CN107177679A

CN107177679A - 一种检测食管鳞癌相关基因tfpi2和hspb2启动子甲基化程度的试剂盒

Info

Publication number: CN107177679A
Application number: CN201710422533.2A
Authority: CN
Inventors: 顾春雨; 程志斌; 郭辉
Original assignee: Beijing Promise Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Promise Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2017-06-07
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明涉及一种检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，包括TFPI2和HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物、反向引物及其非甲基化特异性扩增正向引物和反向引物、内参基因ACTB扩增正向引物和反向引物；TFPI2基因启动子CpG位点为TFPI2基因起始密码子(ATG)上游300bp序列内所包含的至少一个CpG位点；HSPB2基因启动子CpG位点为HSPB2基因起始密码子(ATG)上游300bp序列内所包含的至少一个CpG位点；内参基因ACTB扩增引物不包含ACTB基因序列内任何CpG位点；本发明采用两个基因联合检测的方法，大大增加了检测的准确度和特异性，在食管鳞癌的临床辅助诊断中具有广阔的应用前景。

Description

一种检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测食管鳞癌相关基因 TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒。

背景技术

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是常见恶性肿瘤之一，其发病率在全球和中国分别排名第八和第四，全球每年有超过48万新发病例，造成约40万人死亡，其中一半发生在中国。目前食管癌治疗方法十分有限，5年生存率为15-25％(Chen,Zheng et al.2016)。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是亚洲最主要的食管癌类型(约90％)，全球约70％的ESCC病例发生在中国。ESCC 的发病机理目前尚不明确，吸烟、饮酒、饮食习惯和家族病史等被认为是最重要的影响因素，研究数据表明这些影响因素有明显的地域性差异，其中饮食习惯和家族病史对中国人的影响更大(Chen,Zheng et al.2016)。

目前对食管鳞癌的诊断仍局限在晚期阶段，且缺乏有效的早期诊断手段。近年来，随着分子诊断技术的进步，尤其是分子诊断技术在液体活检方面的广泛应用，大肠癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症的早期筛查技术取得了重大进展。现有分子检测对象多集中于基因突变，即基因序列或拷贝数变异，然而这类突变通常发生在较大的序列范围内，给检测工作带来诸多困难(Warton and Samimi 2015)。相比之下，以基因启动子异常甲基化作为肿瘤标志物具有独特优势，这类甲基化限定在启动子CpG岛中，检测范围较小，并且具有肿瘤特异性，能够在发病早期就被检测到，因此具有巨大的开发价值。目前，基于检测SEPT9启动子甲基化程度的商业化大肠癌检测试剂盒已获美国 FDA批准应用于临床，但食管鳞癌相关基因甲基化检测领域尚无相应产品问世。

目前，已有多个研究机构发表食管鳞癌甲基化检测靶标基因的相关报道，这些靶标基因包括TFPI2(tissue factor pathway inhibitor) 和HSPB2(heat shock proteinB2)。TFPI2在多种肿瘤中表达下调，是一个潜在的抑癌基因，研究表明TFPI2启动子的特定CpG位点在早期食管鳞癌中的甲基化频率为67％，并且与肿瘤进展正相关(Jia, Yang etal.2012)。HSPB2是热激蛋白家族成员，它在早期食管鳞癌中的甲基化频率为95.7％(Chang,Yamashita et al.2011)。这些都为食管鳞癌辅助检测提供了理论基础，但目前国内外尚无TFPI2和HSPB2 启动子甲基化检测试剂盒及其在食管鳞癌辅助检测方面的报道。

发明内容

本发明旨在填补食管鳞癌相关基因甲基化检测试剂盒的空白，提供一种灵敏度高、特异性好、准确率高和操作简单的可用于检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的检测试剂盒，这两种基因启动子特定CpG位点的甲基化频率与食管鳞癌的患病率呈正相关，可以通过此检测辅助诊断食管鳞癌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种可用于检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，包括TFPI2和HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物、反向引物及其非甲基化特异性扩增正向引物和反向引物，其中所述的TFPI2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CGGTCGGACGTTCGTTTCGTATAAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-GAACGACCCGCTAAACAAAACGT-3’(SEQ ID NO.2)；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

5’-TTGGTTGGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3’(SEQ ID NO.3)；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-AAACAACCCACTAAACAAAACATC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CGTGTAAATCGTTTGTGAGGGTTTTAGC-3’(SEQ ID NO.5)；

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CGAAAATATAACCAACGCCGCCC-3’(SEQ ID NO.6)；

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-TGTGTAAATTGTTTGTGAGGGTTTTAGTG-3’(SEQ ID NO.7)；

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CAAAAATATAACCAACACCACCCAAACCC-3’(SEQ ID NO.8)；

所述TFPI2基因启动子CpG位点为TFPI2基因起始密码子 (ATG)上游300bp序列内所包含的至少一个CpG位点；所述HSPB2 基因启动子CpG位点为HSPB2基因起始密码子(ATG)上游300bp 序列内所包含的至少一个CpG位点；所述ACTB基因扩增引物不包含ACTB基因序列内任何CpG位点。

所述试剂盒还包括内参基因ATCB(β-Actin)扩增正向引物和反向引物，其中所述的ATCB基因扩增正向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-GTGTTTAAGATAGTGTTGTGGGTG-3’(SEQ ID NO.9)；

所述的ATCB基因扩增反向引物的核苷酸序列如下所示：

5’-CCTACTATACACCTACTTAATACACACTCC-3’(SEQ ID NO.10)。

所述引物的纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级。

所述试剂盒中还包括阴性质控品、阳性质控品和无模板对照；

优选地，所述无模板对照是指不含人类基因组DNA的反应体系，更加优选地，无模板对照是用无菌水代替模板DNA。

优选地，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组 DNA。

所述试剂盒中，荧光PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～ 10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.05～20ng/μl模板DNA、0.01～ 0.10Μ/μl Taq DNA聚合酶、1～5mM氯化镁、1～2×SYBR Green 核酸染料、0.1～1μM引物。

优选地，所述荧光PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～2×PCR 缓冲液、0.4～0.8mM dNTPs、0.2～0.5μM引物、0.1～10ng/μl模板 DNA、0.05～0.10Μ/μl Taq DNA聚合酶、2～3mM氯化镁、1～ 1.5×SYBR Green核酸染料。

所述荧光PCR扩增反应体系中包含Tris·Cl、氯化钠、氯化钾和硫酸镁。

所述试剂盒中，荧光PCR扩增条件为：预变性：94～95℃30～ 60秒；循环：变性94～95℃5～10秒，退火50～65℃10～30秒，延伸68～72℃15～60秒(采集荧光)，共35～50个循环；熔解曲线： 94～95℃5～10秒，65℃60～90秒，以0.1～0.5℃/秒速度升温至 94～95℃(持续采集荧光)。

本发明通过TFPI2、HSPB2基因与内参基因ATCB的PCR扩增结果来判定检测结果，提高了检测结果的敏感性和可靠性。由荧光 PCR扩增曲线可得到PCR扩增的Cq值，由熔解曲线可得到PCR产物的Tm值。TFPI2、HSPB2基因和内参基因PCR扩增结果指其Cq 值，即TFPI2、HSPB2基因与内参基因ATCB的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。通过Cq值，再结合熔解曲线可以判断有无特异性扩增，从而得知样品中TFPI2、HSPB2启动子甲基化的程度。

与以往技术相比，本发明的有益结果有：首先，本发明首次公开了一种检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子CpG位点的甲基化程度的试剂盒，为食管鳞癌辅助检测提供了一项新的手段。其次，本发明专门针对TFPI2和HSPB2基因中的中国患者特有CpG位点设计引物，并通过实验证实了这些CpG位点与食管鳞癌密切相关。再次，本发明采用两个基因联合检测的方法，大大增加了检测的准确度和特异性，在食管鳞癌的临床辅助诊断中具有广阔的应用前景。

本发明的技术关键点和预保护点在于食管鳞癌相关基因TFPI2 和HSPB2在中国本土食管鳞癌患者中特有的启动子CpG位点信息，以及TFPI2和HSPB2甲基化和非甲基化特异性扩增引物序列。

具体实施方式

下面结合实施例1对本发明作进一步详细描述。

实施例1

材料：待检肿瘤组织和癌旁组织样本、阳性质控品、阴性质控品。所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。人食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化检测试剂盒，其中包括：TFPI2和HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性引物； TFPI2和HSPB2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性引物；内参基因ACTB的引物。

所述TFPI2基因启动子CpG位点为TFPI2基因起始密码子 (ATG)上游300bp序列内所包含的至少一个CpG位点；所述HSPB2 基因启动子CpG位点为HSPB2基因起始密码子(ATG)上游300bp 序列内所包含的至少一个CpG位点；所述ACTB基因扩增引物不包含ACTB基因序列内任何CpG位点。所述TFPI2基因启动子CpG 位点的甲基化特异性引物(其终浓度为：0.1～1μM)包括：

正向引物：5’-CGGTCGGACGTTCGTTTCGTATAAAGC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物：5’-GAACGACCCGCTAAACAAAACGT-3’(SEQ ID NO.2)；

所述TFPI2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性引物(其终浓度为：0.1～1μM)包括：

正向引物：5’-TTGGTTGGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3’ (SEQ ID NO.3)；

反向引物：5’-AAACAACCCACTAAACAAAACATC-3’(SEQ ID NO.4)；

所述HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性引物(其终浓度为：0.1～1μM)包括：

正向引物：5’-CGTGTAAATCGTTTGTGAGGGTTTTAGC-3’ (SEQ ID NO.5)；

反向引物：5’-CGAAAATATAACCAACGCCGCCC-3’(SEQ ID NO.6)；

所述HSPB2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性引物(其终浓度为：0.1～1μM)包括：

正向引物：5’-TGTGTAAATTGTTTGTGAGGGTTTTAGTG-3’ (SEQ ID NO.7)；

反向引物：5’-CAAAAATATAACCAACACCACCCAAACCC-3’ (SEQ ID NO.8)；

所述ACTB内参基因扩增引物(其终浓度为：0.1～1μM)包括：

正向引物：5’-GTGTTTAAGATAGTGTTGTGGGTG-3’(SEQ ID NO.9)；

反向引物：5’-CCTACTATACACCTACTTAATACACACTCC-3’ (SEQ ID NO.10)。

所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或 HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰 PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为100pmol/L备用。

仪器：罗氏Lightcycler 96、赛默飞Nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。

试剂：血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(本实施例中采用天根公司产品)、DNA聚合酶(赛默飞公司)、10×PCR Buffer(赛默飞公司)、MgCl₂(赛默飞公司)、dNTP(赛默飞公司)、纯化水。

1.肿瘤组织和癌旁组织基因组DNA的提取

采用北京天根生物科技有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体步骤如下：

(1)组织应先打碎处理为细胞悬液，然后10,000rpm(～11,200×g) 离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。可加入4μL RNaseA(100mg/ml)溶液，振荡15sec，室温放置5min。

(2)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。每小时颠倒混合样品2-3次，用水浴振荡器也可。

(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(4)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤7。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm (～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。要求分离纯化出的 DNA浓度至少在10ng/μL以上，A260/A280比值在1.80以上。DNA 产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

2.亚硫酸氢盐(Bisulfite)修饰DNA

采用Qiagen公司Fast Bisulfite Conversion Kit (Cat.59824)，具体步骤如下：

(1)确保亚硫酸氢盐溶液(Bisulfite Solution)完全溶解。

(2)按照下面表格加入反应各组分：

	高浓度(1ng-2μg)	低浓度(1-500ng)
			DNA	最多20μL	最多40μL
超纯水
			亚硫酸氢盐溶液	85μL	85μL
DNA保护液	35μL	15μL
			总体积	140μL	140μL

(3)剧烈混匀，置于室温。

(4)反应条件为：95℃5min；60℃1～20min，2个循环。

(5)反应完成后短暂离心，将反应物全部转移至1.5mL离心管中。

(6)加入310μL Buffer BL，震荡混匀，短暂离心。

(7)加入250μL无水乙醇，振荡15sec混匀，短暂离心。

(8)自4℃冰箱中取出MinElute DNA Spin Column，将上步反应液全部加入柱子中。

(9)最大转速离心1min，弃滤液。

(10)加入500μL Buffer BW，最大转速离心1min，弃滤液。

(11)加入500μL Buffer BD室温孵育15min。

(12)最大转速离心1min，弃滤液。

(13)加入500μL Buffer BW，最大转速离心1min，弃滤液。

(14)重复上步1次。

(15)加入500μL无水乙醇，最大转速离心1min，弃滤液。

(16)将柱子放入2ml收集管中，最大转速离心1min除尽残夜。

(17)将柱子放入新的1.5ml离心管中，加入15μL Buffer EB，轻盖盖子。

(18)室温孵育1min。

(19)最大转速离心1min，收集DNA，-20℃保存。

3.PCR反应的体系和反应条件

所述荧光PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1μM引物、0.05～20ng/μL模板DNA、0.01～0.10Μ/μL Taq DNA聚合酶、1～2×SYBR Green核酸染料、1～ 5mM氯化镁。

优选地，所述荧光PCR扩增体系的终浓度组成为：1～2×PCR缓冲液、0.4～0.8mMdNTPs、0.2～0.5μM引物、0.1～10ng/μL模板 DNA、0.05～0.10Μ/μL Taq DNA聚合酶、1～1.5×SYBR Green核酸染料、2～3mM氯化镁。

所述检测基因为TFPI2和HSPB2基因，所述内参基因为ACTB (β-actin)。

所述dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP和 10mM dGTP。

所述荧光PCR扩增反应体系中包含Tris·Cl、氯化钠、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。

所述荧光PCR扩增反应的具体过程为：94～95℃预变性30～ 60sec；扩增阶段，94～95℃变性5～10s，50～65℃退火10～30s， 68～72℃延伸15～60sec(采集荧光)，进行35～50个循环；熔解曲线：94～95℃5～10秒，65℃60～90秒，以0.1～0.5℃/秒速度升温至 94～95℃(持续采集荧光)。

4.PCR反应的加样布局

待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行 2个复孔检测，PCR仪96孔板加样布局见下表1。表中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control)， NTC代表无模板对照(No template control)，S代表检测样本(Sample)。

表1

5.实验结束以后，按以下步骤进行检测结果的分析、判定

无模板对照(NTC)的扩增曲线分析，TFPI2、HSPB2和内参基因 ACTB应无扩增曲线明显扩增信号，说明实验无污染，可以继续分析。

质控品的内参基因ACTB应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，质控品内参基因ACTB的Cq值应符合表2中质控品的参数范围；阴性质控品的TFPI2、HSPB2应无明显扩增曲线变化，阳性质控品TFPI2、HSPB2的Cq值应符合表2中质控品的参数范围。质控品检测满足以上条件时，证明实验有效，可继续分析。

表2

质控品	TFPI2或HSPB2的Cq值	ACTB的Cq值
			阳性质控品	Cq值≤40	Cq值≤32
阴性质控品	无扩增信号	Cq值≤32

样本的内参基因ACTB应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，样本PCR检测结果应按照表3标准进行判读。

表3

若不符合表3中的第1、2项要求，则建议重新进行PCR检测。若不符合表3中第3项要求，则建议重新提取组织DNA。

在以上实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如按照分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件或制造厂商所建议的条件进行操作。

参考文献

1.Chang,X.,et al.(2011)."Promoter methylation of heat shock proteinB2in human esophageal squamous cell carcinoma."Int J Oncol 38(4):1129-1135.

2.Chen,W.,et al.(2016)."Cancer statistics in China,2015."CA Cancer J Clin 66(2): 115-132.

3.Jia,Y.,et al.(2012)."Methylation of TFPI-2 is an early event ofesophageal carcinogenesis."Epigenomics 4(2):135-146.

4.Warton,K.and G.Samimi(2015)."Methylation of cell-free circuLatingDNA in the diagnosis of cancer."Front Mol Biosci 2:13.

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

<110> 北京呈诺医学科技有限公司

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<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

5’-CGGTCGGACGTTCGTTTCGTATAAAGC-3’

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

5’-GAACGACCCGCTAAACAAAACGT-3’

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

5’-TTGGTTGGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3’

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

5’-AAACAACCCACTAAACAAAACATC-3’

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

5’-CGTGTAAATCGTTTGTGAGGGTTTTAGC-3’

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

5’-CGAAAATATAACCAACGCCGCCC-3’

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

5’-TGTGTAAATTGTTTGTGAGGGTTTTAGTG-3’

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

5’-CAAAAATATAACCAACACCACCCAAACCC-3’

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

5’-GTGTTTAAGATAGTGTTGTGGGTG-3’

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

5’-CCTACTATACACCTACTTAATACACACTCC-3’

Claims

1.一种检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：包括TFPI2和HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物、反向引物及其非甲基化特异性扩增正向引物和反向引物、内参基因ACTB扩增正向引物和反向引物；

所述TFPI2基因启动子CpG位点为TFPI2基因起始密码子ATG上游300bp序列内所包含的至少一个CpG位点；所述HSPB2基因启动子CpG位点为HSPB2基因起始密码子ATG上游300bp序列内所包含的至少一个CpG位点；所述内参基因ACTB扩增引物不包含ACTB基因序列内任何CpG位点；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示：

5’-CGGTCGGACGTTCGTTTCGTATAAAGC-3’；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示：

5’-GAACGACCCGCTAAACAAAACGT-3’；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.3所示：

5’-TTGGTTGGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3’；

所述的TFPI2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示：

5’-AAACAACCCACTAAACAAAACATC-3’；

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.5所示：

5’-CGTGTAAATCGTTTGTGAGGGTTTTAGC-3’；

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.6所示：

5’-CGAAAATATAACCAACGCCGCCC-3’；

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增正向引物的核苷酸序列如SEQID NO.7所示：

5’-TGTGTAAATTGTTTGTGAGGGTTTTAGTG-3’；

所述的HSPB2基因启动子CpG位点的非甲基化特异性扩增反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.8所示：

5’-CAAAAATATAACCAACACCACCCAAACCC-3’；

所述的ATCB基因扩增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：

5’-GTGTTTAAGATAGTGTTGTGGGTG-3’；

所述的ATCB基因扩增反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：

5’-CCTACTATACACCTACTTAATACACACTCC-3’。

2.如权利要求1所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阴性质控品、阳性质控品和无模板对照。

3.如权利要求2所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA，所述无模板对照是指不含人类基因组DNA的反应体系。

4.如权利要求3所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述无模板对照是用无菌水代替模板DNA的反应体系。

5.如权利要求1所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述引物的纯度达到PAGE级或HPLC级。

6.如权利要求1所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，荧光PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.05～20ng/μl模板DNA、0.01～0.10Μ/μl Taq DNA聚合酶、1～5mM氯化镁、1～2×SYBR Green核酸染料、0.1～1μM引物。

7.如权利要求6所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述荧光PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～2×PCR缓冲液、0.4～0.8mM dNTPs、0.2～0.5μM引物、0.1～10ng/μl模板DNA、0.05～0.10Μ/μl Taq DNA聚合酶、2～3mM氯化镁、1～1.5×SYBR Green核酸染料。

8.如权利要求6所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述荧光PCR扩增反应体系中还包括Tris·Cl、氯化钠、氯化钾和硫酸镁。

9.如权利要求1所述的检测食管鳞癌相关基因TFPI2和HSPB2启动子甲基化程度的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，荧光PCR扩增条件为：预变性：94～95℃30～60秒；循环：变性94～95℃5～10秒，退火50～65℃10～30秒，延伸68～72℃15～60秒，共35～50个循环；熔解曲线：94～95℃5～10秒，65℃60～90秒，以0.1～0.5℃/秒速度升温至94～95℃。