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CN107011242A - 用于治疗尤文肉瘤家族肿瘤的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗尤文肉瘤家族肿瘤的方法和组合物 Download PDF

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CN107011242A CN201611030609.9A CN201611030609A CN107011242A CN 107011242 A CN107011242 A CN 107011242A CN 201611030609 A CN201611030609 A CN 201611030609A CN 107011242 A CN107011242 A CN 107011242A
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Abstract

本发明涉及用于治疗尤文肉瘤家族肿瘤的方法和组合物。本发明提供了制备式(I)的化合物的方法，所述方法包括：使被取代的苯乙酮与被取代的靛红缩合。本发明还提供了一种治疗癌症的方法。

Description

用于治疗尤文肉瘤家族肿瘤的方法和组合物
本申请是申请日为2013年4月11日、申请号为“201380030414.2”、发明名称为“用于治疗尤文肉瘤家族肿瘤的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2012年4月12日递交的美国临时申请序列号为61/623349，标题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING EWINGS SARCOMA FAMILY OF TUMORS”的权益，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦赞助R&D的声明
本发明是利用美国国立卫生研究院授予的NIH资助/合同号R01CA138212和R01CA133662下的政府支持完成。政府具有在本发明中的特定权利。
技术领域
提供与EWS-FLI1蛋白抑制剂相关的化合物、组合物和方法，EWS-FLI1蛋白抑制剂被提供。该化合物在包括尤文肉瘤家族肿瘤的癌症治疗中具有实用性。
背景技术
尤文肉瘤家族肿瘤(Ewing’s Sarcoma Family of Tumors，ESFT)是高度侵袭性肿瘤，它发生在儿童、青少年和年轻成年人的骨与软组织中。它们对化疗有反应，然而尽管高剂量的化疗，仍有75％到80％的已经发展到转移性ESFT的患者会在五年内死亡(Grier,H.E等，N.Engl.J.Med.348，694-701(2003))。ESFT含有熟知的染色体易位。这使位于22号染色体上的尤文肉瘤(EWS)基因与ets家族基因接合，ets家族基因通常为位于11号染色体上的Friend型白血病插入(FLI)1，t(11：22)导致不同的融合蛋白的表达(Aykut Uren,JeffreyA Torestsky Ewing’s sarcoma oncoproteins EWS-FLI1:the perfect target withouta therapeutic agent,Future Oncol.1(4)，521-528(2005))。
体外研究和体内研究已表明，肿瘤蛋白EWS-FLI1的消除导致ESTF细胞系的增殖减少以及肿瘤体积的减小。EWS-FLI1缺乏酶活性，然而，RHA解旋酶A(RHA)增加EWS-FLI1调节的肿瘤发生，因此，在这两种蛋白之间的蛋白-蛋白互作对维持肿瘤生长是必需的(HyariyeN Erkizan等.A small molecule blocking oncogenic protein EWS-FlI1 interactingwith RHA helicase A inhibits growth of Ewing’s sarcoma.Nature Medicine 15(7)750-756(2009))。破坏关键蛋白互作的范例在可用于疾病的治疗，疾病包括具有类似易位的肉瘤和具有MLL易位的白血病((Helman LJ,Meltzer P.Mechanisms of sarcomadevelopment.Nat Rev Cancer 2003；3(9):685-94)；以及Pui CH,Relling MV,DowningJR.Acute lymphoblastic leukemia.N Engl J Med 2004；350(15):1535-48)。此外，无序蛋白基于它们固有的生化性质可以是优良的治疗靶标(Cheng Y,LeGall T,Oldfield CJ,等。Rational drug design via intrinsically disordered protein.TrendsBiotechnol 2006；24(10):435-42)。
尽管多年来利用反义RNA和siRNA(小分子干扰RNA)对EWS-FLI1进行体外研究和异种移植研究，迄今为止基于不充分的递送和稳定性这作为人类疗法都是不切实际的。因此，对治疗例如ESFT的病症存在改进的疗法的需要。
发明内容
一些实施方式涉及一种化合物，该化合物具有式：
或其药学上可接受的盐，
式中，R1选自氢、C1-6烷基、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸、
R3，R4，R5，R9和R14各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R10、R11、R12和R13各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R6为C1-6二烷基胺；R7选自氢和C1-6烷基；R8和R15各自独立地为C1-6烷基；每个R16独立地为氢、-OH或C1-6烷氧基；n为从0至4的整数；p为1或3；并且虚线代表可选的双键，其中，所述双键具有选自顺式(cis)和反式(trans)的构型，其条件为R3、R4、R5、R9和R14中的至少一个选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。
在一些实施方式中，式I的化合物可以为具有式Ia结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，式I的化合物可以为具有式Ib结构的化合物:
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，R1选自亮氨酸(Leu)、亮氨酸-天冬氨酸(Leu-Asp)、亮氨酸-天冬氨酸-丙氨酸(Leu-Asp-Ala)、-CH2-C(＝O)-NHCH2COOH、-CH2-C(＝O)-(CH2)C(CH3)2、
在一些实施方式中，R3选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。
在一些实施方式中，R3为-N(CH3)2。
在一些实施方式中，R3为-SCH3。
在一些实施方式中，提供了一种药物组合物，其含有式(I)的化合物和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括对有需要的受试者施用有效量的式(I)的化合物。
在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物。
在一些实施方式中，所述受试者为人。
在一些实施方式中，所述癌症选自前列腺癌和尤文肉瘤。
在一些实施方式中，提供了一种杀灭或抑制肿瘤细胞生长的方法，包括将细胞与有效量的式(I)的化合物接触。
在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，所述细胞为人的细胞。
在一些实施方式中，所述细胞为体外细胞。
在一些实施方式中，所述细胞为体内细胞。
在一些实施方式中，癌症包括上述细胞，所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、尤文肉瘤和黑色素瘤。
在一些实施方式中，式(I)的化合物具有式：
在一些实施方式中，式(I)的化合物具有式：
在一些实施方式中，式(I)的化合物可以选自：
或其药学上可接受的盐。
附图说明
图1示出NSC635453的结构以及特定类似物的通用结构。
图2示出增加YK-4-279潜能的示例性策略。
图3A为对于各种浓度的YK-4-279和PT-1-33，TC71细胞和TC32细胞的生长抑制的曲线图。图3B为对于各种浓度的YK-4-279、PT-1-33和PT-1-55，TC71细胞的生长抑制的曲线图。图3C为对于各种浓度的YK-4-279和PT-1-123，TC71细胞的生长抑制的曲线图。
图4为来自用YK-4-279处理的TC32细胞且与RHA、EWS-FLI1或总蛋白共沉淀的的蛋白裂解物的免疫印迹显微照片。
图5A至图5G为在通过不同的候选试剂测定抑制EWS-FLI1与RHA结合的酶联免疫吸附测定(ELISA)试验中的相对光密度的示图。
图6A和图6B为曲线图，该曲线图示出在测定抑制EWS-FLI1与NROB1启动子结合的荧光素酶检测中，对于不同浓度的候选试剂的相对荧光素酶活性的总体趋势。
图7A至图7I示出在测定抑制EWS-FLI1与NROB1启动子结合的荧光素酶检测中，对于不同浓度的候选试剂的荧光素酶活性。
具体实施方式
以下的描述和实施例详细说明本发明所公开的一些示例性实施方式。本领域技术人员将认识到本发明的许多变型和修改，所述变型和修改包含在本发明的范围内。因此，特定示例性实施方式的描述不应当被认为成限制本发明的范围。
利用表面等离子体共振将NCI/DTP库中的三千小分子进行筛选用于EWS-FLI1结合。化合物NSC635437被选定为合适的候选物用于进一步的优化和进一步的研究(图1)。在所设计的第一系列的类似物中，YK-4-279是最活跃的(图2)。YK-4-279已示出功能性抑制EWS-FLI1和ESFT细胞，并导致半胱天冬酶-3(caspase-3)活性的增加(Hyariye N Erkizan等.A small molecule blocking oncogenic protein EWS-FlI1interactin with RHAhelicase A inhibits growth of Ewing’s sarcoma.Nature Medicine 15(7)750-756(2009))。本申请涉及改进的化合物和使用所述化合物治疗例如尤文肉瘤的病症的方法。
定义
如本文所用，任何“R”基团，例如，但不限于R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、Ra、Rb，表示可以被连接到指定的原子的取代基。R基团可以是取代的或未取代的。如果两个“R”基团被描述为“合起来(taken together)”，则R基团与它们所连接的原子可以形成环烷基、芳基、杂芳基或杂环。例如，但不限于，如果NR1aR1b基团的R1a和R1b被指定为“合起来”，这意味着它们彼此共价键合形成环：
每当基团被描述为“可选地取代的”时，基团可以是未取代的或用一个或多个指定的取代基取代。同样地，当基团被描述为“未取代的或取代的”时，如果取代的，则一个或多个取代基可以选自一个或多个指定的取代基。如果没有取代基被指定，这意味着所指定的“可选地取代的”或“取代的”基团可单独且独立地被一个或多个基团取代，所述一个或多个基团选自烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤素、硫代羰基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、保护的C-羧基、O-羧基、异氰酸基、氰硫基、异氰硫基、硝基、甲硅烷基、亚氧硫基、亚磺酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤代甲烷磺酰基、三卤代甲烷磺酰氨基、氨基、单取代的氨基和二取代的氨基，以及它们的保护的衍生物。
如本文所用，“Ca至Cb”，其中“a”和“b”是整数，是指在烷基、烯基或炔基中的碳原子的数目，或在环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基基团的环中的碳原子的数目。也就是说，烷基、烯基、炔基、环烷基的环、环烯基的环、环炔基的环、芳基的环、杂芳基的环或杂脂环基的环，可以含有从“a”到“b”的碳原子，包括“a”和“b”。因此，例如，“C1至C4烷基”基团是指具有从1至4个碳原子的所有的烷基，即，CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。如果“a”和“b”没有指定用于烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基或杂脂环基基团，则在这些定义中所描述的最大范围被假定。
如本文所用，“烷基”是指直链或支链的烃链，其包括完全饱和(没有双键或三键)的烃基。该烷基可具有1至20个碳原子(每当在本文中出现时，数值范围例如“1至20”是指在给定范围内的每个整数；例如，“1至20个碳原子”是指该烷基可包括1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直到包括20个碳原子，但是本定义也涵盖没有标出数值范围的术语“烷基”的出现)。烷基也可以是具有1至10个碳原子的中等大小的烷基。烷基也可以是具有1至6个碳原子的低级烷基。化合物的烷基可以被命名为“C1-C4烷基”或类似的命名。仅作为举例，“C1-C4烷基”表示在烷基链中有一个至四个碳原子，即，该烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基基团包括但决不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。该烷基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“烯基”是指在直链或支链的烃链中含有一个或多个双键的烷基。烯基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“炔基”是指在直链或支链的烃链中含有一个或多个三键的烷基。炔基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“环烷基”是指完全饱和(没有双键或三键)的单环烃环系或多环烃环系。当两个或更多个环组成时，所述环可以用稠合方式连接在一起。环烷基可含有在环(一个或多个)中的3至10个原子或在环(一个或多个)中的3至8个原子。环烷基可以是未取代的或取代的。典型的环烷基包括但绝不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
如本文所用的“环烯基”是指在至少一个环中含有一个或多个双键的单环烃环系或多环烃环系；但是，如果存在多于一个的双键，则双键不能形成贯穿所有环的完全离域的π电子体系(否则该基团将是如本文所定义的“芳基”)。当两个或更多个环组成时，所述环可以用稠合方式连接在一起。环烯基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“环炔基”是指在至少一个环中含有一个或多个三键的单环烃环系或多环烃环系。如果存在多于一个的三键，则三键不能形成贯穿所有环的完全离域的π电子体系。当两个或更多个环组成时，所述环可以用稠合方式连接在一起。环炔基可以是未取代的或取代的。
如本文所用，“芳基”是指碳环(所有碳)单环或多环的芳族环系(包括稠环体系，其中两个碳环的环共用一个化学键)，其具有贯穿所有环的完全离域的π电子体系。在芳基中的碳原子的数目可以变化。例如，芳基可以是C6-C14芳基、C6-C10芳基或C6芳基。芳基的示例包括但不限于苯、萘和甘菊蓝(azulene)。芳基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子的单环或多环的芳族环系(环系具有完全离域的π电子体系)，杂原子即除碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫。在杂芳基的一个或多个环中的原子的数目可以变化。例如，杂芳基在一个或多个环中可含有4至14个原子、在一个或多个环中可含有5至10个原子或在一个或多个环中可含有5至6个原子。此外，术语“杂芳基”包括稠合环系，其中两个环，例如至少一个芳基环和至少一个杂芳基环，或至少两个杂芳基环，共用至少一个化学键。杂芳基环的示例包括但不限于呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、恶唑、苯并恶唑、1,2,3-恶二唑、1,2,4-恶二唑、噻唑、1,2,3-噻二唑、1,2,4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、吲哚、吲唑、吡唑、苯并吡唑、异恶唑、苯并异恶唑、异噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉和三嗪。杂芳基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“杂环基”或“杂脂环基”是指到三元、四元、五元、六元、七元、八元、九元、十元，直到18元的单环、双环和三环环系，其中，碳原子和从1至5个杂原子一起构成所述环系。杂环可选地可含有以这样方式定位的一个或多个不饱和键，然而，完全离域的π电子体系不贯穿所有环而出现。杂原子是除碳以外的元素，包括但不限于氧、硫和氮。杂环还可以含有一个或多个羰基或硫代羰基官能团，以便使该定义包括氧代体系和硫代体系，例如内酰胺、内酯、环状酰亚胺、环状硫代酰亚胺和环状氨基甲酸酯。当两个或更多个环组成时，所述环可以用稠合方式连接在一起。附加地，在杂脂环基中的任何氮原子可以被季铵化。杂环基或杂脂环基可以是未取代的或取代的。这种“杂环基”或“杂脂环基”的示例包括但不限于1,3-二恶英、1,3-二恶烷、1,4-二恶烷、1,2-二氧戊环、1,3-二氧戊环、1,4-二氧戊环、1,3-氧硫杂环己烷、1,4-氧硫杂环己二烯、1,3-氧硫杂环戊烷、1,3-二硫杂环戊二烯、1,3-二硫戊环、1,4-氧硫杂环己烷、四氢-1,4-噻嗪、2H-1,2-恶嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、三恶烷、六氢-1,3,5-三嗪、咪唑啉、咪唑烷、异恶唑啉、异恶唑烷、恶唑啉、恶唑烷、恶唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、吗啉、环氧乙烷、哌啶N-氧化物、哌啶、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮、吡咯烷二酮、4-哌啶酮、吡唑啉、吡唑烷、2-氧代吡咯烷、四氢吡喃、4H-吡喃、四氢噻喃、硫代吗啉、硫吗啉基亚砜、硫吗啉基砜、以及它们的苯并稠合类似物(例如苯并咪唑烷酮、四氢喹啉、3,4-亚甲二氧苯基)。
如本文所用，“芳烷基”和“芳基(烷基)”是指由低级亚烷基连接的作为取代基的芳基。芳烷基的低级亚烷基和芳基可以是取代的或未取代的。示例包括但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。
如本文所使用，“杂芳烷基”和“杂芳基(烷基)”是指由低级亚烷基连接的作为取代基的杂芳基。杂芳烷基的低级亚烷基和杂芳基可以是取代的或未取代的。示例包括但不限于：2-噻吩基烷基、3-噻吩基烷基、呋喃基烷基、噻吩基烷基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异恶唑基烷基和咪唑基烷基，以及它们的苯并稠合的类似物。
“(杂脂环基)烷基”和“(杂环)烷基”是指由低级亚烷基连接的作为取代基的杂环基或杂脂环基(heteroalicyclylic)。(杂脂环基)烷基的低级亚烷基和杂环基可以是取代的或未取代的。示例包括但不限于(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基、(哌啶-4-基)乙基、(哌啶-4-基)丙基、(四氢-2H-噻喃-4-基)甲基和(1,3-噻嗪(thiazinan)-4-基)甲基。
“低级亚烷基”是直链的-CH2-系链基团(tethering group)，通过它们的末端碳原子形成键以连接分子片段。示例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)和亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)。低级亚烷基可以通过使用取代基替代低级亚烷基的一个或多个氢而被取代，所述取代基在“取代的”的定义中列出。
如本文所用，“烷氧基”是指式-OR，式中R是如上定义的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基或环炔基。烷氧基的非限制性列表是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。烷氧基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“酰基”是指由羰基连接的作为取代基的氢、烷基、烯基、炔基或芳基。示例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯酰基。酰基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“羟烷基”是指在烷基中的一个或多个氢原子被羟基取代的烷基。示例性羟烷基包括但不限于2-羟乙基、3-羟丙基、2-羟丙基和2,2-二羟基乙基。羟烷基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“卤代烷基”是指在烷基中的一个或多个氢原子被卤素取代的烷基(例如，单卤代烷基、二卤代烷基和三卤代烷基)。这类基团包括但不限于氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟甲基、2-氟异丁基。卤代烷基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“卤代烷氧基”是指在烷氧基中的一个或多个氢原子被卤素取代的烷氧基(例如，单卤代烷氧基、二卤代烷氧基和三卤代烷氧基)。这类基团包括但不限于氯甲氧基、氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-氯-2-氟甲氧基和2-氟异丁氧基。卤代烷氧基可以是取代的或未取代的。
如本文所用，“芳氧基”和“芳硫基”是指RO-和RS-，其中R为芳基，例如但不限于苯基。芳氧基和芳硫基两者可以是取代的或未取代的。
“亚氧硫基”或“硫代”基团是指“-SR”基团，其中R可以是氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。亚氧硫基可以是取代的或未取代的。术语“亚氧硫基”或“硫代”包括，但不限于-SH基(也被称为“硫醇”基团)，和-SRA基团(当RA不为氢时，也被称为“硫醚”)。
“亚磺酰基”基团是指“-S(＝O)-R”基团，其中，R可以是与根据亚氧硫基所定义的相同的基团。亚磺酰基可以是取代的或未取代的。
“磺酰基”基团是指“SO2R”基团，其中，R可以是与根据亚氧硫基所定义的相同的基团。磺酰基可以是取代的或未取代的。
“O-羧基”基团是指“RC(＝O)O-”基团，其中，R可以是如本文所定义的氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。O-羧基可以是取代的或未取代的。
术语“酯”和“C-羧基”是指“-C(＝O)OR”基团，其中，R可以是与根据O-羧基所定义的相同的基团。酯和C-羧基可是取代的或未取代的。
“硫代羰基”基团是指“-C(＝S)R”基团，其中，R可以是与根据O-羧基所定义的相同的基团。硫代羰基可以是取代的或未取代的。
“三卤代甲烷磺酰基”基团是指“X3CSO2-”基团，其中，X为卤素。
“三卤代甲烷磺酰氨基”基团是指“X3CS(O)2N(RA)-”基团，其中，X是卤素并且R A为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。
如本文所使用的术语“氨基”是指-N(R)2基团，其中，R独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。氨基可以是取代的或未取代的。术语“氨基”包括但不限于-NH2基团(也被称为“铵”基)，-NHR基团(当R不是氢时，也被称为“仲胺”)或-NR2基团(当R不是氢时，也被称为“叔胺”)。
如本文所用，“羟基”是指-OH基团。
“氰基”基团是指“-CN”基团。
如本文所使用的术语“叠氮基”是指-N3基团。
“异氰酸基”基团是指“-NCO”基团。
“氰硫基”基团是指“-CNS”基团。
“异氰硫基”基团是指“-NCS”基团。
“巯基”基团是指“-SH”基团。
“羰基”基团是指C＝O基团。
“S-磺酰氨基”基团是指“-SO2N(RARB)”基团，其中，RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。S-磺酰氨基可以是取代的或未取代的。
“N-磺酰氨基”基团是指“RSO2N(RA)-”基团，其中，R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-磺酰氨基可以是取代的或未取代的。
“O-氨甲酰基”基团是指“-OC(＝O)N(RARB)”基团，其中，RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。O-氨甲酰基可以是取代的或未取代的。
“N-氨甲酰基”基团是指“ROC(＝O)N(RA)-”基团，其中，R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-氨甲酰基可以是取代的或未取代的。
“O-硫代氨甲酰基”基团是指“-OC(＝S)-N(RARB)”基团，其中，RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。O-硫代氨甲酰基可以是取代的或未取代的。
“N-硫代氨甲酰基”基团是指“ROC(＝S)N(RA)-”基团，其中，R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-硫代氨甲酰基可以是取代的或未取代的。
“C-酰氨基”基团是指“-C(＝O)N(RARB)”基团，其中，RA和RB可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。C-酰氨基可以是取代的或未取代的。
“N-酰氨基”基团是指“RC(＝O)N(RA)-”基团，其中，R和RA可以独立地为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、芳烷基或(杂脂环基)烷基。N-酰氨基可以是取代的或未取代的。
如本文所使用的术语“卤原子”或“卤素”是指，周期表第7族的元素中放射稳定的原子中的任何一个原子，例如氟、氯、溴和碘。
在未规定取代基的数目(例如卤代烷基)的情况下，则可以有一个或多个取代基存在。例如“卤代烷基”可以包括一个或多个相同的或不同的卤素。作为另一个示例，“C1-C3烷氧基苯基”可以包括一个或多个相同或不同的含有一个、两个或三个原子的烷氧基。
如本文所使用，任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写，除非另有说明，均符合其通常的用法、公认的缩写或IUPAC-IUB委员会对生物化学的命名法(参见，Biochem.11：942-944(1972))。
应当理解，本文所述的化合物可以同位素标记。使用同位素如氘取代可提供由于较大的代谢稳定性所带来的特定治疗优势，例如，增加体内半衰期或降低剂量需求。在化合物结构中所代表的每种化学元素可以包括所述元素的任何同位素。例如，在化合物结构中可以明确公开或理解氢原子存在于化合物中。氢原子可以存在于化合物的任何位置中，氢原子可以是氢的任何同位素，包括但不限于氢-1(氕)和氢-2(氘)。因此，本文提及的化合物包括所有可能的同位素形式，除非上下文另有明确说明。
可以理解，本文所描述的方法和组合物包括晶体形式(也被称为多晶型物，其包括相同元素组成的化合物的不同晶体堆积排列)、无定形相、盐、溶剂化物和水合物。在一些实施方式中，本文所描述的化合物与药学上可接受的溶剂以溶剂化的形式存在，该溶剂例如水、乙醇等。在其它实施方式中，本文所述的化合物以非溶剂化的形式存在。溶剂化物含有化学计量的量或非化学计量的量的溶剂，并且可以在结晶过程期间与药学上可接受的溶剂形成，该溶剂例如水、乙醇等。当溶剂是水时形成水合物，或当溶剂是醇时形成醇化物。此外，本文所提供的化合物可以以非溶剂化的形式以及溶剂化的形式存在。一般而言，为了本文所提供的化合物和方法的目的，溶剂化的形式被认为等同于非溶剂化的形式。
当提供数值范围时，应当理解，上限和下限以及在该范围的上限和下限之间的每个中间值被包括在实施方式中。
特定的合成方法
在一些实施方式中，将适当的苯乙酮(4.0当量)和催化剂量的二乙胺(10滴)加入到4,7-二氯靛红(1.0当量)的甲醇溶液(5mL)中。将混合物在室温下搅拌，直到起始材料(4,7-二氯靛红)完全消失。将所得溶液浓缩并用于急骤层析中，使用己烷/乙酸乙酯洗脱，得到定量产率的纯产物。使用己烷/乙酸乙酯通过重结晶进行进一步纯化。使用Varian-400光谱仪(400MHz)记录NMR氢谱(1H)，以ppm表示化学位移(δ)，低磁场以四甲基硅烷作为内标，耦合常数(J-值)以赫兹(Hz)表示。元素分析由Atlantic Microlabs执行。
本文提供的特定的化合物可以根据以下的合成方案来制备。
在这些方案中，将酮(4.0当量)和催化剂量的二乙胺(10滴)加入到取代的靛红(1.0当量)的甲醇溶液(5mL)中。将混合物在室温下搅拌，直到起始材料(取代的靛红)完全消失。将所得溶液浓缩，并用于急骤层析中，使用己烷/乙酸乙酯洗脱，得到定量产率的纯产物。使用己烷/乙酸乙酯通过重结晶进行进一步纯化。
包括在连接两个环系的基团中的碳-碳双键的抑制剂可以由相应的饱和的抑制剂通过使用本领域公知的合成技术还原该化合物来制备。
特定的化合物
本文所提供的特定化合物包括具有下式的化合物：
式中，R1选自氢、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸、
R3、R4、R5、R9和R14各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R10、R11、R12和R13各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；R6为C1-6二烷基胺；R7选自氢和C1-6烷基；R8和R15各自独立地为C1-6烷基；n为从0至4的整数；其条件为R3、R4、R5、R9和R14中的至少一个选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。
在一些实施方式中，R1选自亮氨酸(Leu)、亮氨酸-天冬氨酸(Leu-Asp)、亮氨酸-天冬氨酸-丙氨酸(Leu-Asp-Ala)、-CH2-C(＝O)-NHCH2COOH、-CH2-C(＝O)-(CH2)C(CH3)2、
在一些实施方式中，R3选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15。
在一些实施方式中，R3为-N(CH3)2。
在一些实施方式中，R3为-SCH3。
在一些实施方式中，式(I)的化合物具有式：
在一些实施方式中，式(I)的化合物具有式：
根据存在的取代基，小分子抑制剂可以是药学上可接受的盐的形式。如本文中所使用的术语“药学上可接受的盐”是广义上的术语，对本领域普通技术人员来说是被给予的普通和惯用的含义(并且不被限于特定的或专用的含义)，并且是指但不限于由药学上可接受的、无毒的酸或碱制备的盐。合适的药学上可接受的盐包括金属盐(例如，铝盐、锌盐)、碱金属盐(例如锂盐、钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)；有机盐，例如赖氨酸、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普鲁卡因和三羟甲基氨基甲烷(tris)的盐；游离酸和碱的盐；无机盐，例如硫酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐；以及其它盐，该盐目前广泛在药学上使用并列在那些本领域技术人员公知的来源中，例如默克索引(The Merck Index)。任何合适的成分可以被选择以制成在此所讨论的治疗试剂的盐，只要它是无毒的并且基本上不干扰所期望的活性。
优选的实施方式的化合物可以包括同分异构体、外消旋体、光学异构体、对映体、非对映体、互变异构体、以及顺式/反式构象异构体。所有这些异构体形式都包括在优选的实施方式中，包括它们的混合物。如上面所讨论的，优选的实施方式的化合物可具有手性中心，例如，它们可以含有不对称碳原子，因此可以以对映体或非对映异构体和它们的混合物的形式存在，例如外消旋物。不对称碳原子可以以(R)-构型、(S)-构型或(R,S)-构型存在，优选以(R)-构型或(S)-构型存在，或可以作为混合物存在。同分异构体混合物可根据需要按照常规方法被分离来获得纯的同分异构体。
该化合物可以是无定形的形式或晶体的形式。优选实施方式的化合物的晶体形式可以以多晶型存在，其被包含在优选的实施方式中。此外，优选的实施方式的一些化合物也可以与水或其它有机溶剂形成溶剂化物。这种溶剂化物也同样包括在优选的实施方式的范围之内。
特定的药物组合物
通常优选地以静脉内或皮下的单位剂型施用优选的实施方式的抑制剂；然而，也可以考虑其它施用途径。预期的施用途径包括但不限于口服、肠胃外注射、静脉内注射和皮下注射。优选的实施方式的抑制剂可以被配制成液体制剂，例如，用于口服。合适的剂型包括混悬剂、糖浆剂、酏剂等。特别优选的用于口服的单位剂型包括片剂和胶囊。特别优选的是配置成一天服用一次的单位剂型；然而，在特定的实施方式中可以期望配置用于一天服用两次、或者一天服用多次的单位剂型。
优选的实施方式的药物组合物优选与接受者的血液或其它体液等渗。组合物的等渗性可以使用酒石酸钠、丙二醇或其它无机溶质或有机溶质来获得。氯化钠是特别优选的。可以使用缓冲剂，例如乙酸及其盐、柠檬酸及其盐、硼酸及其盐、以及磷酸及其盐。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer’s dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏油或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。
该药物组合物的粘度可以使用药学上可接受的增稠剂保持在选定的水平。甲基纤维素是优选的，因为它容易得到和经济使用，并且易于起作用。其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于选定的增稠剂。优选地使用将达到选定的粘度的量。粘性的组合物通常在溶液中加入这样的增稠剂来制备。
药学上可接受的防腐剂可用于增加药物组合物的保质期。苄醇可是适合的，但是也可以采用多种防腐剂，防腐剂包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇或苯扎氯铵。基于组合物的总重量计，防腐剂的合适的浓度通常为约0.02％至约2％，但是根据选定的试剂，可以期望较多或较少的量。如上文所述的还原剂可以有利地用于保持制剂良好的保质期。
优选的实施方式的抑制剂可以是具有合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)的混合物，并且可以含有辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝添加剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、色素等，这取决于施用途径和所需的制剂。参见例如，“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”，LippincottWilliams&Wilkins；第20版(2003年6月1日)以及“Remington’s PharmaceuticalSciences”，Mack出版公司；第18版和第19版(分别为1985年12月和1990年6月)。这种制剂可以包括络合剂、金属离子、聚合物(例如聚乙酸、聚羟基乙酸、水凝胶、葡聚糖等)、脂质体、微乳、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或球芽。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于单甘油酯、双甘油酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。这种附加组分的存在可以影响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放速率和体内清除速率，因此可以根据预期应用选择，使得载体的特性对选定的施用途径是适应的。
对于口服，药物组合物可作为片剂、水性混悬剂或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂。根据本领域中已知的用于药物组合物制备的方法可以制备用于口服使用的组合物，并且该组合物可以包括一种或多种以下试剂：甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。水性混悬剂可以含有活性成分以及适合于制备水性混悬剂的赋形剂。
用于口服使用的制剂也可以提供为硬明胶胶囊，其中一种或多种活性成分与惰性固体稀释剂混合，稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土，或者提供为软明胶胶囊。在软胶囊中，抑制剂可被溶解或混悬在合适的液体中，液体例如水或油介质，例如花生油、橄榄油、脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。用于口服配制的稳定剂和微球体也可以被使用。胶囊可包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂制成的软的密封胶囊，增塑剂例如甘油或山梨糖醇。推入配合胶囊可以含有活性成分以及填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)和可选的稳定剂。
片剂可以是未包衣的或利用已知的方法进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供在更长的时间内的持续作用。例如，可以使用延时材料例如单硬脂酸甘油酯。当以固体形式施用时，例如片剂形式，所述固体形式典型地含有约0.001wt.％或更低至约50wt.％或更多的一种或多种活性成分，优选为从约0.005wt.％、0.01wt.％、0.02wt.％、0.03wt.％、0.04wt.％、0.05wt.％、0.06wt.％、0.07wt.％、0.08wt.％、0.09wt.％、0.1wt.％、0.2wt.％、0.3wt.％、0.4wt.％、0.5wt.％、0.6wt.％、0.7wt.％、0.8wt.％、0.9wt.％或1wt.％至约2wt.％、3wt.％、4wt.％、5wt.％、6wt.％、7wt.％、8wt.％、9wt.％、10wt.％、15wt.％、20wt.％、25wt.％、30wt.％、35wt.％、40wt.％或45wt.％。
片剂可以含有活性成分，是具有无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物，赋形剂包括惰性材料。例如，片剂可以通过压制或模制，可选地利用一种或多种附加成分来制备。压制的片剂可以通过在合适的机器中压制呈自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性成分来制备，该活性成分可选地混合有粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂。模制片剂可通过在合适的机器中将用惰性液体稀释剂润湿的粉状抑制剂的混合物模制来制成。
优选地，每个片剂或胶囊含有从约1mg或更少到约1000mg或更多的优选的实施方式的抑制剂，更优选为从约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg至约150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg或900mg。最优选地，片剂或胶囊剂在剂量的范围内被提供，以允许分开剂量被施用。因此对患者适合的剂量和每日给药剂量的次数可以方便地选择。在特定的实施方式中，可以优选地将两种或更多种待被施用的治疗剂合并到单独的片剂或其它剂型中(例如，在组合疗法中)；然而，在其它的实施方式中，优选地，可以分开的剂型提供治疗剂。
合适的惰性材料包括稀释剂例如碳水化合物、甘露醇、乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖、淀粉等，或无机盐例如磷酸三钙、磷酸钙、磷酸钠、碳酸钙、碳酸钠、碳酸镁和氯化钠。崩解剂或粒化剂可以被包括在制剂中，例如淀粉(例如玉米淀粉)、藻酸、羟乙酸淀粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土、不溶性阳离子交换树脂、粉末状树胶(例如琼脂、刺梧桐树胶或黄芪胶)、或藻酸或它们的盐。
粘合剂可以被用于形成硬片剂。粘合剂包括来自天然产物的材料，例如阿拉伯胶、黄芪胶、淀粉和明胶、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。
润滑剂，例如硬脂酸或它的镁盐或钙盐、聚四氟乙烯、液体石蜡、植物油和蜡、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、聚乙二醇、淀粉、滑石、热解硅石、水合硅铝酸盐等，可以包括在片剂制剂中。
表面活性剂也可以被使用，例如，阴离子洗涤剂例如十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠，阳离子洗涤剂例如苯扎氯铵或苄索氯铵，或者非离子洗涤剂例如聚氧乙烯氢化蓖麻油、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素或羧甲基纤维素。
控释制剂可以被采用，其中氨磷汀或它的一种或多种类似物包含在惰性基质中，其允许通过扩散或沥滤机制而释放。缓慢退化的基质也可以包含在制剂中。其它递送系统可以包括定时释放递送系统、延迟释放递送系统或持续释放递送系统。
涂层可以被使用，例如，非肠溶性材料，如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯酮和聚乙二醇，或肠溶性材料，如邻苯二甲酸酯。染料或颜料可以被添加用于识别或表征不同组合的抑制剂剂量。
当以液体形式口服施用时，液体载体例如水、石油、动物来源的油或植物来源的油例如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油、或合成的油可以加入到一种或多种活性成分中。生理盐水溶液、右旋糖或其它糖溶液、或二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇也是适合的液体载体。药物组合物还可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油；矿物油，例如液体石蜡；或它们的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶，例如阿拉伯胶和黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；由脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或偏酯，例如山梨聚糖单油酸酯；以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。该乳剂也可含有甜味剂和调味剂。
也可使用肺部递送。当吸气时，化合物被输送到肺部并穿过肺部上皮层到血流中。可以使用广泛的设计成用于治疗产品的肺部递送的机械装置，包括但不限于喷雾器、定量药物吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟知的。这些装置采用适合于化合物分配的制剂。通常，每种制剂对所采用的装置的类型是特定的，除了在治疗中有用的稀释剂、佐剂和/或载体外，还可以包括使用适当的推进剂材料。
有利地，该化合物和/或其它可选的活性成分以颗粒形式被制备用于肺部递送，颗粒具有从0.1μm或更小至10μm或更大的平均粒径，更优选地从约0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm或0.9μm至约1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm或9.5μm。用于抑制剂的肺部递送的药学上可接受的载体包括碳水化合物，例如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨醇。在制剂中使用的其它成分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可以使用天然的表面活性剂或合成的表面活性剂，包括聚乙二醇和葡聚糖，例如环糊精。胆汁盐和其它相关的增强剂、以及纤维素和纤维素衍生物和氨基酸也可被使用。也可使用脂质体、微胶囊、微球、包合复合物和其它类型的载体。
适合通过喷射型或超声型的雾化器使用的药物制剂，通常包括以每毫升(mL)溶液约0.01mg或更少至100mg或更多的抑制剂的浓度而溶解或混悬在水中的抑制剂，优选地每毫升溶液从约0.1mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg至约15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg或90mg。该制剂也可包括缓冲剂和单糖(例如，用于蛋白质稳定化和渗透压的调节)。喷雾器制剂还可含有表面活性剂，以减少或防止由溶液雾化形成气溶胶引起的抑制剂的表面诱导团聚。
利用定量吸入器装置使用的制剂通常包括精细粉末，该粉末含有在表面活性剂的帮助下混悬在推进剂中的活性成分。推进剂可以包括常规的推进剂，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃和烃。优选的推进剂包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇、1,1,1,2-四氟乙烷以及它们的组合。合适的表面活性剂包括脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、和油酸。
用于从粉末吸入器装置中分配的制剂通常包括含有抑制剂的精细干粉，可选地包括利于粉末从吸入器装置分配的量的填充剂，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，该量通常为制剂的约1wt.％或更少至制剂的99wt.％或更多，优选为从制剂的约5wt.％、10wt.％、15wt.％、20wt.％、25wt.％、30wt.％、35wt.％、40wt.％、45wt.％或50wt.％至约55wt.％、60wt.％、65wt.％、70wt.％、75wt.％、80wt.％、85wt.％或90wt.％。
当优选的实施方式的化合物通过静脉内注射、肠胃外注射或其它注射施用时，优选以无热源的、肠胃外可接受的水溶液或油性混悬剂的形式。混悬剂可以根据本领域公知的方法使用合适的分散剂或润湿剂和混悬剂来配制。具有合适的pH、等渗性、稳定性等的可接受的水溶液的制备是在本领域的技术范围内。用于注射的优选的药物组合物，优选含有等渗载体例如1,3-丁二醇、水、等渗氯化钠溶液、林格氏溶液、右旋糖溶液、右旋糖和氯化钠溶液、乳化林格氏液或本领域已知的其它载体。此外，无菌的不挥发性油可通常用作溶剂或混悬介质。为了这个目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。此外，例如油酸的脂肪酸同样可被用于形成可注射制剂。药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。
注射的持续时间可以根据各种因素进行调整，并且可以包括在连续静脉给药的几秒钟或更少至0.5小时、0.1小时、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或更长时间的过程内施用的单次注射。
优选的实施方式的化合物可以附加地使用在药物组合物中常规发现的附属组分，附属组分以其领域既定的方式并且在其领域既定的水平上。因此，例如，组合物可以含有用于组合疗法的额外的相容的药学上活性材料(例如补充的抗微生物剂、止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂、抗炎剂、还原剂、化学治疗剂等)，或可含有用于通过物理方法配制的优选实施方式的各种剂型的材料，例如赋形剂、染料、增稠剂、稳定剂、防腐剂或抗氧化剂。可与优选的实施方式的化合物组合使用的抗癌剂，包括但不限于长春花生物碱，例如长春碱和长春新碱；蒽环类，例如阿霉素、柔红霉素、表阿霉素；蒽类，例如比生群和米托蒽醌；表鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼泊苷；以及其它抗癌药物，例如放线菌素D(actinomyocin D)、丝裂霉素C(mithomycin C)、光辉霉素、甲氨蝶呤、多烯紫杉醇、依托泊苷(VP-16)、紫杉醇、多烯紫杉醇和亚德里亚霉素)；以及免疫抑制剂(例如环孢霉素A、他克莫司)。在一些实施方式中，本文提供的化合物、组合物和方法可结合有组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC)、极光激酶抑制剂、脱甲基化试剂(例如5-AZA胞苷)、具有自然杀伤细胞的免疫疗剂、IGF-IR抗体、尤因抗原的抗体、免疫抑制药物和羟基脲。组蛋白脱乙酰酶抑制剂的示例包括伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、丙戊酸、N-羟基-3-(3-苯基氨基磺酰基苯基)丙烯酰胺(belinostat)、N-(2-氨基苯基)-4-([[4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基]氨基]甲基)苯甲酰胺(mocetinostat)、[4-[(羟基氨基)羰基]苯基]氨基甲酸[6-[(二乙基氨基)甲基]-2-萘基]甲酯(givinostat)和曲古抑菌A。极光激酶抑制剂的示例包括ZM447439、N-[2,3-二氢-2-氧代-3-[(3Z)-苯基[[4-(1-哌啶基甲基)苯基]氨基]亚甲基]-1H-吲哚-5-基]乙磺酰胺(hesperadin)和VX-680。脱甲基化剂的示例包括5-氮杂胞苷、5-氮杂脱氧胞苷和普鲁卡因。免疫抑制药物的示例包括6-巯基嘌呤和硫唑嘌呤。
特定的试剂盒
优选的实施方式的化合物可以以试剂盒的形式被提供给给药医师或其他健康护理专业人员。该试剂盒是包装盒，该包装盒容纳容器，该容器含有在合适的药物组合物中的化合物，以及对受试者施用药物组合物的说明书。该试剂盒可选地还可含有一种或多种附加治疗试剂，例如，目前用于治疗本文所描述的肉瘤的化疗试剂。例如，可提供含有与一种或多种附加的化疗试剂组合的一种或多种组合物的试剂盒，该组合物包含优选实施方式的化合物，或者可以提供单独的含有优选实施方式的抑制剂的药物组合物和附加的治疗试剂。该试剂盒还可以含有单独剂量的优选实施方式的化合物以用于连续给药或顺序给药。该试剂盒可选地可含有一个或多个诊断工具和使用说明书。该试剂盒可以含有合适的递送器件，例如注射器等，以及用于施用一种或多种抑制剂和任何其它治疗试剂的说明书。该试剂盒可选地可含有说明书以用于所包括的任何或所有的治疗试剂的储存、重构(如果适用)以及施用。该试剂盒可包括多个容器，多个容器表明给予受试者施用的数目。
特定的治疗方法
本文提供的一些实施方式涉及治疗的尤文肉瘤家族肿瘤(ESFT)的方法。ESFT含有独特的融合蛋白EWS-FLI1。ESFT影响在年龄3至40岁之间的患者，多数情况发生在第二个十年中。虽然ESFT所来源的胚胎细胞类型是未知的，但是肿瘤通常极其靠近骨生长，但可发生为软组织肿块。超过40％的存在局部肿瘤的患者将发展成复发性疾病，这些人的大多数都将死于ESFT，然而尽管高剂量化疗，75％至80％的存在转移性ESFT的患者将在5年内死亡(Grier HE,Krailo MD,Tarbell NJ,等.Addition of ifosfamide and etoposide tostandard chemotherapy for Ewing's sarcoma and primitive neuroectodermal tumorof bone.N Engl J Med 2003；348(8):694-701)。这些存活率在过去的20年中并没有改善，即使在剂量加大的化疗之后。为了提高存活并且降低治疗相关的发病率，在优选的实施方式中所提供的用于治疗ESFT患者的新型靶向策略可以被使用。
ESFT的特征在于易位，在95％的肿瘤中在位于22号染色体上EWS基因(尤文肉瘤)的中央外显子到ets家族基因的中央外显子之间会发生易位，ets家族基因为位于11号染色体上的FLI1(Friend白血病插入)基因，t(11；22)；或ets家族基因为位于21号染色体上的ERG基因，t(21；22)。EWS-FLI1的融合转录编码具有两个主要结构域的55kDa蛋白质(约68kD的电泳运动)。EWS结构域是一种强效的转录激活因子，而FLI1结构域含有高度保守的etsDNA结合域(May WA,Lessnick SL,Braun BS,等.The Ewing's sarcoma EWS/FLI-1 fusiongene encodes a more potent transcriptional activator and is a more powerfultransforming gene than FLI-1.Mol Cell Biol 1993；13(12):7393-8)；将所得的EWS-FLI1融合蛋白作为异常转录因子。小鼠成纤维细胞的EWS-FLI1转化需要EWS和FLI1两者的功能域是完整的(May WA,Gishizky ML,Lessnick SL，等.Ewing sarcoma 11；22translocation produces a chimeric transcription factor that requires the DNA-binding domain encoded by FLI1 for transformation.Proc Natl Acad Sci U S A1993；90(12):5752-6)。
EWS-FLI1是重要的治疗靶标，因为它仅在肿瘤细胞中表达并且需要保持ESFT细胞系的生长。使用反义寡脱氧核苷酸(ODN)(Toretsky JA,Connell Y,Neckers L,BhatNK.Inhibition of EWS-FLI-1 fusion protein with antisenseoligodeoxynucleotides.J Neurooncol 1997；31(1-2):9-16；Tanaka K,Iwakuma T,Harimaya K,Sato H,Iwamoto Y.EWS-Fli1 antisense oligodeoxynucleotide inhibitsproliferation of human Ewing's sarcoma and primitive neuroectodermal tumorcells.J Clin Invest 1997；99(2):239-47)或小干扰RNA(siRNA)(Ouchida M,Ohno T,Fujimura Y,Rao VN,Reddy ES.Loss of tumorigenicity of Ewing's sarcoma cellsexpressing antisense RNA to EWS-fusion transcripts.Oncogene 1995；11(6):1049-54；Maksimenko A,Malvy C,Lambert G,等.Oligonucleotides targeted against ajunction oncogene are made efficient by nanotechnologies.Pharm Res 2003；20(10):1565-7；Kovar H,Aryee DN,Jug G,等，EWS/FLI-1 antagonists induce growthinhibition of Ewing tumor cells in vitro.Cell Growth Differ 1996；7(4):429-37)降低EWS-FLI1的表达水平，引起裸鼠ESFT细胞系增殖的降低和肿瘤的消退。在纳米技术上的最新进展提高了siRNA的传递和控制释放，但利用当前技术，在人体中通过反义ODN或siRNA降低EWS-FLI1是不可能的(Maksimenko A,Malvy C,Lambert G,等.Oligonucleotides targeted against a junction oncogene are made efficient bynanotechnologies.Pharm Res 2003；20(10):1565-7；Lambert G,Bertrand JR,Fattal E,等，EWS fli-1 antisense nanocapsules inhibits Ewing sarcoma-related tumor inmice.Biochem Biophys Res Commun 2000；279(2):401-6)。对于EWS-FLI1靶向的有趣方法使用siRNA降低的EWS-FLI1和小分子库之间的比较表达，这些小分子使用阿糖胞苷(Ara-C)进行目前的临床试验(Stegmaier K,Wong JS,Ross KN,等.Signature-based smallmolecule screening identifies cytosine arabinoside as an EWS/FLI modulator inEwing sarcoma.PLoS medicine 2007；4(4):e122)。鉴定Ara-C的方法还表明阿霉素和嘌呤霉素会降低EWS-FLI1水平。阿霉素是目前使用的用于ESFT患者的标准疗法，然而，存活率远不是可接受的(Grier HE,Krailo MD,Tarbell NJ,等.Addition of ifosfamide andetoposide to standard chemotherapy for Ewing's sarcoma and primitiveneuroectodermal tumor of bone.N Engl J Med 2003；348(8):694-701)。目前正在II期试验中，评估Ara-C在ESFT患者中的使用。虽然希望这代表了需要的临床突破，但其肯定证明EWS-FLI1的小分子靶向的重要性。优选的实施方式提供的小分子蛋白-蛋白互作抑制剂(SMPPII)，其破坏EWS-FLI1与关键蛋白伴侣结合，从而实现EWS-FLI1的肿瘤特异性和更精确的定位。
有足够的证据得出，EWS-FLI1融合蛋白的功能不同于未易位的EWS或FLI1(MayWA,Gishizky ML,Lessnick SL,等.Ewing sarcoma 11；22 translocation produces achimeric transcription factor that requires the DNA-binding domain encoded byFLI1 for transformation.Proc Natl Acad Sci U S A 1993；90(12):5752-6)。与缺少EWS-FLI1表达的肿瘤相比较，采自表达ESFT患者的肿瘤细胞或者表达EWS-FLI1的细胞系的基因表达谱的改变(Braun BS,Frieden R,Lessnick SL,May WA,DennyCT.Identification of target genes for the Ewing's sarcoma EWS/FLI fusionprotein by representational difference analysis.Mol Cell Biol 1995；15(8):4623-30)，表明EWS-FLI1可能在转录调节上起作用(Khan J,Wei JS,Ringner M,等.Classification and diagnostic prediction of cancers using gene expressionprofiling and artificial neural networks.Nat Med 2001；7(6):673-9；Baer C,NeesM,Breit S,等.Profiling and functional annotation of mRNA gene expression inpediatric rhabdomyosarcoma and Ewing's sarcoma.Int J Cancer 2004；110(5):687-94)。虽然EWS-FLI1调节的基因表达的机制的清晰画面还未呈现，但是该活性可能是在EWS-FLI1和RNA合成及剪接的调节子之间的直接互作或二级互作的结果(Uren A,ToretskyJA.Ewing's Sarcoma Oncoprotein EWS-FLI1:the Perfect Target without aTherapeutic Agent.Future Onc 2005；1(4):521-8)。
因为EWS-FLI1仅在肿瘤细胞中表达，故其是好的治疗靶标；然而，靶向这种肿瘤特异性致癌基因的能力先前还没有成功。朝向小分子发展的挑战之一是EWS-FLI1缺少任何已知的酶结构域，并且酶结构域已被认为对于靶向治疗是关键的。此外，EWS-FLI1是无序蛋白，表明它不表现出刚性结构，该刚性结构可以被用于基于结构的药物设计(Uren A,Tcherkasskaya O,Toretsky JA.Recombinant EWS-FLI1 oncoprotein activatestranscription.Biochemistry 2004；43(42):13579-89)。事实上，EWS-FLI1的无序性质是其转录调节的关键(Ng KP,Potikyan G,Savene RO,Denny CT,Uversky VN,LeeKA.Multiple aromatic side chains within a disordered structure are criticalfor transcription and transforming activity of EWS family oncoproteins.ProcNatl Acad Sci U S A 2007；104(2):479-84)。无序蛋白质特别因为它们的生化无序的性能，对于小分子蛋白-蛋白互作抑制剂被认为是更具吸引力的靶标(Cheng Y,LeGall T,Oldfield CJ,等.Rational drug design via intrinsically disorderedprotein.Trends Biotechnol 2006；24(10):435-42)。
在体外和体内EWS-FLI1结合RNA解旋酶A。人们认为，EWS-FLI1的蛋白-蛋白互作可有助于其致癌潜能；因此，已经寻求直接与EWS-FLI1相互作用并且功能性调节EWS-FLI1的新的蛋白。有转录活性的重组体EWS-FLI1(Uren A,Tcherkasskaya O,ToretskyJA.Recombinant EWS-FLI1 oncoprotein activates transcription.Biochemistry2004；43(42):13579-89)被用作靶标以用于筛选商用噬菌体展示肽库。区别地结合EWS-FLI1的二十八个新型肽根据噬菌体测序被鉴定。国立生物技术信息中心的数据库搜索与这些肽同源的人类蛋白，鉴定出一种肽，该肽和人类的RNA解旋酶A(RHA，基因库登录号A47363)的氨基酸823-832是同源的(Toretsky JA,Erkizan V,Levenson A,等.Oncoprotein EWS-FLI1 activity is enhanced by RNA helicase A.Cancer Res 2006；66(11):5574-81)。
RHA，高度保守的DEXD/H盒解旋酶家族蛋白中的一员，是人类转录组的一个完整的、多功能的成员(Zhang S,Grosse F.Multiple functions of nuclear DNA helicaseII(RNA helicase A)in nucleic acid metabolism.Acta Biochim Biophys Sin(上海)2004；36(3):177-83；von Hippel PH,Delagoutte E.A general model for nucleic acidhelicases and their"coupling"within macromolecular machines.Cell 2001；104(2):177-90)。这些蛋白涉及来自古生菌、真细菌、低级真核生物和高级真核生物的多种生物体和一些病毒(包括黄病毒科(Flavivirus family)的正义RNA病毒)中不同的功能。RHA是用于NF-κB的转录辅活化因子，并已示出与Creb结合蛋白(CBP)(Nakajima T,Uchida C,Anderson SF,等.RNA helicase A mediates association of CBP with RNA polymeraseII.Cell 1997；90(6):1107-12)、RNA聚合酶II(Nakajima T,Uchida C,Anderson SF,等.RNA helicase A mediates association of CBP with RNA polymerase II.Cell 1997；90(6):1107-12)、乳腺癌的肿瘤抑制子BRCA1(Anderson SF,Schlegel BP,Nakajima T,Wolpin ES,Parvin JD.BRCA1 protein is linked to the RNA polymerase IIholoenzyme complex via RNA helicase A.Nat Genet 1998；19(3):254-6)、以及最近的EWS-FLI1(Toretsky JA,Erkizan V,Levenson A,等.Oncoprotein EWS-FLI1 activity isenhanced by RNA helicase A.Cancer Res 2006；66(11):5574-81)形成复合物。EWS-FLI1与RHA的区域结合，该区域是独特的并且不被认为是任何其它RHA结合伴侣的结合位点(Toretsky JA,Erkizan V,Levenson A,等.Oncoprotein EWS-FLI1 activity isenhanced by RNA helicase A.Cancer Res 2006；66(11):5574-81)。RHA表达增强EWS-FLI1介导的锚定非依赖性集落形成，而RHA的失活突变防止集落形成(Toretsky JA,Erkizan V,Levenson A,等.Oncoprotein EWS-FLI1 activity is enhanced by RNAhelicase A.Cancer Res 2006；66(11):5574-81)。这种结构和功能的互作是用于优选的实施方式的治疗试剂的基础。
尽管转录在肿瘤发生中的重要性，但是解旋酶在这一过程中的作用还没有被充分研究。RHA是具有不同功能的人类转录组的主要成员(Zhang S,Grosse F.Multiplefunctions of nuclear DNA helicase II(RNA helicase A)in nucleic acidmetabolism.Acta Biochim Biophys Sin(上海)2004；36(3):177-83；von Hippel PH,Delagoutte E.A general model for nucleic acid helicases and their"coupling"within macromolecular machines.Cell 2001；104(2):177-90)。我们最近公布的数据示出，RHA与多功能EWS-FLI1癌蛋白相互作用(Toretsky JA,Erkizan V,Levenson A,等.Oncoprotein EWS-FLI1 activity is enhanced by RNA helicase A.Cancer Res2006；66(11):5574-81)。这种相互作用可以解释观察到的EWS-FLI1在转录起始和转录后的RNA修饰中的作用。RNA解旋酶也被得知结合并充当一些相同因子的桥梁，这些相同的因子已被鉴定为EWS-FLI1结合伴侣，包括剪接因子U1C(Chen JY,Stands L,Staley JP,Jackups RR,Jr.,Latus LJ,Chang TH.Specific alterations of U1-C protein or U1small nuclearRNA can eliminate the requirement of Prp28p,an essential DEAD box splicingfactor.Mol Cell 2001；7(1):227-32；Knoop LL,Baker SJ.The splicing factor U1Crepresses EWS/FLI-mediated transactivation.J Biol Chem 2000；275(32):24865-71)、Creb结合蛋白(CBP)(Nakajima T,Uchida C,Anderson SF,等.RNA helicase Amediates association of CBP with RNA polymerase II.Cell 1997；90(6):1107-12)和RNA聚合酶II(Nakajima T,Uchida C,Anderson SF,等.RNA helicase A mediatesassociation of CBP with RNA polymerase II.Cell 1997；90(6):1107-12)。RHA可以执行类似的功能用于EWS-FLI1和RNA聚合酶II，在关键加工蛋白的补充中起作用。RHA还可通过保持EWS-FLI1作为大型转录复合物的一部分而有助于ESFT肿瘤发生，该复合物的功能依赖于作为能量源的RHA的ATP酶活性。最后，解旋酶，例如RHA，可以稳定mRNA种类(Iost I,Dreyfus M.mRNAs can be stabilized by DEAD-box proteins.Nature 1994；372(6502):193-6)。EWS-FLI1通过RHA转录的mRNA的稳定化和代谢可以增加EWS-FLI1的致癌性质。
尽管EWS-FLI1对于ESFT细胞是非常特异的，但是EWS和RHA被普遍地表达。在EWS-FLI1和RHA之间的区域被可具有特异性的分子治疗剂靶向；因为EWS-FLI1仅在肿瘤中表达，与RHA的互作点可以是唯一的。治疗试剂，即，小分子蛋白-蛋白互作抑制剂，在此提供以抑制EWS-FLI1的功能。
大多数易位融合蛋白肉瘤预示不良的预后，包括ESFT。染色体易位t(11；22)，导致了独特而关键的融合蛋白EWS-FLI1，是一种极好的癌症靶标。许多其他的肉瘤有类似的易位变型(表2来自Helman LJ,Meltzer P.Mechanisms of sarcoma development.Nat RevCancer 2003；3(9):685-94)。
已经报道了在胰腺的实性假乳头状肿瘤(solid pseudopapillaryneoplasms)中EWS-FLI1易位(Maitra A.,等Detection of t(11；22)(q24；q12)translocation and EWS-FLI-1 fusion transcript in a case of solid pseudopapillary tumor of thepancreas.Pediatr Dev Pathol 2000；3:603-605)，然而EWS-FLI1在所有的实性假乳头状肿瘤中的作用仍有待解决(Katharina Tiemann等,Solid pseudopapillary neoplasms ofthe pancreas are associated with FLI-1 expression,but not with EWS/FLI-1translocation)。
EWS同源物或FLI1同源物是在大范围的肉瘤和白血病中发生的易位伴侣。EWS，或其同源物TLS或FUS，涉及透明细胞肉瘤、粘液状肉瘤、促结缔组织增生小圆细胞肿瘤、软骨肉瘤和急性髓性白血病的染色体易位。FLI1属于ets家族基因。FLI1的同源物ERG在约10％的尤文肉瘤和20％的急性髓性白血病中易位。这表明，EWS-FLI1可以作为模式系统，可能影响一类疾病(与易位伴侣相关)，该疾病影响大量的患者(Uren A.,Tcherkasskaya O.和Toretsky J.A.Recombinant EWS-FLI1 oncoprotein activatestranscription.Biochemistry 43(42)13579-89(2004))。
ERG也在前列腺癌中易位，其中TMPRSS2：ERG融合暗示了一个不同的分子亚型，该分子亚型可限定疾病进展的风险(F.Demichelis等,TMPRSS2:ERG gene fusionassociated with lethal cancer in a watchful waiting cohort.Oncogene(2007)26,4596-4599)。其中已经观察到EWS或FLI1家族成员易位的其它疾病，包括先天性的纤维肉瘤和细胞中胚层肾瘤，其中ets家族成员ETV6与NTRK3并列。其它易位基因的融合包括导致BCR-ABL融合蛋白的表达的慢性髓性白血病，以及滑膜肉瘤，其中18号染色体的SYT基因与X染色体的SSX1或SSX2并列(Aykut Uren和Jeffrey A.Toretsky,Pediatric malignanciesprovide unique cancer therapy targets.Curr Opin Pediatr 17:14-19(2005))。
因此，优选的实施方式中的治疗试剂有潜力应用在许多其它的肿瘤中。更广泛地，一些最困难的白血病也有易位产生的涉及混合谱系白血病基因(MLL，11q23)的融合蛋白，我们的工作可以作为用于极难治疗的癌症群体的范例(Pui CH,Chessells JM,Camitta B,等.Clinical heterogeneity in childhood acute lymphoblastic leukemia with11q23 rearrangements.Leukemia 2003；17(4):700-6)。因此，实施方式包括已经发生了易位的癌症。易位融合基因列于表1中。
表1
特定的适应症
本文提供的特定的化合物、组合物和方法可用于治疗多种疾病，例如包含易位基因融合的肿瘤、尤文肉瘤、透明细胞肉瘤、粘液样肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、粘液样软骨肉瘤、急性髓性白血病、先天性纤维肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌。
实施例
以下实施例仅出于说明目的被提供，并且不应被解释为限制本发明，实施例包括实施方式和所得的结果。其中化学结构描绘了具有未填充(unfilled)化合价的原子，但应当理解，使用一个或多个氢原子满足化合价。
实施例1-4,7-二氯靛红类似物的合成
在催化剂量的二乙胺的存在下，将适当的苯乙酮和4,7-二氯靛红缩合以定量产率制备期望的化合物。示例性化合物：R1＝4'-CN(PT-1-11)；2'-OCH3(PT-1-12)；3'-OCH3(PT-1-18)；2',4'-OCH3(PT-1-19)；2',3'-OCH3(PT-1-20)；3',4'OCH3(PT-1-21)；3',5'OCH3(PT-1-22)；2',3',4',-OCH3(PT-1-23)；3',4',5'-OCH3(PT-1-13)；4'-OC2H5(PT-1-14)；4'-CF3(PT-1-15)；4'-OCF3(PT-1-16)；4'-N(CH3)2(PT-1-17)；4'-OPh(PT-1-60)；4'-SCH3(PT-1-67)；以及4'-C(CH3)2(PT-1-67)。
实施例2-脱水4,7-二氯靛红类似物的合成
将在96％H2SO4中的4,7-二氯靛红溶液在室温下搅拌，得到还原的类似物。示例性化合物：R2＝4'-OCH3(PT-1-33)；2',4'-OCH3(PT-1-39)；2',3',4',-OCH3(PT-1-41)；4'-OC2H5(PT-1-43)；以及4'-N(CH3)2(PT-1-38)。
实施例3-还原的4,7-二氯靛红类似物的合成
实施例4-还原的4，7二氯靛红的吡啶衍生物的合成
实施例5-特定的化合物的生物活性
使用类似于本文中所描述的方法的方法来制备表2中提供的化合物。在PANC1(人类胰腺癌)、TC32(人类ESFT细胞系)和TC71(人类ESFT细胞系)细胞中的特定化合物的结构和IC50活性汇总于表2中。
表2
实施例6-使用替代的类似物的EWS-FLI1细胞的生长抑制
YK-4-279类似物对ESFT细胞的作用通过测定其生长抑制来检测。对于细胞单层生长，该先导化合物的IC50是900nM。对于各种浓度的特定化合物，测定ESFT细胞的生长抑制。对于各种浓度的YK-4-279和PT-1-33，测定TC71细胞和TC32细胞的生长抑制(图3A)。对于各种浓度的YK-4-279、PT-1-33和PT-1-55，测定TC71细胞的生长抑制(图3B)。对于各种浓度的YK-4-279和PT-1-123，测定TC71细胞的生长抑制(图3C)。一些类似物与YK-4-279具有相似的活性。脱水类似物和醇类似物示出了对抗ESFT细胞的相似的活性(图3A)。酮的修饰并没有改善化合物的活性(图3B和图3C)。
实施例7-EWS-FLI1细胞的细胞凋亡
来自TC32细胞的蛋白裂解物用YK-4-279处理并且利用RHA、EWS-FLI1或者总蛋白共沉淀而制备免疫印迹(图4)。YK-4-279并不直接影响EWS-FLI1或RHA的水平，但破坏它们的相互作用。RHA与EWS-FLI1相互作用的破坏显示出研制一类小分子作为对抗尤文家族肉瘤肿瘤的潜在治疗剂的途径。尽管YK-4-279破坏蛋白-蛋白互作，但PT-1-17似乎在TC71细胞中更有效。YK-4-279的脱水类似物没有显著增加化合物的效力。
实施例8-EWS-FLI1/RHA结合的破坏
在ELISA试验中，筛选出了破坏EWS-FLI1和组氨酸(His)标记的RHA蛋白、His-标记的RHA(647-1075)之间结合的候选小分子的活性。简言之，将候选试剂在涂布有EWS-FLI1的板上与RHA培养。在冲洗该板之后，利用一级抗RHA抗体和二级信号抗体来测定保留结合到该板上的RHA的量。
在96孔板的孔中将100μl/孔的20nM的EWS-FLI1蛋白溶液(1M咪唑、20mM的Tris、500mM的NaCl)在4℃下培养过夜。将板用PBS清洗，在室温下用150μl/孔的4％BSA将板封闭至少2小时，然后再次用ELISA清洗溶液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)清洗板。将板用100μl/孔的在PBS中的候选剂(10μM或50μM的终浓度)或DMSO对照在室温下培养1小时。将板在4℃下用100μl/孔的20nM的His-RHA的蛋白溶液(0.5M咪唑、125mM的NaCl、20mM的Tris)培养过夜，然后用ELISA清洗溶液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)清洗。在室温下用100μl/孔的一级抗RHA抗体(1：1000的羊抗-DHX9/EB09297，Everest)培养板1小时，然后用ELISA清洗液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)清洗，对结合到板上的RHA进行检测。在室温下用100μl/孔的二级抗山羊抗体(1：500的驴抗山羊IgG-HRP：sc-2020)培养板1小时，然后用ELISA清洗液(PBS+0.1％T20，200μl/孔)清洗，对一级抗体进行检测。使用辣根过氧化物酶分析试剂盒，通过在450nm处读板来测定每个孔中的二级抗山羊抗体的量(Bio-Rad-TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒#172-1066)。表明较低HRP量的相对较低的光密度表明候选试剂对EWS-FLI1-RHA的结合具有增强的抑制活性。该结果汇总在图5A至图5G中。图5A总结了对于以下候选分子的结果：YK-4-275、YK-4-285、PT-1-12、PT-1-18、PT-1-19、PT-1-20、PT-1-21、PT-1-22、PT-1-23、PT-1-175。图5B总结了对于以下候选分子的结果：PT-2-84、PT-2-59、PT-1-17、PT-2-71、PT-2-89、PT-1-123、PT-1-15、PT-1-60、PT-1-67、PT-1-69。图5C总结了对于以下候选分子的结果：YK-4-285、YK-4-286、PT-1-33、PT-1-38、PT-1-271、PT-1-52、PT-1-56、PT-1-64、PT-2-94、PT-1-267。图5D总结了对于以下候选分子的结果：YK-4-282、YK-4-287、YK-4-280、YK-4-289、YK-4-288、YK-4-278、YK-4-276、YK-4-283、YK-4-277、YK-4-281。图5E总结了对于以下候选分子的结果：PT-1-54、YK-4-279(S)、YK-4-279(R)、PT-1-55、PT-2-75、PT-2-39、PT-2-79、PT-1-16、PT-1-13、PT-2-64。图5F总结了对于以下候选分子的结果：YK-4-284、PT-1-14、PT-1-39、PT-1-41、PT-1-43、PT-1-53、PT-2-56、PT-2-52、PT-1-61、PT-1-183。图5G总结了对于以下候选分子的结果：PT-1-275、PT-2-69、PT-2-99、YK-4-288、PT-1-19、PT-1-20、PT-1-69、PT-2-89、PT-1-17、PT-2-94。
实施例9-EWS-FLI1转录因子活性的破坏
使用荧光素酶试验筛选出了破坏EWS-FLI1转录因子活性的候选小分子的活性，其中结合NROB1启动子的EWS-FLI1增强荧光素酶的表达。简言之，用含有驱动荧光素酶表达的NROB1启动子的载体和EWS-FLI1表达载体转染细胞。将转染的细胞用不同浓度的候选试剂处理，并且对在荧光素酶表达的相对水平中的任何变化进行测定。将COS7细胞接种于96孔板中，并用pciNEO/EF载体和pGL3-NROB1转染。对照包括仅使用每种载体的转染。将转染的细胞用各种浓度的候选试剂处理，并且对处理的细胞分析荧光素酶活性。降低的荧光素酶活性表明候选试剂对作为转录因子的EWS-FLI1具有抑制活性，从而促进荧光素酶的转录。图6A和图6B示出对于各种浓度的候选试剂的相对荧光素酶活性的大致趋势。图7A至图7I示出对于各种浓度的候选试剂的抑制活性。
虽然本公开在附图和前面的描述中已经被详细地说明和描述，但是这种说明和描述被认为是说明性的或示范性的而非限制性的。本公开并不限于所公开的实施方式。在实施所要求保护的公开时，从附图、公开和所附权利要求的研究中，本领域技术人员可理解和实施所述公开的实施方式的多个变型。
本文引用的所有参考文献的全部内容通过引用并入本文中。当通过引用合并的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容矛盾时，本说明书意图替代和/或优于任何这种矛盾的材料。
除非另有定义，否则所有术语(包括技术术语和科学术语)对本领域的普通技术人员来说都被给予其普通和惯用的含义，并且不局限于特定的或专门的含义，除非本文明确地所定义的。但是应当注意，当描述本发明的特定特征或本方面时，特定术语的使用不应被认为暗示该术语在本文中被重新定义，以被限定为包括与该术语相关联的本发明的特征或方面的任何具体特征。
当提供一个数值范围时，应当理解上限和下限以及在该范围的上限和下限之间的每个中间值被包含在实施方式之内。
在本申请中使用的术语与短语以及它们的变型，特别是在所附的权利要求书中，除非另有明确说明，否则应被解释为与限制性相反的开放式的。如前述的示例，术语“包括”应被理解成指“包括，没有限制的情况下”、“包括但不限于”等；如本文所用的术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除附加的、未陈述的元素或方法步骤；术语“具有”应被解释为“至少具有”；术语“包括”应被解释为“包括但不限于”；术语“实施例”用于提供讨论中的项目的示例性例子，而不是它的详尽的或限制性的列表；形容词如“已知的”、“正常的”、“标准的”和类似含义的术语不应被解释为将描述的项目限制在给定时间段或限制为在给定时间可利用的项目，而是应被理解成包括已知的、正常的、或标准的，目前或者在将来任何时间可利用或者得知的技术；和术语如“优选的”、“最好的”、“期望的”或“理想的”以及类似含义的词语的使用，不应被理解为暗示对本发明的结构或功能来说特定特征是关键的、必要的或更重要的，而是应被理解为仅意图强调可在本发明的特定的实施方式中采用或者不采用的替代或附加的特征。同样，一组用连接词“和”连接的项目不应被理解为要求这些项目中的每一个存在于该组中，而是应该被理解为“和/或”，除非另有明确说明。类似地，一组用连接词“或”连接的项目不应被理解为要求在该组中相互排斥，而是应该被理解为“和/或”，除非另有明确说明。
对于基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对上下文和/或该申请合适的情况下，本领域技术人员可以从复数转换到单数和/或从单数转换到复数。为清楚起见各种单数/复数变换可在文中明确规定。不定冠词“一”或“一个”不排除多个。单个处理器或其它单元可以实现在权利要求中记载的若干项目的功能。某些措施被记载在相互不同的从属权利要求中的仅有事实并不表明这些措施的组合不能被有利地使用。在权利要求中的任何附图标记不应当被解释为限制范围。
本领域中技术人员还应理解，如果意图特定数目的所介绍的权利要求特征(recitation)，则这种意图将被明确地记载在权利要求中，并且在不存在这样的特征时这种意图不存在。例如，作为对理解的帮助，下面的所附权利要求可含有引导性短语“至少一个”和“一个或多个”的用法，以介绍权利要求的特征。然而，这种短语的使用不应当被解释为暗示通过不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”对权利要求特征的介绍将任何含有这样介绍的权利要求特征的特定权利要求限制为仅含有一个这种特征的实施方式，即使当相同的权利要求包括引导性短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词例如“一个(a)”或“一个(an)”时(例如，“一个(a)”和/或“一个(an)”通常应被解释为是指“至少一个”或“一个或多个”)；同样也适用于使用定冠词以介绍权利要求特征。另外，即使所介绍的权利要求特征的特定数目被明确陈述，本领域技术人员将认识到，这种特征应通常被解释为意指至少所陈述的数目(例如，仅叙述“两个特征”没有其它修饰语，通常意味至少两个特征，或两个或更多个特征)。此外，在使用类似于“至少一个A、B和C等”的惯例的情况下，通常这种结构意图指就本领域技术人员而言将理解该惯例(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有只有A、只有B、只有C、A和B、A和C、B和C和/或A、B和C等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这种结构意图指就本领域技术人员而言将理解该惯例(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有只有A、只有B、只有C、A和B、A和C、B和C和/或A、B和C等的系统)。本领域技术人员还将理解，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或多个可替选的术语的几乎任何的转折连词和/或短语，应该被理解为设想可能包括术语之一、术语中的任一个或者两个术语。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
所有在说明书中所用的表示成分、反应条件等的量的数字应当被理解为在任何情况下中由术语“约”来修饰。因此，除非有相反的说明，否则本文所述数值参数是近似值，其可根据试图获得的期望性能而变化。在最低限度，并且不试图将等同原则的应用限制到任何要求本申请的优先权的申请中的任何权利要求范围，每个数值参数应当根据有效数字的数目和普通四舍五入的方法来解释。
此外，为了清楚和理解的目的，尽管前文已经在一些细节上通过说明和示例的方式进行了描述，但是显然对本领域技术人员，特定变化和修改可以被实施。因此，说明书和实施例不应被解释为将本发明的范围限制在本文中描述的具体实施方式和实施例，而是还包括伴随本发明的真实范围和精神的所有的修改和替选方式。

Claims (19)

1.一种制备式I的化合物的方法：
式中，R1选自氢、C1-6烷基、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸、
R3选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-N(R15)2和-SR15；
R4、R5、R9和R14各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；
R10选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；
R11、R12和R13各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；
R6为C1-6二烷基胺；
R7选自氢和C1-6烷基；
R8和R15各自独立地为C1-6烷基；
每个R16独立地为氢、-OH；
n为从0至4的整数；
p为1或3；并且
虚线代表可选的双键，其中，所述双键具有选自顺式和反式的构型，
条件为R4、R5、R9和R14中的至少一个选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15，或者R3选自-N(R15)2和-SR15，
所述方法包括：使被取代的苯乙酮与被取代的靛红缩合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述被取代的靛红为4,7-二氯靛红。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缩合是在催化剂量的二乙胺的存在下进行的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括对缩合的产物进行脱水。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物为：
或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物为：
或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，R1选自亮氨酸、亮氨酸-天冬氨酸、亮氨酸-天冬氨酸-丙氨酸、-CH2-C(＝O)-NHCH2COOH、-CH2-C(＝O)-(CH2)C(CH3)2、
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物选自：
9.根据权利要求1所述的方法，其中，R3选自-N(R15)2和-SR15。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，R3为-N(CH3)2。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，R3为-SCH3。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述化合物为：
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物为：
14.一种治疗癌症的方法，所述方法包括将有效量的与另外的化疗试剂组合的式(I)的化合物施用给有需要的受试者，其中，所述式(I)的化合物为：
其中，R1选自氢、C1-6烷基、一个氨基酸、连接在一起的两个氨基酸、连接在一起的三个氨基酸、
R3选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-N(R15)2和-SR15；
R4、R5、R9和R14各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；
R10选自卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；
R11、R12和R13各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)NH2、-NO2、-NH2、-OH、-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15；
R6为C1-6二烷基胺；
R7选自氢和C1-6烷基；
R8和R15各自独立地为C1-6烷基；
每个R16独立地为氢、-OH；
n为从0至4的整数；
p为1或3；并且
虚线代表可选的双键，其中，所述双键具有选自顺式和反式的构型，
条件为R4、R5、R9和R14中的至少一个选自-NH(R15)、-N(R15)2和-SR15，或者R3选自-N(R15)2和-SR15。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述另外的化疗试剂选自长春花生物碱、蒽环类、蒽类、表鬼臼毒素、放线菌素D、丝裂霉素C、光辉霉素、甲氨蝶呤、多烯紫杉醇、依托泊苷(VP-16)、紫杉醇、多烯紫杉醇、亚德里亚霉素、免疫抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC)、极光激酶抑制剂、脱甲基化试剂、尤因抗原抗体、和羟基脲。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述长春花生物碱选自长春碱和长春新碱。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述癌症选自胰腺癌和尤文肉瘤。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述癌症包括EWS基因中的易位。
19.根据权利要求14所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。
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