CN107429259A

CN107429259A - 通过增加莨菪亭含量，增加转基因植物中大豆锈病抗性的方法

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Publication number: CN107429259A
Application number: CN201680019694.0A
Authority: CN
Inventors: H·舒尔塞斯; U·康拉特; C·朗根巴赫
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2016-02-01
Publication date: 2017-12-01
Also published as: AR104772A1; EP3253780A1; WO2016124515A1; US10570412B2; BR112017016688B1; US20180010144A1; BR112017016688A2

Abstract

一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法，其中所述方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累。

Description

通过增加莨菪亭含量，增加转基因植物中大豆锈病抗性的方法

发明简述

本发明涉及一种增加植物、植物部分和/或植物细胞中针对真菌性病原体、尤其大豆锈菌和/或禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和/或轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)的抗性的方法。这通过增加植物、植物部分和/或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的含量、尤其通过增加F6H1表达来实现。这也可以通过施加含有莨菪亭和/或其衍生物的制剂或溶液来实现。

另外，本发明涉及重组表达载体构建体，所述重组表达载体构建体包含与编码F6H1蛋白的序列相同或同源的序列。

发明背景

农业作物植物栽培主要地起到为人类和动物产生食品原料的作用。尤其，作为现今规则的单作高度易受流行样疾病传播影响。结果是产量明显减少。迄今，已经主要通过使用农药控制致病生物。如今，人类也有可能开始直接修饰植物或病原体的基因组成。备选地，可以合成真菌性感染后植物产生的天然存在的杀真菌剂并施加至植物。

抗性总体上描述了植物防止或至少削弱遭受有害病原体侵染和定植的能力。可以识别天然存在抗性的不同机理，借助这些机理，植物抵抗植物病原性生物定植(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie,Springer Verlag,Berlin-Heidelberg,德国)。

就小种特异性抗性，也称作宿主抗性，在相容性和不相容性相互作用之间作出区分。在相容性相互作用中，强毒性病原体和易感植物之间发生相互作用。病原体存活，并且可以建立繁殖结构，而宿主在发育方面严重受阻或死亡。在另一方面，当病原体感染植物但是在症状轻微形成之前或之后其生长受抑制(大多因为存在NBS-LRR家族的R基因所致，参见下文)时，不相容性相互作用发生。在后一种情况下，植物抵抗相应的病原体(Schopfer和Brennicke，参见上文)。然而，这种类型抗性对某种菌株或病原体最具特异性。

在相容性和不相容性相互作用中，宿主对病原体的防御性和特异性反应发生。然而，在自然界，这种抗性经常因病原体的新型毒力小种快速进化形成而克服(Neu等人(2003)American Cytopathol.Society,MPMI16 No.7:626-633)。

大部分病原体具有植物物种特异性。这意味着病原体可以在某些植物物种中引起疾病，但是在其他植物物种中不引起疾病(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24:259-264)。某些植物物种中针对病原体的抗性称作非宿主抗性。非宿主抗性提供了免于植物病原体影响的强大、广谱和永久性保护。提供非宿主抗性的基因提供了对抗非宿主植物中某些疾病的强大、广谱和永久性保护的机会。尤其，这种抗性对不同的病原体株系起作用。

真菌在全球分布。迄今已知大约100,000种不同的真菌物种。其中锈菌类特别重要。它们可以具有至多五个不同孢子阶段(不动精子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子)的复杂发育周期。

在致病真菌感染植物期间，通常观察到不同阶段。植物病原真菌和其潜在宿主植物之间相互作用的第一阶段对植物被真菌定植而言具有决定意义。在感染的第一阶段期间，孢子与植物的表面接合，萌发并且真菌穿入植物。真菌可以借助现存孔如气孔、皮孔、排水器和伤口穿入植物，或另外，它们因机械力的结果和借助消化细胞壁的酶直接穿入植物表皮。用于穿入植物的特定感染结构物形成。为了对抗，植物已经形成物理屏障，如蜡层，和具有抗真菌作用的化学化合物，以抑制孢子萌发、菌丝生长或穿透。

大豆锈菌豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)直接穿透植物表皮。在穿过表皮细胞后，真菌到达叶肉的胞间隙，在这里真菌开始扩散遍及整个叶。为了获得养分，真菌穿入叶肉细胞并在叶肉细胞内部形成吸器。在穿入过程期间，被穿透的叶肉细胞的细胞膜保持完整。

镰刀菌属(Fusarium)物种是攻击广泛类型植物物种(包括许多重要作物如玉米和小麦)的重要植物病原体。它们造成种子腐病、苗枯病以及根腐病、茎腐病和穂腐病。镰刀菌属病原体通过感染种子、根或穗丝感染植物或它们通过伤口或天然开口和裂口穿透植物。在非常短的建立阶段后，镰刀菌属真菌开始分泌霉菌毒素如单端孢霉烯、玉米赤霉烯酮和镰孢菌酸至感染的宿主组织中，导致细胞死亡和感染的组织浸软。从死亡组织获得营养，真菌随后开始通过感染的植物扩散，造成严重产量损失和所收获籽粒的品质下降。

活体营养型植物病原真菌依赖植物活细胞的代谢取得它们的营养。这种类型的真菌属于活体营养型真菌类，如许多锈真菌、白粉病真菌或卵菌病原体如疫霉属(Phytophthora)或霜霉属(Peronospora)。坏死营养型植物病原真菌依赖植物的死细胞取得其营养，例如来自镰刀菌属、丝核菌属(Rhizoctonia)或球腔菌属(Mycospaerella)的物种。大豆锈菌占据居间位置，因为它直接穿透表皮，因此被穿透的细胞变得坏死。在穿透后，真菌变成专性活体营养型生活方式。基本上沿用这种感染策略的活体营养型真菌性病原体的亚类是半坏死营养型病原体。

莨菪亭和莨菪苷是在遭受各种病原体如真菌或细菌感染时或响应于昆虫采食损伤、机械损伤、脱水或多种其他非生物胁迫在不同植物中积累的抗微生物酚类羟香豆素。

莨菪亭显示广谱抗微生物活性并且可以在体外抑制各种真菌或细菌的发育和生长(Goy,P.A.,Signer,H.,Reist,R.,Aichholz,R.,Blum,W.,Schmidt,E.和Kessmann,H.(1993)Accumulation of scopoletin is associated with the high diseaseresistance of the hybrid Nicotiana glutinosa x Nicotiana debneyi.Planta 41:200–206.；Tal,B.和Robeson,D.J.(1986b).The Metabolism of Sunflower PhytoalexinsAyapin and Scopoletin:Plant-Fungus Interactions.Plant Physiology 82:167–172)。

莨菪亭和其葡糖苷莨菪苷源自类苯基丙烷途径(图1；(Kai,K.,Mizutani,M.,Kawamura,N.,Yamamoto,R.,Tamai,M.,Yamaguchi,H.,Sakata,K.和Shimizu,B.(2008).Scopoletin is biosynthesized via ortho-hydroxylation of feruloyl CoA by a 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase in Arabidopsis thaliana.Plant Journal 55:989–99)。

莨菪亭/莨菪苷合成的关键步骤包括阿魏酰-CoA邻羟化、侧链的反/顺异构化、内酰化和–考虑莨菪苷合成时-糖基化(Kai等人,2008)。在拟南芥中，最近已经显示，莨菪亭产生取决于借助Fe(II)-和2-酮戊二酸依赖性双加氧酶F6H1(At3g13610)的阿魏酰-CoA邻羟化。发现侧链E-Z异构化和内酰化自发地进行。(Kai等人,2008)。

在植物中，积累的莨菪亭最终可以糖基化以产生莨菪苷。已经鉴定到可以在体外催化莨菪亭糖基化的几种拟南芥糖基转移酶(例如，UGT71C1)(Lim,E.-K.,Baldauf,S.,Li,Y.,Elias,L.,Worrall,D.,Spencer,S.P.,Jackson,R.G.,Taguchi,G.,Ross,J.,andBowles,D.J.(2003).Evolution of substrate recognition across a multigenefamily of glycosyltransferases in Arabidopsis.Glycobiology 13:139–45.)以及二种不同的烟草糖基转移酶(Togt1和Togt2)(Fraissinet-Tachet,L.,Baltz,R.,Chong,J.,Kauffmann,S.,Fritig,B.和Saindrenan,P.(1998).Two tobacco genes induced byinfection,elicitor and salicylic acid encode glucosyltransferases acting onphenylpropanoids and benzoic acid derivatives,including salicylic acid.FEBSletters 437:319–23)。

通常将莨菪苷视为效力弱于莨菪亭的抗微生物剂。在病原体诱导的机械损伤或超敏反应(HR)后，含有莨菪苷的细胞的去区室化可能导致莨菪苷从液泡释放入细胞质及由β-葡糖苷酶后续水解葡萄糖缀合物。

莨菪亭和其葡糖苷莨菪苷广泛地分布在植物当中并且已经在大约80个不同植物科的多种植物器官中检出。有趣地，莨菪亭生物合成似乎在几种经济重要的作物(例如，大豆(Glycine max)、玉蜀黍(Zea mays)、普通小麦(Triticum aestivum)、稻(Oryza sativa)等)中丧失，这表明合成这种抗微生物物质的能力可能已经在育种期间丧失。但是，这不适用于甘薯(sweet potato)、烟草、向日葵、棉花或木薯，因为已经证实莨菪亭在这些作物中响应于感染而积累(Gnonlonfin,G.J.B.,Sanni,A.和Brimer,L.(2012).ReviewScopoletin–A Coumarin Phytoalexin with Medicinal Properties.Critical Reviewsin Plant Sciences 31:47–56总结)。

大豆锈病最近变得日益重要。该疾病可以由活体营养型锈菌豆薯层锈菌(Sydow)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(Arthur)引起。它们属于担子菌门(Basidiomycota)、锈菌目(Uredinales)、层锈菌科(Phakopsoraceae)。两种锈菌均感染广泛种类的豆科宿主植物。豆薯层锈菌，也称作亚洲锈菌，是大豆上侵入性更强的病原体，并且因此至少目前对农业非常重要。豆薯层锈菌可以几乎在世界上全部热带和亚热带大豆种植区找到。豆薯层锈菌能够在天然条件下感染来自豆科(Leguminosae)17个家族的31个物种并且能够在受控条件下生长在其他60个物种上(Sinclair等人,(编著)，Proceedings ofthe rust workshop(1995),National SoyaResearch Laboratory,Publication No.1(1996)；Rytter J.L.等人,Plant Dis.87,818(1984))。山马蝗层锈菌(P.meibomiae)已经在加勒比海盆地及在波多黎各发现，并且尚未造成重大损失。

豆薯层锈菌可以目前在野外仅借助杀真菌剂控制。没有获得对全谱系分离株有抗性的大豆植物。当检索抗性大豆种质(accessions)时，找到了NBS-LRR家族的介导大豆抵抗豆薯层锈菌的六个优势R基因。该抗性快速丧失，原因是豆薯层锈菌形成新的毒力小种。

玉米育种中，增加镰刀菌抗性是一个最重要的目标。尽管与镰刀菌属物种的相互作用表型的天然多样性巨大，但抗性似乎以低遗传度分布遍及许多弱QTL。因此，仅在通过育种增加镰刀菌抗性方面取得少许进展。

近年来，真菌性疾病，例如大豆锈病和禾谷镰刀菌病，已经作为农产品中的病害变得重要。因此现有技术中需要开发控制真菌和提供抗真菌性植物的方法。

大多数研究已经在感染植物表皮层的白粉菌和霜霉领域进行。然而，仍未解决与感染叶肉的大豆锈菌或感染不可接近性内部组织的镰刀菌属真菌斗争的问题。

本发明的目的尤其是提供一种增加针对真菌性病原体、优选地针对层锈菌科(Phakopsoraceae)真菌性病原体、更优选地针对层锈菌属(Phakopsora)真菌性病原体、最优选地针对豆薯层锈菌(Sydow)和/或山马蝗层锈菌(Arthur)(也称作大豆锈菌)的抗性的方法。

本发明的又一个目的尤其是提供一种增加针对真菌性病原体、优选地针对镰刀菌属真菌性病原体、最优选地针对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和/或轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)的抗性的方法。

令人惊讶地，我们发现，可以通过在植物中增加莨菪亭或其衍生物的产生或增加其积累和通过向植物直接施加莨菪亭或其衍生物，控制真菌性病原体，尤其层锈菌属真菌性病原体，例如大豆锈菌，和/或镰刀菌属真菌性病原体，例如禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌。

令人惊讶地，我们发现，可以通过增加任选与选自CCoAOMT1、ABCG37和UGT71C1的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白表达，控制真菌性病原体，尤其层锈菌属真菌性病原体，例如大豆锈菌，和镰刀菌属真菌性病原体，例如禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌。

本发明因此提供一种通过增加莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累或通过向植物、植物部分或植物细胞外源施加莨菪亭和/或其衍生物，增加转基因植物、植物部分或转基因植物细胞中针对真菌性病原体，优选地针对层锈菌科和/或丛赤壳科(Nectriaceae)真菌性病原体、更优选地针对层锈菌属和/或镰刀菌属真菌性病原体、最优选地针对豆薯层锈菌(Sydow)、山马蝗层锈菌(Arthur)、禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌的抗性的方法。

又一个目的是提供针对真菌性病原体，优选地针对层锈菌科和/或丛赤壳科真菌性病原体、更优选地针对层锈菌属和/或镰刀菌属真菌性病原体、最优选地针对豆薯层锈菌(Sydow)、山马蝗层锈菌(Arthur)、禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌有抗性的转基因植物、一种用于产生这类植物的方法以及可用于上述方法的重组载体构建体。

本发明还涉及包含外源核酸或其片段的重组载体构建体和转基因植物、植物部分或植物细胞，所述外源核酸或其片段导致莨菪亭和/或其衍生物的产生增强。另外，本文要求保护一种使用本发明的核酸产生转基因植物、植物部分或植物细胞的方法。此外，本文要求保护本发明核酸或重组载体用于转化植物、植物部分或植物细胞的用途。

本发明还涉及用于向植物、植物部分或植物细胞的表面施加莨菪亭和/或衍生物的方法以及经莨菪亭和/或衍生物包覆的植物表面或植物部分表面。

如上文概述，通过主要权利要求的主题物实现本发明的目的。本发明的优选实施方案由从属权利要求的主题物限定。

附图说明

图1显示拟南芥(Arabidopsis thaliana)中莨菪亭和莨菪苷合成的关键步骤(如Kai等人,Plant J.2008Sep；55(6):989-99提出)

(a)咖啡酸单元的3-O-甲基化主要借助CCoAOMT1，利用咖啡酰CoA发生。阿魏酰CoA的邻羟化由F6H1催化，随后是侧链的反/顺异构化和内酰化以形成莨菪亭。C3H，邻香豆酸3-羟化酶；4CL，4-香豆酸:CoA连接酶。

(b)对硫酯提出侧链反/顺异构化和内酰化的离子机制。

图2a显示携带p35S::F6H1(At3g13610)供本明烟草(N.benthamiana)叶中瞬时产生莨菪亭的植物转化载体的示意图(参见实施例3)。

图2b显示携带P35S::FLAG-标签:F6H1(At3g13610)供表达加FLAG标签的F6H1的植物转化载体的示意图，所述F6H1用于本明烟草叶中瞬时产生莨菪亭(参见实施例3)。

图2c显示携带pUbi:F6H1(At3g13610)供大豆植物中稳定产生莨菪亭的植物转化载体的示意图(参见实施例6-10)。

图3显示携带pUbi F6H1(AT3G13610)+pSUPER CCoAOMT1(At4g34050)供大豆植物中稳定产生莨菪亭的植物转化载体的示意图(参见实施例7-11)。

图4显示携带pUbi F6H1(AT3G13610)+pSUPER CCoAOMT1(At4g34050)+pGlyma14g06680ABCG37(PDR9；AT3G53480)供大豆植物中稳定产生莨菪亭的植物转化载体的示意图(参见实施例7-11)。

图5显示携带pUbi F6H1(AT3G13610)+pSUPER UGT71C1(At2g29750)供大豆植物中稳定产生莨菪亭的植物转化载体的示意图(参见实施例7-11)。

图6含有序列表中序列的简述。

图7a显示具有SEQ ID NO:1的拟南芥F6H1(At3g13610)基因的核苷酸序列。

图7b显示具有SEQ ID NO:2的拟南芥F6H1(At3g13610)基因的蛋白质序列。

图8a显示具有SEQ ID NO:3的拟南芥CCoAOMT1(At4g34050)基因的核苷酸序列。

图8b显示具有SEQ ID NO:4的拟南芥CCoAOMT1(At4g34050)基因的蛋白质序列。

图9a显示具有SEQ ID NO:5的拟南芥ABCG37(PDR9；AT3G53480)基因的核苷酸序列。

图9b显示具有SEQ ID NO:6的拟南芥ABCG37(PDR9；AT3G53480)基因的蛋白质序列。

图10a显示具有SEQ ID NO:7的拟南芥UGT71C1基因的核苷酸序列。

图10b显示具有SEQ ID NO:8的拟南芥UGT71C1基因的蛋白质序列。

图11显示用来测定野生型大豆植物和抗锈真菌豆薯层锈菌的转基因大豆植物的患病叶面积水平的评分系统(如GODOY,C.V.,KOGA,L.J.和CANTERI,M.G.Diagrammaticscale for assessment of soybean rust severity.Fitopatologia Brasileira 31:063-068.2006中所述)。

图12a显示瞬时转化的本明烟草叶中通过过量表达F6H1产生莨菪亭。通过用携带图2a和2b中所示的质粒之一根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL01浸润，瞬时转化本明烟草的叶(参见实施例3)。如实施例3b中所述，通过HPLC鉴定和定量由瞬时转化的本明烟草叶所产生的莨菪亭。

未转化的(野生型)本明烟草不能够产生莨菪亭。瞬时表达F6H1酶(原始序列(F6H1，图2a))或加FLAG标签的酶(Ω-F6H1-FLAG；图2b)导致本明烟草的叶中产生和积累莨菪亭(取决于使用的构建体)。

图12b显示瞬时转化的本明烟草叶中通过过量共表达F6H1和CCoAOMT1增强了莨菪亭和莨菪苷的产生。通过用携带含有F6H1基因或F6H1基因和CCoAOMT1基因的质粒的根癌农杆菌浸润，瞬时转化本明烟草的叶(参见图2b和实施例3)。未转化的(野生型)本明烟草不能够产生莨菪亭。瞬时表达F6H1酶(Ω-F6H1-FLAG)导致莨菪亭的产生和积累。与单独的F6H1相比，瞬时过量共表达与CCoAOMT1(Ω-F6H1-FLAG+CCoAOMT1)组合的F6H1酶导致莨菪亭的产生和积累增强，如HPLC色谱图中的较大峰面积可见。这个结果显示可能通过共表达CCoAOMT1增强F6H1积累。

图13莨菪亭体内抑制ASR(亚洲大豆锈菌)孢子的萌发。

将拟南芥Col-0野生型植物的叶在用豆薯层锈菌(带条纹柱)接种(bi)之前6小时或用豆薯层锈菌(黑色柱)接种的同时(未用莨菪亭处理的植物，浅灰色柱)用1mM莨菪亭处理：感染后48小时显微镜下评估ASR孢子的萌发(参见例子6.1)

定量显微分析显示，豆薯层锈菌孢子的萌发强烈地受拟南芥叶上存在的1mM莨菪亭抑制，与施加方法无关(共施加或预处理)。

图14a莨菪亭在体外抑制ASR孢子的萌发。在玻璃载片上含有0(灰色点柱)、10μM(垂直条纹柱)、100μM(对角条纹柱)、500μM(水平条纹柱)和1mM(黑色柱)莨菪亭的水中萌发豆薯层锈菌的孢子。接种后6小时显微镜下确定孢子的形态学状态(参见实施例5a)。定量显微分析显示，豆薯层锈菌孢子的萌发和附着胞的形成以剂量依赖性方式强烈地受莨菪亭的存在抑制。

图14b莨菪亭在植物中减少大豆锈菌病症状。

将大豆植物的叶用10μM、100μM或1mM莨菪亭处理，同时用豆薯层锈菌接种(共施加)。未用莨菪亭处理的植物标记作为对照(参见实施例6.2)。根据图11并如实施例10中所述评估患病的叶面积。

定量分析感染叶面积的比率显示，由豆薯层锈菌感染引起的患病叶面积以剂量依赖性方式因共施加莨菪亭而强烈缩减。

图14c莨菪亭在植物中减少大豆锈菌病症状。

将大豆植物的初生叶(灰色点柱)或第一具三叶的(垂直条纹柱)和第二具三叶的(对角条纹柱)在豆薯层锈菌接种之前6小时(预处理)或用豆薯层锈菌接种的同时(共施加)用1mM莨菪亭处理。未用莨菪亭处理的植物标记作为“仅ASR”(参见实施例6.2)。根据图11并如实施例10中所述评估患病的叶面积。

定量分析感染叶面积的比率显示，由豆薯层锈菌感染引起的患病叶面积因初生叶(灰色点柱)和第一具三叶的(垂直条纹柱)和第二具三叶的(对角条纹柱)上1mM莨菪亭预处理或共施加而强烈缩减。

图15显示莨菪亭对禾谷镰刀菌生长的(体外)影响

在含有1mM莨菪亭(溶解于甲醇中)或作为对照的单一甲醇的PDA平板上培育禾谷镰刀菌真菌。显微镜下测定以mm/天计的禾谷镰刀菌生长速率(参见实施例5b)。

与PDA+甲醇上培育的禾谷镰刀菌相比，琼脂中存在1mM莨菪亭导致禾谷镰刀菌生长速率每天降低61％，这表明莨菪亭也对禾谷镰刀菌有毒。

图16显示与野生型对照相比，表达F6H1酶的大豆叶。F6H1酶的表达导致抗真菌分子莨菪亭积累，如紫外柱下通过荧光可见。使用365nm波长UV通过B-100AP UV灯(UVP LLC,Upland,加拿大)激发荧光。

图17显示与野生型植物相比，评定因过量表达F6H1酶(构建体参见图2c)而积累莨菪亭的25株转基因大豆植物(衍生自5个独立事件)的结果。

发明详述

可以通过参考本发明实施方案的以下详述和其中所包含的优选实施例更轻易地理解本发明。

定义

除非另外说明，本文中所用的术语将根据相关领域技术人员的常规用法进行理解。除了本文所提供术语的定义之外，分子生物学领域中常见术语的定义也可以在Rieger等人,1991Glossary of genetics:classical and molecular,第5版,柏林:Springer-Verlag并在Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人,编著,GreenePublishing Associates,Inc与John Wiley&Sons,Inc.之间的合资公司CurrentProtocols(1998Supplement)中找到。

应当理解如本说明书中和权利要求中所用，“a”或“an”可以意指一个或多个，这取决于使用它的上下文。因此，例如，对“一个细胞”的提及指可以利用至少一个细胞。应当理解本文中所用术语的目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的。

在本申请书的全文范围内，参考了多种出版物。这些出版物全部及这些出版物中完整引用的那些参考文献的公开内容因而通过引用的方式并入本申请书，旨在更充分地描述与本发明相关的现有技术状态。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术、涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应和各种分离技术是本领域技术人员已知并常用的那些技术。下述文献中描述了多种标准技术：Sambrook等人,1989MolecularCloning,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,N.Y.；Maniatis等人,1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,N.Y.；Wu(编著)1993Meth.Enzymol.218,Part I；Wu(编著)1979Meth Enzymol.68；Wu等人,(编著)1983Meth.Enzymol.100及101；Grossman和Moldave(编著)1980Meth.Enzymol.65；Miller(编著)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Old和Primrose,1981Principles of Gene Manipulation,University of California Press,Berkeley；Schleif和Wensink,1982PracticalMethods in Molecular Biology；Glover(编著)1985DNA Cloning第I和II卷,IRL Press,Oxford,UK；Hames和Higgins(编著)1985Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,UK；以及Setlow和Hollaender 1979Genetic Engineering:Principles andMethods,第1-4卷,Plenum Press,New York。在使用的情况下，认为缩写和命名是本领域中的标准并且常用于专业期刊(如本文援引的那些)中。

蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和/或酶，它们相对于所讨论的未修饰蛋白具有氨基酸置换、缺失和/或插入并且与作为所述肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶来源的未修饰蛋白具有相同、基本上相同或相似的生物学活性。

核酸的“同源物”涵盖相对所讨论的未修饰核酸而言具有核酸置换、缺失和/或插入的核苷酸和/或多核苷酸，其中由这类核酸编码的蛋白质具有与衍生所述核苷酸和/或多核苷酸的未修饰核酸编码的未修饰蛋白相同、基本上相同或相似的生物学活性。特别地，核酸的同源物可以涵盖基于简并性氨基酸密码子的置换。

术语“同一性”、“同源性”和“相似性”是在本文中可互换地使用。两个核酸序列或氨基酸序列之间的“同一性”或“同源性”或“相似性”在每种情况下均指在相应F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸序列或相应F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1氨基酸序列的整个长度的至少70％、至少80％或至少90％范围内，优选地在相应F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸序列或相应F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1氨基酸序列的整个长度范围内。

优选地，通过以下方式计算“序列同一性百分数”：在特定区域范围内比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中出现相同碱基或氨基酸的位置的数目以产生匹配位置的数目，这类位置的数目除以所比较区域内位置的总数并将结果乘以100。

用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48:443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即，覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性或相似性或同源性百分数并且进行两个序列之间同一性或相似性或同源性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(版本1.83)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定总体相似性/同源性/同一性百分数(Campanella等人,BMC Bioinformatics.2003年7月 10日；4:29.MatGAT:an applicationthat generates similarity/homology/identity matrices using protein or DNAsequences)。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(SmithTF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。

也可以借助Informax(USA)公司Vector NTI软件包7.1程序，使用Clustal方法(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignments on amicrocomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2):151-1)连同以下设置，计算序列同一性：

多重比对参数：

空位开口罚分 10

空位延伸罚分 10

空位分离罚分范围 8

空位分离罚分关闭

比对延迟的同一性％ 40

残基特异性空位关闭

亲水残基空位关闭

转折权重 0

配对比对参数：

FAST算法开启

K-tuple大小 1

空位罚分 3

窗大小 5

最佳对角线数目 5

备选地，可以根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.,Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500,网页：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#和以下设置，确定同一性

DNA空位开口罚分 15.0

DNA空位延伸罚分 6.66

DNA矩阵同一性

蛋白质空位开口罚分 10.0

蛋白质空位延伸罚分 0.2

蛋白质矩阵Gonnet

蛋白质/DNA末端空位 -1

蛋白质/DNA空位距离 4

因此，可以通过本领域已知的序列比较及比对算法(参见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer,Stockton Press,1991和其中引用的参考文献)并且用如使用默认参数在BESTFIT软件程序中所执行那样的例如Smith-Waterman算法计算核苷酸序列或蛋白质序列之间的差异百分数，(例如，威斯康星大学遗传学计算集团(University ofWisconsin Genetic Computing Group))，优化根据本发明可用的核酸或蛋白质和F6H1、CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸以及F6H1、CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1蛋白质之间的序列同一性。

“缺失”指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸或指从DNA、ssRNA和/或dsRNA移除一个或多个核酸。

插入指向蛋白质或核酸中的预定位点引入一个或多个氨基酸残基或核酸残基。

“置换”指蛋白质的氨基酸以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替换。

在核酸水平，置换指在核酸内部将一个或多个核苷酸更换为其他核苷酸，其中由修饰的核酸编码的蛋白质具有基本上相同或相似的功能。特别地，核酸的同源物涵盖基于简并性氨基酸密码子的置换。

氨基酸置换一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于对蛋白质所设置的功能性约束条件，并且可以为1到10个氨基酸变动；插入或缺失通常将是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸置换优选地是保守性氨基酸置换。保守性置换表是本领域熟知的(参见例如Taylor W.R.(1986)The classification of amino acid conservation J TheorBiol.,119:205-18和下表1)。

表1：保守性氨基酸置换的例子

氨基酸置换、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。

用于操作DNA序列以产生蛋白质的置换、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA中预定位点处产生置换突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gene体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。

术语“编码”或“编码”用于核酸借助遗传密码(即，一系列分别是三核苷酸序列的密码子)含有蛋白质的氨基酸序列信息的能力，所述遗传密码规定蛋白质合成期间接下来将添加哪个氨基酸。术语“编码”或“编码”因此包括核酸的全部可能可读框。另外，术语“编码”或“编码”还适用于其编码序列被翻译前移除的非编码核酸序列中断的核酸，例如，包含内含子的核酸序列。

术语“结构域”指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。

存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864；Letunic等人，(2002)Nucleic Acids Res 30,242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994),A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifsand its function in automatic sequence interpretation(引自)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology.Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编著，第53-61页,AAAIPress,Menlo Park；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004))或Pfam(Bateman等，Nucleic Acids Research 30(1):276-280(2002))。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具在ExPASy蛋白质组服务器上可获得(瑞士生物信息研究所(Gasteiger等人,ExPASy:The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis,NucleicAcids Res.31:3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。

用软件工具InterProScan 4.8版分析时，本发明的核酸可以包含如下文定义的结构域(参见Zdobnov E.M.和Apweiler R.；"InterProScan-an integration platform forthe signature-recognition methods in InterPro."；Bioinformatics,2001,17(9):847-8；InterPro database,release 42(2013年4月4日))。

如本文所用术语“真菌抗性”、“抵抗真菌”和/或“抗真菌的”意指减少、防止或延迟真菌感染。优选地真菌抗性是大豆锈菌抗性和/或镰刀菌抗性。术语“抗性”指真菌抗性。抗性不暗示植物必然地具有100％抗感染性。在优选的实施方案中，增强或增加真菌抗性意指抗性植物中的抗性与野生型植物相比大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、或大于95％。优选地，野生型植物是基因型与具有增加的真菌、尤其大豆锈菌和或镰刀菌抗性的植物相似、更优选相同的植物，但不包含任选与选自CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的外源F6H1核酸。优选地，野生型植物不能够产生多于10μM莨菪亭和/或其衍生物，更优选地多于5μM莨菪亭和/或其衍生物，最优选地，野生型植物不能够产生莨菪亭和/或其衍生物。

如本文所用术语“大豆锈菌抗性”、“抵抗大豆锈菌”、“抗大豆锈菌的”、“锈菌抗性”、“抵抗锈菌”或“抗锈菌的”意指与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，减少或防止或延迟植物、植物部分或植物细胞被层锈菌科、尤其层锈菌属，更具体地大豆锈菌或亚洲大豆锈菌(ASR)、更具体地豆薯层锈菌、山马蝗层锈菌和/或腐皮镰刀菌感染。

如本文所用术语“镰刀菌抗性”、“抵抗镰刀菌”或“抗镰刀菌的”意指与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，减少或防止或延迟植物、植物部分或植物细胞被镰刀菌属、尤其禾谷镰刀菌、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、早熟禾镰刀菌(Fusarium poae)、轮枝镰刀菌(串珠镰刀菌)、胶孢镰刀菌(Fusarium subglutinans)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、Fusarium virguliforme和/或腐皮镰刀菌(Fusarium solani)感染。

植物的真菌抗性水平可以按多种方式确定，例如通过相对于总面积或三维空间评定/测量感染的叶面积或三维空间来确定。另一种确定抗性水平的可能性是计数植物上镰刀菌菌落的数目或测量这些菌落产生的孢子的数量。另一个解析真菌侵染程度的方式是通过定量(q)PCR特异性测量真菌DNA的量。针对大部分真菌性病原体的特异性探针和引物序列是在文献中可获得的(Frederick RD,Snyder CL,Peterson GL等人,2002Polymerasechain reaction assays for the detection and discrimination of the rustpathogens Phakopsora pachyrhizi and P.meibomiae,Phytopathology92(2)217-227)。(Nicolaisen M,Suproniene S,Nielsen LK,Lazzaro I,Spliid NH,JustesenAF.2009Real-time PCR for quantification of eleven individual Fusarium speciesin cereals.J Microbiol Methods.2009Mar；76(3):234-40.)

评价真菌生物量的另一个方式是按生物化学方式确定真菌特异性化合物(如麦角甾醇或壳多糖)的量(L.M.Reid,R.W.Nicol,T.Ouellet,M.Savard,J.D.Miller,J.C.Young,D.W.Stewart和A.W.Schaafsma(1999)Interaction of Fusarium graminearum andF.moniliforme in Maize Ears:Disease Progress,Fungal Biomass,and MycotoxinAccumulation Phytopathology 89(11)1028-1037；CA Roberts,RR Marquardt,AAFrohlich,RL McGraw,RG Rotter,JC Henning(1991)Chemical and spectralquantification of mold in contaminated barley；Cereal Chemistry68(3):272-275)。

如本文中所用，术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基配对作用与互补链结合的任意过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,NewYork)。杂交和杂交的强度(即，核酸分子之间结合的强度)受此类因素影响，如核酸分子之间的互补性程度、所涉及条件的严格性、所形成杂合体的Tm和核酸分子内部的G:C比。

如本文中所用，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离成单链的温度。用于计算核酸分子的Tm的等式是本领域熟知的。如标准参考文献所示，当核酸分子处于1M NaCl的水溶液中时，可以通过等式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)来进行Tm值的简单估计(见例如，Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,inNucleic Acid Hybridization(1985))。其他参考文献包括更复杂计算法，这些算法考虑了结构特征及序列特征以计算Tm。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。

特别地，术语“严格性条件”指这些条件，其中作为互补核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或与之相同的100个或更多个连续核苷酸、150个或更多个连续核苷酸、200个或更多个连续核苷酸或250个或更多个连续核苷酸在等同于在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交同时在50℃或65℃、优选地在65℃于2X SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下与特定核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)杂交。优选地，该杂交条件等同于在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，同时在50℃或65℃、优选地65℃于1X SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选地，该杂交条件等同于在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，同时在50℃或65℃、优选地在65℃于0.1XSSC、0.1％SDS中洗涤。优选地，互补核苷酸分别与外源F6H1、CCoAOMT、ABCG37基因和UGT71C1的片段或完整核酸杂交。备选地，优选的杂交条件涵盖在65℃在1x SSC中或在42℃在1x SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃在0.3x SSC中洗涤或在50℃在4x SSC中或在40℃在6x SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃在2x SSC中洗涤。其他优选的杂交条件是0.1％SDS、0.1x SSD和65℃。

术语“植物”意在包括处于任何成熟或发育阶段的植物，以及取自或源自任意这种植物的任何组织或器官(植物部分)，除非由上下文另外清晰地指明。植物部分包括但不限于植物细胞、茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚胎、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体、须根培养物、和/或等等。本发明还包括本发明植物产生的种子。优选地，种子包含外源F6H1核酸，所述核酸任选地与选自CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合。在一个实施方案中，种子可以发育成与植物种子的野生型品种相比抗真菌性感染性增加的植物。如本文所用，“植物细胞”包括，但不限于原生质体、配子生产细胞和再生成为完整植株的细胞。植物的各种组织的组织培养和从中再生出植物是本领域熟知的并且广泛地公开。

本文中对“内源”核酸和/或蛋白质的称谓指在植物中以其天然形式(即不存在任何人类干预情况下)存在的所讨论核酸和/或蛋白质。

术语“外源”核酸指已经借助基因技术引入植物中的核酸。“外源”核酸可以不以其天然形式出现在植物中，与如植物中以其天然形式存在的所讨论核酸不同，或可以与如植物中以其天然形式存在的所讨论核酸相同，但是没有整合于它们的天然遗传环境内部。“外源”的相应含义在蛋白质表达的背景下适用。例如，与内源基因表达相比时，含有转基因(即，外源核酸)的转基因植物可以遭遇相应的基因或蛋白质表达总体上大幅度增加。本发明的转基因植物包括整合在任何基因座处的外源F6H1核酸，所述外源核酸任选与选自CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种外源核酸组合，并且任选地，植物还可以包括在天然遗传背景内部的内源基因。优选地，植物、植物部分或植物细胞不包括任选地与选自CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1的一种或多种内源核酸组合的内源F6H1核酸。

出于本发明的目的，“重组”就例如核酸序列而言意指包含任选与CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸中任一者或多者组合的F6H1核酸的核酸分子、表达盒或载体构建体，全部这些构建体均由人类通过基因技术方法产生，其中：

(a)序列F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸或其部份，或

(b)与本发明的F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸序列有效连接的基因控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

不位于野生型植物的基因组内部其天然遗传环境下或已经由人类通过基因技术方法修饰。修饰可以采取例如一个或多个核苷酸残基置换、添加、缺失、倒位或插入的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的天然基因组基因座或染色体基因座或在基因组文库中存在或与天然启动子组合。

例如，天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用的蛋白质的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义–当这种表达盒由人类通过非天然性合成(“人工”)方法(如诱变处理)修饰时，变成重组表达盒。合适的方法例如在US 5,565,350、WO 00/15815或US200405323中描述。另外，天然存在的表达盒–例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用的蛋白质的对应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义–在这种表达盒没有在天然遗传环境中而在一个不同遗传环境中整合时，变成重组表达盒。

术语“分离的核酸”或“分离的蛋白质”指不位于其天然环境、尤其它的天然细胞环境内的核酸或蛋白质。因此，分离的核酸或分离的蛋白质基本上与其天然环境的其他组分分离。但是，本领域技术人员明白分离的核酸或分离的蛋白质的制备物可以显示一定程度的不纯度，这取决于所用的分离方法。用于纯化核酸和蛋白质的方法是本领域熟知的。分离的基因可以从生物分离，或可以是人造的，例如通过化学合成法。在这个方面，重组核酸也可以处于分离的形成。

如本文所用，术语“转基因”指外源含有本文所述的核酸，重组构建体、载体或表达盒或其部份的生物，例如，植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分，其中所述核酸，重组构建体、载体或表达盒或其部份优选地通过基本上不是生物的过程、优选地通过农杆菌转化法引入。重组构建体或其部份稳定整合入染色体，从而它通过无性繁殖、营养繁殖或有性繁殖传递给后续世代。优选的后续世代也是转基因的。基本上生物的过程可以是植物杂交和/或天然重组。

优选地，本发明或根据本发明使用的核酸包括

F6H1核酸

F6H1和CCoAOMT核酸，

F6H1和ABCG37核酸，或

F6H1和UGT71C1核酸，或

F6H1、CCoAOMT和ABCG37核酸或

F6H1、CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸。

出于本发明的目的，转基因植物、植物细胞或组织因此理解为意指，任选与选自CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸借助基因技术整合至基因组中。

出于本发明的目的，重组构建体、载体或表达盒包含任选与选自CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的外源F6H1核酸并且借助基因技术制备。

“野生型”植物、“野生型”植物部分或“野生型”植物细胞意指所述植物、植物部分或植物细胞不表达外源F6H1、CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸和外源F6H1、CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1蛋白。优选地，野生型植物不能够产生多于10μM莨菪亭和/或其衍生物，更优选地不多于5μM莨菪亭和/或其衍生物，并且最优选地，野生型植物不能够产生莨菪亭和/或其衍生物。莨菪亭的衍生物例如是莨菪苷。优选地，野生型植物植物不表达内源F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸和内源F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1蛋白。

天然基因座意指特定染色体上的位置和/或某些基因之间的位置和/或与转化的原始植物相同的序列背景。

优选地，转基因植物、植物细胞或其组织表达任选地与选自CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸。优选地，转基因植物、植物细胞或其组织用重组载体构建体转化，所述的重组载体构建体包含任选地与选自本文所述的CCoAOMT、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸。F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸可以位于相同的载体或不同的重组载体上。

术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定基因载体构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或基因载体构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括翻译mRNA和随后合成所编码的蛋白质，即，蛋白质表达。

如本文中所用的术语“增加的表达”或“增强的表达”或“过量表达”或“含量增加”意指相对于原有野生型表达水平为额外的任何形式的表达。出于本发明的目的，原初的野生型表达也可以是零(不存在表达)。

用于增加基因或基因产物的表达的方法是本领域内充分记录过的，并且包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子或RNAa(Li等人,2006,PNAS103(46)17337-42)。可以导入在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般在上游)中导入充当启动子或增强子元件的分离的核酸，从而上调编码目的蛋白的核酸表达。例如，可以通过突变、缺失和/或置换在体内改变内源性启动子(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子相对于本发明基因以恰当的方向及距离引入植物细胞，从而控制该基因的表达。

术语“功能性片段”指任何核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质分别仅包含全长核酸或全长蛋白质的部分，但在植物中表达时仍提供基本上相同或相似的功能，例如，增加的真菌抗性和/或相同、基本上相同或相似的生物学活性。优选地，该片段包含至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的原始序列。优选地，功能性片段包含分别如原始核酸或原始蛋白质中那样的连续核酸或氨基酸。在一个实施方案中，任何F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸的片段在相应F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸的至少70％、至少75％、至少90％核苷酸的长度范围内具有如上文定义的同一性。

术语“相同的生物学活性”、“基本上相同的生物学活性”、“相似的生物学活性”或增加的生物学活性优选地意指在植物中表达F6H1和任选地CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸或其片段时，与野生型植物、野生型植物部分、或野生型植物细胞相比，导致莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累增加多于0.1μM、优选地多于1μM、优选地多于2μM、更优选地多于5μM、最优选地多于10μM。

如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其部分或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。因此，剪接变体可以具有移除或添加或部分移除或部分添加的一个或多个或甚至全部内含子。根据这个定义，将cDNA视为相应的含有内含子的基因组序列的剪接变体并且反之亦然。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工产生。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(参见例如Foissac和Schiex(2005)BMC Bioinformatics.6:25)。

野生型植物可以表达相应的内源F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸。就过量表达外源F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸而言，出于本发明的目的，相应内源核酸的原始野生型表达水平也可以是零(不存在表达)。

就载体构建体和/或重组核酸分子而言，术语“有效连接”意指待表达的核酸以允许核酸表达(例如，当载体引入宿主植物细胞时在宿主植物细胞中)的方式与调节序列连接，所述调节序列包括启动子、终止子、增强子和/或其他表达控制元件(例如，多聚腺苷化信号)。例如以下文献中描述了此类调节序列：Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)，及Gruber和Crosby，引自：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick和Thompson编著,第7章,89-108,CRC Press:Boca Raton,Florida，包括其中参考文献。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和指导这种核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些调节序列。本领域技术人员会理解，载体的设计可能取决于此类因素，如待转化细胞的选择、所需的核酸表达水平等。

如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的载体构建体转化并且可以从中再生完整植物。所选的具体组织根据可用于并且最好适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统而变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞中并且可以例如作为质粒维持为非整合。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。宿主基因组包括胞核中所含的核酸以及质体(例如，叶绿体和/或线粒体)中所含的核酸。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化的植物。

术语“终止子”包括这样的控制序列，其是位于转录单位末端的DNA序列，所述DNA序列发出将初级转录物3'加工和多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以衍生自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。

发明详述

F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸

待过量表达以实现对真菌性病原体(例如层锈菌科真菌病性原体(例如大豆锈菌)或镰刀菌属真菌病性原体，尤其禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌)的抗性增加的F6H1核酸优选地是这样的核酸，所述核酸由选自以下的核酸组成或包含前述核酸：

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:1所代表的核酸序列或其功能性片段、或剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；

(ii)编码F6H1蛋白的核酸，所述F6H1蛋白以增加的优选顺序与SEQ ID NO:2所代表的氨基酸序列或其功能性片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选地，该F6H1蛋白与SEQ ID NO:2编码的F6H1蛋白具有基本上相同或相似的生物学活性；优选地，相对于对照植物，该F6H1蛋白赋予增强的真菌抗性；

(iii)核酸分子，所述核酸分子与根据(i)或(ii)的任一个核酸分子的互补序列在高严格性杂交条件下杂交；优选地，编码F6H1蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQ IDNO:2中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；和

(iv)编码与上文(i)至(iii)的F6H1核酸所编码的F6H1蛋白相同的F6H1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的F6H1核酸不同的核酸。

待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的F6H1核酸例如是选自SEQ IDNo.1、9、11、13、15、17、19和21的核酸。待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的F6H1核酸例如是编码选自SEQ ID No.2、10、12、14、16、18、20和22的F6H1蛋白的核酸。

F6H1蛋白可以包含如SEQ ID No.63中所限定的结构域并与相应序列代表的蛋白质序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

待过量表达以实现对真菌性病原体(例如层锈菌科真菌病性原体(例如大豆锈菌)或镰刀菌属真菌病性原体，尤其禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌)的抗性增加的CCoAOMT核酸优选地是这样的核酸，所述核酸由选自以下的核酸组成或包含前述核酸：

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:3所代表的核酸序列或其功能性片段、或剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；

(ii)编码CCoAOMT蛋白的核酸，所述CCoAOMT蛋白以增加的优选顺序与SEQ ID NO:4所代表的氨基酸序列或其功能性片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选地，该蛋白质与SEQ ID NO:4编码的CCoAOMT蛋白具有基本上相同或相似的生物学活性；优选地，相对于对照植物，该CCoAOMT蛋白赋予增强的真菌抗性；

(iii)核酸分子，所述核酸分子与根据(i)或(ii)的任一个核酸分子的互补序列在高严格性杂交条件下杂交；优选地，编码CCoAOMT蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQID NO:4中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；和

(iv)编码与上文(i)至(iii)的CCoAOMT核酸所编码的CCoAOMT蛋白相同的CCoAOMT蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的CCoAOMT核酸不同的核酸，

待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的CCoAOMT核酸例如是选自SEQ IDNo.3、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47的核酸。待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的CCoAOMT核酸例如是编码选自SEQ ID No.4、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48的CCoAOMT蛋白的核酸。

CCoAOMT蛋白可以包含如SEQ ID No.64中所限定的结构域、与相应序列代表的蛋白质序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

待过量表达以实现对真菌性病原体(例如层锈菌科真菌病性原体(例如大豆锈菌)或镰刀菌属真菌病性原体，尤其禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌)的抗性增加的ABCG37核酸优选地是这样的核酸，所述核酸由选自以下的核酸组成或包含前述核酸：

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:5所代表的核酸序列或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；

(ii)编码ABCG37蛋白的核酸，所述ABCG37蛋白以增加的优选顺序与SEQ ID NO:6所代表的氨基酸序列或其功能性片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选地，该蛋白质与SEQ ID NO:6编码的ABCG37蛋白具有基本上相同或相似的生物学活性；优选地，相对于对照植物，该ABCG37蛋白赋予增强的真菌抗性；

(iii)核酸分子，所述核酸分子与根据(i)或(ii)的任一个核酸分子的互补序列在高严格性杂交条件下杂交；优选地，编码ABCG37蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQID NO:6中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；和

(iv)编码与上文(i)至(iii)的ABCG37核酸所编码的ABCG37蛋白相同的ABCG37蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的ABCG37核酸不同的核酸。

待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的ABCG37核酸例如是选自SEQ IDNo.5、49、51和53的核酸。待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的ABCG37核酸例如是编码选自SEQ ID No.6、50、52和54的ABCG37蛋白的核酸。

ABCG37蛋白可以包含至少一个选自如SEQ ID No.65、66、67和/或68中所限定的结构域、与相应序列代表的蛋白质序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

待过量表达以实现对真菌性病原体(例如层锈菌科真菌病性原体(例如大豆锈菌)或镰刀菌属真菌病性原体，尤其禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌)的抗性增加的UGT71C1核酸优选地是这样的核酸，所述核酸由选自以下的核酸组成或包含前述核酸：

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:7所代表的核酸序列或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；

(ii)编码UGT71C1蛋白的核酸，所述UGT71C1蛋白以增加的优选顺序与SEQ ID NO:8所代表的氨基酸序列或其功能性片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；优选地，该蛋白质与SEQ ID NO:8编码的UGT71C1蛋白具有基本上相同或相似的生物学活性；优选地，相对于对照植物，该UGT71C1蛋白赋予增强的真菌抗性；

(iii)核酸分子，所述核酸分子与根据(i)或(ii)的任一个核酸分子的互补序列在高严格性杂交条件下杂交；优选地，编码UGT71C1蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQID NO:8中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；和

(iv)编码与上文(i)至(iii)的UGT71C1核酸所编码的UGT71C1蛋白相同的UGT71C1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的UGT71C1核酸不同的核酸。

待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的UGT71C1核酸例如是选自SEQ IDNo.55、57、59和61的核酸。待过量表达以实现对真菌性病原体的抗性增加的UGT71C1核酸例如是编码选自SEQ ID No.56、58、60和62的UGT71C1蛋白的核酸。

UGT71C1蛋白可以包含至少一个选自如SEQ ID No.69和/或70中所限定的结构域、与相应序列代表的蛋白质序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

参比本文具体公开的序列中给出的整个核苷酸区域指示核酸的同一性百分数。

优选地，在长度上，F6H1核酸片段的部分是SEQ ID NO:1中给出的核酸序列的约500-600、约600-700、约700-800、约800-900、约900-1000或约1000-1086个核苷酸，优选地是其连续核苷酸，优选地从核酸5’或3’末端计数。

优选地，在长度上，CCoAOMT核酸片段的部分是SEQ ID NO:3中给出的核酸序列的约400-500、约500-600、约600-700、约700-780个核苷酸，优选地是其连续核苷酸，优选地从核酸5’或3’末端计数。

优选地，在长度上，ABCG37核酸片段的部分是SEQ ID NO:5中给出的核酸序列的约2500-2600、约2600-2700、约2700-2800、约2800-2900、约2900-3000、约3000-3100、约3100-3200、约3200-3300、约3300-3400、约3400-3500、约3500-3600、约3600-3700、约3700-3800、约3800-3900、约3900-4000、约4000-4100、约4100-4200或约4300-4353个核苷酸，优选地是其连续核苷酸，优选地从核酸5’或3’末端计数。

优选地，在长度上，UGT71C1核酸片段的部分是SEQ ID NO:7中给出的核酸序列的约500-600、约600-700、约700-800、约800-900、约900-1000、约1000-1100、约1100-1200、约1200-1300、约1300-1400或约1400-1446个核苷酸，优选地是其连续核苷酸，优选地从核酸5’或3’末端计数。

本文中提及的全部核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以按已知方式通过化学合成从核苷酸结构单元产生，例如通过各个重叠的互补性双螺旋核酸结构单元的片段缩合来产生。寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式通过亚磷酸酰胺(phosphoamidite)方法(Voet,Voet,第2版,Wiley Press,New York,第896-897页)进行。合成性寡核苷酸的积聚和借助DNA聚合酶Klenow片段填补缺口和连接反应以及一般克隆技术在Sambrook等人(1989)中描述，参见下文。

本文所述的F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1核酸可用于本发明的构建体、方法、植物、可收获部分和产物中。

F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1蛋白

在本发明的一个实施方案中，F6H1蛋白由包含外源核酸的核酸编码，所述外源核酸具有

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:1、其功能性片段或其剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；或

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:2、其功能性片段具有至少F6H1同源性的氨基酸序列；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；

(iii)外源核酸，其能够与根据(i)或(ii)的任一个核酸的互补序列在严格条件下杂交；优选地编码F6H1蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQ ID NO:2中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；或

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的F6H1蛋白相同的F6H1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸。

在本发明的一个实施方案中，CCoAOMT蛋白由包含外源核酸的核酸编码，所述外源核酸具有

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:3、其功能性片段或其剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；或

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:4、其功能性片段具有至少CCoAOMT同源性的氨基酸序列；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；

(iii)外源核酸，其能够与根据(i)或(ii)的任一个核酸的互补序列在严格条件下杂交；优选地编码CCoAOMT蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQ ID NO:4中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；或

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的CCoAOMT蛋白相同的CCoAOMT蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸。

在本发明的一个实施方案中，ABCG37蛋白由包含外源核酸的核酸编码，所述外源核酸具有

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:5、其功能性片段或其剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；或

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:6、其功能性片段具有至少ABCG37同源性的氨基酸序列；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；

(iii)外源核酸，其能够与根据(i)或(ii)的任一个核酸的互补序列在严格条件下杂交；优选地编码ABCG37蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQ ID NO:6中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；或

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的ABCG37蛋白相同的ABCG37蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸。

在本发明的一个实施方案中，UGT71C1蛋白由包含外源核酸的核酸编码，所述外源核酸具有

(i)以增加的优选顺序与SEQ ID NO:7、其功能性片段或其剪接变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸；或

(ii)编码蛋白质的外源核酸，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:8、其功能性片段具有至少UGT71C1同源性的氨基酸序列；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；

(iii)外源核酸，其能够与根据(i)或(ii)的任一个核酸的互补序列在严格条件下杂交；优选地编码UGT71C1蛋白；优选地其中所述核酸分子编码与SEQ ID NO:8中所述的多肽具有基本上相同特性的多肽；优选地相对于对照植物，编码的蛋白质赋予增强的真菌抗性；或

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的UGT71C1蛋白相同的UGT71C1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸。

优选地，F6H1多肽包含由SEQ ID NO:1中所述的核酸序列编码的任一氨基酸序列的约200-225、约225-250、约250-275、约275-300、约300-325、约325-350或约350-362个氨基酸残基，优选地包含其连续氨基酸残基，优选地从氨基酸序列N末端或C末端计数，或直至所述氨基酸序列的全长。

优选地，CCoAOMT多肽包含由SEQ ID NO:3中所述的核酸序列编码的任一氨基酸序列的约100-125、约125-150、约150-175、约175-200、约200-225、约225-250或约250-260个氨基酸残基，优选地包含其连续氨基酸残基，优选地从氨基酸序列N末端或C末端计数，或直至所述氨基酸序列的全长。

优选地，ABCG37多肽包含由SEQ ID NO:5中所述的核酸序列编码的任一氨基酸序列的约1100-1125、约1125-1150、约1150-1175、约1175-1200、约1200-1225、约1200-1225、约1225-1250、约1250-1275、约1275-1300、约1300-1325、约1325-1350、约1350-1375、约1375-1400、约1400-1425或约1425-1451个氨基酸残基，优选地包含其连续氨基酸残基，优选地从氨基酸序列N末端或C末端计数，或直至所述氨基酸序列的全长。

优选地，UGT71C1多肽包含由SEQ ID NO:7中所述的核酸序列编码的任一氨基酸序列的约225-250、约250-275、约275-300、约300-325、约325-350、约350-375、约375-400、约400-425、约425-450、约450-475或约475-482个氨基酸残基，优选地包含其连续氨基酸残基，优选地从氨基酸序列N末端或C末端计数，或直至所述氨基酸序列的全长。

本文所述的F6H1、CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1蛋白质可用于本发明的构建体、方法、植物、可收获部分和产物中。

用于增加真菌抗性的方法

本发明的一个实施方案是一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的本发明方法，其中所述方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生。莨菪亭的衍生物可以是莨菪苷。

莨菪亭由以下结构式限定：

莨菪苷由以下结构式限定：

本发明的一个实施方案是一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法，其中该方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中F6H1蛋白的表达和/或生物学活性，其中所述F6H1蛋白通过如上文定义的方式编码。在一个优选实施方案中，所述方法还包括与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的至少一种或更多种额外蛋白质的表达和/或生物学活性，其中所述CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白如上文定义。优选地，所述方法包括增加植物、植物部分和/或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累。

本发明的一个实施方案是一种与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，通过增加F6H1蛋白的表达和/或生物学活性并且任选地与增加选自CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质或其功能性片段、同源物的表达和/或生物学活性组合，增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性、优选地针对层锈菌科和/或镰刀菌属的抗性的方法。优选地，从外源核酸表达F6H1蛋白。优选地，从外源核酸表达F6H1蛋白和选自CCoAOMT、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质。

本发明的一个实施方案是一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法，所述方法包括

(a)用表达盒稳定转化植物细胞，所述表达盒包含编码F6H1蛋白的外源核酸，

(b)从植物细胞再生出植物；并且

(c)表达所述外源核酸。

本发明的优选方法包括

(a)用表达盒的稳定转化植物细胞，所述表达盒包含编码F6H1蛋白的外源核酸和编码CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的一种或多种外源核酸，

(b)从植物细胞再生出植物；并且

(c)表达所述外源核酸，

任选地其中将编码CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的核酸按足以在所述植物中产生真菌抗性或足以在其中增加真菌抗性的量和时间表达。

优选地，编码F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的核酸与启动子处于功能性连接。优选地，该启动子是组成型、病原体诱导型、优选地真菌诱导型、叶肉特异性启动子和/或表皮特异性启动子和/或茎秆特异性、穗或谷粒特异性启动子

优选地，与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，植物、植物部分或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生增加。

在优选的实施方案中，与未经F6H1核酸转化的野生型植物相比，F6H1蛋白在植物中的蛋白质数量和/或生物学活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

在优选的实施方案中，与未经CCoAOMT核酸转化的野生型植物相比，CCoAOMT蛋白在植物中的蛋白质数量和/或生物学活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

在优选的实施方案中，与未经ABCG37核酸转化的野生型植物相比，ABCG37蛋白在植物中的蛋白质数量和/或生物学活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

在优选的实施方案中，与未经UGT71C1核酸转化的野生型植物相比，UGT71C1蛋白在植物中的蛋白质数量和/或生物学活性增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

编码F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1的外源核酸位于相同或不同的表达盒上。优选地，一个表达盒包含了编码F6H1的外源核酸和任选地与编码CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1的一种或多种外源核酸组合。

优选地，该表达盒包含外源核酸，所述外源核酸编码

F6H1，

F6H1和CCoAOMT1，

F6H1和ABCG37，

F6H1和UGT71C1，

F6H1、CCoAOMT1和ABCG37

F6H1、CCoAOMT1和UGT71C1，

F6H1、UGT71C1和ABCG37或

F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白。

在另一个实施方案中，外源核酸编码

F6H1和CCoAOMT1，

F6H1和ABCG37，

F6H1和UGT71C1或

F6H1、CCoAOMT1和ABCG37

F6H1、CCoAOMT1和UGT71C1

F6H1、UGT71C1和ABCG37或

F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白位于不同的表达盒上。

真菌性病原体或真菌样病原体(如，例如，Chromista)可以属于包括根肿菌门(Plasmodiophoramycota)、卵菌门(Oomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、担子菌门(Basidiomycota)或半知菌纲(Deuteromycetes)(半知菌类)的群组。可以通过举例方式提到，但不受限制的病原体是表2和表3中详述的那些，以及与它们相关的疾病。

表2：活体营养型和/或半坏死营养型植物病原真菌引起的疾病

表3：由坏死营养型和/或半活体营养型真菌和卵菌纲真菌引起的疾病

优选的真菌性病原体属于柄锈菌目(Pucciniales)、尤其层锈菌科、尤其层锈菌属、更具体地是物种豆薯层锈菌和/或山马蝗层锈菌-也称作大豆锈菌或亚洲大豆锈菌(ASR)、和/或优选的真菌性病原体属于丛赤壳科、尤其镰刀菌属、尤其物种禾谷镰刀菌、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、早熟禾镰刀菌(Fusarium poae)、轮枝镰刀菌(串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme))、胶孢镰刀菌(Fusariumsubglutinans)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、藤仓镰刀菌(Fusariumfujikuroi))、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、Fusarium virguliforme和/或腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。最优选地是禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌。

F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1表达构建体和载体构建体

本发明的一个实施方案是一种重组载体构建体，其包含与启动子和转录终止序列有效连接的编码如上文定义的F6H1蛋白的核酸。

本发明的一个实施方案是一种重组载体构建体，其包含与启动子和转录终止序列有效连接的编码如上文定义的CCoAOMT1蛋白的核酸。

本发明的一个实施方案是一种重组载体构建体，其包含与启动子和转录终止序列有效连接的编码如上文定义的ABCG37蛋白的核酸。

本发明的一个实施方案是一种重组载体构建体，其包含与启动子和转录终止序列有效连接的编码如上文定义的UGT71C1蛋白的核酸。

在一个实施方案中，编码F6H1蛋白、CCoAOMT1蛋白、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的核酸位于相同的重组载体构建体上。在另一个实施方案中，编码F6H1蛋白、CCoAOMT1蛋白和/或ABCG37蛋白的核酸位于不同的载体构建体上。优选地，一个表达盒包含外源核酸，所述外源核酸编码F6H1并且任选地与编码选自CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1中一者或多者的外源核酸组合。优选地，重组载体构建体包含编码以下蛋白质的外源核酸：

F6H1，

F6H1和CCoAOMT1，

F6H1和ABCG37，

F6H1和UGT71C1，

F6H1、CCoAOMT1和ABCG37

F6H1、CCoAOMT1和UGT71C1

F6H1、UGT71C1和ABCG37或

F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白。

本发明的启动子可以是组成型的、诱导性型的、尤其是病原体诱导型的，发育阶段优选的、细胞类型优选的、组织优选的或器官优选的。合适启动子和终止子的例子是：

p-PcUbi::F6H1::t-ocs

p-SUPER::CCoAOMT1::t-nos

p-Glyma14g06680::ABCG37::t-StCATHD

p-SUPER::UGT71C1::t-nos

PcUbi启动子调节欧芹(Petroselinum crispum)ubi4-2基因(登录号X64345)的组成型表达(Kawalleck,P.,Somssich,I.E.,Feldbrügge,M.,Hahlbrock,K.和Weisshaar,B.(1993).Polyubiquitin gene expression and structural properties of the ubi4-2gene in Petroselinum crispum.Plant molecular biology,21(4),673-684)。p-超级启动子由三个相同章鱼碱合酶增强子尾随MAS启动子组成(Lee等人,2007Plant Physiology第145卷第4期 1294-1300)。已经在筛选大豆叶中优势表达的基因时鉴定了p-Glyma14g06680启动子。该启动子调节很可能为水通道蛋白的基因Glyma14g06680的表达(WO12127373)。T-ocs和t-NOS终止子均衍生自农杆菌(Gielen,J.等人."The completenucleotide sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmidpTiAch5."The EMBO journal3.4(1984):835)。T-ocs是根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的终止子并且t-NOS是其胭脂碱合酶基因的终止子。StCATHD-pA是来自马铃薯的组织蛋白酶D抑制物基因的终止子(t-StCat)(Herbers等人,1994)。

一个类型的重组载体构建体是“质粒”，其指可以向其中连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连入病毒基因组中。某些载体构建体能够在引入它们的宿主植物细胞中自主复制。其他载体构建体在引入宿主植物细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而随着宿主基因组一起复制。特别地，载体构建体能够指导与载体有效连接的基因表达。但是，本发明意在包括这类起到等同功能的其他形式的表达载体构建体，如病毒载体(例如，马铃薯病毒X、烟草脆裂病毒和/或双生病毒)。

转基因生物；转基因植物、植物部分和植物细胞

一个优选的实施方案是这样的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，其过量表达外源F6H1蛋白，任选地与过量表达选自如上文定义的核酸编码的CCoAOMT1蛋白，ABCG37蛋白和/或UGT71C1蛋白中一者或多者组合。

在优选的实施方案中，所述转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞中F6H1蛋白的生物学活性、CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和/或UGT71C1蛋白中一者或多者的任选生物学活性增加。

在优选的实施方案中，与未经F6H1核酸转化的野生型植物相比，F6H1蛋白在转基因植物中的蛋白质数量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

在优选的实施方案中，与未经CCoAOMT1核酸转化的野生型植物相比，CCoAOMT1蛋白在转基因植物中的蛋白质数量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

在优选的实施方案中，与未经ABCG37核酸转化的野生型植物相比，ABCG37蛋白在转基因植物中的蛋白质数量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

在优选的实施方案中，与未经UGT71C1核酸转化的野生型植物相比，UGT71C1蛋白在转基因植物中的蛋白质数量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

在优选的实施方案中，与未经相应核酸转化的野生型植物相比，与CCoAOMT1和/或ABCG37和/或UGT71C1组合的F6H1蛋白在转基因植物中的数量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。

更优选地，已经通过用本文所述的一种或多种重组载体构建体转化，获得本发明的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。在一个实施方案中，将转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞用如所述的一种或多种重组载体构建体转化，其中编码F6H1蛋白、和/或CCoAOMT1蛋白、和/或ABCG37蛋白和/或UGT71C1蛋白的核酸位于相同的重组载体构建体或不同的载体构建体上。优选地，重组载体构建体包含外源核酸，所述外源核酸编码F6H1和CCoAOMT1、F6H1和ABCG37、F6H1和UGT71C1或F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白。

一个优选的实施方案包含转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，其过量表达任选地与选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种额外蛋白质组合的外源F6H1蛋白，其中编码相应蛋白质的核酸与启动子和转录终止序列有效连接。

用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的适合方法是植物生物技术领域熟知的。任何方法可以用来将重组表达载体转化入植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。公开了用于转化双子叶植物的一般方法，例如，在美国专利号4,940,838；5,464,763等中公开。美国专利号5,004,863；5,159,135；和5,846,797中阐述了用于转化特定双子叶植物(例如，棉花)的方法。可以使用美国专利号4,992,375；5,416,011；5,569,834；5,824,877；6,384,301中和EP 0301749B1中阐述的大豆转化方法。转化方法可以包括直接和间接转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入法、脂质体介导转化法(US 4,536,475)、使用基因枪的生物射弹法(Fromm ME等人,Bio/Technology.8(9):833-9,1990；Gordon-Kamm等人,Plant Cell 2:603,1990)、电穿孔法、干燥胚在包含DNA的溶液中孵育法和微量注射法。在这些直接转化法的情况下，所用的质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单质粒，如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等的那些。若将从转化的细胞再生完整植物，则额外的选择标记基因优选地位于质粒上。直接转化技术同等地适用于双子叶植物和单子叶植物。

也可以通过农杆菌的细菌性感染(例如EP 0 116 718)、借助病毒载体的病毒性感染(EP 0 067 553；US 4,407,956；WO 95/34668；WO 93/03161)或借助花粉(EP 0 270 356；WO 85/01856；US 4,684,611)实施转化。基于农杆菌的转化技术(尤其对于双子叶植物)在本领域是熟知的。农杆菌菌株(例如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，其在用农杆菌感染植物后转移至该植物。T-DNA(转移的DNA)整合入植物细胞的基因组。该T-DNA可以位于Ri-或Ti-质粒上或分别地包含在所谓双元载体中。用于农杆菌介导转化的方法例如在Horsch RB等人(1985)Science 225:1229中描述。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，但也已经应用于单子叶植物。在例如White FF,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants,TransgenicPlants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R.Wu编著,Academic Press,1993,第15-38页；Jenes B等人,Techniques for Gene Transfer,Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R.Wu编著,Academic Press,1993,第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225中描述了通过农杆菌转化植物。转化可以产生瞬时的或稳定的转化和表达。虽然本发明的多核苷酸可以插入属于这些广泛类型范围内的任意植物和植物细胞中，然而它特别地用在作物植物细胞中。

可以借助技术人员熟悉的全部方法再生出基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在S.D.Kung和R.Wu,Potrykus或和Willmitzer的上述出版物中找到。

在转化后，可以对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在，其中所述的标记由连同目的基因一起被共转移的植物可表达基因编码，随后将转化的材料再生成完整植物。为了选出转化的植物，转化中所获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，按上述方式获得的种子可以种植，并且在初始培育期后，经受喷洒所致的合适选择作用。另一种可能性在于将种子(如果适宜，在消毒后)在使用合适选择剂的琼脂板上培育，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对转化的植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在。也可以通过筛选编码F6H1、CCoAOMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的核酸存在，直接选出转化的植物。

在DNA转移和再生后，也可以对推定转化的植物，例如使用DNA印迹分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选或额外地，可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析，监测新引入的DNA的表达水平，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。

可以通过多种手段增殖产生的转化植物，如通过克隆性增殖或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以自交并且可以选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且随后可以通过经典育种技术进一步增殖T2植物或与适宜的测验系杂交以产生杂种。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞与非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，经转化以含有表达盒的全部细胞)；转化的组织的和未转化组织的移植体(例如，在植物中，向未转化的接穗嫁接的转化根砧木)。

优选地，构建体或载体或表达盒不存在于原始植物的基因组中或存在于转基因植物的基因组中，不在原始植物基因组的其天然基因座处。

优选地，本发明的转基因植物或通过本发明方法获得的植物具有增加的针对真菌性病原体、优选地针对锈菌病原体(即，柄锈菌目真菌性病原体)、优选地针对层锈菌科真菌性病原体、更优选地针对层锈菌属真菌性病原体、最优选地针对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称作大豆锈菌)的抗性。优选地，针对豆薯层锈菌和/或山马蝗层锈菌的抗性增加。

优选地，植物、植物部分或植物细胞是选自以下的植物或衍生自选自以下的植物：菜豆、大豆、豌豆、三叶草(clover)、葛、紫花苜蓿、兵豆、羽扇豆、野豌豆、落花生、稻、小麦、大麦、拟南芥、兵豆、香蕉、卡诺拉油菜、棉花、马铃薯、玉米、甘蔗、苜蓿和糖用甜菜。

在本发明的一个实施方案中，植物选自菜豆、大豆、豌豆、三叶草、葛、紫花苜蓿、兵豆、羽扇豆、野豌豆和/或落花生。优选地，植物是豆科植物，包括以下属的植物：菜豆属(Phaseolus)(包括法国菜豆(French bean)、矮生菜豆、蔓菜豆(菜豆(Phaseolusvulgaris))，利马豆(棉豆(Phaseolus lunatus)L.)、宽叶菜豆(Tepary bean)(尖叶菜豆(Phaseolus acutifolius A.Gray))、红花菜豆(荷包豆(Phaseolus coccineus))；大豆属(Glycine)(包括野大豆(Glycine soja)、大豆(大豆(Glycine max(L.)Merill))；豌豆(豌豆属(Pisum))(包括剥皮豌豆(豌豆普通型栽培变种(Pisum sativum L.convar.sativum)、也称作光滑或圆形豌豆；大豌豆(Pisum sativum L.convar.medullareAlef.emend.C.O.Lehm)、糖荚豌豆(Pisum sativum L.convar.axiphium Alefemend.C.O.Lehm)、也称作荷兰豆、豆荚可食性豌豆或嫩豌豆(mangetout)(Pisum grandasneida L.convar.sneidulo p.shneiderium))；花生(落花生(Arachis hypogaea))、三叶草(车轴草属物种(Trifolium))、苜蓿(苜蓿属(Medicago))、葛藤(野葛(Puerarialobata))、寻常紫花苜蓿，苜蓿(M.sativa L.)、鹰嘴豆(鹰嘴豆属(Cicer))、兵豆(Lens)(兵豆(Lens culinaris Medik.)、羽扇豆(羽扇豆属(Lupinus))；野豌豆(蚕豆属(Vicia))、蚕豆、蚕豆(蚕豆(Vicia faba))、山黧豆(山黧豆属(Lathyrus))(包括家山黧豆(Lathyrussativus)、玫红山黧豆(Lathyrus tuberosus)；豇豆属(Vigna)(包括蛾豆(乌头叶豇豆(Vigna aconitifolia)(Jacq.)Maréchal)、红小豆(赤豆(Vigna angularis(Willd.)Ohwi和H.Ohashi)、黑绿豆(urd bean)(黑小豆(Vigna mungo(L.)Hepper)、绿豆(Vigna radiata(L.)R.Wilczek)、班巴拉豆(bambara groundnut)(Vigna subterrane(L.)Verdc.)、饭豆(赤小豆(Vigna umbellata(Thunb.)Ohwi和H.Ohashi))、野豇豆(Vigna vexillata(L.)A.Rich.)、豇豆(Vigna unguiculata(L.)Walp.)，划分成三个亚种：长豇豆(asparagusbean)、豇豆(cowpea)，小豇豆(catjang bean))；木豆(Cajanus cajan(L.)Millsp.)、硬皮豆属(Macrotyloma)(包括geocarpa groundnut(Macrotyloma geocarpum(Harms)Maréchal和Baudet)、马齿豆(horse bean)(硬皮豆(Macrotyloma uniflorum(Lam.)Verdc.))；翼豆(四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus(L.)DC.))、非洲豆薯(Sphenostylis stenocarpa(Hochst.ex A.Rich.)Harms)、埃及黑豆(Egyptian black bean)、牛豆(dolichos bean)、白扁豆(lablab bean)(扁豆(Lablab purpureus)(L.)Sweet)、豆薯(豆薯属(Pachyrhizus))、瓜尔豆(Cyamopsis tetragonolobus(L.)Taub.)；和/或刀豆属(Canavalia)(包括直生刀豆(Canavalia ensiformis(L.)DC.)、刀豆(刀豆(Canavaliagladiata(Jacq.)DC.)。

进一步优选的是选自菜豆、大豆、豌豆、三叶草、葛、紫花苜蓿、兵豆、羽扇豆、野豌豆和落花生的植物。最优选地，植物、植物部分或植物细胞是或衍生自大豆和/或玉米。

优选地，本发明的转基因植物或通过本发明方法获得的植物是大豆植物并具有增加的针对柄锈菌目真菌性病原体(锈菌)、优选地层锈菌科(Phacopsoraceae)真菌性病原体、更优选地针对层锈菌属(Phacopsora)真菌性病原体、最优选地针对豆薯层锈菌和山马蝗层锈菌(也称作大豆锈菌)的抗性。优选地，针对豆薯层锈菌和/或山马蝗层锈菌的抗性增加。

优选地，本发明的转基因植物或通过本发明方法获得的植物是玉米植物并且针对丛赤壳科、尤其镰刀菌属真菌性病原体、尤其物种禾谷镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、假禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、早熟禾镰刀菌、轮枝镰刀菌(串珠镰刀菌)、胶孢镰刀菌、层出镰刀菌、藤仓镰刀菌、燕麦镰刀菌、尖孢镰刀菌、Fusarium virguliforme和/或腐皮镰刀菌具有增加的抗性。最优选地是禾谷镰刀菌和/或轮枝镰刀菌。

用于产生转基因植物的方法

本发明的一个实施方案提供一种用于产生具有增加的真菌抗性的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，所述方法包括引入

a)编码F6H1蛋白的外源核酸，其中所述F6H1蛋白由与启动子和转录终止序列有效连接的如上文定义的核酸编码，

并且进一步任选地引入选自以下的一种或多种核酸

b)与启动子和转录终止序列有效连接的编码如上文定义的CCoAOMT1蛋白的外源核酸，

c)与启动子和转录终止序列有效连接的编码如上文定义的ABCG37蛋白的外源核酸，和

d)与启动子和转录终止序列有效连接的编码如上文定义的UGT71C1蛋白的外源核酸至植物、植物部分或植物细胞中，

其中编码F6H1、CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的外源核酸位于相同或不同的载体构建体上，

从植物、植物部分或植物细胞产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞；并且表达由重组载体构建体编码的蛋白质。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于产生具有增加的真菌抗性的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，所述方法包括

(a)将本发明的重组载体构建体引入植物、植物部分或植物细胞中，并且；

(b)从植物、植物部分或植物细胞产生转基因植物，并且任选地。

(c)表达F6H1蛋白和选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质。

优选地，所述引入和表达不包括基本上生物的过程。

优选地，用于产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法还包括步骤：选择表达F6H1蛋白和选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质的转基因植物。

优选地，用于产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法额外地包括收获转基因植物的种子并种植种子以及将种子培育成植物的步骤，其中培育的植物包含与启动子和转录终止序列有效连接的编码F6H1蛋白的核酸和编码选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1蛋白中蛋白质的一种或多种核酸。

优选地，将收获转基因植物的种子并种植种子及将种子培育成植物的步骤重复多于一次，优选地，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50次。

可以通过如上文所述的已知方法(例如，通过筛选由随F6H1、CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1基因一起共转移的植物可表达基因编码的一种或多种标志物的存在或通过直接筛选FF6H1、CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸)选出转基因植物。

另外，提供外源F6H1核酸(其任选与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合)或包含F6H1核酸(其任选与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合)的重组载体构建体的用途，用于转化植物、植物部分或植物细胞以提供抗真菌植物、植物部分或植物细胞。

可收获部分和产物

根据本发明的转基因植物的可收获部分是本发明组成部分。优选地，可收获部分包含任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸或任选与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白。可收获部分可以是种子、根、叶和/或花。优选的大豆植物部分是大豆。优选的玉米植物部分是玉米粒。

衍生自本发明转基因植物、其部分或其可收获部分的产物是本发明组成部分。优选的产物是油，优选地玉米油或大豆油。

优选的大豆植物部分是大豆粒，所述大豆粒包含任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸或任选与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白。

优选的玉米植物部分是玉米粒，所述玉米粒包含任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸或任选与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白。

在一个优选实施方案中，产物衍生自上文描述的植物或衍生自上文描述的植物的可收获部分，其中产物优选地是大豆油和/或玉米油。

优选地，大豆油包含任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸或任选与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白。

优选地，玉米油包含任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸或任选与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白。

用于制造产物的方法

在一个实施方案中，用于产生产物的方法包括

a)培育本发明的或通过本发明方法可获得的植物并且

b)从或借助本发明植物和/或这些植物的部分例如种子产生所述产物。

在又一个实施方案中，所述方法包括步骤a)培育本发明的植物，b)从植物取出如上文定义的可收获部分和c)从或借助本发明的可收获部分产生所述产物。

优选地，通过所述方法获得的产物包含根据本发明的外源核酸和/或蛋白质。

用于产生产物的方法，包括

a)培育根据本发明或通过本发明方法可获得的植物，并且

b)从或借助植物和/或所述植物的部分(优选地种子)，产生所述产物，其中产物包含任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸或由所述核酸编码的蛋白质。

产品可以在已经培育这种植物的地点产生，植物和/或其部分可以从已经培育有植物的地点取出以产生产品。一般而言，将植物培育，从植物取下所需的可收获部分，如果可行的话，重复循环进行，并且从植物的可收获部分产生产品。培育植物的步骤可以每次在实施本发明的方法时仅进行仅一次，同时允许产生产品步骤重复多次，例如，通过反复取下本发明植物的可收获部分并且如果需要进一步加工这些部分以获得产物。还可以重复培育本发明植物的步骤并且贮藏植物或可收获部分直至随后对积累的植物或植物部分一次性进行产物的产生。另外，培育植物的步骤和产生产品步骤可以在时间上重叠地、甚至很大程度上同时地或依次地进行。通常，植物在产生产品之前的一些时间培育。

在一个实施方案中，由本发明方法产生的产品是植物产品，如但不限于食品原料、饲料原料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品和/或药物。将食品原料视为用于营养和/或用于补充营养的组合物。将动物饲料原料并且尤其动物饲料补充物视为食品原料。

在另一个实施方案中，用于生产的本发明方法用于产生农产品，如但不限于植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖、脂肪、油、聚合物、维生素等。

植物产物可能很大程度由一种或多种农产品组成。

用于繁育的方法/用于改善植物的方法/产生植物品种的方法

使用已知植物育种方法，可以使本发明的转基因植物与相似的转基因植物或与缺少本发明核酸的转基因植物或与非转基因植物杂交，以制备种子。进一步，本发明的转基因植物细胞或植物可以包括和/或杂交至包含一种或多种外源核酸的另一个转基因植物，因此在植物和/或其后代中产生转基因的“堆叠”。随后将种子种植以获得包含任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1核酸的核酸组合的F6H1核酸的杂交型能育转基因植物。杂交的能育转基因植物可以具有经雌性亲本或经雄性亲本遗传的特定表达盒。第二种植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂种。在本发明中也包括这些杂交的转基因植物中任意者的种子。本发明的种子可以从能育转基因植物收获并用来培育出本发明的转化植物的后代世代，所述转化植物包括包含外源核酸的杂交植物系。

因此，本发明的一个实施方案是一种用于繁育抗真菌植物的方法，所述方法包括步骤

(a)将本文所述的转基因植物或通过本文所述方法可获得的植物与第二植物杂交；

(b)获得因(a)中所述杂交步骤产生的一粒种子或多粒种子；

(c)种植所述种子或多粒种子并将所述种子或多粒种子培育成植物；并且

(d)从所述植物中选择表达F6H1蛋白的植物，所述蛋白质任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合。

另一个优选实施方案是一种用于改善植物的方法，所述方法包括

(a)通过本发明的任何方法获得转基因植物；

(b)在一个植物细胞将(a)的植物的至少一个植物细胞的遗传物质与至少一个细胞的遗传物质组合，所述至少一个细胞在一个或多个基因方面不同于(a)的植物的植物细胞，或使(a)的转基因植物与第二植物杂交；

(c)从至少一株植物获得种子，所述至少一株植物从(b)的一个植物细胞或步骤(b)杂交的植物产生；

(d)种植所述种子并将种子培育成植物；并且

(e)从所述植物中选择表达下述核酸的植物，所述核酸编码任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白；和任选地

(f)从表达下述核酸的植物产生繁殖材料，所述核酸编码任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和UGT71C1蛋白的一种或多种蛋白质组合的F6H1蛋白。

可以通过如上文所述的已知方法(例如，通过筛选由随F6H1、CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1基因一起共转移的植物可表达基因编码的一种或多种标志物的存在或筛选F6H1、CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸本身)选出转基因植物。

根据本发明，如果并入非染色体的自主性复制子或整合至植物染色体中，则引入的任选地与选自CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸的一种或多种核酸组合的F6H1核酸可以在植物细胞中稳定地维持。无论是否存在于染色体外非复制型或复制型载体构建体或整合入染色体的载体构建体内，外源F6H1、CCoAMT1、ABCG37和/或UGT71C1核酸均优选地位于一个或多个植物表达盒中。植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中驱动基因表达的调节序列，其中所述调节序列如此功能性连接，从而每种序列可以实现其功能，如通过多腺苷酸化信号终止转录。优选的多腺苷酸化信号是从根癌农杆菌t-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等人,1984,EMBO J.3:835)的称作章鱼碱合酶的基因3或其功能性等同物起源的那些多腺苷酸化信号，而在植物中有功能活性的全部其它终止子也是合适的。由于植物基因表达极经常地在转录水平上不受限制，故植物表达盒优选地包含其它功能连接的序列，如翻译增强子，如过量驱动序列，其含有来自烟草花叶病毒的增加多肽/RNA比率的5’非翻译性前导序列(Gallie等人,1987,Nucl.Acids Research15:8693-8711)。植物表达载体的例子包括以下文献中详述的那些：Becker,D.等人,1992,New plant binary vectors withselectable markers located proximal to the left border,Plant Mol.Biol.20:1195-1197；Bevan,M.W.,1984,Binary Agrobacterium vectors for planttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；和Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；引自：Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,Kung和R.Wu编著,Academic Press,1993,S.15-38。

本发明的一个优选方法是一种向植物、植物部分或植物细胞的表面施加莨菪亭和/或其衍生物的方法，其中与未向其表面施加莨菪亭和/或衍生物的植物、植物部分或植物细胞相比，通过向植物、植物部分或植物细胞的表面施加莨菪亭和/或其衍生物，增加对植物、植物部分或植物细胞的真菌性病原体的抗性，其中植物是大豆和/或玉米。

在本发明的一个实施方案中，植物表面或植物部分表面用莨菪亭和/或其衍生物包覆，其中植物是大豆和/或玉米。

在本发明的一个实施方案中，植物、植物部分或植物细胞具有莨菪亭和/或其衍生物包覆的表面，其中植物是大豆和/或玉米。

实施例

以下实施例不意在显示本发明的权利要求书范围，反而意在说明某些实施例。在所例举方法中的技术人员想到的变型将落入本发明的范围内。

实施例1：一般方法

可以例如按已知的方式，使用亚磷酰胺法(Voet,Voet,第2版，Wiley Press NewYork，第896-897页)影响寡核苷酸的化学合成。出于本发明目的所实施的克隆步骤例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、转移核酸至硝化纤维素和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、细菌培养、噬菌体增殖和重组DNA的序列分析，如Sambrook等人,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989),ISBN 0-87969-309-6所述实施。重组DNA分子的测序用MWG-Licor激光荧光DNA测序仪，按照Sanger法(Sanger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463(1977))实施。

实施例2：瞬时转化本明烟草的过量表达载体构建体的克隆

为了获得cDNA，从已经在收获之前两天用豆薯层锈菌接种的拟南芥pen2突变体的叶组织提取RNA。使用RevertAid H minus逆转录酶(Thermo Scientific)产生cDNA。制备和纯化cDNA的全部步骤均根据手册中所述进行。

通过如Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo Scientific)热启动、Pfu Ultra、PfuTurbo或Herculase DNA聚合酶(Stratagene)的方案中所述的PCR，从cDNA扩增SEQ-ID 1-序列(F6H1)。Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶方案的组成如下：1x PCR缓冲液，0.2mM每种dNTP，100ng拟南芥cDNA(var Columbia-0)，50pmol正向引物，50pmol反向引物，1u Phusion热启动，Pfu Ultra，Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶。

扩增循环如下：

1个在98℃30秒的循环；随后35个循环：在每种情况下，在98℃10秒，在62℃30秒和在72℃40秒，然后1个在72℃10分钟的循环，随后4℃。

出于克隆目的，以下引物序列用来特异性扩增F6H1全长ORF：

F6H1_attB1正向引物：

5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCTCCAACACTCTTGAC-3′

i)(SEQ ID NO:76)

F6H1_attB2反向引物

5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGATCTTGGCGTAATCG-3′

ii)(SEQ ID NO:77)

将扩增片段凝胶纯化并且根据生产商的说明，使用克隆法，克隆入pDONR207进入载体(Invitrogen)。使用这种克隆技术，将全长F6H1片段按有义方向插在进入载体的attL1和attL2重组位点之间。为了制备未加标签的F6H1过量表达构建体，根据生产商的方案，通过使用含有F6H1片段的pDONR207载体，实施LR反应(Gateway系统,Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州,美国)。作为靶，使用双元pB2GW7(根特大学，比利时)载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的pBR322复制起点，和(4)在右边界和左边界之间pNos-启动子控制下的bar选择基因。将重组反应转化入感受态大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自每种载体构建体的阳性克隆测序并提交供大豆转化(参见图2a)。

将扩增片段凝胶纯化，并且根据生产商的手册，使用MultiSite 克隆法以制备加FLAG标签的F6H1过量表达构建体。首先，使用以下引物(attB引物延长加下划线)，从载体pTA7002(Shuqun Zhang,Columbia大学，密苏里州，美国)PCR扩增Ω-FLAG序列，所述载体携带5′侧翼分布有烟草花叶病毒Ω翻译增强子的拟南芥MKK4基因和FLAG标签序列：

(i)Ω-FLAG-attB1正向引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCATATTTTTACAACAATTACCAACAACA

(SEQ ID NO：78)

(ii)Ω-FLAG-attB5r反向引物：

GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTCTTGTCATCGTCGTCCTTGT

(SEQ ID NO：79)

接着，从如上述制备的pen2cDNA中PCR扩增F6H1全长编码性序列。携带5′attB5和attB2延长物的以下引物序列用于PCR扩增F6H1

(i)F6H1-attB5正向引物：

GGGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGCAATGGCTCCAACACTCTTGAC(SEQ ID NO：80)

(ii)F6H1-attB2反向引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCAGATCTTGGCGTAATCG(SEQ ID NO：77，参见上文)

将PCR产物按凝胶法纯化并且通过gateway克隆法(BP反应)，将attB1-Ω-FLAG-attB5r序列引入pDONR221P1-P5r。类似地，将attB5-F6H1-attB2序列克隆入pDONR221P5-P2。将重组反应转化入感受态大肠杆菌(DH5α)。在提取质粒后，两种载体均随pB2GW7目的载体一起用于LR重组。通过特异性限制酶切消化和测序，筛选所产生的含有两种序列(Ω-FLAG和F6H1)的表达克隆，之后转化(图2b)。

实施例3a：本明烟草叶的瞬时转化

根据略微地修饰的来自以下文献的方案瞬时转化本明烟草叶：Popescu等人，2007(Popescu，S.C.，Popescu，G.V.，Bachan，S.，Zhang，Z.，Seay，M.，Gerstein，M.，Snyder，M.和Dinesh-Kumar，S.P.(2007)。通过高密度拟南芥蛋白质微阵列揭示钙调蛋白相关蛋白与其靶的差异性结合作用(Proc Natl Acad Sci U S A 104，4730-4735)。携带目的DNA构建体的单一农杆菌(菌株AGL01)(参见图2a和2b)在28℃于含有适宜抗生素的YEB培养基中培养14–16小时。通过离心(5000转/分钟，10分钟)收获细胞，将其在含有10mM MgCl₂、10mM MESpH 5.6和150μM乙酰丁香酮的缓冲液中重悬至OD 0.4-0.8并且在室温孵育2–5小时。随后，将经目的DNA构建体转化的农杆菌与等体积的含有来自番茄丛矮病毒(TBSV)的p19沉默阻抑蛋白基因的农杆菌混合，并将1:1混合物经注射器浸润至6周龄本明烟草植物的叶中。农杆菌浸润后三天，将叶在液氮中冷冻并储存在-80℃直至分析。

实施例3b：提取莨菪亭和基于HPLC的分析(图12a和12b)

将植物材料在液N₂中研磨并用90％(v/v)补充有4-甲基伞形酮作为内标物的甲醇(每0.5g新鲜材料1ml)提取24小时。将提取物以15,000g离心10分钟。上清液在真空离心机浓缩并将干燥的残余物溶解于150μl 100％甲醇中。随后在Nucleosil C18柱(EC 150/4,6Nucleosil 100-5C18；Macherey-Nagel)上，将样品(20μl进样量)在室温以水中1％(v/v)甲酸(A)和甲醇中1％(v/v)甲酸(B)建立的梯度流动相及1.0ml/分钟的流量进行反相高效液相色谱(HPLC)分析。梯度程序在15％B启动2分钟，随后18分钟线性增加至21.5％，随后在20分钟和40分钟之间线性增加至55％B。该梯度随后5分钟增加至95％B。这个比例维持10分钟并且随后5分钟内返回初始条件。莨菪亭用荧光检测器以激发波长345nm和发射波长460nm检出并且通过与纯的参比化合物(莨菪亭，SIGMA-ALDRICH)比较来鉴定。

实施例4：确定基因转录物的丰度

如Chomczynski和Sacchi(1987)所描述，从所述的拟南芥突变体的叶提取总RNA。使用随机引物(9聚物)和RevertAidTM逆转录酶(Fermentas)根据生产商的说明，将1μg RNA转录成cDNA。在ABI7300中使用SYBR Green(Invitrogen)按以下RT-qPCR条件，对基因转录物的积累定量：50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒，60℃1分钟和95℃15秒(第三和第四步骤重复40次)。

与F6H1基因(SEQ ID No 1)特异性杂交的引物：

F6H1_RT_F：5′-CTCAGCCTCTTCTTTGTCTC-3(SEQ ID NO：81)

F6H1_RT_R：5′-AAGCCTCCTCACCATCTTC-3′(SEQ ID NO：82)

与CCoAOMT1(SEQ ID No3)特异性杂交的引物：

CCoAOMT1_RT_F：5′-ATGGCGACGACAACAACAGAAGC-3(SEQ ID NO：83)

CCoAOMT1_RT_R：5′-GCCAATCACTCCTCCAATTTTCACA-3′(SEQ ID NO：84)

与ABCG37(SEQ ID No 5)特异性杂交的引物：

ABCG37_RT_F：5′-GATCGACTCTCCTTGATGATGGCGA-3(SEQ ID NO：85)

ABCG37_RT_R：5-CGCACTCGGCCACCACTTTTAAACT-3′(SEQ ID NO：86)

与UGT71C1(SEQ ID No 7)特异性杂交的引物：

UGT71C1_RT_F：5′-CTCGCAACAATCGAACTCGCCAAA-3(SEQ ID NO：87)

UGT71C1_RT_R：5′-TCGGCAAATTCCACAAAGAGTTCCA-3′(SEQ ID NO：88)

全部引物均根据标准规范(Udvardi等人，2008)设计，使用NCBI的Primer Blast工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行脱靶检索。表达基因对肌动蛋白2归一化。使用ABI7300软件分析数据，并且根据Livak和Schmittgen(2001)以2-^(Ct ^{F6H1-Ct肌动蛋白2})计算相对于肌动蛋白的表达。

实施例5：体外萌发试验

实施例5a豆薯层锈菌的生长抑制

将豆薯层锈菌的孢子重悬于补充Tween-20和10μM、100μM、500μM和1mM莨菪亭的H₂O中。使用重悬于补充Tween-20的H₂O中的豆薯层锈菌孢子作为对照。将全部重悬的孢子转移到玻璃载片上。在六小时孵育时间后，ASR孢子萌发并且开始形成附着胞。

通过定量显微分析确定萌发率和附着胞形成率。显示可见芽管形成，但是芽管端部不增厚的孢子计为“萌发”，而存在增厚的芽管端部表示附着胞形成(图14a)。

向ASR孢子施加莨菪亭以剂量依赖性方式减少萌发和附着胞形成。在1mM浓度，莨菪亭完全消除孢子体外萌发。

实施例5b禾谷镰刀菌的生长抑制

在补充有甲醇中1mM莨菪亭或等体积的缺少莨菪亭的甲醇作为对照的新鲜PDA平板上放置来自24℃在马铃薯右旋糖琼脂(PDA)上培育的7日龄禾谷镰刀菌培养物的1cm²琼脂块。通过喷洒Uvitex2溶液(0.1％Uvitex 2B(Polyscience,Warrington,UK)，溶解于0.1MTris-/HCl-缓冲液，pH 8.5)，将真菌孢子染色。使用荧光显微镜每日测量真菌生长以确定真菌的平均生长速率。每份样品计数100个孢子(参见图15b)。

实施例6：体内孢子萌发试验

6.1拟南芥

将拟南芥种子播种在土壤上(VM型，Einheitserde Werkverband)并在4℃层积(stratified)二天。将植物在短日照条件(密室内，8小时光周期，120μmol m^-2s^-1光子辐照度)22℃和65％湿度培育。如下文描述用豆薯层锈菌接种五至六周龄植物。

对于预处理实验，将拟南芥植物用1mM莨菪亭喷洒(溶解于H₂O中，0.01％Tween-20)；在短日照条件孵育6小时并随后用1mg/ml豆薯层锈菌夏孢子接种。对于共处理实验，将豆薯层锈菌孢子溶解于补充有1mM莨菪亭的0.01％Tween-20中。

在接种后，将植物覆以润湿的塑料圆顶以确保高湿度并在短日照条件下孵育(参见上文)。24小时后移走塑料圆顶并将植物在相同条件孵育另外24小时。感染后2天收获叶并且令其在饱和(2.5g/ml)水合氯醛溶液浸泡的组织上脱色。通过定量显微分析确定萌发和脱色叶上的穿透。显示可见芽管形成的孢子归为“萌发”类别。预处理以及共处理的植物显示萌发孢子形成大幅度减少，表明莨菪亭对大豆锈菌真菌的毒性作用(图13)。我们从未观测到在拟南芥中导致多效性作用的莨菪亭的任何植物毒性作用。

6.2大豆

将大豆种子在土壤上(VM型，Einheitserde Werkverband)播种并在短日照条件密室内(8小时光周期，120μmol m^-2s^-1光子辐照度)22℃和65％湿度培育。如下文描述用豆薯层锈菌接种五至六周龄植物。

对于共处理实验，将豆薯层锈菌孢子溶解于补充有10μM、100μM、500μM和1mM莨菪亭的0.01％Tween-20中(图14b和c)。

对于预处理实验，将大豆植物用1mM莨菪亭喷洒(溶解于H₂O中，0.01％Tween-20)；孵育6小时并随后用1mg/ml豆薯层锈菌夏孢子接种(图14c)。

在接种后，将植物覆以润湿的塑料圆顶以确保高湿度并在短日照条件下孵育(参见上文)。24小时后移走塑料圆顶并将植物在相同条件孵育另外11天。在感染后12天，通过使用程序Assess2.0对初生叶、第一和第二具三叶的评定患病叶面积(Lobet G.,Draye X.,Périlleux C.2013An online database for plant image analysis software tools,Plant Methods,vol.9(38))。将全部叶上显示真菌菌落或强烈黄化/褐变的叶面积的百分数的平均数视为患病叶面积。

预处理以及共处理的植物显示感染叶面积的形成大幅度减少(图14b和14c)，从而显示莨菪亭抑制大豆锈菌的潜力。从未观测到在大豆中导致多效性作用的莨菪亭的任何植物毒性作用，因此毒性作用是真菌特异的。

实施例7：克隆用于稳定转化大豆的过量表达载体构建体

通过DNA合成法生成本申请中提到的F6H1(AT3G13610，SEQ ID No:1)、CCoAOMT1(At4g34050，SEQ ID No:3)、ABCG37(PDR9；AT3G53480，SEQ ID No:5)和UGT71C1(SEQ IDNo:7)基因的DNA序列(Geneart，雷根斯堡，德国)。

F6H1DNA(如SEQ ID No:1中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-C载体(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于欧芹遍在蛋白启动子和根癌农杆菌衍生的章鱼碱合酶终止子(t-OCS)之间。PcUbi启动子调节欧芹(Petroselinum crispum)ubi4-2基因(登录号X64345)的组成型表达(Kawalleck等人,1993Plant Molecular Biology21(4):673-684)。

为了获得双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用空pENTRY-A载体、空pENTRY-C和上述pENTRY-C载体中的PcUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间AtAHASL-启动子控制下的AHAS选择(参见图2c)。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自该载体构建体(图2c)的阳性克隆测序并提交用于大豆转化。

为了获得F6H1-CCoAOMT1双基因构建体(图3)，将CCoAOMT1的DNA(如SEQ ID No:3中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-B载体(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于pSuper启动子(Lee等人,2007Plant Physiology第145卷第4期1294-1300)和根癌农杆菌衍生的胭脂碱合酶终止子(t-nos)之间。超级启动子由三个相同章鱼碱合酶增强子尾随MAS启动子组成(Lee等人,2007Plant Physiology第145卷第4期1294-1300)。

为了获得含有F6H1和CCoAOMT1的双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用空pENTRY-A载体、上述pENTRY-B载体中的pSuper启动子::CCoAOMT1::nos-终止子和上述pENTRY-C载体中的PcUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间AtAHASL-启动子控制下的AHAS选择盒(参见图3)。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自每种载体构建体的阳性克隆测序并提交用于大豆转化。

为了获得F6H1-UGT71C1双基因构建体(图5)，将UGT71C1DNA(如SEQ ID No:7中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-B载体(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于pSuper启动子(Lee等人,2007PlantPhysiology第145卷第4期1294-1300)和根癌农杆菌衍生的胭脂碱合酶终止子(t-nos)之间。超级启动子由三个相同章鱼碱合酶增强子尾随MAS启动子组成(Lee等人,2007PlantPhysiology第145卷第4期1294-1300)。

为了获得含有F6H1和UGT71C1的双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用空pENTRY-A载体、上述pENTRY-B载体中的pSuper启动子::UGT71C1::nos-终止子和上述pENTRY-C载体中的PcUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间AtAHASL-启动子控制下的AHAS选择盒(参见图5)。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自每种载体构建体的阳性克隆测序并提交用于大豆转化。

为了获得F6H1-CCoAOMT1-ABCG37(图4)三基因构建体，将ABCG37DNA(如SEQ IDNo:5中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-A载体(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于pGlyma14g06680启动子(参见WO 2012/127373)和马铃薯(Solanum tuberosum)组织蛋白酶D抑制蛋白(Herbers,Karin,SaloméPrat和Lothar Willmitzer."Functional analysis of a leucineaminopeptidase from Solanum tuberosum L."Planta 194.2(1994):230-240)之间。pGlyma14g06680启动子在大豆中介导中等强度的组成型表达。

为了获得含有F6H1、CCoAOMT1和ABCG37的双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用如上所述的pENTRY-A载体中的Glyma14g06680启动子::ABCG37::组织蛋白酶D抑制蛋白终止子、上述pENTRY-B载体中的pSuper启动子::CCoAOMT1::nos-终止子和上述pENTRY-C载体中的PcUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。

作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间AtAHASL-启动子控制下的AHAS选择盒(参见图4)。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自每种载体构建体的阳性克隆测序并提交用于大豆转化。

实施例8：大豆转化

将表达载体构建体(参见实施例2)转化入大豆。

8.1大豆种子消毒和萌发

实际上，任何大豆品种的任何种子均可以用于本发明的方法中。多种大豆栽培品种(包括Jack、Williams 82、Jake、Stoddard、CD215和Resnik)适于大豆转化。将大豆种子在密室中用氯气消毒，其中通过在具有紧密配合盖的干燥器中逐滴添加3.5ml 12N HCl至100ml漂白剂(5.25％次氯酸钠)中，产生所述氯气。在密室中24小时至48小时后，取出种子并且将大约18粒至20粒种子铺在100mm皮式培养皿中含有或不含5μM 6-苄基-氨基嘌呤(BAP)的固态GM培养基上。籽苗在无BAP的情况下伸得更长，并且根发育，尤其次生根和侧根形成。通过形成更短和更矮壮的籽苗，BAP增强籽苗。

在25℃于光照(>100μEinstein/m²s)下培育的七日龄籽苗用作三个外植体类型的外植体材料。此时，种皮裂开并且将上胚轴连同单身复叶培育到至少子叶的长度。上胚轴应当是至少0.5cm以避开子叶-茎节组织(由于大豆栽培品种和种子批可能在发育的时间方面变动，所以对萌发阶段的描述比特定萌发时间更精确)。

关于整株籽苗接种，参见方法A(实施例8.3.和8.3.2)或关于叶外植体接种，参见方法B(实施例8.3.3)。

对于方法C(参见例子8.3.4)，从每株籽苗移除下胚轴和两片子叶的一又二分之一或部分。随后将籽苗置于增殖培养基上2周至4周。籽苗产生几株分枝的苗以从中获得外植体。大部分外植体源自从顶芽长出的小植物。优选地使用这些外植体作为靶组织。

8.2-农杆菌培养物的培育和制备

通过以下方式制备农杆菌培养物：将携带所需双元载体的农杆菌(例如，根癌农杆菌或发根农杆菌(A.rhizogenes))(例如H.Klee.R.Horsch和S.Rogers,1987Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further Applicationsto Plant Biology；Annual Review of Plant Physiology第38卷:467-486)划线到固态YEP生长培养基(YEP培养基：10g酵母提取物，10g Bacto蛋白胨，5g NaCl，调节pH至7.0，并用用H₂O补足终体积到1升，对于YEP琼脂平板，添加20g琼脂，高压灭菌)上并在25℃孵育直至菌落出现(约2天)。取决于Ti或Ri质粒、双元载体和细菌染色体上存在的选择标记基因，将不同的选择化合物用于YEP固态和液态培养基中的根癌农杆菌和发根农杆菌选择。多种农杆菌菌株可以用于该转化方法。

在大约两天后，(以无菌牙签)挑取单菌落并接种于含有抗生素的50ml液态YEP并以175转/分钟(25℃)振摇直至实现0.8-1.0之间的OD₆₀₀(大约2天)。制备用于转化的日常甘油贮藏物(15％)并将1ml农杆菌母液等分入1.5ml微量离心管中，随后贮存在-80℃。

外植体接种当日之前，将200ml YEP用5μl至3ml农杆菌日常贮藏物于500ml锥形烧瓶中接种。将烧瓶在25℃振摇过夜直至OD₆₀₀在0.8和1.0之间。在制备大豆外植体之前，通过在20℃以5,500x g离心10分钟，沉淀农杆菌。将沉淀物重悬于液态CCM中至所需的密度(OD₆₀₀ 0.5-0.8)并在使用之前置于室温至少30分钟。

8.3-外植体制备物和共培育(接种)

8.3.1方法A：在转化当日制备外植体。

此时的籽苗具有伸长的上胚轴，从至少0.5cm但是通常在0.5cm和2cm之间。成功地使用长度至多4cm的伸长的上胚轴。随后在i)具有或没有一些根的情况下，ii)具有不完整的，一片或两片子叶的情况下制备外植体，移除全部预先形成的叶，包括顶端分生组织，并且使用锐利解剖刀，以数次切割弄伤位于第一组叶处的茎节。

这种在茎节处的切口不仅引起农杆菌感染，还分散叶腋分生组织细胞并损伤预先形成的苗。在弄伤和制备后，将外植体放置入(set aside)皮式培养皿并随后与液态CCM/农杆菌混合物共培育30分钟。随后将外植体从液态培养基取出并铺在含有固态共培育培养基的15x 100mm培养板上的无菌滤纸上。如此放置受伤的靶组织，从而它们与培养基直接接触。

8.3.2改良方法A：上胚轴外植体制备

使用从4至8日龄籽苗制备的大豆上胚轴段作为再生和转化的外植体。大豆栽培品种L00106CN、93-41131和Jack的种子在具有或没有细胞分裂素的1/10MS盐或组成相似的培养基中萌发4天至8天。通过从茎段移除子叶节和茎节制备上胚轴外植体。将上胚轴切成2至5段。特别优选与包含叶腋分生组织的初生茎节或较高茎节连接的段。

将这些外植体用于农杆菌感染。将携带具有目的基因(GOI)和AHAS、bar或dsdA选择标记基因的质粒的农杆菌AGL1在含适宜抗生素的LB培养基中培养过夜，收获并重悬于含乙酰丁香酮的接种培养基中。将新鲜制备的上胚轴段浸泡在农杆菌悬液中30至60分钟并随后将外植体在无菌滤纸上蘸干。将接种的外植体随后在含L-半胱氨酸和TTD及用于增加T-DNA递送的其他化学品如乙酰丁香酮的共培育培养基上培养2至4日。随后将感染的上胚轴外植体置于含选择剂如灭草烟(imazapyr)(用于AHAS基因)、草铵膦(glufosinate)(用于bar基因)或D-丝氨酸(用于dsdA基因)的苗诱导培养基上。再生的苗在含选择剂的伸长培养基上继代培养。

为了再生转基因植物，将这些段随后在含细胞分裂素如BAP、TDZ和/或激动素用于诱导苗的培养基上培养。在4至8周后，将培养的组织转移至含较低浓度细胞分裂素用于苗伸长的培养基上。将伸长的苗转移至含植物生长激素用于生根和植物发育的培养基。再生多株苗。

回收显示强烈cDNA表达的多个稳定转化的节段。从上胚轴外植体再生大豆植物。展示了高效T-DNA递送和稳定转化的节段。

8.3.3方法B：叶外植体

为了制备叶外植体，从下胚轴取下子叶。将子叶彼此分离并移除上胚轴。通过在托叶基部小心切割从上胚轴取下由叶片、叶柄和托叶组成的初生叶，从而外植体上包含叶腋分生组织。为了损伤外植体以及刺激从头苗形成，移除任何预先形成的苗并且用锋利解剖刀切割托叶之间的区域3至5次。

在外植体制备后立即将外植体完全浸没入或损伤的叶柄末端浸入农杆菌悬液中。在接种后，将外植体在无菌滤纸上蘸干以移走过多农杆菌培养物并且放置外植体，以损伤侧接触覆盖固态CCM培养基的7cm圆形Whatman纸(见上文)。这种滤纸防止根癌农杆菌在大豆外植体上过度生长。用Parafilm^TM“M”(American National Can,Chicago,Ill.,美国)包裹五块平板并且在25℃在暗处或亮处孵育三至五天。

8.3.4方法C：增殖的叶腋分生组织

为了制备增殖的叶腋分生组织外植体，使用增殖的3-4周龄小植物。叶腋分生组织外植体可以从第一至第四节制备。可以从每株籽苗获得平均三个至四个外植体。通过切割节间上腋生茎节下方0.5至1.0cm并从外植体移走叶柄和叶，从小植物制备外植体。其中存在叶腋分生组织的尖端用解剖刀切割以诱导从头苗生长和允许农杆菌接近靶细胞。因此，0.5cm外植体包含茎和芽。

一旦切割，将外植体立即置于农杆菌悬液中20至30分钟。在接种后，将外植体在无菌滤纸上蘸干以移走过多农杆菌培养物，随后取决于农杆菌菌株，放置几乎完全浸没于固态CCM中或置于覆盖固态CCM的7cm圆形滤纸上部。这种滤纸防止农杆菌在大豆外植体上过度生长。用Parafilm^TM“M”(American National Can,Chicago,Ill.,美国)包裹平板并且在25℃在暗处孵育二至三天。

8.4-苗诱导

在25℃暗处共培育3至5天后，将外植体在液态SIM培养基中淋洗(以移走过多农杆菌)(SIM，参见Olhoft等人,2007A novel Agrobacterium rhizogenes-mediatedtransformation method of soy using primary-node explants from seedlings InVitro Cell.Dev.Biol.—Plant(2007)43:536–549；以移走过多农杆菌)或Modwash培养基(1X B5主要盐，1X B5次要盐，1X MSIII铁，3％蔗糖，1X B5维生素，30mM MES，350mg/L特美汀pH 5.6，WO 2005/121345)并在无菌滤纸上蘸干(以特别防止损伤叶片)，之后放置在固态SIM培养基上。大约5个外植体(方法A)或10至20个(方法B和C)外植体如此安置，从而靶组织与培养基直接接触。在头两周期间，外植体可以在具有或没有选择培养基的情况下培养。优选地，将外植体转移到不含选择化合物的SIM上一周。

对于叶外植体(方法B)，外植体应当如此置于培养基中，从而它垂直于培养基表面，同时叶柄埋入培养基且叶片伸出培养基。

对于增殖的叶腋分生组织(方法C)，外植体如此置于培养基中，从而它平行于培养基表面(向基)，同时外植体部分地嵌入培养基中。

用Scotch 394透气胶带(3M，St.Paul，Minn.，美国)包裹平板并且置于生长箱中二周，在18小时光照/6小时黑暗周期在70-100μE/m²s时温度平均为25℃。外植体在含有或不含选择化合物的情况下留在SIM培养基上直至从头苗生长在目标区域出现(例如，上胚轴上方第一茎节处的叶腋分生组织)。可以在这个时间期间向新鲜培养基转移。约一周后，将外植体从含有或不含选择化合物的SIM转移至含选择化合物的SIM。在这个时间，在多种SIM(方法B)中叶外植体的叶柄基部处、对籽苗外植体而言在初生茎节(方法A)处并且对增殖的外植体而言在腋生茎节(方法C)处存在明显的从头苗发育。

优选地，移除转化之前形成的全部苗直至共培育后2周以刺激来自分生组织的新生长。这有助于减少原代转化体中的嵌合现象并增加转基因分生组织细胞的扩增。在这段时间期间，可以将或可以不将外植体切割成更小的片(即，通过切割上胚轴，使茎节从外植体脱离)。

8.5-苗伸长

在SIM培养基(优选地含选择化合物)上2周至4周(或直至一簇苗形成)后，将外植体转移至刺激苗原基的苗伸长的SEM培养基(苗伸长培养基，参见Olhoft等人,2007A novelAgrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soy using primary-node explants from seedlings.In Vitro Cell.Dev.Biol.—Plant(2007)43:536–549)。这种培养基可以含有或可以不含有选择化合物。

每2周至3周后，将外植体在仔细移除死亡组织后转移至新鲜的SEM培养基(优选地含有选择化合物)。外植体应当聚拢在一起并且不分散成小片并或多或少地保留健康。将外植体继续转移直至外植体死亡或苗伸长。取出伸长>3cm的苗并置于RM培养基中约1周(方法A和B)，或约2至4周(方法C)，这取决于栽培品种在何时开始形成根。在外植体有根的情况下，将它们直接转移至土壤中。将生根的苗转移至土壤并在生长箱中硬化2至3周，之后转移至温室。使用这种方法获得的再生的植物是能育的并且平均每株植物产生500粒种子。

与根癌农杆菌共培育5日后，目的基因(GOI)瞬时表达在籽苗叶腋分生组织外植体上、尤其外植体制备期间弄伤的区域内扩散(方法A)。将外植体置于不含选择化合物的苗诱导培养基中，以观察初生茎节怎样对苗诱导和再生作出反应。因此迄今，大于70％的外植体在这个区域形成新苗。GOI表达在SIM上14日后稳定，暗示T-DNA整合入大豆基因组中。此外，初步实验导致形成表达cDNA的苗，所述苗在SIM上3周后形成。

对于方法C，使用增殖的叶腋分生组织方案时，大豆小植物的平均再生时间是从外植体接种起14周。因此，这种方法具有产生能育、健康大豆植物的快速再生时间。

实施例9：大豆的病原体测定法

9.1.植物的生长

将每个事件10株T1大豆植物盆栽并在植物室中培育3-4周(16小时白天-8小时夜晚节律在16℃和22℃温度以及75％湿度)直至前2片具三叶的充分展开。

9.2接种

植物用豆薯层锈菌孢子接种。

为了获得接种用的适宜孢子材料，在接种前2-3天取得15-20天前经锈菌感染的大豆叶并转移至琼脂平板(H₂O中的1％琼脂)。将叶在其上侧面在琼脂上的情况下放置，这允许真菌生长透过组织并产生非常幼龄的孢子。对于接种溶液，将孢子从叶震落并添加至Tween-H₂O溶液。在光学显微镜下借助Thoma计数板进行孢子计数。为了接种植物，将孢子悬液加入到压缩空气推动的喷雾瓶并均匀施加到植物或叶上直至叶表面充分润湿。对于宏观测定法，使用孢子密度1-5x 10⁵个孢子/ml。对于显微术，使用>5x 10⁵个孢子/ml的密度。接种的植物置于平均22℃和>90％空气湿度的温室密室中24小时。在平均25℃和70％空气湿度的密室中进行后续栽培。

实施例10：显微镜下筛选：

为了评价病原体发育，将植物的接种叶在感染后48小时用苯胺蓝染色。

苯胺蓝染色起到检测荧光物质的作用。在宿主相互作用和非宿主相互作用中防御反应期间，物质如苯酚、胼胝质或木质素积累或产生并且在乳突中细胞壁处局限地或在完整细胞中掺入(超敏反应，HR)。形成与苯胺蓝结合的复合物，例如在胼胝质情况下这导致黄色荧光。将叶材料转移至含有脱色液II(乙醇/乙酸6/1)的falcon管或碟并在90℃的水浴中孵育10-15分钟。此后立即移除脱色液II，并将叶用水洗涤2次。对于染液，将叶在染色液II(0.05％苯胺蓝＝甲基蓝，0.067M磷酸氢二钾)中孵育1.5-2小时并此后立即通过显微术分析。

通过显微术评价(计数)不同的相互作用类型。使用Olympus UV显微镜BX61(入射光)和UV长光程滤光片(激发：375/15，分光器；：405LP)。在苯胺蓝染色后，孢子在UV光下显示蓝色。可以借助绿/黄染色在真菌附着胞下方识别乳突。超敏反应(HR)以完整细胞荧光为特征。

实施例11：评价大豆锈菌病易感性

通过估计叶背侧(离轴侧)上患病面积(被正在形成孢子的锈菌(uredinia)覆盖的面积)评定大豆锈菌病的进展情况。另外，考虑叶的黄化(关于方案，参见图11)。

总计，将50株T1大豆植物/构建体用豆薯层锈菌孢子接种。在接种后14天评定大豆对所接种大豆植物的豆薯层锈菌的宏观疾病症状。

将全部叶上显示真菌菌落或强烈黄化/褐变的叶面积的百分数的平均数视为患病叶面积。平行于非转基因对照植物，总计评价50株大豆T1植物/构建体(通过RT-PCR检查表达)。使用与转基因植物平行培育的非转基因大豆植物作为对照。

F6H1基因的表达将导致玉米针对豆薯层锈菌的抗性增强。

实施例12：克隆用于稳定转化玉米的过量表达载体构建体

通过DNA合成法生成本申请中提到的F6H1(AT3G13610)、CCoAOMT1(At4g34050)和ABCG37(PDR9；AT3G53480)基因的DNA序列(Geneart，雷根斯堡，德国)。

F6H1DNA(如SEQ ID No:1中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-C载体(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于玉米遍在蛋白启动子和根癌农杆菌衍生的章鱼碱合酶终止子(t-OCS)之间。

为了获得双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用空pENTRY-A载体、空pENTRY-C和上述pENTRY-C载体中的ZmUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间玉米AHASL2启动子控制下的AHAS选择(玉蜀黍乙酰羟酸合酶(AHAS108)基因)盒。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自该载体构建体的阳性克隆测序并提交用于玉米转化。

为了获得F6H1-CCoAOMT1双基因构建体，将CCoAOMT1DNA(如SEQ ID No:3中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-B载体(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于pSuper启动子(Lee等人,2007PlantPhysiology第145卷第4期1294-1300)和根癌农杆菌衍生的胭脂碱合酶终止子(t-nos)之间。超级启动子由三个相同章鱼碱合酶增强子尾随MAS启动子组成(Lee等人,2007PlantPhysiology第145卷第4期1294-1300)。

为了获得含有F6H1和CCoAOMT1的双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用空pENTRY-A载体、上述pENTRY-B载体中的pSuper启动子::CCoAOMT1::nos-终止子和上述pENTRY-C载体中的PcUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间玉米AHASL2启动子控制下的AHAS选择(玉蜀黍乙酰羟酸合酶(AHAS108)基因)。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自每种载体构建体的阳性克隆测序并提交用于大豆转化。

为了获得F6H1-UGT71C1双基因构建体，将UGT71C1DNA(如SEQ ID No:7中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-B载体(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于pSuper启动子(Lee等人,2007PlantPhysiology第145卷第4期1294-1300)和根癌农杆菌衍生的章鱼碱合酶终止子(t-nos)之间。超级启动子由三个相同章鱼碱合酶增强子尾随MAS启动子组成(Lee等人,2007PlantPhysiology第145卷第4期1294-1300)。

为了获得含有F6H1和UGT71C1的双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用空pENTRY-A载体、上述pENTRY-B载体中的pSuper启动子::UGT71C1::nos-终止子和上述pENTRY-C载体中的ZmUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间玉米AHASL2启动子控制下的AHAS选择(玉蜀黍乙酰羟酸合酶(AHAS108)基因)盒。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自该载体构建体的阳性克隆测序并提交用于玉米转化。

为了获得F6H1-CCoAOMT1-ABCG37三基因构建体，将ABCG37DNA(如SEQ ID No:5中所示)以如此方式合成，从而PacI限制性位点位于起始ATG之前并且AscI限制性位点在终止密码子下游。将合成的DNA利用限制性酶PacI和AscI(NEB Biolabs)消化并以如此方式连接于PacI/AscI消化的Gateway pENTRY-A载体(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)，从而全长片段以有义方向位于ScBV启动子(Bouhida,Mohammed,B.E.Lockhart和Neil E.Olszewski."An analysis of the complete sequence of asugarcane bacilliform virus genome infectious to banana and rice."The Journalof general virology 74(1993):15-22.)和马铃薯组织蛋白酶D抑制蛋白(Herbers,Karin,SaloméPrat和Lothar Willmitzer."Functional analysis of a leucineaminopeptidase from Solanum tuberosum L."Planta 194.2(1994):230-240)之间。ScBV启动子在玉米中介导中等强度的组成型表达。

为了获得含有F6H1、CCoAOMT1和ABCG37的双元植物转化载体，根据制造商的方案，通过使用如上所述的pENTRY-A载体中的ScBV启动子::ABCG37::组织蛋白酶D抑制蛋白终止子、上述pENTRY-B载体中的pSuper启动子::CCoAOMT1::nos-终止子和上述pENTRY-C载体中的ZmUbi启动子::F6H1::OCS-终止子，实施三重LR反应(Gateway系统，Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,加利福尼亚州，美国)。

作为靶，使用一种双元pDEST载体，其组成如下：(1)用于细菌选择的壮观霉素/链霉素抗性盒，(2)农杆菌中的pVS1复制起点，(3)用于大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点，和(4)在右边界和左边界之间玉米AHASL2启动子控制下的AHAS选择(玉蜀黍乙酰羟酸合酶(AHAS108)基因)。将重组反应转化入大肠杆菌(DH5α)，微量制备并通过特异性限制酶切消化筛选。对来自该载体构建体的阳性克隆测序并提交用于玉米转化。

实施例13：玉米转化

将携带含有目的基因(见上文)和突变玉米AHAS基因的质粒的农杆菌细胞在补充有适宜抗生素的YP培养基中培育1-2天。采集一个接种环的农杆菌细胞并悬浮在1.8ml M-LS-002培养基(LS-inf)中。将培养物以1,200转/分钟振摇时孵育5分钟-3小时。在授粉后8-11天收获玉米穗轴。将穗轴在20％Clorox溶液中消毒5分钟，随后用70％乙醇喷洒并且随后用无菌水彻底淋洗。将大小0.8-2.0mm的不成熟胚剖取至含有农杆菌细胞的LS-inf溶液内的管中。

通过从日本烟草农杆菌介导植物转化方法改进的方案(美国专利号5,591,616；5,731,179；6,653,529；和美国专利申请公开号2009/0249514)，将构建体转化至不成熟的胚中。两种类型的质粒载体用于转化。一个类型的质粒在边界的左侧和右侧的每侧上仅具有一个T-DNA边界，并且选择标记基因和目的基因在T-DNA左边界和右边界之间。另一个类型是所谓“双T-DNA构建体”，如日本烟草美国专利号5,731,179中所述。在两种DNA构建体中，选择标记基因位于一组T-DNA边界之间并且目的基因包含在第二组T-DNA边界之间。可以使用两种质粒载体的任一种。将质粒载体电穿孔至农杆菌中。

通过颠倒该管几次实施胚的农杆菌感染。将混合物倾倒于含有共培育培养基(M-LS-011)的平板表面上的滤纸圆片上。将液态农杆菌溶液移除并且在显微镜下检查胚并使胚以盾片侧向上方式放置。将胚在暗处在22℃培养2-4天，并转移至不含选择化合物的M-MS-101培养基并且孵育四至七天。随后将胚转移至含0.75μM咪草烟的M-LS-202培养基并在27℃培育三周以选择转化的愈伤组织细胞。

通过转移抗性愈伤组织至补充有0.75μM咪草烟的M-LS-504培养基并在光照下在26℃生长二至三周，诱导植物再生。随后将再生的苗转移至含M-MS-618培养基(0.5μM咪草烟)的生根箱。将带根的小植物转移至土壤较少的盆栽混合物并在生长箱中培育一周，随后移栽到较大的盆并在温室中维持直至成熟。

转基因玉米植物的产生还例如在美国专利号5,591,616和6,653,529；美国专利申请公开号2009/0249514和WO/2006136596中描述，所述文献因而通过引用的方式完整并入。可以使用农杆菌转化法进行玉米的转化，如美国专利号5,591,616；5,731,179；美国专利申请公开号2002/0104132等中所述。玉米(Zea Mays L.)的转化也可以用Ishida等人(NatureBiotech.,1996,14:745-750)描述的方法的改良形式进行。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源(Fromm等人,Biotech,1990,8:833)，不过其他基因型也可以成功地使用。从授粉后(DAP)大约11日的玉米植物收获谷穗，此时不成熟胚的长度是约1至1.2mm。将不成熟的胚与含有“超级双元载体”的根癌农杆菌共培育，并且通过器官发生过程回收转基因植物。在WO94/00977和WO 95/06722中描述了超级双元载体系统。载体如所述那样构建。使用多种选择标记基因，包括编码突变乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利号6,025,541)。类似地，多种启动子用来调节性状基因以提供对基因转录的组成型、发育性、诱导型、组织或环境性调节。可以利用切碎的胚并可以将它们在愈伤组织诱导培养基上培育，随后在含有咪唑啉酮作为选择剂的玉米再生培养基上培育。将皮式培养皿在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移栽至温室中的土壤。从显示耐受咪唑啉酮除草剂并对转基因为PCR阳性的植物产生T1种子。

实施例14：镰刀菌和炭疽菌(Colletotrichum)抗性筛选

将表达单独或与CCoAOMT1、ABCG37或UGT71C1组合(如上文所述)的F6H1DNA的转基因玉米植物在温室或植物室中在标准生长条件下于受控环境(20-25℃，60-90％湿度)中培育。

在转基因玉米植物进入生殖阶段不久后，使用镰刀菌或禾生炭疽菌孢子的真菌悬液(PBS溶液中10⁵个孢子)，靠近茎秆基部接种这些转基因玉米植物。将植物在20-25℃和60-90％湿度孵育2-4周。

为了评定茎腐病，将茎秆劈开并通过观察真菌沿茎秆向上生长时的特征性褐色至黑色，评定疾病进展情况。通过赋予目视评分实施疾病定级。每个实验评定超过10株转基因植物(和作为对照的野生型植物)的患病叶面积。为了分析，将非转基因母体植物的患病叶面积的平均数设定成100％以计算转基因系的相对患病叶面积。

F6H1基因的表达将导致玉米针对镰刀菌属物种和禾生炭疽菌的抗性增强。

实施例15：评价莨菪亭积累的影响和大豆锈菌病易感性

评价叶中莨菪亭积累对抗性的影响。为了实现莨菪亭在叶中积累，生成F6H1过量表达构建体。F6H1过量表达构建体(图2c)携带在组成型和普遍表达的启动子控制下的F6H1酶编码性序列(SEQ-ID-No.1)(如实施例7中所述)。将该构建体如实施例8中所述那样(方法C)转化入大豆，并且如实施例9中所述那样，将所得的T1大豆种子播种并栽培3周。

选择5个最佳发挥作用的独立事件供进一步分析。由于性状功效取决于T-DNA插入位点变动，这5个独立事件的平均数视为评估F6H1过量表达的总体影响的良好指标。

总计，每个事件栽培5株转基因植物。另外，平行培育11株非转基因野生型大豆植物作为对照。通过qPCR证实构建体的存在，并通过荧光的存在证实莨菪亭积累(图16)。使用365nm波长UV，使用B-100AP UV灯(UVP LLC,Upland,加拿大)激发荧光。荧光的出现仅是定性指标(非定量)。

将三周龄植物(V1阶段)如实施例9中所述那样用豆薯层锈菌孢子接种。

感染后14天通过目视评定患病叶面积，评定大豆锈菌病进展。患病叶面积定义为其上显示真菌菌落或强烈黄化/褐变的叶面积。以百分数计的相对患病面积定义为患病叶面积除以总叶面积(示意图参见图11)。

与评价非转化野生型对照平行，评价积累莨菪亭的植物。图17中显示用导致莨菪亭积累的F6H1过量表达构建体(图2c)转化的大豆植物的平均患病叶面积。

F6H1的表达(构建体1，图2c)导致34.9％的相对患病叶面积。相比之下，野生型显示43.9％的相对患病叶面积。因此，F6H1的表达(构建体1，图2c)在5个独立事件范围内平均导致显著(p<0.05，t检验，*图17)的大豆锈菌抗性相对增加20.6％。

该数据清楚显示，植物内莨菪亭积累导致与非转基因野生型对照相比，转基因植物的疾病较轻。因此，F6H1在大豆中的表达显著地(<0.05)增加大豆对大豆锈菌的抗性。

Claims

1.一种用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法，其中所述方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中莨菪亭和/或其衍生物的产生和/或积累。

2.根据权利要求1所述的方法，其中莨菪亭的衍生物是莨菪苷。

3.用于增加植物、植物部分或植物细胞中真菌抗性的方法或根据权利要求1或2所述的方法，其中方法包括步骤：与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中F6H1蛋白的表达和/或生物学活性，其中所述F6H1蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:1、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:2或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；

(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸的互补序列杂交的外源核酸；或

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的F6H1蛋白相同的F6H1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸，

4.根据权利要求3所述的方法，其中方法还包括与野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加植物、植物部分或植物细胞中选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的至少一种或更多种额外蛋白质的表达和/或生物学活性，

(a)其中所述CCoAOMT1蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:3、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:4或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；

(iv)外源核酸，编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的CCoAOMT1蛋白相同的CCoAOMT1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同，

(b)其中所述ABCG37蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:5、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:6或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的ABCG37蛋白相同的ABCG37蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的外源核酸，

并且

(c)其中所述UGT71C1蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:7、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:8或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的外源核酸；

5.根据权利要求4所述的方法，包括步骤：

(a)用包含外源核酸的表达盒稳定转化植物细胞，所述外源核酸编码F6H1蛋白并任选地编码选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种额外的蛋白质，

(b)从植物细胞再生出植物；并且

(c)表达所述外源核酸。

其中编码F6H1蛋白的外源核酸和编码选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种额外的蛋白质的外源核酸位于相同的表达盒或不同的表达盒上。

6.重组载体构建体，包含选自以下的一种或多种核酸：

(a)编码F6H1蛋白的核酸，其中所述F6H1蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:1、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:2或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的F6H1蛋白相同的F6H1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，

与启动子和转录终止序列有效连接，

(b)编码CCoAOMT1蛋白的核酸，其中所述CCoAOMT1蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:3、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:4或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的CCoAOMT1蛋白相同的CCoAOMT1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，

与启动子和转录终止序列有效连接，

(c)编码ABCG37蛋白的核酸，其中所述ABCG37蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:5、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:6或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的ABCG37蛋白相同的ABCG37蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(IN)的核酸不同的核酸；

与启动子和转录终止序列有效连接；和

(d)编码UGT71C1蛋白的核酸，其中所述UGT71C1蛋白由以下核酸编码

(i)与SEQ ID NO:7、或其功能性片段、或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO:8或其功能性片段具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质的核酸；

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的UGT71C1蛋白相同的UGT71C1蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，

与启动子和转录终止序列有效连接。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其中启动子是组成型、病原体诱导型启动子、叶肉特异性启动子或表皮特异性启动子。

8.转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，用根据权利要求6或7所述的一种或多种重组载体构建体转化，其中编码F6H1蛋白、CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和/或UGT71C1蛋白的核酸位于相同的重组载体构建体或不同的载体构建体上。

9.转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，过量表达任选地与选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种额外蛋白质组合的外源F6H1蛋白，

(a)其中所述F6H1蛋白由以下核酸编码

与启动子和转录终止序列有效连接，

(b)其中所述CCoAOMT1蛋白由以下核酸编码

与启动子和转录终止序列有效连接，

(c)其中所述ABCG37蛋白由以下核酸编码

(iv)编码与上文(i)至(iii)的核酸所编码的ABCG37蛋白相同的ABCG37蛋白，但因遗传密码简并性而与上文(i)至(iii)的核酸不同的核酸，

与启动子和转录终止序列有效连接，

并且

(d)其中所述UGT71C1蛋白由以下核酸编码

与启动子和转录终止序列有效连接。

10.用于产生具有增加的真菌抗性的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，包括

(i)向植物、植物部分或植物细胞引入编码F6H1蛋白的外源核酸，所述外源核酸任选地与编码选自CCoAOMT1蛋白、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的一种或多种外源蛋白质的一种或多种外源核酸组合，

(ii)从植物、植物部分或植物细胞产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞；并且

(iii)表达由重组载体构建体编码的蛋白质，其中编码F6H1蛋白、CCoAMTI蛋白、ABCG37蛋白和/或UGT71C1蛋白的外源核酸位于相同或不同的载体构建体上，

(a)其中所述F6H1蛋白由以下核酸编码

与启动子和转录终止序列有效连接，

(b)其中所述CCoAOMT1蛋白由以下核酸编码

(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸；或

与启动子和转录终止序列有效连接，

(c)其中所述ABCG37蛋白由以下核酸编码

并且

(d)其中所述UGT71C1蛋白由以下核酸编码

11.根据权利要求10所述的方法，还包括步骤：收获转基因植物的种子并种植种子以及将种子培育成植物，其中培育的植物包含编码F6H1蛋白的外源核酸，并且任选地还包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸选自如权利要求10中限定的编码F6H1蛋白、CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的外源核酸。

12.根据权利要求6或7所述的任何重组载体构建体的用途，用于转化植物、植物部分或植物细胞以提供抗真菌植物、植物部分或植物细胞。

13.权利要求8或权利要求9中所述的转基因植物的可收获部分，其中转基因植物的可收获部分包含编码F6H1蛋白的外源核酸和/或F6H1蛋白，并且任选地还包含一种或多种额外的外源核酸和/或由所述额外外源核酸编码的额外的外源蛋白质本身，其中所述额外的外源核酸和/或额外的外源蛋白质选自编码F6H1蛋白、CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的外源核酸和/或所述额外的外源蛋白质选自如权利要求10中限定的F6H1蛋白、CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白，

其中可收获部分优选地是转基因植物的转基因种子。

14.产物，衍生自权利要求8或权利要求9中所述的植物、衍生自通过权利要求10或11的方法可产生的植物或衍生自权利要求13的植物的可收获部分，其中产物包含如权利要求10中限定的编码F6H1蛋白的外源核酸和/或F6H1蛋白，和任选地还包含一种或多种外源核酸和/或由所述外源核酸编码的外源蛋白质，其中所述外源核酸选自编码F6H1蛋白，CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的外源核酸和/或所述额外的外源蛋白质选自如权利要求10中限定的F6H1蛋白、CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白，

其中产物优选地是大豆油。

15.用于产生产物的方法，包括

a)培育权利要求8或9或通过权利要求10或11的方法可获得的植物，并且

b)从或借助植物和/或植物的部分、优选地其种子产生所述产物，

其中产物包含如权利要求10中限定的编码F6H1蛋白的外源核酸和/或F6H1蛋白，并且任选地还包含一种或多种外源核酸和/或由所述外源核酸编码的外源蛋白质，其中所述外源核酸选自编码F6H1蛋白，CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白的外源核酸和/或所述额外的外源蛋白质选自如权利要求10中限定的F6H1蛋白、CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白。

16.根据权利要求15所述的方法，包括

a)培育权利要求8或9或通过权利要求10或11的方法可获得的植物，并且从植物取出如权利要求13中限定的可收获部分；并且

b)从或借助植物的可收获部分产生所述产物。

17.根据权利要求1至5、10、11、15、16、21中任一项所述的方法或根据权利要求12所述的用途，其中真菌抗性是针对锈真菌、霜霉病、白粉病、叶斑病、晚疫病、镰刀菌和/或壳针孢的抗性。

18.根据权利要求17所述的方法、用途、可收获部分或产物，其中真菌抗性是针对大豆锈菌和/或镰刀菌的抗性。

19.根据权利要求18所述的方法或用途，其中真菌抗性针对山马蝗层锈菌(Phakopsorameibomiae)、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和/或轮枝镰刀菌(Fusarium verticolloides)。

20.根据权利要求1至5、10、11、15、16、21、22、23所述的方法或根据权利要求8或9所述的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞、或根据权利要求12所述的用途、根据权利要求13所述的可收获部分或根据权利要求14所述的产物，其中植物选自菜豆、大豆、豌豆、三叶草、葛、紫花苜蓿、兵豆、羽扇豆、野豌豆、落花生、稻、小麦、大麦、拟南芥、兵豆、香蕉、卡诺拉油菜、棉花、马铃薯、玉米、甘蔗、苜蓿和糖用甜菜，优选地其中植物是大豆或玉米。

21.用于繁育抗真菌植物的方法，包括

(i)将权利要求8或9的植物或通过权利要求10或11的方法可获得的植物与第二植物杂交；

(ii)从步骤(a)的杂交获得种子；

(iii)种植所述种子并将种子培育成植物；并且

(iv)从所述植物中选择表达F6H1蛋白和任选地表达一种或多种额外的蛋白质的植物，所述额外的蛋白质选自如权利要求10中限定的CCoAMTI、ABCG37蛋白和UGT71C1蛋白。

22.向植物、植物部分或植物细胞的表面施加莨菪亭和/或其衍生物的方法，其中与未向其表面施加莨菪亭和/或衍生物的植物相比，通过向植物、植物部分或植物细胞的表面施加莨菪亭和/或其衍生物，增加植物、植物部分或植物细胞对真菌性病原体的抗性，其中植物是大豆和/或玉米。

23.用莨菪亭和/或其衍生物包覆的植物表面或植物部分表面，其中植物是大豆和/或玉米。

24.具有莨菪亭和/或其衍生物包覆的表面的植物、植物部分或植物细胞，其中植物是大豆和/或玉米。