DNA分子量标记，(-)阴性对照和(+)阳性对照(纯化的人基因组DNA)。
b. 从施用于FTA样品收集卡的生物样品的基因组DNA检测
将来自c57BL/6小鼠和NOS3缺失的小鼠(在129/B6背景中)的鼠组织施用于FTA样品收集卡。这些固相支持体是经化学处理的基于纤维素的纸。使小鼠安乐死并解剖以收集器官(血液、心脏、脑、肺、肝，和肾)。将器官“夹在”两个纸层之间。通过无菌吸液管将压力施用于在各纤维素基质中埋置的组织。对于组织匀浆，使用塑料均化器在1.5 ml微量离心管中处理大约5 g组织，然后接着施用于纸基质。在施用后，允许所有样品风干2小时，然后与干燥剂一起贮存于密封的袋中。在一些情况下，样品在处理前贮存至多2个月。
使用Harris一次性微穿孔机(1.2 mm或3 mm直径)分别从FTA纸卡切下呈冲孔圆片形式的干燥组织样品。从干燥样品的中心切下样品圆片并置于清洁的无DNase的1.5 ml微量离心管中。
缺失或基因敲除NOS3小鼠，用内皮氧化氮合酶(eNOS)外显子10-特异性正向引物、eNOS Neo-特异性正向引物和eNOS外显子12-特异性反向引物，通过基因组DNA的PCR扩增鉴定。
使用MJ Research热-循环仪，靶DNA用初始10 min的变性步骤，接着94℃持续35sec，65℃持续1 min和72℃持续1 min的36个循环；接着于72℃最终延伸5 min来扩增。使用Experion毛细管电泳系统观察生成的PCR产物。按照生产商的指示，使用引物设计基因组DNA量化试剂盒，对小鼠样品(gDNA-mo-q-DD)进行小鼠DNA量化。各个野生型(WT)和NOS缺失的组织样品被分别施用于不同的纸卡。为举例说明区分来自纸基质上贮存的DNA的基因型变体的能力，一个区域的PCR扩增在WT和转基因(NOS3缺失，基因敲除)小鼠中进行。
在图10中，使用从纸卡的组织分离的DNA作为扩增模板，显示与NOS基因座相关的PCR扩增子。泳道1-5是从WT小鼠组织(分别为心脏、肝、脑、肺，和肾)分离的DNA。泳道6-10是从NOS小鼠组织(分别为心脏、肝、脑、肺，和肾)扩增的DNA。
图10 - 源自施用于FTA样品收集卡的从WT和NOS3缺失基因敲除小鼠分离的组织的DNA扩增产物。泳道1-5是从WT小鼠组织(分别为心脏、肝、脑、肺，和肾)分离的DNA。泳道6-10是从NOS小鼠组织(分别为心脏、肝、脑、肺，和肾)扩增的DNA。
图10 - 源自施用于FTA样品收集卡的从WT和NOS3缺失基因敲除小鼠分离的组织的DNA扩增产物。泳道1-5是从WT小鼠组织(分别为心脏、肝、脑、肺，和肾)分离的DNA。泳道6-10是从NOS小鼠组织(分别为心脏、肝、脑、肺，和肾)扩增的DNA。
在表3中，记录了从在FTA样品收集卡上贮存的组织分离的DNA的成功扩增。从1.2mm冲孔分离DNA。‘+’表示扩增子存在。表4显示编码源自WT和NOS3缺失基因敲除的两种小鼠的产物的基因组DNA的DNA扩增(ND = 未测出，和(+)表示正确大小的PCR产物的存在。
表3
c. 使用FTA样品收集卡的直接DNA STR分析
一项实验被进行以从施用于固体纤维素支持体基质(“FTA样品收集卡”；GEHealthcare，目录代码：WB120205)的106个人胚胎干细胞(GE Healthcare；细胞系ref：WCB307 GEHC 28)直接扩增DNA。直接扩增程序包括从已施用生物样品于其上的样品收集卡获得1.2 mm冲孔。将该冲孔直接加入到STR扩增混合物中。这种直接方法不需要洗涤步骤以在下游工作流程之前除去与FTA冲孔有关的化学物。在此，采用从FTA卡上的血液斑点直接扩增DNA。直接STR分析使用PowerPlex 21系统(产品代码DC8902, Promega, Southampton,UK)经28个扩增循环，在重复的样品上进行。PowerPlex 21系统采用4色荧光检测并便于21个基因座(20个STR基因座和牙釉蛋白)的共同扩增，包括D1S1656、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、牙釉蛋白、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX和vWA。PowerPlex 21系统提供扩增人基因组DNA的合适的STR区域必需的全部材料和试剂，包括热-启动热稳定的DNA聚合物、主混合物和引物。这种试剂盒被用来从FTA卡冲孔的1.2 mm直径样品直接扩增DNA。该程序完全按照如在指示手册(PowerPlex 21系统, Promega, Southampton, UK)中所述进行。热循环条件是：96℃ 1分钟，接着94℃ 10秒钟，59℃ 1分钟和72℃ 30秒钟的28个循环。最终反应被加热至60℃ 20分钟。
生成的PCR产物使用ABI™ 3130xl基因分析仪毛细管电泳系统分离并用GeneMapper™ ID v3.2软件(Life Technologies, Paisley, UK)分析。生成的STR特征被询问并与标准品和质量规格如峰高度等比较。该研究证实完全的DNA STR特征从FTA纸获得，所述FTA纸已被直接加入到STR试剂混合物中，没有进行预先的洗涤步骤。
图11显示施用于FTA样品收集卡的人胚胎干细胞的直接STR分析。
4. 专门的化学处理的RNA稳定固相支持体
如前所述，使组织样品施用于专门的RNA稳定固相支持体纸卡。切下样品冲孔，并如下所述使用GE Healthcare illustra RNAspin试剂盒分离RNA。在ABI 7900实时PCR系统上，利用可市售获得的如在表X中详述的mRNA定量试剂盒进行RNA定量。
使用Harris 3 mm一次性微冲孔机，从干燥样品斑点的中心切下冲孔，并置于清洁的无RNase的1.5 ml微量离心管中。使illustra缓冲液RA1 (350 μl)与3.5 μl β-巯基乙醇合并，并将该溶液加入到圆片。使用20号针头匀化圆片。将生成的匀浆转移至RNAspin微量过滤柱用于随后的残余物质的去除。以11,000 x g离心柱1 min并弃去RNAspin微量滤器。匀化的溶胞产物含有RNA，并将这种滤液转移至一个新的无RNase的1.5 ml微量离心管中。
将乙醇(70%；350 μl)加入到匀化的溶胞产物中并通过涡流混合2 x 5 sec脉冲。对于每次制备，溶胞产物被上下吸取2-3次，并施加于置于2 ml微量离心管中的RNA微量离心柱。将管以8000 x g离心30 sec并弃去流通液。将RNA离心柱转移至一个新的收集管。加入illustra MDB缓冲液(350 μl)并以11 000 x g将管离心1 min。再次弃去流通液并使柱返回到收集管。DNase反应混合物依据生产商的指示制备并加入到RNAspin柱内包含的滤器表面上。这种DNAse的温育于室温进行15 min。将洗涤缓冲液RA2 (200 μl)施加于RNA微量离心柱并以11 000 x g离心柱1 min。再次弃去流通液并使柱返回到收集管。将缓冲液RA3600 μl施加于RNA微量离心柱并以11 000 x g离心柱1 min，弃去流通液并使柱返回到收集管。还进行用缓冲液RA3 (250 μl)的另外柱洗涤。为了完全干燥膜，以11 000 x g离心柱2min，最后将柱置于无核酸酶的1.5 ml微量离心管中。将无RNase的水(40 μl)施加于柱并以11 000 x g离心柱1 min。纯化的RNA立即用于下游应用，或者于-80℃贮存待用。
为确定在长时间贮存后来自多种组织的RNA的完整性，实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)在从纸卡上贮存的小鼠组织样品分离的RNA上进行。这些在干燥剂的存在下贮存2月。mRNA定量依据生产商的指示，使用以下完成：i) ABI Taqman啮齿动物GAPDH对照试剂盒(部件# 4308313)，ii) 用于鼠HPRT、GAPDH和β-肌动蛋白基因的Invitrogen实时LUX mRNA引物套装(分别为cat. 105M-02, 100M-02，和101M-02)，或者iii) 得自Applied Bio-systems的组织特异性基因引物套装(详情见表X)。
图12显示使用ABI Taqman啮齿动物GAPDH对照试剂盒的来自几个组织源的GADPH的相对表达水平。源自施用于固相支持体卡的样品的RNA水平通过与从小鼠RNA标准样品的定量滴定曲线生成的已知值比较来确定。从两种类型的纸分离的RNA检出可比较的GAPDHRNA水平。
编码HPRT、GAPDH和β-肌动蛋白的鼠mRNA的绝对定量用合适的Invitrogen实时LUX引物套装进行。源自施用于纸的样品的RNA水平通过与从小鼠RNA标准样品的定量滴定曲线生成的已知值比较来确定。与RNA的分离有关的数据在图X中描述并证实该物质能够支持来自众多组织类型的RNA的贮存和稳定。
RNA表达多路复用分析可使用逆转录酶PCR互补寡核苷酸引物和探针如可市售获得的Taqman探针(Invitrogen)和已建立的方法和技术执行。
图12显示代表得自重复实验的结果的一起分组的配对柱状图。
5. 从施用于FTA Elute样品收集卡的生物样品的基因组DNA洗脱分析
a. 使用从施用于指定FTA Elute的生物样品洗脱的DNA的定量PCR
全血和培养的HeLa细胞(以1x107/ml的浓度)点样在指定FTA Elute卡上。从这些卡(对于血液，2 x 3 mm冲孔；和对于Hela细胞，1 x 3 mm冲孔)获得3 mm冲孔。按照生产商的指示，根据高通量洗脱方案(见下文)，从样品收集卡洗脱DNA，将5 µl洗脱液加入到定量PCRRnase P检测试剂(Applied Biosystems)中。此外，还切下1.2和3 mm冲孔，并先用1 ml洗脱缓冲剂洗涤，然后将它们加入到Rnase P检测试剂。
指定FTA Elute高通量洗脱方案 - 使用无菌3 mm Harris冲孔机和无菌切割垫，从清洁的样品收集卡冲切两个邻近的圆片被置于96孔PCR板(具有0.2ml孔，如ABgene)的孔中。这些圆片将在实验期间用作阴性/仅纸对照。为防止血液斑点和未-点样对照之间的交叉-污染：分开的冲孔被用于各样品类型。使用不同的无菌3 mm Harris冲孔机和无菌切割垫，从干燥血液斑点的中心冲切两个邻近的圆片并置于96孔PCR板的孔中。
一旦所有的圆片被冲孔并转移至96孔板，如下进行处理：-
加入200 µl无菌(室温)水至各孔中，密封板(如，用微安光学粘合膜，AppliedBiosystems部件编号4311971)并脉冲涡流3次，每次持续总共5秒钟(即，3 x 5 secs. 共15秒钟)。立即以1200rpm离心板2 min，抽吸水并弃去。一旦水已从96孔板中的所有样品中被抽吸掉，加入60 µl无菌水至各孔并用板封条(如，Microseal A film (Biorad))密封板。以1200rpm离心板2 min并于98℃加热温育30分钟。
在30分钟温育步骤结束时，将板从热源移开并使用在最高速度设置下设定的涡流混合仪或板振动器(如，Heidolph Titramax)，脉冲涡流60次(大约1次脉冲/秒)。在这样进行之前，封板条必须牢固地粘附于板以防止孔之间的样品的交叉-污染。以1200rpm离心板2min。使用吸液管(体积设置在60 µl)和无菌吸液管尖，从96孔板的孔除去洗脱液并转移至单独的(空)孔中。于4℃贮存洗脱的DNA直至随时待用。
使用上述程序，从施用于指定FTA elute样品收集卡的生物样品检测和量化RNAase P特定序列，因此显示施用于指定FTA elute的样品适合用于基于直接PCR的扩增工作流程(见表4)。未点样的或阴性对照冲孔不生成任何RNAse特定序列(数据未显示)。
表4
样品 指定FTA Elute 冲孔大小 方案 平均DNA效价(ng/µl)
血液 批次A 2 x 3 mm冲孔 洗脱 0.04
血液 批次B 2 x 3 mm冲孔 洗脱 0.05
血液 批次C 2 x 3 mm冲孔 洗脱 0.06
血液 批次D 1 x 1.2 mm冲孔 直接/洗涤 0.04
HeLa 批次A 1 x 3 mm冲孔 洗脱 6.03
HeLa 批次B 1 x 3 mm冲孔 洗脱 5.10
HeLa 批次C 1 x 3 mm冲孔 洗脱 5.96
HeLa 批次D 1 x 3 mm冲孔 直接/洗涤 0.80
HeLa 批次D 1 x 1.2 mm冲孔 直接不洗涤 1.74
表4显示使用从施用于指定FTA Elute的生物样品洗脱的人基因组DNA的定量PCR的结果。作为一种比较，FTA elute样品收集卡也经受直接和洗涤的冲孔方案。
b. 使用随时待用的试剂(GE Healthcare)的直接终点PCR与施用于指定FTAElute的Hela细胞组合，以从源自HeLa细胞的基因组DNA扩增人乳头瘤病毒(HPV) 18特异性DNA序列。培养的HeLa (100 µl)细胞以浓度2.5x106/ml点样到指定FTA Elute卡上。从这些卡获得1.2 mm冲孔并直接置于25 µl终点PCR反应中，使用GEHC illustra PureTaqReadyTo Go (RTG)珠扩增。人gDNA被用作对照模板。这以使用相同的PCR组分的液体格式重复。表6提供了细节。
表6
液体格式 Qty/反应物(µl) 最终浓度
HPV-18正向引物@ 10pmol/ul 0.5 5皮摩尔
HPV-18反向引物@ 10pmol/ul 0.5 5皮摩尔
人gDNA @ 1ng/ul或1.2mm iFTAe冲孔 2ul gDNA或1 x 1.2mm冲孔
dNTPs，2.5mM 2.5 250 µM
Taq聚合酶1U 1 1单位
10X PCR缓冲液 - GEHC 2.5
无Rnase水 16
总计 25 µl
RTG珠格式 Qty/反应物(µl) 最终浓度
HPV-18正向引物@ 10pmol/ul 0.5 5皮摩尔
HPV-18反向引物@ 10pmol/ul 0.5 5皮摩尔
人gDNA @ 1ng/ul或iFTAe冲孔/孔 2ul gDNA或1 x 1.2mm冲孔
1 RTG珠/孔
无Rnase水 22
总计 25ul
正向和反向序列具有HPV型18特异性。HPV-18病毒的存在由如在图13中所示的334bpPCR产物的扩增指示，其中图解说明了使用指定FTA elute与直接终点PCR方法的组合，成功地扩增了存在于HeLa细胞中的HPV-18特异性序列。
虽然已经描述和说明了实施方案，但对技术人员而言将是显而易见的是，在不偏离所要求保护的本发明的范围的情况下，对那些实施方案的添加、删除和修饰是可能的。例如，使用4个不同的样品收集区域的样品收集器10/100已被描述和说明，其中3个具有有助于样品的贮存和保藏的化学处理。然而，应该意识到，可采用更多或更少的区域，这取决于需要的诊断或研究信息。用来形成如上所述的样品收集器的材料是优选的，但可使用其它具有良好效果的材料。本文所用的所谓“感染性物质”意指任何引起疾病的微生物或其它因子，如细菌、真菌或病毒。

Claims (15)

1.一种生物样品处理方法，其包括以下步骤：
a)提供包含固相支持体的样品收集器，所述固相支持体具有多个化学上区分的样品接收区；
b)将生物样品施用于一个或多个所述区域；和
2.权利要求1的生物样品处理方法，其还包括以下步骤：
c)使所述一个或多个区域暴露于足以基本上灭活存在于所述生物样品中的任何感染性物质的UV光。
3.权利要求1或3的样品处理方法，其还包括以下步骤：
d)例如通过冲孔，将一个或多个所述样品接收区的一部分切下到接收容器中；和
e)对源自切下的部分的任何生物材料进行测定，而无需将所述切下的部分转移至另一个容器中。
4.权利要求3的样品处理方法，其中所述测定包括在涉及宿主或者涉及样品内待鉴定的感染性物质的生物样品材料的每种情况下，测定DNA和/或RNA含量，和/或蛋白鉴定，和/或酶鉴定的一种或多种。
5.前述权利要求的任一项的样品处理方法，其还包括以下步骤的任何一个或多个：
a)干燥所述施用的样品；
b)用折合盖覆盖所述干燥区域，任选地通过压敏粘合剂保持在适当位置；和
c)贮存所述样品收集器。
6.权利要求5的样品处理方法，其中折合盖允许UV光基本上由此通过。
7.一种包含固相支持体(12)的生物样品收集器(10/100/500)，所述支持体具有多个化学上区分的样品接收区(22、24、26、28)，用于接收生物样品。
8.权利要求6的样品收集器，其中所述化学上区分的区域包括：一个或多个化学上未处理的区域；一个或多个用弱碱、螯合剂和阴离子型表面活性剂的组合处理的区域；一个或多个用蛋白变性剂处理的区域；和/或一个或多个用蛋白变性剂、还原剂、抗-氧化剂和缓冲剂处理的区域。
9.权利要求8的样品收集器，其中，所有化学上区分的区域包括抗-氧化剂。
10.权利要求7、8或9的样品收集器，其还包含在使用时保护所述固相支持体的封套，其包括用于覆盖所述区域的盖部分。
11.权利要求10的样品收集器，其中所述封套包括在使用时使所述盖保持于适当位置的压敏粘合剂。
12.一种收集感染性物质样品的收集方法，其通过依据权利要求1-6的任一项的方法或通过依据权利要求7-11的任一项的样品收集器设备进行。
13.权利要求12的收集方法，其中所述物质是与疾病如出血性疾病例如埃博拉病毒性疾病，或人类免疫缺陷病毒相关的RNA，或是与疾病如流感病毒相关的DNA。
14.包含固相支持体的生物样品收集器设备，所述固相支持体具有多个用于接收生物样品的化学上区分的样品接收区，所述设备还包含经安排用于使所述区域暴露于UV光的UV光源，所述UV光具有足够强度和足够持续时间以灭活固相支持体上的任何感染性物质。
15.权利要求14的设备，其还包含经安排以对所述固相支持体的一部分冲孔的冲孔机，经安排接收所述冲孔的接收容器，和在无需将所述冲孔转移至另一个容器的情况下对所述部分进行测定的工具。
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