CN105112529A - 人ndrg4/tfpi2基因甲基化检测标志物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物以及试剂盒，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物包括ACTB、NDRG4和TFPI2三种基因的捕获引物、甲基化引物和探针。本发明能够用于结直肠癌的检测、辅助诊断以及复发的预测、疗效评价等方面，具有灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。

Description

人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物及试剂盒。

背景技术

结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是临床上常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，结直肠癌的发病率和病死率均在不断上升，在全世界排名第二。临床诊治实践表明，早期的结直肠癌无明显的临床症状，但是手术治疗可使早期结直肠癌得到根治，对于I、II期的结直肠癌患者，外科手术的5年生存率分别达到90％和75％，而对于晚期患者则不足10％。且晚期结直肠癌经化放疗联合分子靶向治疗后平均生存时间仍不足30个月。因此通过对结直肠癌的早期筛查和诊断对提高肿瘤治愈率、降低肿瘤转移率和复发率具有十分重要的意义。

结肠镜是发现早期结直肠癌的重要方式，然而它是一种侵入性检查，要求完全彻底的肠道准备，进行大规模筛查难度较大。而纤维结直肠镜对于直径小于5mm的病变漏诊率高达到27％。大便潜血试验是一种非侵入手段，但是敏感性较差，在15-80％左右，特异性也较低。

众多研究表明，DNA甲基化发生在结直肠癌形成的早期甚至起始阶段，并且DNA甲基化状态改变与结直肠癌的发生发展关系密切，贯穿整个肿瘤发生发展过程。以单个基因甲基化为粪便DNA筛查标记，检测大肠癌敏感性达38％-94％，检测大肠腺瘤的敏感性达31％-70％，特异性达79％-100％。而且甲基化标记还具有稳定性强和容易检测的特性。同时，大量研究表明，粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DNA；又由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，使得从粪便中提取的DNA质量较好，因此粪便样本DNA甲基化检测作为一种检测性能较好、高特异性和非侵入性手段，能根据其阳性结果对疑似病例进行进一步检测，可作为筛查诊断结直肠肿瘤的一种重要的辅助手段，具有很重要的筛查早期结直肠癌的临床价值。

目前已有大量文献报道了一系列在结直肠癌中甲基化程度异常的基因，如NDRG4、TFPI2、SEPT9、BMP3和VIM等等。N-Myc下游调控基因4(N-mycdownstream-regulatedgene4，NDRG4，又名SMAP-8或者BDM1)位于染色体16q21-q22.3，有17个外显子，是一种抑癌基因。近年来研究认为NDRG4基因存在于结直肠癌肿瘤组织和体液中，且可能具有稳定性高、可重生的特点，这为提高结直肠癌的早期筛查和诊断提供了一个全新的视角。Veerle和他的同事发现NDRG4启动子的甲基化可作为生物标志物，用于粪便样品检测直肠癌，敏感性为61％，特异度为93％。赵慧霞等从84例结直肠癌手术切除癌组织、癌旁组织及其术前粪便、尿和血中提取DNA，应用巢式甲基化特异性PCR检测NDRG4基因甲基化水平。

组织因子途径抑制因子基因(tissuefactorpathwayinhibitor2，TFPI2)定位于7q22区域，包含5个外显子，是Kunitz型丝氨酸蛋白质抑制物，对细胞外基质的降解和重塑起到重要的作用。TFPI2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿瘤，TFPI2的表达水平也会随之显著下降。有研究证实，与肿瘤产生相关的TFPI2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关。已经有相关研究报道TFPI2可作为结直肠癌粪便DNA筛查的标志物之一。

在现阶段，采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DNA和检测微小RNA的浓度对结直肠癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但在应用于结直肠癌的早期诊断方面还很不成熟，诊断准确率、特异性、有效性不高等缺点尚有待解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单快速、无创伤的结直肠癌检测标志物以及试剂盒，具有定量、灵敏度高、特异性强、检测成本低、取材方便、样本易存放和无创伤性等优点。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物包括ACTB、NDRG4和TFPI2三种基因的捕获引物、甲基化引物和探针；

其中，三种基因的捕获引物分别是：

捕获探针	序列(5’-3’)
		ACTB	/5AmMC6/ACCCAGCACACAGTGGCAGACACAGGTTCACAGT
NDRG4	/5AmMC6/TCCCTCGCGCGTGGCTTCCGCCTTCTGCGCGGCTGGGGTGCC
		TFPI2	/5AmMC6/CCTGGAGCAGAAAGCCGCGC

三种基因的甲基化引物和探针分别是：

引物探针	序列(5’-3’)
		ACTB(F)	GTGATGGAGGAGGTTTAGTAA

ACTB(R)	AACCACAACCTAATAAAAAAAA
		ACTB(PRO)	VIC-ACACACAATAACA-MGB
NDRG4(F)	CAGGGTGTTTTTTAGGTTTC
		NDRG4(R)	ACTTCCGCCTTCTACGCG
NDRG4(PRO)	FAM-TCGCGGTTTTCG-MGB
		TFPI2(F)	GTTGGGTAAGGCGTTCGC
TFPI2(R)	CTCTCGCCCCGCATAAAACG
		TFPI2(PRO)	FAM-GTGCGCGGTCC-MGB

。

本发明还提供一种人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒包括：

捕获试剂：NDRG4捕获液、TFPI2捕获液、ACTB捕获液、细胞裂解液、清洗缓冲液、捕获洗脱液；

硫化纯化试剂：硫化剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化漂洗液I、纯化漂洗液II、纯化漂洗液III、纯化洗脱液；

定量化检测试剂：NDRG4PCRMix、TFPI2PCRMix、ACTBPCRMix、标准品、阴性质控品、阳性质控品、聚合酶。

所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒用于检测时的PCR程序如下：首先95℃变性5分钟，然后95℃变性20秒、60℃退火40秒，并进行50次循环，PCR循环过程中，仪器升降温速度设定为1.3℃/S，最后40℃维持30秒。

所述PCR结果在480II上进行NDRG4/TFPI2/ACTB的CP值分析，用不同浓度梯度的标准品溶液制作标准曲线，从标准曲线上得到相对应的拷贝数的对数值，运用逻辑回归方程P＝0.795×logNDRG4+0.218×logTFPI2-0.216×logACTB+2.601，value＝exp(P)/(1+exp(P))，计算出得分。

所述PCR结果的分析具体如下：

1)PCR结果在480II上进行NDRG4/TFPI2/ACTB的CP值分析，以扩增过程前3-15个循环荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为Ct值；检测结果扩增曲线应为“S”型；

2)以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值作纵坐标，制备“Ct-Log拷贝数”标准曲线；

3)根据样本的Ct值可从标准曲线上得到相应的Log拷贝数，再根据逻辑回归方程：

P＝0.795×logNDRG4+0.218×logTFPI2-0.216×logACTB+2.601，value＝exp(P)/(1+exp(P))，计算出得分；

4)将得分与cut-off值进行比较：

A、计算阳性质控品的SCORE值(P值)，其结果大于0.6134，计算阴性质控品的SCORE值，其结果小于0.6134，可以继续分析；

B、计算样本的SCORE值，若结果小于等于0.6134，患肠癌风险性较低；SCORE大于0.6134，患肠癌或者肠癌早期病变风险性较高，建议镜检确认。

本发明采用特定检测标志物结合荧光PCR方法定量测定人粪便样本中NDRG4和TFPI2基因甲基化程度。在人粪便样本液中加入一定量的裂解液，再加入羧基磁珠与氨基探针偶联形成的捕获探针来捕获人粪便样本中NDRG4、TFPI2和ACTB基因。将捕获到的基因通过转化液和DNA保护液进行硫化处理，硫化产物再进行纯化。对纯化产物进行荧光PCR检测，用不同浓度梯度的标准品溶液制作标准曲线。从标准曲线上得到相对应的拷贝数的对数值，运用逻辑回归方程计算出得分，与cut-off值相比较，来对肠癌以及肠癌前期病变进行临床辅助诊断。

本发明针对NDRG4/TFPI2基因中的中国人特有CpG位点，专门设计针对中国人的引物探针，并通过实验得出这些位点中的CG为与肠癌相关联的位点；并采用多基因联合粪便捕获目的基因，大大增加检测的准确度和特异性。

本发明采用NDRG4、TFPI2和ACTB三个基因拟合出逻辑回归方程，运用算法清晰、透明的逻辑回归公式，针对中国人病种进行统计得出适合中国人的cut-off值，特别适合用于评价中国人群的患癌风险，对肠癌以及肠癌早期病变进行筛查。

本发明对NDRG4、TFPI2和ACTB多基因联合检测，能够快速、高效地对肠癌和肠癌前期病变进行临床辅助诊断，具有操作简单、快速、准确度高、灵敏度高、无创伤等优点，在临床辅助诊断中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是实施例中息肉的ROC曲线图。

图2是实施例中腺瘤的ROC曲线图。

图3是实施例中肠癌的ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

1、人NDRG4/TFPI2基因甲基化定量检测体系

样本：人粪便样本、阳性质控品、阴性质控品以及标准品(质粒的拷贝数分别为100000、10000、1000、100和10)；

仪器：Lightcycler480、高速离心机、水浴锅、PCR仪、漩涡震荡仪、超净工作台；

ACTB、NDRG4和TFPI2基因的捕获引物如下所示：

捕获探针	序列(5’-3’)
		ACTB	/5AmMC6/ACCCAGCACACAGTGGCAGACACAGGTTCACAGT
NDRG4	/5AmMC6/TCCCTCGCGCGTGGCTTCCGCCTTCTGCGCGGCTGGGGTGCC
		TFPI2	/5AmMC6/CCTGGAGCAGAAAGCCGCGC

注：/5AmMC6/表示探针5‘端氨基基团+碳6分子

ACTB、NDRG4和TFPI2三个基因的甲基化引物和探针如下所示：

引物、探针	序列(5’-3’)
		ACTB(F)	GTGATGGAGGAGGTTTAGTAA
ACTB(R)	AACCACAACCTAATAAAAAAAA
		ACTB(PRO)	VIC-ACACACAATAACA-MGB
NDRG4(F)	CAGGGTGTTTTTTAGGTTTC
		NDRG4(R)	ACTTCCGCCTTCTACGCG
NDRG4(PRO)	FAM-TCGCGGTTTTCG-MGB
		TFPI2(F)	GTTGGGTAAGGCGTTCGC
TFPI2(R)	CTCTCGCCCCGCATAAAACG
		TFPI2(PRO)	FAM-GTGCGCGGTCC-MGB

2、人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒

2.1根据确定的反应体系建立的人NDRG4/TFPI2/ACTB基因捕获试剂，具体组分如下：

2.2、根据确定的反应体系建立的人NDRG4/TFPI2/ACTB基因硫化纯化试剂，具体组分如下：

2.3、根据确定的反应体系建立的人NDRG4/TFPI2基因甲基化定量检测试剂，具体组分如下：

2.4、根据确定的反应体系建立的人NDRG4/TFPI2基因质控品试剂，具体组分如下：

3、人NDRG4/TFPI基因甲基化检测试剂盒检测过程

3.1、粪便脱落细胞目的基因的靶向捕获

a)操作前准备

1)检查细胞裂解液是否有晶体析出，如有，使用前需56℃促溶，室温15℃～30℃下操作。

2)将NDRG4捕获液/TFPI2捕获液/ACTB捕获液从4℃取出，室温平衡5min，振荡混匀，备用。

b)提取步骤

1)称取10g左右的粪便样本(新鲜或冷冻)，每克粪便样本加入2mL粪便处理液，剧烈震荡混匀，确保没有块状物质，室温放置30min，每10min震荡一次；

2)放入离心机中，3500g离心30min，快速吸取粪便上清10mL于50mL离心管中(不要放置较长时间，沉淀容易散开)，剩余上清液放置于另一支50mL离心管中，-80℃保存，弃沉淀；

3)向上清中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮(另备)，振荡混匀，室温条件下旋转15min；

4)将处理好的粪便上清液倒入过滤器(另备)中，收集过滤后的液体；

5)加入6.7mL裂解液，上下颠倒混匀离心管，90℃水浴锅中变性30min，每10min摇匀一次；

6)向每管样品中各加入30μL的NDRG4捕获液、TFPI2捕获液以及ACTB捕获液，室温条件下旋转杂交孵育90min；

7)短暂离心，将离心管置于磁力架上5min，弃上清，动作缓慢轻柔(注意不要吸到磁珠)；

8)加入1mL清洗液，将磁珠从管壁吹掉，转移到1.5mLEP管中，磁力架上静置3～5min后吸弃废液；重复上述清洗步骤2次，充分洗涤；

9)吸弃上清液，在通风橱中放置5～10min，使得液体完全挥发；

10)加入52μL洗脱液，涡旋振荡，放入92℃水浴锅中加热5min；

11)短暂离心后，离心管置于磁力架上2min，吸取50μL上清液，进行下一步实验。

3.2、硫化操作

a)实验前试剂准备

1)溶解转化试剂：加入1mL纯化水，室温涡旋振荡10min，至粉末完全溶解。如有必要，可在50℃水浴中加热使其溶解。

2)纯化漂洗液I：加入24mL无水乙醇，得到30mL使用体积。

3)纯化漂洗液II：使用前加入2mL无水乙醇，得到10mL的使用体积。

4)纯化漂洗液III：使用前加入2mL无水乙醇，得到10mL的使用体积。

b)硫化操作步骤

1)硫化体系：取一新的200μLPCR管，加入50μLDNA溶液，加入95μL转化试剂溶液，再加入15μLDNA保护液，混匀后瞬离。

2)转化条件如下：

98℃for10分钟，80℃for1小时，20℃保存20小时。

c)bisDNA(BisulfiteconversionDNA)的纯化回收

1)取一个新的1.5mL的EP管，加入0.6mL的结合液，再加入上述的转化修饰产物(约160μL)，涡旋振荡15s，瞬离。

2)加入20μL磁珠，涡旋振荡混匀，室温振荡20min。

3)将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清。

4)加入500μL纯化漂洗液I，涡旋混匀10s。

5)将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清。

6)加入500μL纯化漂洗液II，涡旋混匀10s后，室温颠倒混匀，孵育10-20min。

7)将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清。

8)加入500μL纯化漂洗液III，涡旋混匀10s。

9)将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清。

10)加入500μL纯化漂洗液I，涡旋混匀10s。

11)将离心管放置在磁力架上1min，磁珠完全吸附后，弃去上清。

12)重复步骤3.10-3.11。

13)小心去除残留液体，自然干燥10min。

14)向磁珠加入60μL预热到80℃的洗脱液，充分混匀后80℃孵育10min(中间再混一次)。

15)离心管置于磁力架上，磁珠完全吸附后，吸取纯净上清至新的离心管。弃去含有磁珠的离心管。

3.3、甲基化定量PCR检测

1)PCR检测前，取出检测试剂盒，置于冰箱2-8℃，融化试剂；试剂振荡混匀，短暂离心，并按如下体系配制反应混合液：

NDRG4-PCR反应液配置(16测试)

TFPI2-PCR反应液配置(16测试)

ACTB-PCR反应液配置(16测试)

PCR仪加样推荐布局

注：PC：PositiveControl，阳性质控品；NC：NegativeControl，阴性质控品；NTC：NoTemplateControl，无模板对照；S：Sample，检测样品。

2)分别向NDRG4反应孔中加入15μLNDRG4反应液；向TFPI2反应孔中加入15μLTFPI2反应液；向ACTB反应孔中加入15μLACTB反应液；

3)分别向对应的反应孔中加入各种浓度的标准品、待检样本、阳性质控品、阴性质控品、无模板对照15μL，小心盖上八联管管盖。振荡混匀，离心上机。

4)按照下表指示设置反应程序(首次设置程序应保存为模板程序)，样品上机后，保存实验名称，运行PCR反应。并及时根据实验布局编写加样排版和样品名称。

PCR反应程序

3.4、结果计算

PCR运行结束以后，在480II上进行NDRG4/TFPI2/ACTB的CP值分析。基线的确定方法和循环阈值(Ct值)的要求：以扩增过程前3-15个循环荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为循环阈值(Ct值)。检测结果扩增曲线应为“S”型。

以标准品拷贝数的对数值为横坐标(X)，以Ct值作纵坐标(Y)，制备“Ct-Log拷贝数”标准曲线，标准品线性相关系数r≥0.980。

根据样本的Ct值可从标准曲线上得到相应的Log拷贝数，再根据逻辑回归方程：

P＝0.795×logNDRG4+0.218×logTFPI2-0.216×logACTB+2.601，value＝exp(P)/(1+exp(P))计算出得分。与cut-off值进行比较。

1)计算阳性质控品的SCORE值(P值)，其结果大于0.6134，计算阴性质控品的SCORE值，其结果小于0.6134，可以继续分析；

2)计算样本的SCORE值，若结果小于等于0.6134，患肠癌风险性较低；SCORE大于0.6134，患肠癌或者肠癌早期病变风险性较高，建议镜检确认。

4、人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒的验证评估

利用肠炎症、肠息肉、肠腺瘤和肠癌粪便样本来验证试剂盒，对结果进行分析：本发明的特异性为93.3％，息肉灵敏度为55.6％，腺瘤灵敏度为91.3％，肠癌灵敏度为93.75％。

1)、对80例息肉粪便样本进行检测，ROC曲线(受试者工作特征曲线receiveroperatingcharacteristiccurve)如图1所示，AUC为0.719。

2)、对82例腺瘤粪便样本进行检测，ROC曲线如图2所示，AUC为0.948。

3)、对80例肠癌粪便样本进行检测，ROC曲线如图3所示，AUC为0.967。

以上结果表示本发明准确性很高、特异性好，能够快速、高效地对肠癌和肠癌前期病变进行临床辅助诊断。

本发明对NDRG4、TFPI2和ACTB多基因联合检测，能够快速、高效地对肠癌和肠癌前期病变进行临床辅助诊断，具有操作简单、快速、准确度高、灵敏度高、无创伤等优点，在临床辅助诊断中具有广泛的应用前景。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物，其特征在于，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测标志物包括ACTB、NDRG4和TFPI2三种基因的捕获引物、甲基化引物和探针；

其中，所述三种基因的捕获引物分别是：

捕获探针 序列(5’-3’) ACTB /5AmMC6/ACCCAGCACACAGTGGCAGACACAGGTTCACAGT NDRG4 /5AmMC6/TCCCTCGCGCGTGGCTTCCGCCTTCTGCGCGGCTGGGGTGCC TFPI2 /5AmMC6/CCTGGAGCAGAAAGCCGCGC

所述三种基因的甲基化引物和探针的序列分别是：

引物、探针 序列(5’-3’) ACTB(F) GTGATGGAGGAGGTTTAGTAA ACTB(R) AACCACAACCTAATAAAAAAAA ACTB(PRO) VIC-ACACACAATAACA-MGB NDRG4(F) CAGGGTGTTTTTTAGGTTTC NDRG4(R) ACTTCCGCCTTCTACGCG NDRG4(PRO) FAM-TCGCGGTTTTCG-MGB TFPI2(F) GTTGGGTAAGGCGTTCGC TFPI2(R) CTCTCGCCCCGCATAAAACG TFPI2(PRO) FAM-GTGCGCGGTCC-MGB

。

2.人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒包括：

捕获试剂：NDRG4捕获液、TFPI2捕获液、ACTB捕获液、细胞裂解液、清洗缓冲液、捕获洗脱液；

硫化纯化试剂：硫化剂、DNA保护液、结合液、磁珠、纯化漂洗液I、纯化漂洗液II、纯化漂洗液III、纯化洗脱液；

定量化检测试剂：NDRG4PCRMix、TFPI2PCRMix、ACTBPCRMix、标准品、阴性质控品、阳性质控品、聚合酶。

3.如权利要求2所述的人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒用于检测时的PCR程序如下：首先95℃变性5分钟，然后95℃变性20秒、60℃退火40秒，并进行50次循环，PCR循环过程中，仪器升降温速度设定为1.3℃/S，最后40℃维持30秒。

4.如权利要求3所述的人NDRG4/TFPI2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述PCR结果在480II上进行NDRG4/TFPI2/ACTB的CP值分析，用不同浓度梯度的标准品溶液制作标准曲线，从标准曲线上得到相对应的拷贝数的对数值，运用逻辑回归方程P＝0.795×logNDRG4+0.218×logTFPI2-0.216×logACTB+2.601，value＝exp(P)/(1+exp(P))，计算出得分。