CN107102149B

CN107102149B - 一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法

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Publication number: CN107102149B
Application number: CN201710305080.5A
Authority: CN
Inventors: 任平; 任一平; 蒋易蓉
Original assignee: Hangzhou Papide Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Pu Pai Technology Co., Ltd.
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2037-05-03
Also published as: CN107102149A

Abstract

本发明公开了一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，属于蛋白质定量检测技术领域。所述筛选方法包括：(1)利用BLAST比对分析待测蛋白质理论酶解肽段对应的匹配得分与干扰数目；(2)经高效液相色谱串联质谱分析目标肽段的质谱响应值和碎片丰度；(3)利用拟合曲线计算目标肽段在酶解1～3小时的酶解比率；(4)计算目标肽段的回收率和精密度。本发明联合利用多种方法从特异性、质谱特性、酶解特性、准确性和稳定性等方面综合筛选适用于蛋白质准确定量的特征肽段；筛选出的特征肽段可满足高效液相色谱串联质谱法对食品基质中蛋白质的定量检测要求，实现灵敏度高，精密度好，重现性佳的蛋白质定量检测。

Description

一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法

技术领域

本发明涉及蛋白质定量检测技术领域，具体涉及一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法。

背景技术

蛋白质的准确定量是生物、制药、食品等研究领域的重要内容，其传统的定量方法主要分为以凯氏定氮法、考马斯亮兰法为例的总蛋白质含量检测方法和以电泳法、酶联免疫吸附法为例的单一目标蛋白质含量检测方法。

定量蛋白质组学是一种新型的蛋白质准确定量技术，基于基因组学与蛋白质组学的研究思路，以及传统电泳法与高效液相串联质谱法的技术手段，实现目标蛋白质组中多种蛋白质的准确定量。定量蛋白质组学的检测思路主要包括蛋白质提取、蛋白质纯化、蛋白质酶解、同位素标记、特征肽段筛选和特征肽段定量检测。

如申请公布号为CN 106442803 A的专利文献公开了一种可实现牛血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法，该试剂盒由标准物质和反应试剂两部分组成，标准物质包括：特征肽段及其内标肽段；反应试剂包括：碳酸氢铵、二硫苏糖醇、碘乙酰胺、胰蛋白酶、甲酸。通过将含牛血清白蛋白样品与反应试剂按一定的体积比混合，温育振荡后，使之发生酶解反应，再将标准物质和/或最终酶解产物分别注入高效液相色谱-串联质谱仪中，根据特征肽段母离子和子离子的质荷比(m/z)及特征肽段的保留时间(tR)进行定性鉴别，色谱峰面积变化测算出牛血清白蛋白的绝对含量。

其中，特征肽段筛选是保证检测结果准确、稳定、可靠的重要步骤。目前，特征肽段的筛选主要通过肽段的特异性、肽段离子的质谱响应和肽段离子的碎片丰度进行评价。Uniport和NCBI等网站能对肽段进行BLAST检验，评价肽段的特异性；ProteomicsDiscoverer和Skyline等软件能对肽段的质谱采集文件进行分析，评价肽段离子的质谱响应与碎片丰度。然而，此类方法主要针对生物样本中的常见蛋白质，当用于食品中蛋白质特征肽段的筛选时，存在一定的局限性。

通常食品会按照一定生产方式进行加工处理。比如加热，食品中的蛋白质的空间构象会发生变化，从而会影响到蛋白质的酶解特性；又比如添加基质辅料，基质辅料也会对蛋白质的酶解效率产生影响。如用于定量的特征肽段无法酶解完全，其检测的结果偏低，势必影响蛋白质定量的准确性。

因此，需要建立一种针对食品基质中蛋白质的定量特征肽段的筛选方法，在考虑肽段的特异性、肽段离子的质谱响应和碎片丰度的同时，考虑到食品基质本身与酶解效率对定量结果的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，克服现有的筛选方法对于食品中蛋白质定量检测存在一定局限性的问题。

为实现上述目的，采用如下技术方案：

一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，包括：

(1)利用BLAST比对分析待测蛋白质理论酶解肽段对应的匹配得分与干扰数目，选择匹配得分≥20、干扰数目≤5的理论酶解肽段为候选肽段；

(2)将待测蛋白质样品酶解得到肽段混合液，经高效液相色谱串联质谱分析所述的候选目标肽段的质谱响应值和碎片丰度，选择蛋白质组学软件评分为黄色和绿色的候选肽段为候选目标肽段；

(3)测量待测蛋白质样品在不同酶解时间对应生成的所述候选目标肽段浓度，将其代入方程拟合得到所述候选目标肽段的酶解曲线方程，根据酶解曲线方程计算在酶解1～3小时对应所述候选目标肽段的酶解比率，选择酶解比率为100±10％的候选目标肽段为候选特征肽段；

其中，c为对应酶解时间t时目标肽段的浓度；a为初始条件下的蛋白质浓度；a＝A，k＝(1+K_M/A)以及m＝v_max/A；

(4)待测蛋白质样品与加标物混合后得到加标样，测量加标样酶解生成的所述候选特征肽段浓度，计算所述候选特征肽段的回收率和精密度，回收率＝100±10％和精密度≤5％的候选特征肽段即为所述的特征肽段。

步骤(1)中，所述理论酶解肽段指待测蛋白质的理论序列经胰蛋白酶Trypsin完全酶解的氨基酸个数大于4个的所有肽段，其中，胰蛋白酶Trypsin的酶解位点为精氨酸与赖氨酸的羧基端，而连接脯氨酸的羧基端除外。

采用蛋白质组学中的BLAST检验(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，分析待测蛋白质中各条理论酶解肽段对应的匹配得分与干扰数目，进而评价肽段的特异性。其中匹配得分由肽段的长度和数据库匹配程度决定；干扰数目是决定肽段特异性的主要参数。在全蛋白质组学数据库中搜索，与目标肽段100％匹配的干扰肽段数目越多，则说明肽段的特异性越弱。

作为优选，选择干扰数目为零的理论酶解肽段为候选肽段。

步骤(2)-(4)中，采用胰蛋白酶Trypsin进行酶解。本发明采用的胰蛋白酶为基因工程技术制备的碱性胰蛋白酶，只作用于精氨酸和赖氨酸的C端，具有高度专一性，能稳定、特异地将目标蛋白质酶切成分子量为几十至上千道尔顿的肽段分子。

步骤(2)中，所述蛋白质组学软件为Proteomics Discoverer，Skyline或Byonic。

将含待测蛋白质的样品酶解，经高效液相色谱串联质谱检测，采集所述候选肽段的数据导入Skyline软件，与蛋白质组学数据库进行比对。依据Skyline软件内置的评价方法，可将候选肽段的品质分为红、黄、绿三个等级，选择黄色或绿色的候选肽段。

作为优选，选择评分为绿色的候选肽段为候选目标肽段。

步骤(3)中，方程是由米氏方程推导得出，具体推导过程如下：

该方程成立的基本假设为①酶解反应过程中反应速度始终符合米氏方程(1)，即本模型仅适用于符合米氏方程的酶解反应；②酶解反应过程中相较于底物浓度而言，酶过量，即酶解反应速率未达到最大反应速率；③针对同一酶和底物，米氏常数不变；④1mol底物反应生成1mol产物。可知：

其中，v为对应底物浓度为[S]时的酶反应速率，v_max为对应酶反应条件下的最大反应速率，K_M为米氏常数。

[S]＝S₀-c (2)

其中，S₀为当前反应条件下的最大底物浓度，即初始条件下的底物浓度A，[S]为对应酶解时间t时的底物浓度，而c为对应酶解时间t时的产物浓度。

米氏方程阐述了一定酶条件下底物浓度与反应速率的关系，而为了表示确定的反应条件下产物浓度与反应时间的关系，对米氏方程进行了一定的转化。

首先，反应速率、产物浓度与反应时间的关系见方程(3)。

其中，c为对应酶解时间t时的产物浓度，v为产物的生成速率，即底物的反应速率。

将方程(2)和方程(3)带入方程(1)中，可得方程(4)，并进而转化为方程(5)。

进而对方程(5)两边取积分，可得方程(6)，并进而转化为方程(7)和方程(8)。

-(A-c)-K_M·In(A-c)＝v_max·t+c₀ (8)

考虑边界条件t＝0时，c＝0。代入方程(8)可得方程(9)。

c₀＝-A-K_M·InA (9)

将方程(9)代入方程(8)可得方程(10)，并进而化简为方程(11)。

c-K_M·In(A-c)＝v_max·t-K_M·InA (10)

定义一个新函数f(t)，其中t为酶解反应时间，见方程(12)。

将函数f(t)代入方程(11)可得方程(13)。

A·f(t)-K_M·In[1-f(t)]＝v_max·t (13)

定义一个新函数g(t)，其中t为酶解反应时间，见方程(14)，并进而转化为方程(15)。

f(t)＝1-e^g(t) (15)

将方程(15)代入方程(13)可得方程(16)，并进而转化为方程(17)。

A-A·e^g(t)＝v_max·t+K_M·g(t) (16)

根据泰勒级数展开公式，并得到近似方程(18)和方程(19)。

将方程(19)代入方程(17)可得到方程(20)，并进而转化为方程(21)，方程(22)和方程(23)。

考虑边界条件t＝0时，c＝0。代入方程(14)可得方程(24)。

因此方程(23)取正号，即得方程(25)。

同时，由方程(25)可知函数g(t)为奇函数，则方程(25)可转化为方程(26)。

将方程(14)代入方程(26)可得方程(27)，并进而转化为方程(28)和方程(29)。

为简化方程(29)，定义三个未知参数a，k，m，方且程(29)可简化为方程(30)。

其中a＝A，k＝(1+K_M/A)以及m＝v_max/A。

方程(30)可用于已知反应时间和产物浓度的酶解曲线的拟合。

本发明中基于方程(30)对酶解时间(t)和对应生成的所述候选目标肽段浓度(c)的基本关系进行拟合，得到对应的酶解曲线方程，利用该酶解曲线方程计算酶解1-3h时的酶解比率，当酶解比率为100±10％时，认为对应的候选目标肽段在1-3h内完全酶解，选择能够完全酶解的候选目标肽段作为候选特征肽段。

若不能完全酶解的目标肽段作为定量特征肽段时，其检测的结果偏低，影响蛋白质定量检测的准确性。

作为优选，酶解时间为2h。Trypsin酶自身也是蛋白质，其存在酶自切的现象。随着酶解时间的延长，底物蛋白质的浓度下降，酶自切的发生概率不断增加。同时，前期实验数据表明2小时内蛋白质中未完全酶切的位点将始终难以达到完全酶切状态，说明2小时后酶自切的现象已影响到底物蛋白质的正常酶切，其酶解过程不完全符合酶解曲线模型的基本假设，因此选择2小时作为采集酶解数据点对应的酶解时间。

作为优选，测量≥5个酶解时间对应的候选目标肽段浓度。曲线拟合时，输入的数据点越多，拟合出的曲线方程越准确。

根据简化方程(30)可知，酶解曲线方程为指数方程的变形，其各点斜率随着酶解时间的增加而减小，即酶解速率随着酶解时间测增加而减小。为了更加准确地拟合酶解曲线，采集酶解数据点对应的酶解时间应为先密后疏。为方便实验操作与数据处理，采用前期每间隔3min采集数据点共5次，后期每间隔15min采集数据点共7次。

步骤(3)和(4)中，采用高效液相色谱-质谱联用的方法测量肽段的浓度。

由于食品中成分复杂，除了待测蛋白质，还含有基质成分，使得质谱检测存在基质效应，影响检测准确性。作为优选，采用二甲基化同位素标记法进行测量。

二甲基化同位素标记法是在甲醛分子的作用下将溶液中的游离氨基反应生成席夫碱，进而在氰基硼氢化钠的还原下，稳定、高效地实现游离氨基的二甲基化。对于经碱性胰蛋白酶酶解生成的肽段来说，游离氨基的来源为肽段N端和赖氨酸(K)残基两部分，而一般地，以精氨酸(R)结尾的肽段只有N端一个可标记位点。在普通甲醛(CH₂O)的作用下，一个游离氨基位点可增加两个甲基，实现分子量增加28Da的标记；而在同位素甲醛(¹³CD₂O)的作用下，一个游离氨基位点可实现分子量增加34Da的标记。因此，经碱性胰蛋白酶酶解的肽段，经二甲基化标记后，可实现轻链与重链至少6Da的质量数差异，使得目标肽段拥有其对应的同位素内标，保证定量检测的准确性。

步骤(3)中，本发明在测量不同酶解时间的候选目标肽段浓度时，均采用相同的内标物，对测量误差进行校正，保证测量的准确性。具体地，计算候选目标肽段响应值与对应同位素内标肽段响应值的比例，表示该候选目标肽段的生成浓度(即内标法定量)。

作为优选，步骤(3)中，以待测蛋白质样品酶解120min得到的酶解产物经同位素标记后作为内标物。

作为优选，测量各酶解时间对应的候选目标肽段浓度后，应用SAS软件编程，将各酶解时间及对应的目标肽段的浓度代入上述数学模型，使用高斯迭代法进行拟合，确定三个参数a、k、m，生成对应的酶解曲线方程。

步骤(4)中，所述加标物为蛋白质标准品。作为优选，所述加标物采用≥3个浓度水平。实际操作中，根据食品中待测蛋白质含量水平的不同，确认不同的加标水平。加标实验重复进行3次，每次设置3个平行。

本发明采用三天三平行三水平的加标实验，检测候选特征肽段的回收率与精密度，用于评价肽段的准确性和稳定性，保证筛选的定量特征肽段具有可准确定量的性质。

作为优选，步骤(4)中，以蛋白质标准品的酶解液经同位素标记后作为内标物。

具体地，以加标样中测得候选特征肽段的响应值与对应同位素内标肽段的比值作为加样检测值，以不含加标物的待测蛋白质样品中测得的候选特征肽段的响应值与对应同位素内标肽段的比值作为本底值，再根据公式回收率＝(检测值-本底值)/加标量×100％，计算加标回收率。

所述精密度用相对标准偏差(RSD)来表示。

选择回收率和精密度符合ISO/IEC 17025:2005标准的候选特征肽段作为待测蛋白质的定量特征肽段。

通过本发明方法筛选到的特征肽段经方法学验证之后，证明可用于食品中蛋白质的定量检测及其检测试剂盒的研发。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明方法可以满足复杂食品基质中蛋白质定量用特征肽段的全面筛选，通过综合评价筛选出适用于蛋白质准确定量的特征肽段。

(2)本发明方法可为复杂食品基质中蛋白质定量提供特征肽段，可满足高效液相色谱串联质谱法对食品基质中蛋白质的定量检测要求，实现灵敏度高，精密度好，重现性佳的蛋白质定量检测。

(3)本发明方法采用二甲基化同位素标记方法，使得每条特征肽段都拥有对应的同位素内标，能够保证筛选结果的准确、可靠。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：生牛乳中牛血清白蛋白的定量特征肽段优选方法。

1.肽段的特异性评价：采用蛋白质组学中的BLAST检验(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，分析确定牛血清白蛋白中各条理论酶解肽段对应的匹配得分与干扰数目。其中，匹配得分由肽段的长度和数据库匹配程度决定，而干扰数目则是决定肽段特异性的主要参数。在全蛋白质组学数据库中搜索，与目标肽段100％匹配的干扰肽段数目越多，则说明肽段的特异性越弱。

如表2所示，根据各条肽段的检验结果，最终优选出16条特异性强的候选目标肽段，分别为LVNELTEFAK、TCVADESHAGCEK、NECFLSHK、LKPDPNTLCDEFK、AEFVEVTK、YICDNQDTISSK、SHCIAEVEK、DAIPENLPPLTADFAEDK、DAFLGSFLYEYSR、EYEATLEECCAK、DDPHACYSTVFDK、QNCDQFEK、CCTKPESER、RPCFSALTPDETYVPK、LFTFHADICTLPDTEK、LVVSTQTALA。

2.肽段的质谱特性评价：针对优选的特异性好的候选目标肽段，应用Skyline软件(http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline)进行目标肽段的质谱响应与碎片丰度评价。

首先进行蛋白质的酶解，制得目标肽段溶液：准确吸取50μL生牛乳稀释液(蛋白质含量低于5g/mL)，加入900μL浓度为100mmol/L的NaHCO₃溶液和10μL浓度为500mmol/L的DTT溶液，70℃恒温振荡反应30min后取出冷却至室温，加入30μL浓度为500mmol/L的IAA溶液，暗室室温静置30min，加入10μL浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃恒温振荡反应2h酶解，取出酶解样液过0.22μm滤膜，得到目标肽段溶液。

进而采用UPLC-Q-Orbitrap液相质谱联用仪中的ddMS模式进行数据采集：①液相色谱参考条件：色谱柱：BEH 300C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：A相：0.1％甲酸-水溶液；B相：0.1％甲酸-乙腈溶液；进样体积：5μL；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。②高分辨质谱参考条件：质谱仪：Q Exactive静电场轨道离子阱质谱仪；离子源模式：HESI源正离子模式；鞘气气流：40L/min；辅助气气流：10L/min；毛细管电压：3.5kV；毛细管温度：320℃；辅助气温度：350℃；数据采集模式：数据依赖的全扫描(dd MS)模式，为全扫描阶段与数据依赖的二级质谱扫描阶段交替进行。

全扫描阶段参数：质谱扫描范围为200-2000m/z，分辨率为70000，最大延迟时间为200ms，自动增益控制(AGC)值为1×10⁶；数据依赖的二级质谱扫描阶段参数：分辨率为17500，最大延迟时间为50ms，自动增益控制(AGC)值为1×10⁵，目标离子数目为10个/循环，阶梯碰撞能量为25、30、35，截取窗口为2.0m/z。

最终将dd MS的采集数据文件导入Skyline软件，并与蛋白质组学数据库进行比对，依据Skyline软件内置的评价方法，优选标记为黄色和绿色的肽段为候选目标肽段。

在牛血清白蛋白的候选目标肽段中，有12条肽段可作为质谱响应与碎片丰度较好的候选目标肽段，分别为NELTEFAK、ADESHAGCEK、NECFLSHK、SHCIAEVEK、DAIPENLPPLTADFAEDK、EYEATLEECCAK、DDPHACYSTVFDK、QNCDQFEK、CCTKPESER、RPCFSALTPDETYVPK、LFTFHADICTLPDTEK、LVVSTQTALA。

3.肽段的酶解特性评价：针对上述优选的候选肽段，采用经米氏方程推导的酶解函数模型进行肽段酶解特性的评价。

首先进行蛋白质的酶解与目标肽段的定量，建立不同酶解时间与各肽段生成量的基本关系：

准确吸取50μL生牛乳稀释液(蛋白质含量低于5g/mL)，加入900μL浓度为100mmol/L的NaHCO₃溶液和10μL浓度为500mmol/L的DTT溶液，70℃恒温振荡反应30min后取出冷却至室温，加入30μL浓度为500mmol/L的IAA溶液，暗室室温静置30min，加入10μL浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃恒温振荡反应酶解，分别经过3min、6min、9min、12min、15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min和120min酶解后，取酶解液过0.22μm滤膜，得到相应的样品酶解液，。

准确吸取500μL样品酶解液，加入20μL质量分数为4％的普通甲醛(CH₂O)和20μL浓度为0.6M的氰基硼氢化钠，25℃恒温振荡反应1h，取出后加入80μL体积分数为1％的氨水，终止反应，并加入40μL纯甲酸，进一步终止反应，制得样品标记液。另取500μL 120min的酶解液作为同位素内标，加入20μL质量分数为4％的同位素甲醛(¹³CD₂O)和20μL浓度为0.6M的氰基硼氢化钠，同时进行25℃恒温振荡反应1h，取出后加入80μL体积分数为1％的氨水，终止反应，并加入40μL纯甲酸，进一步终止反应，制得内标溶液。

取100μL样品标记液与100μL内标溶液混合，制得进样液。采用UPLC-Q-Orbitrap液相质谱联用仪中的Full MS模式进行数据采集：①液相色谱参考条件：色谱柱：BEH 300C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：A相：0.1％甲酸-水溶液；B相：0.1％甲酸-乙腈溶液；进样体积：5μL；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。②高分辨质谱参考条件：质谱仪：QExactive静电场轨道离子阱质谱仪；离子源模式：HESI源正离子模式；鞘气气流：40L/min；辅助气气流：10L/min；毛细管电压：3.5kV；毛细管温度：320℃；辅助气温度：350℃；数据采集模式：Full MS模式，质谱扫描范围为200-2000m/z，分辨率为70000，最大延迟时间为200ms，自动增益控制(AGC)值为1×10⁶。

利用内标法计算不同酶解时间酶解液中各目标肽段响应值与对应的同位素内标肽段响应值的比例，表示该酶解时间下肽段的生成量。进而应用SAS软件，将酶解时间与对应的肽段生成量代入酶解函数模型拟合生成各肽段的酶解曲线函数表达式，利用各肽段的表达式计算酶解时间为2h时，肽段的酶解比率，当酶解比率为100％±10％时，认为对应肽段在2h时完全酶解。

如表2所示，根据各肽段的酶解比率，筛选可完全酶解的肽段作为目标候选肽段。在牛血清白蛋白的上述12条目标候选肽段中，有6条肽段可实现完全酶解，作为具有准确定量能力的目标候选肽段，分别为LVNELTEFAK、TCVADESHAGCEK、QNCDQFEK、RPCFSALTPDETYVPK、LFTFHADICTLPDTEK、LVVSTQTALA。

4.肽段的准确性与稳定性评价：针对上述优选的候选肽段，建立同位素稀释高效液相色谱串联高分辨质谱联用法实现肽段的准确定量，并采用三天三平行三水平加标实验，检测候选肽段在食品基质中的回收率与精密度，评价肽段的准确性与稳定性。

首先进行同位素稀释高效液相色谱串联高分辨质谱联用法的建立。方法包括蛋白质的酶解、肽段的二甲基化标记和高分辨质谱数据采集。

样品检测液的制备：(1)空白样：取100μL新鲜生牛乳样品，加入900μL超纯水，混匀后备用。(2)低水平加标样：取100μL新鲜生牛乳样品，加入50μL 100μg/mL BSA标准溶液，加入850μL超纯水，混匀后备用。(3)中水平加标样：取100μL新鲜生牛乳样品，加入200μL 100μg/mL BSA标准溶液，加入700μL超纯水，混匀后备用。(4)高水平加标样：取100μL新鲜生牛乳样品，加入500μL 100μg/mL BSA标准溶液，加入400μL超纯水，混匀后备用。

蛋白质的酶解：准确吸取50μL上述样品检测液(蛋白质含量低于5g/mL)，加入900μL浓度为100mmol/L的NaHCO₃溶液和10μL浓度为500mmol/L的DTT溶液，70℃恒温振荡反应30min后取出冷却至室温，加入30μL浓度为500mmol/L的IAA溶液，暗室室温静置30min，加入10μL浓度为1mg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃恒温振荡反应2h酶解，取出酶解样液过0.22μm滤膜，得到样品酶解液。

肽段的二甲基化标记：准确吸取500μL样品酶解液，加入20μL质量分数为4％的普通甲醛(CH₂O)和20μL浓度为0.6M的氰基硼氢化钠，25℃恒温振荡反应1h，取出后加入80μL体积分数为1％的氨水，终止反应，并加入40μL纯甲酸，进一步终止反应，制得样品标记液。另取500μL BSA标准品的酶解液作为同位素内标，加入20μL质量分数为4％的同位素甲醛(¹³CD₂O)和20μL浓度为0.6M的氰基硼氢化钠，同时进行25℃恒温振荡反应1h。取出后加入80μL体积分数为1％的氨水，终止反应，并加入40μL纯甲酸，进一步终止反应，制得内标溶液。

取100μL样品标记液与100μL内标溶液混合，制得进样液。高分辨质谱数据采集：采用UPLC-Q-Orbitrap液相质谱联用仪中的SIM模式进行数据采集，①液相色谱参考条件：色谱柱：BEH 300C18色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；流动相：A相：0.1％甲酸-水溶液；B相：0.1％甲酸-乙腈溶液；进样体积：5μL；柱温：30℃；流速：0.3mL/min。②高分辨质谱参考条件：质谱仪：Q Exactive静电场轨道离子阱质谱仪；离子源模式：HESI源正离子模式；鞘气气流：40L/min；辅助气气流：10L/min；毛细管电压：3.5kV；毛细管温度：320℃；辅助气温度：350℃；数据采集模式：SIM模式，分辨率为35000，最大延迟时间为100ms，自动增益控制(AGC)值为1×10⁵。

进而采用上述检测方法进行三天三平行三水平加标实验，评价各候选肽段的回收率与精密度。根据牛乳中含有牛血清白蛋白的含量，设置加标水平为5ppm，20ppm和50ppm。

以各肽段对应同位素标记肽段为内标，用BSA标准品制作标准曲线，定量得到空白样与三水平加标样中各候选肽段的检测值，其中空白样的检测值作为本底值，再根据公式计算加标回收率。

如表2所示，加标实验结果显示，肽段RPCFSALTPDETYVPK的回收率不符合要求，肽段LFTFHADICTLPDTEK的精密度不符合要求，而肽段LVNELTEFAK、TCVADESHAGCEK、QNCDQFEK和LVVSTQTALA的加标实验结果符合ISO/IEC 17025:2005标准(表1)。其中，TCVADESHAGCEK和QNCDQFEK肽段中含有半胱氨酸，其检测准确性可能受到二硫键结合的影响，因此，最终选择LVNELTEFAK和LVVSTQTALA两条肽段作为牛乳中牛血清白蛋白的定量特征肽段。

表1

加标物浓度水平	回收率	RSD
			1000ppm	90％-108％	6％
100ppm	85％-110％	8％
			10ppm	80％-115％	11％
1ppm	75％-120％	16％
			10ppb	70％-125％	32％

表2牛血清白蛋白定量特征肽段的特征参数

实施例2：生牛乳中牛血清白蛋白定量特征肽段的方法学验证。

对实施例1中筛选的LVNELTEFAK和LVVSTQTALA两条肽段在牛乳中牛血清白蛋白的定量实验中进行方法学验证。

方法学验证包括线性与范围、检出限与定量限、回收率和精密度四个部分。

根据方法学验证结果可知，两条定量特征肽段的线性良好(R²＞0.999)，范围为1ppm-100ppm；检出限为0.21-0.22mg/kg，定量限为0.70-0.74mg/kg；回收率为99.0％-111.1％，精密度为2.20％-6.67％，符合ISO/IEC 17025:2005标准。

实施例3：婴幼儿配方粉中α-乳白蛋白的定量特征肽段优选方法。

特征肽段优选方法参照实施例1，结果如表3所示。

表3α-乳白蛋白定量特征肽段的特征参数

实施例4：婴儿营养米粉中β-乳球蛋白的定量特征肽段优选方法。

特征肽段优选方法参照实施例1，结果如表4所示。

表4β-乳球蛋白定量特征肽段的特征参数

Claims

1.一种食品中蛋白质定量检测用特征肽段的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将待测蛋白质样品酶解得到肽段混合液，经高效液相色谱串联质谱分析所述的候选肽段的质谱响应值和碎片丰度，选择蛋白质组学软件评分为黄色和绿色的候选肽段为候选目标肽段；

(4)待测蛋白质样品与加标物混合后得到加标样，分别测量加标样酶解生成的所述候选特征肽段浓度，计算所述候选特征肽段的回收率和精密度，回收率＝100±10％和精密度≤10％的候选特征肽段即为所述的特征肽段；

步骤(3)中，方程是由米氏方程推导得出，该方程成立的基本假设为①酶解反应过程中反应速度始终符合米氏方程，即本模型仅适用于符合米氏方程的酶解反应；②酶解反应过程中相较于底物浓度而言，酶过量，即酶解反应速率未达到最大反应速率；③针对同一酶和底物，米氏常数不变；④1mol底物反应生成1mol产物。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，选择干扰数目为零的理论酶解肽段为候选肽段。

3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，高效液相色谱串联质谱分析得到的数据导入Skyline软件，与蛋白质组学数据库进行比对。

4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，选择评分为绿色的候选肽段为候选目标肽段。

5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，测量≥5个酶解时间对应的候选目标肽段浓度。

6.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)-(4)中，采用胰蛋白酶Trypsin进行酶解。

7.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，采用高效液相色谱-质谱联用的方法测量肽段的浓度。

8.如权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，采用二甲基化同位素标记法进行测量。

9.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，所述加标物采用≥3个浓度水平。

10.如权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，加标实验重复进行3次，每次设置3个平行。