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CN106983768A - 用于在对象中调节smn2剪接的组合物和方法 - Google Patents

用于在对象中调节smn2剪接的组合物和方法 Download PDF

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CN106983768A CN201710003678.9A CN201710003678A CN106983768A CN 106983768 A CN106983768 A CN 106983768A CN 201710003678 A CN201710003678 A CN 201710003678A CN 106983768 A CN106983768 A CN 106983768A
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Abstract

本发明公开了用于调节对象中的SMN2mRNA剪接的化合物、组合物和方法。还提供了所公开的化合物和组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗疾病和病症，包括脊髓性肌萎缩症。

Description

用于在对象中调节SMN2剪接的组合物和方法
本申请是申请号为201080036807.0、申请日为2010年6月17日、发明名称为“用于在对象中调节SMN2剪接的组合物和方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2010/039077的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2009年6月17日，申请号为61/218,031的美国临时申请的优先权。
序列表
本申请连同电子形式的序列表一起提交。提交的序列表是命名为20100617_CORE0086WOSEQ.txt的文件，该文件于2010年6月17日创建，5Kb大小。序列表的电子形式中的信息通过引用全文并入本申请。
背景技术
新合成的真核mRNA分子，称为初级转录物或mRNA前体，在翻译前被加工。mRNA前体的加工包括添加5’甲基化帽和在转录物的3’末端加上约200-250个碱基的poly(A)尾。从mRNA前体到mRNA的加工经常还包括mRNA前体的剪接，其发生在90-95％哺乳动物mRNA的成熟过程中。内含子(或插入序列)是mRNA前体中的某些区域，其不包含在成熟mRNA的编码序列中。外显子是初级转录物的某些区域，其仍保留在成熟mRNA中。外显子被剪接在一起，以形成成熟的mRNA序列。剪接结点也被称作剪接点，其中结点的5′端通常称作“5′剪接位点”或“剪接供体位点”，而3′端则称作“3′剪接位点”或“剪接受体位点”。在剪接过程中，上游外显子的3’末端与下游外显子的5’末端连接。这样，未剪接的mRNA前体在内含子的5’末端具有一个外显子/内含子结点，且在内含子的3’末端具有一个内含子/外显子结点。将内含子除去后，在成熟mRNA的有时被称作外显子/外显子结点或边界的地方，外显子是连续的。隐蔽剪接位点在通常情况下很少使用，但当通常的剪接位点被阻断或无法利用时可以使用。可变剪接被定义为将不同组合的外显子剪接在一起，通常可以从单个基因得到多种mRNA转录物。
点突变可导致mRNA前体加工异常，高达50％的人类遗传病是由这样的点突变导致的。此类点突变可以破坏目前使用的剪接位点，或者可以创造出新的剪接位点，导致产生的mRNA转录物包含不同组合的外显子或出现外显子缺失。点突变还能导致隐蔽剪接位点的激活或破坏调控顺式元件(即剪接增强子或沉默子)(Cartegni et al.，Nat.Rev.Genet.，2002，3，285-298；Drawczak et al.，Hum.Genet.，1992，90，41-54)。将反义寡核苷酸已被用于靶向作用于那些在某些遗传病中导致异常剪接的突变，以重新剪接并获得所需的剪接产物(Kole，Acta Biochimica Polonica，1997，44，231-238)。
反义化合物还可用于改变天然存在的可变剪接变体的比率，如Bcl-x mRNA前体的长型或短型(美国专利6,172,216；美国专利6,214,986；Taylor et al.，Nat.Biotechnol.1999，17，1097-1100)，或用于强行跳过包含提前终止的密码子的特定外显子(Wilton et al.，Neuromuscul.Disord.，1999，9，330-338)。美国专利5,627,274和WO94/26887公开了组合物和方法，其使用不激活RNAse H的反义寡核苷酸，来对抗包含突变的mRNA前体分子的异常剪接。
近端型脊髓性肌萎缩症(SMA)是一种遗传性的、神经退行性病变，其特征为脊髓运动神经元的丧失。SMA是一种发病较早的常染色体隐性遗传病，是目前导致婴儿死亡的首要原因。SMA在不同患者中的严重性不同，因此将其分成三类。I型SMA是最严重的形式，患者在出生时或出生后6个月内发病，一般在2岁以内死亡。患有I型SMA的儿童无法坐下或行走。II型SMA是中间形式，患者能够坐下，但不能站立或行走。患者患有III型SMA的，即该疾病的慢性形式，一般在出生后18个月后发展成SMA(Lefebvre et al.，Hum.Mol.Genet.，1998，7，1531-1536)。
导致SMA的分子机制是运动神经元存活基因1(SMN1)的两个拷贝均缺失，SMN1也称为SMN端粒，这种蛋白是一种多蛋白复合物的一部分，该多蛋白复合物被认为参与小核糖核酸蛋白snRNP生物合成和循环。在染色体5q13的复制区存在一个基本相同的基因SMN2，也称为SMN着丝粒，其调节疾病的严重程度。正常SMN1基因的表达仅导致运动神经元存活基因(SMN)蛋白的表达。尽管SMN1和SMN2都能够编码相同的蛋白，但SMN2在其外显子7的+6位含有翻译沉默突变，会导致在SMN2转录物中外显子7的包含不足。这样，SMN2主要形成为被截短的版本，缺乏外显子7，其不稳定且无活性(Cartegni and Krainer，Nat.Genet.，2002，30，377-384)。SMN2基因表达产生约10-20％的SMN蛋白和80-90％不稳定/非功能性的SMNΔ7蛋白。SMN蛋白在剪接体装配过程中的作用已被验证，且其还可以介导mRNA在神经元的轴突和神经末梢间的转运。
反义技术可有效调节一种或多种特定基因产物，包括可变剪接产物的表达，且其在多种治疗、诊断和研究应用上具有独特的作用。反义技术的原理为，反义化合物可与靶核酸杂交，通过多种反义机制之一调节基因表达的活性，例如转录、剪接或翻译。反义化合物的序列特异性使其成为一种极具吸引力的工具，用于靶点验证和基因功能化，以及作为治疗手段用于选择性调节疾病相关基因的表达。
本领域已知某些与SMN2互补的反义化合物，参见例如，WO 2007/002390；US 61/168,885；Hua et al.，American J.of Human Genetics(April 2008)82，1-15；Singh etal.，RNA Bio.6：3，1-10(2009)。与本领域已知的此类化合物和方法相比，本文所公开的某些反义化合物和方法具有所需的特性。已有专利描述了被设计用于调节SMN2剪接的嵌合肽核酸分子(WO 02/38738；Cartegni and Krainer，Nat.Struct.Biol.，2003，10，120-125)。
发明概述
在某些实施方式中，本发明提供了方法，其包括向对象给药包含反义寡核苷酸的反义化合物，该反义化合物互补于人SMN2 mRNA前体的编码核酸的内含子7，其中反义化合物给药至脑脊液(CSF)中。在某些实施方式中，所述给药是至鞘内空隙。在某些实施方式中，所述给药是至脑内的脑脊液。在某些实施方式中，所述给药包含推注注射。在某些实施方式中，所述给药包含利用递送泵输注。
在某些实施方式中，所述反义化合物的给药剂量为0.01至10毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为0.01至10毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为0.01至5毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为0.05至1毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为0.01至0.5毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，剂量为0.05至0.5毫克反义化合物每千克对象体重。
在某些实施方式中，每日给药所述剂量。在某些实施方式中，每周给药所述剂量。在某些实施方式中，连续给药反义化合物，且所述剂量是每日给药的剂量。在某些实施方式中，该方法包含在诱导期给药至少一个诱导剂量以及在维持期给药至少一个维持剂量。在某些实施方式中，诱导剂量为0.05至5.0毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，维持剂量为0.01至1.0毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，诱导期的持续时间为至少1周。在某些实施方式中，维持期的持续时间为至少1周。在某些实施方式中，各个诱导剂量和各个维持剂量均包含单次注射。在某些实施方式中，各个诱导剂量和各个维持剂量均独立地包含两次或更多注射。在某些实施方式中，在至少1周的治疗期内，给药反义化合物至少两次。在某些实施方式中，治疗期为至少一个月。在某些实施方式中，治疗期为至少2个月。在某些实施方式中，治疗期为至少4个月。在某些实施方式中，通过一次或更多推注注射给药诱导剂量，以及通过输液泵给药维持剂量。
在某些实施方式中，该方法包含评估反义化合物的耐受性和/或有效性。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药不耐受的指征时，降低反义化合物的给药剂量或给药频率。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药有效的指征后，维持或降低反义化合物的给药剂量或给药频率。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药无效的指征后，增加反义化合物的给药剂量。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药有效的指征后，降低反义化合物的给药频率。在某些实施方式中，当出现反义化合物给药无效的指征后，增加反义化合物的给药频率。
在某些实施方式中，该方法包括将反义化合物与至少一种其他疗法联合给药。在某些实施方式中，反义化合物与至少一种其他疗法同时联合给药。在某些实施方式中，在至少一种其他疗法给药前，给药反义化合物。在某些实施方式中，在至少一种其他疗法给药之后，给药反义化合物。在某些实施方式中，所述至少一种其他疗法包括，给药丙戊酸、利鲁唑、羟基脲和丁酸盐中的一种或更多种。在某些实施方式中，所述至少一种其他疗法包括给药曲古霉素-A。在某些实施方式中，至少一种其他疗法包括给药干细胞。在某些实施方式中，至少一种其他疗法为基因治疗。在某些实施方式中，基因治疗给药至CSF以及反义化合物给药至全身。在某些实施方式中，基因治疗给药至CSF，以及反义化合物给药至全身和CSF。在某些实施方式中，本发明提供了治疗方案，其中初始时给药反义化合物至CSF和全身，随后给药基因治疗至CSF，并将反义化合物给药至全身。在某些此类实施方式中，在初始治疗时对象为婴儿。在某些此类实施方式中，对象为2岁以下。在某些实施方式中，在对象的年龄足以接受基因治疗以前，将反义化合物给药至对象的中枢神经系统。在某些此类实施方式中，反义化合物自始自终全身给药。
在某些实施方式中，反义化合物的给药浓度为约0.01mg/ml、约0.05mg/ml、约0.1mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml或约100mg/ml。
在某些实施方式中，在对象的运动神经元中，SMN2 mRNA对外显子7的包含增加。在某些实施方式中，在对象的运动神经元中，SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含增加。
在某些实施方式中，本发明提供在对象的运动神经元中增加SMN2 mRNA对外显子7的包含的方法，包括向对象给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，进而在对象的运动神经元中增加SMN2 mRNA对外显子7的包含。
在某些实施方式中，本发明提供在对象的运动神经元中增加SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含的方法，包括向对象给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，进而在对象的运动神经元中增加SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含。
在某些实施方式中，对象患有SMA。在某些实施方式中，对象患有I型SMA。在某些实施方式中，对象患有II型SMA。在某些实施方式中，对象患有III型SMA。
在某些实施方式中，在子宫内进行第一次给药。在某些实施方式中，在血脑屏障完全形成前进行所述第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生1周内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生1个月内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生3个月内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象出生6个月内进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象1至2岁时进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象1至15岁时进行第一次给药。在某些实施方式中，在对象15岁以上时进行第一次给药。
在某些实施方式中，对象为哺乳动物。在某些实施方式中，对象为人。
在某些实施方式中，该方法包括识别患有SMA的对象。在某些实施方式中，通过测定对象一块或更多块肌肉的电活性来识别所述对象。在某些实施方式中，通过遗传检测以确定对象的SMN1基因中是否具有突变来识别所述对象。在某些实施方式中，通过肌肉组织活检来识别所述对象。
在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少10％。在某些实施方式中，含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少20％。在某些实施方式中，含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少50％。在某些实施方式中，含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少70％。
在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少10％。在某些实施方式中，含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少20％。在某些实施方式中，含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少50％。在某些实施方式中，含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少70％。
在某些实施方式中，所述反义化合物的给药能在所述对象中减轻SMA的至少一种症状。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得在所述对象中的运动功能改善。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得在所述对象的运动功能丧失被推迟或减少。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得呼吸功能改善。在某些实施方式中，所述反义化合物的给药使得生存率改善。
在某些实施方式中，反义寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖配基。在某些实施方式中，至少一种修饰的糖配基包含2’-甲氧乙基糖配基。在某些实施方式中，反义寡核苷酸的各核苷基本上均包含修饰的糖配基。在某些实施方式中，包含修饰糖配基的核苷均包含相同的糖修饰。在某些实施方式中，其中各修饰的糖配基均包含2’-甲氧乙基糖配基。在某些实施方式中，反义寡核苷酸的各核苷均包含修饰的糖配基。在某些实施方式中，核苷均包含相同的糖配基。在某些实施方式中，各修饰的糖配基均包含2’-甲氧乙基糖配基。在某些实施方式中，至少一个核苷间连接为硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施方式中，各核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施方式中，反义寡核苷酸由10至25个连接的核苷组成。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由12至22个连接的核苷组成。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由15至20个连接的核苷组成。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
在某些实施方式中，反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸具有至少90％的互补性。在某些实施方式中，反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸完全互补。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：1的核碱基序列中至少10个连续核碱基。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：1的核碱基序列中至少15个连续核碱基。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：1的核碱基序列。在某些实施方式中，寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列由SEQ ID NO：1的核碱基序列组成。
在某些实施方式中，反义化合物包含缀合基团或末端基团。
在某些实施方式中，反义化合物由反义寡核苷酸组成。
在某些实施方式中，反义化合物也可以全身给药。在某些实施方式中，全身给药是通过静脉或腹腔注射。在某些实施方式中，全身给药和给药至中枢神经系统同时进行。在某些实施方式中，全身给药和给药至中枢神经系统在不同时间进行。
在某些实施方式中，本发明提供了将反义化合物全身给药，可以单独进行，或者与递送至CSF联合进行。在某些实施方式中，将药物组合物全身给药。在某些实施方式中，将药物组合物皮下给药。在某些实施方式中，将药物组合物静脉给药。在某些实施方式中，将药物组合物肌内注射给药。
在某些实施方式中，将药物组合物直接给药至CSF(例如，IT和/或ICV注射和/或输注)并且全身给药。
在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括向对象给药至少一剂量的反义化合物，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO.7的核碱基序列具有100％互补性，且其中各核苷均为2’-MOE修饰的核苷；且其中至少一剂量在0.1mg/kg至5mg/kg之间且给药至CSF。在某些此类实施方式中，所述剂量在0.5mg/kg至2mg/kg之间。在某些实施方式中，至少一剂量通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，所述剂量通过鞘内推注注射给药。在某些实施方式中，至少再给药一次。在某些此类实施方式中，在第一次给药至少2周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少4周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少8周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少12周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少16周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少20周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药时，对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。
在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括向对象给药至少一剂量的反义化合物，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO.7的核碱基序列具有100％互补性，且其中各核苷均为2’-MOE修饰的核苷；且其中至少一剂量为全身给药。在某些此类实施方式中，所述至少一剂量通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，所述剂量通过皮下推注注射给药。在某些实施方式中，给药剂量为0.5mg/kg至50mg/kg之间。在某些实施方式中，给药剂量为1mg/kg至10mg/kg之间。在某些实施方式中，给药剂量为1mg/kg至5mg/kg之间。在某些实施方式中，给药剂量为0.5mg/kg至1mg/kg之间。在某些实施方式中，至少再给药一次。在某些此类实施方式中，在第一次给药至少2周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少4周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少8周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少12周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少16周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，在第一次给药至少20周后，进行第二次给药。在某些实施方式中，第一次给药时对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。
在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括将至少一剂量的反义化合物向对象给药至CSF以及至少一剂量全身给药，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO.7的核碱基序列具有100％互补性，且其中各核苷均为2’-MOE修饰的核苷。在某些此类实施方式中，CSF给药的剂量为0.1mg/kg至5mg/kg之间。在某些实施方式中，全身给药的剂量为0.5mg/kg至50mg/kg之间。在某些实施方式中，至少一次CSF给药通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，至少一次CSF给药通过鞘内推注注射给药。在某些实施方式中，至少一次全身给药通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，至少一次全身给药通过皮下注射给药。在某些实施方式中，CSF给药和全身给药同时进行。在某些实施方式中，CSF给药和全身给药在不同的时间进行。在某些实施方式中，第一次给药时对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。
在某些实施方式中，本发明提供了方法，包括向对象给药至少一全身给药剂量的反义化合物，所述对象具有与SMA相关的至少一种症状，所述反义化合物包含由15至20个连接的核苷组成的寡核苷酸，并且具有核碱基序列，所述核碱基序列的全长与SEQ ID NO.7的核碱基序列具有100％互补性，且其中各核苷均为2’-MOE修饰的核苷；以及至少一剂量的基因治疗剂。在某些实施方式中，全身给药剂量为0.5mg/kg至50mg/kg之间。在某些实施方式中，至少一次全身给药通过推注注射给药。在某些此类实施方式中，至少一次全身给药通过皮下注射给药。在某些实施方式中，全身给药和基因治疗剂给药在同时进行。在某些实施方式中，全身给药和基因治疗剂给药在不同的时间进行。在某些实施方式中，基因治疗剂给药至CSF。在某些此类实施方式中，基因治疗剂通过鞘内注射和/或输注给药。在某些此类实施方式中，基因治疗剂通过脑室内注射和/或输注给药。在某些实施方式中，第一次给药时对象在2岁以下。在某些实施方式中，对象在2至15岁之间。在某些实施方式中，对象在15至30岁之间。在某些实施方式中，对象为30岁以上。在某些实施方式中，与SMA相关的至少一种症状减轻，其进展减慢。在某些实施方式中，寡核苷酸为ISIS396443。
在某些实施方式中，本发明提供方法，包括选择具有至少一种与SMA相关的症状的对象，并按照上文所述的任意方法给药反义化合物。在某些此类实施方式中，在给药后评估SMA的至少一种症状。在某些此类实施方式中，SMA的至少一种症状被改善。在某些此类实施方式中，与未给药反义化合物的对象相比，SMA的至少一种症状未出现进展或进展更为缓慢。
在某些此类实施方式中，本发明提供包含反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，所述反义化合物用于上文所述的任意方法。在某些实施方式中，本发明提供一种此类化合物，用于治疗与存活运动神经元1(SMN1)相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，本发明提供包含反义寡核苷酸的反义化合物用于在药物生产中的用途，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，所述药物用于上文所述的任意方法。在某些实施方式中，该药物用于治疗与存活运动神经元1(SMN1)相关的疾病或病症。
附图的简要说明
图1显示了实施例4所述研究中作用持续时间的结果，其中评估了在7天治疗结束后0、2、4、6和8周时(x-轴)SMN2中外显子7的百分率(y-轴)。第“0”周样品收集自治疗结束后1天。CON表示生理盐水治疗组小鼠。在0至6个月的不同时间点接受生理盐水治疗的对照小鼠之间的百分率不存在差异。
图2显示了实施例4所述研究中作用持续时间的结果，其中评估了在7天治疗结束后0、0.5、1、2、5和6个月时SMN2中外显子7的百分率。第“0”周样品收集自治疗结束后1天。CON表示生理盐水治疗组小鼠。在0至6个月的不同时间点接受生理盐水治疗的对照小鼠之间的百分率不存在差异。
图3显示了实施例6所述实验的结果，检测ISIS396443胚胎给药对台湾品系SMA小鼠尾长的影响。图3A为首次实验和图3B为重复实验，对不同浓度的反义化合物进行检测，其中还包括正常小鼠的数据作为对照。
图4显示了实施例7所述Western印迹的结果。Y轴为包含外显子7的不同样品的SMN百分率。
图5和6显示了实施例7所述实验的结果。向SMA小鼠(台湾品系)给药反义化合物或对照寡核苷酸后对其进行的若干项评估。
图7显示了实施例7所述实验的生存曲线。
图8显示了如实施例7所述，用反义化合物或对照寡核苷酸处理后，对脊髓不同部分运动神经元数量进行评估的结果。
图9显示了如实施例7所述，经反义处理的动物中，对全长SMN RNA(包括外显子7)进行评估的结果。
图10显示了实施例7所述实验的生存曲线，其中动物为(1)未治疗；(2)在出生时(第P0天)给药单剂量反义化合物；或(3)在P0时第一次给药和在第21天(P21)时第二次给药。
图11显示了实施例7所述实验的生存曲线，对接受第二次给药的动物与仅接受第一次给药的动物进行比较。
图12显示了实施例9所述实验的结果，对猴鞘内输注给药反义化合物，并评估96小时后不同组织中化合物的浓度。
图13显示了实施例12所述实验的生存曲线，向患有严重SMA的小鼠皮下注射给药不同剂量的反义化合物。
发明详述
应当理解，前述一般性说明和下文的详细说明仅为示例和解释性的，并非限制本发明所要求的权利。除非另外特别指明，本发明中单数的使用包括复数。如本发明中使用的，除非另有指明，使用的“或”是指“和/或”。另外，术语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的使用为非限制性的。另外，除非另外特别指明，诸如“元件”或“组分”等术语涵盖包括一个单元的元件和组分以及包括超过一个亚单元的元件和组分。
本发明使用的章节标题仅为了组织性目的，不应解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或部分文件，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍以及专题论文等，在此明确地通过参考全文并入，用于任何目的。
I.定义
除非提供特殊定义，本发明所使用的术语与分析化学、合成有机化学以及医用化学和药物化学相关的术语及程序和技术均为本领域熟知和通用。标准的技术可用于化学合成和化学分析。某些此类的技术和程序可以在下列文献中找到，例如“CarbohydrateModifications in Antisense Research”Edited by Sangvi and Cook，AmericanChemical Society，Washington D.C.，1994；“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，18th edition，1990；和“Antisense DrugTechnology，Principles，Strategies，and Applications”Edited by Stanley T.Crooke，CRC Press，Boca Raton，Florida；以及Sambrook et al.，“Molecular Cloning，Alaboratory Manual，”2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，其出于任何目的通过引用全文并入。在允许的情况下，本文通篇公开内容中所引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物以及其他数据均通过引用全文并入本文。
除非另有说明，下列术语具有以下含义：
“核苷”指包含杂环碱基配基和糖配基的化合物。核苷包括，但不限于，天然存在的核苷、修饰核苷，以及具有模拟碱基和/或糖基的核苷。核苷可以被任意种类的取代基所修饰。
“糖配基”指天然或修饰的糖或糖替代物。
“天然的糖”指DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)的呋喃核糖配基。
“修饰的糖”指呋喃核糖配基，其包含天然糖取代基以外的至少一个取代基。
“糖替代物”指除呋喃核糖以外、能够替代核苷中的糖的结构。糖替代物的例子包括，但不限于，开环系统、6元环、氧被取代的糖，例如氧被硫或氮取代。例如，糖替代物包括，但不限于吗啉基取代和含4’-硫的糖。
“核碱基”指核苷的杂环碱基部分。核碱基可以是天然存在的也可以是被修饰的。在某些实施方式中，核碱基可以包含能够与另一个核酸的核碱基形成氢键的任意原子或基团。
“核苷酸”指包含磷酸酯连接基团的核苷。在本申请中，核苷包括核苷酸。
“修饰的核苷”指一种核苷，与天然存在的RNA或DNA核苷相比，其含有至少一种修饰。此类修饰可以位于糖配基中和/或位于核碱基中。
“双环核苷”或“BNA”指一种核苷，其中所述核苷的糖配基包含一种桥，连接糖环中的两个碳原子，以形成双环糖配基。
“4’-2’双环核苷”指包含呋喃环的双环核苷，所述呋喃环含有一种桥，连接呋喃环上的两个碳原子，将糖环的2’位碳原子和4’位碳原子连接。
“2’-修饰”或“2’-取代”指包含糖的核苷，所述糖在2’位含有除H或OH以外的取代基。
“2’-OMe”或“2’-OCH3”或“2’-O-甲基”均指包含糖的核苷，所述糖在糖环的2’位具有-OCH3基团。
“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧乙基”均指包含糖的核苷，所述糖在糖环的2’位具有-OCH2CH2OCH3基团。
“寡核苷酸”指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方式中，多个核苷中的一个或更多个被修饰。在某些实施方式中，寡核苷酸包含一个或更多个核糖核苷酸(RNA)和/或脱氧核糖核苷酸(DNA)。
“寡核苷”指核苷间连接均不含磷原子的寡核苷酸。在本申请中，寡核苷酸包括寡核苷。
“修饰的寡核苷酸”指一种寡核苷酸，其包含至少一个修饰的核苷和/或至少一个修饰的核苷间连接。
“核苷间连接”指寡核苷酸的相邻核苷之间的共价连接。
“天然存在的核苷间连接”指3′至5′的磷酸二酯键。
“修饰的核苷间连接”指除天然存在的核苷间连接以外的任意核苷间连接。
“寡聚化合物”指包含寡核苷酸的化合物。在某些实施方式中，寡聚化合物由寡核苷酸组成。在某些实施方式中，寡聚化合物进一步包含一个或多个缀合和/或末端基团。
“反义化合物”指一种寡聚化合物，其至少有一部分是至少部分互补于其所杂交的靶核酸，其中此类杂交产生至少一种反义活性。
“反义寡核苷酸”指一种反义化合物，其中所述寡聚化合物由寡核苷酸组成。
“反义活性”指因反义化合物与其靶核酸杂交所获得的任何可检测和/或可测定的效应。在某些实施方式中，这样的反义活性是核酸或蛋白的量增加或减少。在某些实施方式中，这样的反义活性是核酸或蛋白的剪接变体比率的改变。在某些实施方式中，这样的反义活性是细胞和/或对象的表型改变。
反义活性的“检测”或“测定”可以是直接的或间接的。例如，在某些实施方式中，通过检测和/或测定靶核酸或蛋白的量，或靶核酸或蛋白的剪接变体的相对量对反义活性进行评估。在某些实施方式中，通过观察细胞或动物的表型改变情况对反义活性进行检测。术语“检测”和“测定”与任何活性、应答或效应相关时，是指为检测或测定进行了实验。此类检测和/或测定可以包括零值。因此，即使为检测或测定而进行的试验得到的结果为无活性(零活性)，然而检测或测定活性的步骤已经进行。
“靶核酸”指任意核酸分子，其表达、量或活性能够被反义化合物所调节。
“靶mRNA”指预先选定的编码某蛋白的RNA分子。
“靶mRNA前体”指预先选定的未被完全加工成mRNA的RNA转录物。值得注意的是，mRNA前体包括一个或多个内含子。
“靶蛋白”指由靶核酸编码的蛋白。
“调节”指对功能或活性的干扰。在某些实施方式中，调节指增加基因表达。在某些实施方式中，调节指降低基因表达。
“表达”指任意功能和步骤，通过这样的功能和步骤将基因编码的信息转化成细胞内存在或操控的结构。
“核碱基序列”指连续核碱基从5’至3’方向的顺序，其与任意糖、连接和/或核碱基修饰无关。
“连续核碱基”指在核酸中彼此直接相邻的核碱基。
“核碱基的互补性”指两个核碱基通过氢键形成非共价配对的能力。
“互补的”是指第一核酸在严格的杂交条件下能够与第二核酸杂交。例如，如果在严格的杂交条件下，反义化合物能够与靶核酸杂交，则反义化合物与其靶核酸是互补的。
“完全互补的”是指第一核酸的各个核碱基均能够与第二核酸中各个相应连续位点的核碱基配对。
反义化合物的“互补性百分率”是指，反义化合物中与靶核酸的等长部分互补的核碱基的百分率。互补性百分率的计算方法为，将反义寡核苷酸中与靶核酸相应连续位点的核碱基互补的核碱基的数目除以反义化合物的总长。
“同一性百分率”是指第一核酸中与第二核酸相应位点具有相同核碱基的核碱基数目除以第一核酸中的核碱基总数。
“杂交”指通过核碱基互补性进行的互补核酸的退火。
“错配”指第一核酸的核碱基无法与第二核酸相应位点的核碱基进行配对。
“同一的核碱基序列”指具有相同的核碱基序列，其与核苷的任何化学修饰无关。
“不同修饰”或“不同的修饰”指核苷或核苷间连接之间具有不同的核苷修饰或核苷间连接，包括无修饰。因此，例如，MOE核苷和未修饰的DNA核苷之间为“不同的修饰”，虽然DNA核苷是未修饰的。同样的，DNA与RNA之间为“不同的修饰”，即使它们均为天然存在的未修饰核苷。除包含不同的核碱基以外其他都相同的核苷不属于不同的修饰，除非另有说明。例如，包含2’-OMe修饰糖和腺嘌呤核碱基的核苷与包含2’-OMe修饰糖和胸腺嘧啶碱基的核苷之间不属于不同的修饰。
“相同修饰”指相互之间相同的核苷和核苷间连接(包括未修饰的核苷和核苷间连接)。因此，例如，两个未修饰的DNA核苷具有“相同修饰”，即使DNA核苷是未修饰的。
“修饰类型”或核苷的“类型”是指核苷的修饰，包括修饰的和未修饰的核苷。相应地，除另有说明外，“具有第一修饰类型的核苷”可以是未修饰核苷。
寡核苷酸的“分离区域”是指寡核苷酸的一部分，其中该区域内的核苷和核苷间连接均包含相同的修饰：并且与其相邻的任意部分的核苷和/或核苷间连接包含至少一种不同的修饰。
“基序”指寡核苷酸中修饰和/或未修饰核碱基、糖和/或核苷间连接的样式。
“完全修饰的寡核苷酸”指各核碱基、各糖、和/或各核苷间连接均被修饰。
“均一修饰的寡核苷酸”指在修饰的寡核苷酸中各核碱基、各糖、和/或各核苷间连接均具有相同修饰。
“交替的基序”指寡核苷酸或其一部分，具有至少四个修饰核苷的分离区域，其样式为(AB)nAm，其中A表示具有第一种修饰类型的核苷区域；B表示具有不同修饰类型的核苷区域；n为2-15；且m为0或1。因此，在某些实施方式中，交替的基序包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20或更多的交替区域。在某些实施方式中，各A区域和各B区域均独立地包含1-4个核苷。
“对象”指入选进行处理或治疗的人或非人动物。
“需求对象”指经鉴定需要治疗或处理的对象。在某些此类实施方式中，对象具有一种或多种指征，表明患有SMA或正处于SMA发展过程中。
“给药”指向对象提供药物或组合物，包括，但不限于，由专业医师给药和自我给药。
“肠道外给药”指通过注射或输注给药。肠道外给药包括，但不限于，皮下给药、静脉给药或肌内给药。
“全身给药”指对除目标活性部位以外的区域给药。全身给药的例子为皮下给药和静脉给药，以及腹腔给药。
“皮下给药”指在皮肤之下给药。
“静脉给药”指给药至静脉。
“脑脊液”或“CSF”指充满脑和脊髓内空间的液体。
“给药至脑脊液”指将物质直接递送至CSF的任意给药方法。
“脑室内”或“ICV”指给药至大脑的脑室系统(ventricular)。
“鞘内”或“IT”指给药至蛛网膜下腔的CSF，蛛网膜覆盖于脑和脊髓之上。通过脊髓的鞘进入蛛网膜下腔进行IT注射，将药物试剂注射入脊髓周围的鞘。
“诱导期”指一段给药期，在此期间开始给药，并且活性药物在靶组织中达到稳态浓度。例如，诱导期是指反义寡核苷酸在肝脏中达到稳态浓度前的给药期。
“维持期”指药物在靶组织中达到稳态浓度以后的给药期。
“持续时间”指活性或事件持续的时间。例如，诱导期的持续时间是指采用诱导剂量给药的时间。
“维持剂量”是指在维持期内进行单次给药的剂量。在本申请中，“诱导剂量”指在诱导期内进行单次给药的剂量。
“联合给药”指向对象给药两种或更多种药物。两种或更多种药物可以在一个药物组合物中，或可以在不同的药物组合物中。所述两种或多种药物的每一种可以通过相同或不同的途径给药。联合给药包括平行或顺序给药。
“处理”指疾病的治疗方法。在某些实施方式中，处理包括，但不限于手术处理、化学处理、和物理干预，如辅助呼吸、插导管、以及出于增强体质目的的物理处理。
“治疗”指使用一种或多种特定的程序，用于治愈或改善疾病。在某些实施方式中，特定的程序为给药一种或多种药物。
“改善”指减轻疾病或状态的至少一种指征的严重性。在某些实施方式中，改善包括延迟或减缓疾病或状态的一种或更多种指征的进程。指征的严重性可以通过本领域技术人员公认的主观或客观检测方法确定。
“阻止发病”指阻止处于疾病或状态的发生风险中的对象发展出疾病或状态。在某些实施方式中，处于疾病或状态风险中的对象接受的治疗与已经患有疾病或状态的对象接受的治疗类似。
“延迟发病”指延迟处于疾病或状态的发生风险中的对象发展出疾病或状态。
“减慢进展”指与疾病或状态相关的至少一种症状的严重性的恶化速度减慢。
“外显子7氨基酸”指与SMN RNA的外显子7对应的SMN蛋白部分。在剪接过程中外显子7未被排除时，SMN RNA表达的SMN蛋白中存在有外显子7氨基酸。
“SMN蛋白”指正常全长的运动神经元存活蛋白。SMN可以由SMN1基因或SMN2基因表达，前提是成熟mRNA中存在外显子7，且SMN蛋白中存在外显子7氨基酸。
“剂量”指在单次给药中或在一段特定时间内提供的药物的特定量。在某些实施方式中，可以通过两次或更多推注注射、片剂或注射给药剂量。例如，在某些实施方式中，在希望皮下或鞘内或ICV给药时，希望的剂量所需要的体积难以通过单次注射来调节。在此类实施方式中，可以使用两次或更多注射以达到希望的剂量。在连续输注装置中，可以将剂量表示为在单位时间内递送的药物的量。
“剂量单位”指提供药物的形式。在某些实施方式中，剂量单位为含有冻干寡核苷酸的小管。在某些实施方式中，剂量单位指含有复溶寡核苷酸的小管。
“治疗有效量”指向动物提供治疗效果的药物的量。
“药物组合物”指适合给药于个体的包含药物的物质混合物。例如，药物组合物可以包含修饰寡核苷酸和无菌水溶液。
“可接受的安全性”指副作用的样式在临床可以接受的限度内。
“副作用”指治疗导致的除所需效应以外的生理应答。
1.某些修饰的寡核苷酸
在某些实施方式中，本发明提供了包括包含反义寡核苷酸的方法和组合物，与由天然存在的寡聚体形成的寡核苷酸相比，如DNA或RNA，所述反义寡核苷酸具有一种或多种修饰。此类修饰的反义寡核苷酸可以具有一种或多种优选的性质。某些此类修饰改变反义寡核苷酸的反义活性，例如增加反义寡核苷酸与其靶核酸的亲和性、增强其对一种或多种核酸酶的抗性、和/或改变寡核苷酸的药代动力学或组织分布性质。在某些实施方式中，此类修饰的反义寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷和/或一种或多种修饰的核苷连接和/或一种或多种缀合基团。
a.某些修饰的核苷
在某些实施方式中，反义寡核苷酸包含一种或多种修饰的核苷。此类修饰的核苷可以包括修饰的糖和/或修饰的核碱基。在某些实施方式中，在寡核苷酸中掺入此类修饰核苷可以使得修饰的寡核苷酸对靶核酸具有更高的亲和性和/或更强的稳定性，包括但不限于，对核酸酶降解具有更高的抗性、和/或具有改进的毒性和/或摄取特性。
i.某些核碱基
核苷中天然存在的碱基部分为杂环碱基，一般为嘌呤和嘧啶。除“未修饰”的或“天然”的核碱基如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)以外，在本发明所述的化合物中还可以掺入本领域技术人员公知的多种修饰的核碱基或核碱基模拟物。在某些实施方式中，修饰的核碱基为结构与母体核碱基非常类似的核碱基，例如7-脱氮杂嘌呤、5-甲基胞嘧啶、或G-夹钳。在某些实施方式中，核碱基模拟物包括更加复杂的结构，例如三环吩噁嗪核碱基模拟物。上文所述的修饰核碱基的制备方法为本领域技术人员所熟知。
ii.某些修饰的糖和糖替代物
本发明的反义寡核苷酸可以任选地含有一种或更多种核苷，其与天然糖相比，其中的糖配基被修饰。包含此类糖修饰核苷的寡核苷酸可以具有增强的核酸酶稳定性、具有增强的结合亲和性或某些其他有益的生物学性质。此类修饰包括但不限于，添加其他取代基团、将非成对环原子桥接以形成双环核酸(BNA)、将核糖环中的氧原子用S、N(R)或C(R1)(R)2(R＝H、C1-C12烷基或保护基团)以及这些组合取代，例如2′-F-5′-甲基取代核苷(其他公开的5′，2′-双取代核苷参见公开于8/21/08的PCT国际申请WO 2008/101157)，或者将核糖环中的氧原子用S取代并进一步在2′-位进行取代(参见公开的美国专利申请US2005-0130923，公开日2005年6月16日)，或者在BNA的5′-取代(参见PCT国际申请WO 2007/134181，公开日11/22/07，其中LNA被例如5′-甲基或5′-乙烯基基团取代)。
具有修饰糖配基的核苷的例子包括但不限于包含5′-乙烯基、5′-甲基(R或S)、4′-S、2′-F、2′-OCH3和2′-O(CH2)2OCH3取代基团的核苷。2’位的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm和Rn独立地为H或取代或非取代的C1-C10烷基。
双环核酸(BNA)的例子包括但不限于在4′和2′核糖环原子之间具有桥接的核苷。在某些实施方式中，本发明所述的反义化合物包括一种或多种BNA核苷，其中桥接包括下式之一：4′-β-D-(CH2)-O-2′(β-D-LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4’-α-L-(CH2)-O-2’(α-L-LNA)；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-C(CH3)2-O-2’(参见PCT/US2008/068922)；4’-CH(CH3)-O-2’和4’-C-H(CH2OCH3)-O-2’(参见美国专利7,399,845，2008年7月15日授权)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(参见PCT/US2008/064591)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见公开的美国专利申请US2004-0171570，2004年9月2日公开)；4’-CH2-N(R)-O-2’(参见美国专利7,427,672，2008年9月23日授权)；4’-CH2-C(CH3)-2’和4’-CH2-C(＝CH2)-2’(参见PCT/US2008/066154)；以及其中R独立地为H、C1-C12烷基、或保护基团。
在某些实施方式中，本发明提供了包含修饰糖配基的修饰核苷，其中所述修饰糖配基不是双环糖配基。某些此类修饰的核苷是已知的。在某些实施方式中，核苷的糖环可以在任意位置被修饰。可以在本发明中使用的糖修饰的例子包括，但不限于，含有选自下述糖取代基团的化合物：OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基或O-烷基-O-烷基，其中的烷基、烯基和炔基可以是取代或非取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。在某些此类实施方式中，此类取代基在糖的2’位。
在某些实施方式中，修饰核苷在糖的2’位具有取代基。在某些实施方式中，这样的取代基选自：卤素(包括，但不限于F)、烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2′-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm和Rn独立地为H或取代或非取代的C1-C10烷基。
在某些实施方式中，适用于本发明的修饰核苷为：2-甲氧乙氧基、2’-O-甲基(2’-O-CH3)、2’-氟代(2’-F)。
在某些实施方式中，修饰核苷在2′-位具有的取代基选自：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他2′-糖取代基团包括：C1至C10烷基、取代烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代甲硅烷基、RNA剪切基团、报告基团、插入剂、用于改善药代动力学性质的基团或用于改善寡聚化合物药效学性质的基团、以及具有类似性质的其他取代基。
在某些实施方式中，修饰核苷包含2’-MOE侧链(Baker et al.，J.Biol.Chem.，1997，272，11944-12000)。已有报道，此类2′-MOE取代比未修饰的核苷和其他修饰核苷，如2’-O-甲基、O-丙基、和O-氨基丙基具有更好的结合亲和性。具有2′-MOE取代的寡核苷酸还可以作为基因表达的反义抑制剂，其特性有望在体内使用(Martin，P.，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504；Altmann et al.，Chimia，1996，50，168-176；Altmann et al.，Biochem.Soc.Trans.，1996，24，630-637；以及Altmann et al.，NucleosidesNucleotides，1997，16，917-926)。
在某些实施方式中，2′-糖取代基团可以位于阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。在某些此类实施方式中，2′-阿拉伯糖修饰为2′-F阿拉伯糖(FANA)。类似的修饰还可以位于糖的其他位置，特别是在3′末端核苷或2′-5′连接的寡核苷酸的糖的3′位，以及在5′末端核苷酸的5′位。
在某些实施方式中，适用于本发明的核苷具有糖替代物如环丁基，以替代呋喃核糖基糖。教导制备此类修饰糖结构的美国专利的例子包括，但不限于，美国专利4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，每一篇都通过引用全文参考并入。
在某些实施方式中，本发明提供在糖的2’-位具有修饰的核苷。在某些实施方式中，本发明提供在糖的5’-位具有修饰的核苷。在某些实施方式中，本发明提供了在糖的2’-位和5’-位都具有修饰的核苷。在某些实施方式中，修饰的核苷可以用于掺入寡核苷酸。在某些实施方式中，修饰的核苷掺入到位于寡核苷酸5’-末端的寡核苷。
b.某些核苷间连接
本发明的反义寡核苷酸可以任选地含有一种或更多种修饰的核苷间连接。根据存在或不存在磷原子，将连接基团定义为两个主要的分类。具有代表性的含磷连接包括，但不限于，磷酸二酯(P＝O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、和硫代磷酸酯(P＝S)。具有代表性的不含磷的连接基团包括，但不限于，亚甲基甲基亚胺基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫羰氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；以及N，N′-二甲肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。将具有非磷连接基团的寡核苷酸称为寡核苷。与天然磷酸二酯键相比，修饰的连接可以改变，通常为增加，寡核苷酸对核酸酶的抗性。在某些实施方式中，具有手性原子的连接可以被制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。具有代表性的手性连接包括，但不限于，烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。含磷和非含磷连接的制备方法为本领域技术人员所熟知。
本文所述的反义寡核苷酸含有一个或更多个不对称的中心，因此产生了对映异构体、非对映异构体和依据绝对立体化学可以被定义为(R)或(S)的其他立体异构构型，如糖端基异构体，或可以被定义为(D)或(L)的其他立体异构构型，如氨基酸等。本文的反义化合物中可包括所有此类可能的异构体，及其外消旋体以及光学纯形式。
在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少一个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少两个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少3个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有至少10个修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，反义寡核苷酸的各核苷间连接均为修饰的核苷间连接。在某些实施方式中，此类修饰的核苷间连接为硫代磷酸酯连接。
c.长度
在某些实施方式中，本发明提供的反义寡核苷酸具有任意多种范围的长度。在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物或反义寡核苷酸包含X-Y连接的核苷或者由X-Y连接的核苷组成，其中X和Y均独立地选自8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、和50；其中X＜Y。例如，在某些实施方式中，本发明提供的反义化合物或反义寡核苷酸包含下述核苷或由下述核苷组成：8-9、8-10、8-11、8-12、8-13、8-14、8-15、8-16、8-17、8-18、8-19、8-20、8-21、8-22、8-23、8-24、8-25、8-26、8-27、8-28、8-29、8-30、9-10、9-11、9-12、9-13、9-14、9-15、9-16、9-17、9-18、9-19、9-20、9-21、9-22、9-23、9-24、9-25、9-26、9-27、9-28、9-29、9-30、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、10-19、10-20、10-21、10-22、10-23、10-24、10-25、10-26、10-27、10-28、10-29、10-30、11-12、11-13、11-14、11-15、11-16、11-17、11-18、11-19、11-20、11-21、11-22、11-23、11-24、11-25、11-26、11-27、11-28、11-29、11-30、12-13、12-14、12-15、12-16、12-17、12-18、12-19、12-20、12-21、12-22、12-23、12-24、12-25、12-26、12-27、12-28、12-29、12-30、13-14、13-15、13-16、13-17、13-18、13-19、13-20、13-21、13-22、13-23、13-24、13-25、13-26、13-27、13-28、13-29、13-30、14-15、14-16、14-17、14-18、14-19、14-20、14-21、14-22、14-23、14-24、14-25、14-26、14-27、14-28、14-29、14-30、15-16、15-17、15-18、15-19、15-20、15-21、15-22、15-23、15-24、15-25、15-26、15-27、15-28、15-29、15-30、16-17、16-18、16-19、16-20、16-21、16-22、16-23、16-24、16-25、16-26、16-27、16-28、16-29、16-30、17-18、17-19、17-20、17-21、17-22、17-23、17-24、17-25、17-26、17-27、17-28、17-29、17-30、18-19、18-20、18-21、18-22、18-23、18-24、18-25、18-26、18-27、18-28、18-29、18-30、19-20、19-21、19-22、19-23、19-24、19-25、19-26、19-29、19-28、19-29、19-30、20-21、20-22、20-23、20-24、20-25、20-26、20-27、20-28、20-29、20-30、21-22、21-23、21-24、21-25、21-26、21-27、21-28、21-29、21-30、22-23、22-24、22-25、22-26、22-27、22-28、22-29、22-30、23-24、23-25、23-26、23-27、23-28、23-29、23-30、24-25、24-26、24-27、24-28、24-29、24-30、25-26、25-27、25-28、25-29、25-30、26-27、26-28、26-29、26-30、27-28、27-29、27-30、28-29、28-30、或29-30个连接的核苷。
在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为15个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为16个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为17个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为18个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为19个核苷。在某些实施方式中，本发明的反义化合物或反义寡核苷酸的长度为20个核苷。
d.某些寡核苷酸基序
在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有的化学修饰的亚基沿着其长度以特定方向排列。在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸是完全修饰的。在某些实施方式中，本发明的反义化合物是均一修饰的。在某些实施方式中，本发明的反义化合物是均一修饰的且各核苷包含2’-MOE糖配基。在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸是均一修饰的且各核苷包含2’-OMe糖配基。在某些实施方式中，本发明的反义寡核苷酸是均一修饰的且各核苷包含吗啉取代糖配基。
在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含交替的基序。在某些此类实施方式中，交替的修饰类型选自2’-MOE、2’-F、双环糖修饰核苷、和DNA(未修饰的2’-脱氧)。在某些此类实施方式中，各交替的区域包含单一核苷。
在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含一个或更多个第一类型核苷区和一个或更多个第二类型核苷区。
在某些实施方式中，在交替的基序中，一个或多个交替的区域包括某类型的多于一个的核苷。例如，本发明的寡聚化合物可以包含下述核苷基序中任一种的一个或更多个区域：
Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1；
Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu2；
Nu1 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2；
Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2；
Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1；
Nu1 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2；
Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1；
Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1；
Nu2 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1Nu2 Nu1 Nu1；或
Nu1 Nu2Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu1 Nu2 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu2 Nu1 Nu1；
其中Nu1为第一类型的核苷且Nu2为第二类型的核苷。在某些实施方式中，Nu1和Nu2中的一个为2’-MOE核苷且Nu1和Nu2中的另一个选自：2’-OMe修饰的核苷、BNA和未修饰的DNA或RNA核苷。
2.寡聚化合物
在某些实施方式中，本发明提供寡聚化合物。在某些实施方式中，寡聚化合物仅包含寡核苷酸。在某些实施方式中，寡聚化合物包含寡核苷酸和一种或更多种缀合和/或末端基团。在上文所讨论的具有任意化学基序的寡核苷酸中可以插入此类缀合和/或末端基团。因此，例如，包含具有交替核苷区域的寡核苷酸的寡聚化合物可以包含末端基团。
a.某些缀合基团
在某些实施方式中，通过连接一个或更多个缀合基团对本发明的寡核苷酸进行修饰。一般而言，缀合基团可修饰与之连接的寡聚化合物的一种或多种性质，包括但不限于，药效学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和清除率。缀合基团在化学领域被常规使用，且与母体化合物直接连接，或通过任选的缀合连接配基或缀合连接基团相连接，母体化合物例如寡聚化合物，如寡核苷酸。缀合基团包括但不限于，插入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸配基、叶酸酯、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷胺、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。某些缀合基团此前已被描述，例如：胆固醇配基(Letsinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)、硫醚，例如，己基-S-三硫醇(Manoharan et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)、脂肪链，例如，十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov etal.，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49-54)、磷脂，例如，双十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1，2-双-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea et al.，Nucl.AcidsRes.，1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)、金刚烷胺乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕榈酰配基(Mishra et al.，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇配基(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。
在某些实施方式中，缀合基团包含活性药物，例如，阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-吡喃洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药物、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。寡核苷酸-药物缀合物及其制备方法参见美国专利申请09/334,130。
教导寡核苷酸缀合物制备方法的具有代表性的美国专利包括，但不限于，美国专利：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
缀合基团可以连接于寡核苷酸的任一个或两个末端(末端缀合基团)和/或任意内部位点。
b.末端基团
在某些实施方式中，寡聚化合物的一个或两个末端包含末端基团。在某些实施方式中，末端基团可以包含上文所述的任意缀合基团。在某些实施方式中，末端基团可以包含附加的核苷和/或反向无碱基核苷。在某些实施方式中，末端基团为稳定基团。
在某些实施方式中，寡聚化合物包含一种或更多种末端稳定基团，其能够增强诸如核酸酶稳定性等特性。稳定基团包括帽结构。本文使用的术语“帽结构”或“末端帽配基”是指可以连接到寡聚化合物的一个或两个末端的化学修饰。某些此类末端修饰可以保护具有末端核酸配基的寡聚化合物不受外切核酸酶的降解，且可以帮助其在细胞内的递送和/或定位。帽可以存在于5′-末端(5′-帽)或3′-末端(3′-帽)或可以存在于两个末端(更详细的内容参见Wincott et al.，国际PCT公开号WO 97/26270；Beaucage and Tyer，1993，Tetrahedron 49，1925；美国专利申请公开号US 2005/0020525；以及WO 03/004602)。
在某些实施方式中，将一个或更多个附加的核苷加入寡聚化合物的寡核苷酸的一个或两个末端。此类附加的末端核苷在本文中称为末端基团核苷。在双链化合物中，此类末端基团核苷是末端(3’和/或5’)突出。在双链反义化合物中，此类末端基团核苷可以与靶核酸互补或不互补。在某些实施方式中，末端基团为非核苷末端基团。此类非末端基团可以为除核苷以外的任意末端基团。
c.寡聚化合物基序
在某些实施方式中，本发明的寡聚化合物包含基序：
T1-(Nu1)n1-(Nu2)n2-(Nu1)n3-(Nu2)n4-(Nu1)n5-T2，其中：
Nu1，为第一类型的核苷；
Nu2，为第二类型的核苷；
每一个n1和n5均独立地为0至3；
n2与n4之和在10至25之间；
n3为0至5；以及
每一个T1和T2均独立地为H、羟基保护基团，任选地连接的缀合基团或加帽基团。
在此类实施方式中，n2和n4之和为13或14；n1为2；n3为2或3；以及n5为2。在某些此类实施方式中，本发明的寡聚化合物包含选自表A的基序。
表A旨在说明，而并非是对本发明进行限制。表A描述的寡聚化合物均包含20个核苷。通过对n1-n5中的一个或多个选择不同数量的核苷，可以很容易地设计包含或多或少核苷的寡聚化合物。在某些实施方式中，Nu1和Nu2均选自如下：2’-MOE、2’-OMe、DNA、和双环核苷。
3.反义的
在某些实施方式中，本发明的寡聚化合物为反义化合物。相应地，在此类实施方式中，寡聚化合物与靶核酸杂交，导致产生反义活性。
a.杂交
在某些实施方式中，本发明提供与靶核酸特异性杂交的反义化合物，在特异性结合所需的条件下，即进行体内检测或治疗时的生理条件，以及进行体外检测时的检测条件，其互补性程度足以避免反义化合物与非靶核酸序列发生非特异性结合。
因此，“严格杂交条件”或“严格条件”指反义化合物与靶序列杂交，而与其他序列杂交最少时的条件。严格条件具有序列依赖性，且在不同条件下有所不同，反义寡核苷酸与靶序列杂交的“严格条件”取决于反义寡核苷酸的性质和成分，以及用来对其进行研究的实验方法。
本领域公知，与未修饰化合物相比，掺入核苷酸亲和性修饰可以允许更多数量的错配。类似地，某些核碱基序列与其他核碱基序列相比可以耐受更多的错配。本领域普通技术人员能够确定寡核苷酸之间、或反义寡核苷酸与靶核酸之间适宜数量的错配，如通过确定熔点(Tm)来确定。Tm或ΔTm的计算方法是本领域技术人员所熟知的。例如，Freier etal.(Nucleic Acids Research，1997，25，22：4429-4443)描述的技术教导本领域技术人员评估核苷酸的修饰对RNA：DNA双螺旋熔点的提升能力。
b.mRNA前体的加工
在某些实施方式中，本文提供的反义化合物与mRNA前体互补。在某些实施方式中，此类反义化合物改变mRNA前体的剪接。在某些此类实施方式中，与靶mRNA前体对应的成熟mRNA的一种变体与该成熟mRNA的另一种变体的比率被改变。在某些此类实施方式中，由靶mRNA前体表达的蛋白的一种变体与该蛋白的另一种变体的比率被改变。某些可以用于改变mRNA前体剪接的寡聚化合物和核碱基序列的例子可以见于US 6,210,892；US 5,627,274；US 5,665,593；5,916,808；US 5,976,879；US2006/0172962；US2007/002390；US2005/0074801；US2007/0105807；US2005/0054836；WO 2007/090073；WO2007/047913，Hua etal.，PLoS Biol 5(4)：e73；Vickers et al.，J.Immunol.2006 Mar 15；176(6)：3652-61；以及Hua et al.，American J.of Human Genetics(2008年4月)82，1-15，以上的每一篇都通过全文参考并入，用于任何目的。在某些实施方式中，根据本发明的基序对改变剪接的反义序列进行修饰。
反义技术是用于调节一种或多种特定基因产物表达的有效方法，且其在多种治疗、诊断和研究应用上具有独特的作用。通过反义作用机制，包括基于靶点占据的反义机制，本文提供的反义化合物可用于调节基因的表达。在一方面，本文提供的反义化合物调节靶基因的剪接。此类调节包括促进或抑制外显子的包含。本文进一步提供了一些反义化合物，其靶向作用于mRNA前体分子中存在的顺式剪接调节元件，包括外显子剪接增强子、外显子剪接沉默子、内含子剪接增强子和内含子剪接沉默子。顺式剪接调节元件的破坏被认为可以改变剪接位点的选择，其可以导致剪接产物组成的改变。
真核mRNA前体的加工是一个复杂的过程，其需要多种信号和蛋白因子，以实现适宜的mRNA剪接。剪接体对外显子的定义不仅仅需要定义内含子-外显子边界的标准剪接信号。一种此类附加信号是顺式作用调节增强子和沉默子序列。经鉴定，外显子剪接增强子(ESE)、外显子剪接沉默子(ESS)、内含子剪接增强子(ISE)和内含子剪接沉默子(ISS)可以抑制或增强剪接供体位点或剪接受体位点的使用，取决于其位点和作用模式(Yeo etal.2004，Proc.Natl.Acad.Sci.美国A.101(44)：15700-15705)。特定蛋白(反式因子)与这些调节序列的结合支配剪接过程，促进或抑制特定剪接位点的使用，从而调节剪接产物的比率(Scamborova et al.2004，Mol.Cell.Biol.24(5)：1855-1869；Hovhannisyan andCarstens，2005，Mol.Cell.Biol.25(1)：250-263；Minovitsky et al.2005，Nucleic AcidsRes.33(2)：714-724)。
4.药物组合物
在某些实施方式中，本发明提供包含一种或多种反义化合物的药物组合物。在某些实施方式中，此类药物组合物包含无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物。在某些实施方式中，此类药物组合物由无菌盐水溶液和一种或多种反义化合物组成。
在某些实施方式中，可以将反义化合物与药学上可接受的活性和/或惰性物质混合，用于制备药物组合物或制剂。用于药物组合物制剂的组合物和方法取决于多种标准，包括但不限于，给药途径、疾病程度或给药剂量。
在某些实施方式中，可以通过将此类寡聚化合物与适宜的药学上可接受的稀释剂或载体进行组合，从而将反义化合物用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲液(PBS)。PBS是一种稀释剂，适用于经肠道外递送的组合物。相应地，在某些实施方式中，在本文所述的方法中使用的药物组合物包含反义化合物和药学上可接受的稀释剂。在某些实施方式中，药学上可接受的稀释剂为PBS。
含有反义化合物的药物组合物包含任意药学上可接受盐、酯、或此类酯的盐。在某些实施方式中，含有反义化合物的药物组合物包含一种或多种寡核苷酸，当所述寡核苷酸给药于动物，包括人时，可以(直接地或间接地)提供生物学活性代谢产物或其残留物。相应地，例如，本发明还提供反义化合物的药学上可接受的盐，前药、此类前药的药学上可接受的盐，以及其他生物等效物。适宜的药学上可接受的盐包括，但不限于，钠盐和钾盐。
前药可以在寡聚化合物的一个或两个末端添加有其他核苷，其在体内可以被内源性的核酸酶所剪切，以形成具有活性的反义寡聚化合物。
在多种方法中，已将基于脂质的载体用于核酸治疗。例如，在一种方法中，将核酸加入到由阳离子脂质和中性脂质混合形成的脂质体或脂复合体中。在另外一种方法中，在不存在中性脂质的情况下，DNA与单一或多聚阳离子脂质形成复合物。
某些制备方法参见Akinc et al.，Nature Biotechnology 26，561-569(2008年5月1日)，其全文通过引用参考并入。
5.向对象给药
在某些实施方式中，向对象给药包含一种或多种反义化合物的药物组合物。在某些实施方式中，此类药物组合物通过注射给药。在某些实施方式中，此类药物组合物通过输注给药。
在某些实施方式中，通过注射或输注将药物组合物给药至CSF。在某些此类实施方式中，将药物组合物直接注射或输注至脊柱。在某些实施方式中，通过注射或输注将药物组合物给药至脑。在某些实施方式中，通过鞘内注射或输注给药药物组合物，而不是给药至脊髓组织本身。不受理论的限制，在某些实施方式中，反义化合物释放进入CSF周围，并且可以渗透进入脊髓实质。鞘内递送的另外一个优点是，鞘内途径模拟了在人体内已常规使用的腰椎穿刺给药(即，脊椎穿刺)。
在某些实施方式中，药物组合物通过脑室内(ICV)注射或输注给药。当向脑室内或脑室递送含有一种或多种反义化合物的药物组合物时，可以在任意一个或多个脑室内进行，其中充满了脑脊液(CSF)。CSF是一种充满了脑室的透明液体，其存在于蛛网膜下腔的空隙，以及在脑和脊髓的周围。CSF由脉络膜丛产生，并通过渗出或组织液交换方式从脑转移至脑室。脉络膜丛是位于脑室外侧底部和第三和第四脑室顶部的结构夹层。某些研究表明，这些结构每天能够产生400-600cc液体，其与每日四次填充中枢神经系统的量一致。在成年人中，经计算该液体的体积为125至150ml(4-5oz)。CSF持续形成、循环和吸收。某些研究表明，每日可以产生约430至450ml(约2杯)CSF。某些计算估计，在成人中的产生量约为0.35ml每分钟，在婴儿中约为0.15每分钟。大多数的CSF由脑室外侧的脉络膜丛产生。其通过Monro孔流入第三脑室，加入第三脑室中产生的产物，并通过Sylvius导水管继续进入第四脑室。在第四脑室中产生更多的CSF，随后这种液体通过Magendie和Luschka孔进入蛛网膜下腔。随后其在整个脑内循环，下至脊髓，上至大脑半球。CSF通过蛛网膜绒毛和颅内血管窦排入血液。
在某些实施方式中，此类药物组合物通过全身给药。在某些实施方式中，药物组合物通过皮下给药。在某些实施方式中，药物组合物通过静脉给药。在某些实施方式中，药物组合物通过肌内注射给药。
在某些实施方式中，药物组合物直接给药至CSF(例如，IT和/或ICV注射和/或输注)以及全身。
在某些实施方式中，通过全身给药的反义化合物进入神经元。在某些实施方式中，全身给药反义化合物可以穿透血脑屏障，特别是在血脑屏障没有完全形成的年轻对象中(例如，在子宫内的对象和/或新生对象)。在某些实施方式中，通过全身给药的反义化合物的一定量可以被神经细胞摄取，甚至在血脑屏障已经完全形成的对象中。例如，反义化合物可以进入位于神经肌接头处或其附近的神经元中(逆行摄取)。在某些实施方式中，此类逆行摄取导致在神经元中发挥反义活性，包括但不限于，运动神经元，并且通过在神经元中发挥反义活性而提供治疗效果。
在某些实施方式中，全身给药通过在神经元以外的细胞和/或组织中发挥反义活性而提供治疗效果。虽然有证据表明正常神经元功能需要神经元中有功能性SMN，但在其他细胞和组织中功能性SMN减少所带来的结果尚未明确定性。在某些实施方式中，在非神经元细胞中发挥反义活性使得SMN功能在这些非神经元细胞中得以恢复，其可以带来治疗效果。
在某些实施方式中，非神经元细胞的SMN功能改善能够改善神经元细胞的功能，而不管神经元中的SMN功能是否改善。例如，在某些实施方式中，全身给药本发明的药物组合物可以使其在肌肉细胞中发挥反义活性。在肌肉细胞中的此类反义活性可以对与该肌肉细胞相关的运动神经元或对神经元整体带来效果。在此类实施方式中，恢复了SMN功能的肌肉细胞可以提供某种因子，其能够改善神经元的存活和/或功能。在某些实施方式中，此类反义活性不依赖于神经元内反义化合物发挥反义活性所带来的益处。在某些实施方式中，全身给药本发明的药物组合物将在其他非神经元细胞中发挥反义活性，包括与神经元无直接关联的细胞。在非神经元细胞中的此类反义活性可以改善神经元的功能。例如，在非神经元细胞(例如，肝细胞)中的反义活性可以使细胞产生能够改善神经元功能的因子。注意：由于“反义活性”包括直接和间接活性，因此即使反义化合物未进入神经系统，其对神经元功能的效果也称为“反义活性”。
在某些实施方式中，药物组合物的全身给药所带来的治疗效果不依赖于其在神经元内的直接或间接反义活性。通常，出现SMA后，神经元功能减弱，结果将产生明显的症状。其他细胞中的SMN活性减弱可能产生其他症状。由于神经元功能减弱导致的症状相对严重，可能掩盖某些此类症状。在某些实施方式中，全身给药使得非神经元细胞中的SMN功能恢复或改善。在某些此类实施方式中，此类恢复或改善的非神经元细胞的SMN功能可以带来治疗效果。例如，在某些例子中，患有SMA的对象生长缓慢。此类生长缓慢可能不是神经元细胞功能减弱的结果。事实上，生长缓慢可能与其他器官中的细胞功能损伤有关，如垂体，和/或可能是整个机体细胞SMN缺陷的结果。在此类实施方式中，全身给药的结果可以改善垂体细胞和/或其他细胞的SMN活性，进而改善生长情况。在某些例子中，给药至CSF使足量神经元的功能得以恢复，以延长对象的生命，但是由于对象的生命延长了，一种或多种此前未知的症状突然出现，因为对象通常在这些症状出现以前已经死亡。某些此类突然出现的症状可能是致命的。在某些实施方式中，通过全身给药治疗突然出现的症状。在不考虑作用机制的情况下，在某些实施方式中，SMA的多种症状均可以通过全身给药治疗，这些症状包括但不限于，此前被与神经元功能损伤相关的更加严重的症状所掩盖的症状。
在某些实施方式中，全身给药本发明的药物组合物使得肌肉细胞中的SMN活性增加。在某些实施方式中，肌肉细胞中此类SMN活性的改善可以提供治疗效果。已有报道表明，仅有在肌肉中改善SMN活性还不足以提供治疗效果(例如，Gravrilina，et al.，Hum MolGenet 2008 17(8)：1063-1075)。在某些实施方式中，本发明提供能够在肌肉中改善SMN功能并提供治疗效果的方法。在某些例子中，在其他细胞中(单独或与肌肉细胞一起)的SMN功能的改善产生了该治疗效果。在某些实施方式中，仅改善肌肉中的SMN功能就可以提供治疗效果。
在某些实施方式中，全身给药使得存活情况改善。
6.脊髓性肌萎缩症(SMA)
SMA是一种以脊髓运动神经元退化为特征的遗传病。SMA的病因为SMN1基因的两个功能性拷贝纯合性缺失。但是，SMN2基因具有编码与SMN1相同蛋白的能力，这样就可以克服SMA患者的遗传缺陷。在SMN2外显子7的+6位含有一个翻译沉默突变(C→T)，其导致SMN2转录物中的外显子7不能被有效包含。因此，SMN2的主要形式缺乏外显子7，其不稳定且没有活性。因此，能够调节SMN2剪接以使得含有外显子7的SMN2转录物百分率增加的治疗化合物，将可以用于治疗SMA。
在某些实施方式中，本发明提供与编码SMN2的mRNA前体互补的反义化合物。在某些此类实施方式中，反义化合物改变SMN2的剪接。某些用于改变SMN2剪接的序列和区域可以参见PCT/US06/024469，其全文通过引用参考并入，用于任何目的。在某些实施方式中，具有本文所述任意基序的寡聚化合物具有与SMN2的内含子7互补的核碱基序列。在非限制性的下表中列出了某些此类核碱基序列的例子。
序列 长度 SEQ ID
TGCTGGCAGACTTAC 15 3
CATAATGCTGGCAGA 15 4
TCATAATGCTGGCAG 15 5
TTCATAATGCTGGCA 15 6
TTTCATAATGCTGGC 15 2
ATTCACTTTCATAATGCTGG 20 7
TCACTTTCATAATGCTGG 18 1
CTTTCATAATGCTGG 15 8
TCATAATGCTGG 12 9
ACTTTCATAATGCTG 15 10
TTCATAATGCTG 12 11
CACTTTCATAATGCT 15 12
TTTCATAATGCT 12 13
TCACTTTCATAATGC 15 14
CTTTCATAATGC 12 15
TTCACTTTCATAATG 15 16
ACTTTCATAATG 12 17
ATTCACTTTCATAAT 15 18
CACTTTCATAAT 12 19
GATTCACTTTCATAA 15 20
TCACTTTCATAA 12 21
TTCACTTTCATA 12 22
ATTCACTTTCAT 12 23
AGTAAGATTCACTTT 15 24
本发明的反义化合物可以用于调节对象如人中SMN2的表达。在某些实施方式中，对象患有脊髓性肌萎缩症。在某些此类对象中，SMN1基因缺失或不足以产生足量的功能性SMN蛋白。在某些实施方式中，本发明的反义化合物可以有效调节SMN2的剪接，使得在SMN2mRNA中，并且最终在包含外显子7对应的氨基酸的SMN2蛋白中，外显子7的包含增加。此类替代SMN2蛋白与野生型SMN蛋白类似。能够有效调节SMN2 mRNA的表达或其所表达的蛋白产物的本发明反义化合物，被认为是活性反义化合物。
对SMN2表达的调节可以在体液中检测，体液可以含有或不含细胞，或在动物的组织、器官中检测。本领域技术人员已知获取供分析用的样本的方法，样本例如体液(例如，唾液、血清、CSF)、组织(例如，活检)、或器官，以及制备供分析用样本的方法。RNA和蛋白水平分析采用的方法已在上文中进行了讨论，且其均为本领域技术人员所熟知。通过本领域公知的常规临床方法，从用本发明一种或多种化合物接触的动物收集上文所述的液体、组织或器官，检测其中与靶基因表达相关的生物标记物，进而评估治疗效果。
还包括了用有效量的本发明所述一种或更多种反义化合物或组合物接触体液、器官或组织的方法。体液、器官或组织可以与一种或更多种本发明的化合物接触，使得体液、器官或组织的细胞中SMN2的表达被调节。可以利用本领域的常规方法，监测反义化合物或组合物对靶核酸或其产物的调节作用，从而确定有效量。
本发明还提供了如本文所述的反义化合物，以用于如本文所述的任意方法。例如，本发明提供了包含与编码人SMN2的核酸互补的反义化合物，用于治疗与运动神经元存活蛋白(SMN)相关的疾病或状态，如脊髓性肌萎缩症(SMA)。作为进一步的例子，本发明提供了包含反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸与编码人SMN2的核酸互补，通过将反义化合物直接给药至中枢神经系统(CNS)或CSF，用于治疗与运动神经元存活蛋白(SMN)相关的疾病或状态。
本发明还提供了如本文所述的反义化合物用于生产药物的用途，所述药物用于如本文所述任意方法。例如，本发明提供了包含反义寡核苷酸的反义化合物用于生产药物的用途，所述反义寡核苷酸互补于编码人SMN2的核酸，所述药物用于治疗与运动神经元存活蛋白(SMN)相关疾病或状态，如脊髓性肌萎缩症(SMA)。作为进一步的例子，本发明提供了包含反义寡核苷酸的反义化合物用于生产药物的用途，所述反义寡核苷酸互补于编码人SMN2的核酸，通过将所述药物直接给药至中枢神经系统(CNS)或CSF，所述药物用于治疗与运动神经元存活蛋白(SMN)相关疾病或状态。
在某些实施方式中，具有本文所述任意基序的寡聚化合物具有与SMN2的外显子7互补的核碱基序列。
在某些实施方式中，具有本文所述任意基序的寡聚化合物具有与SMN2的内含子6互补的核碱基序列。
在某些实施方式中，反义化合物包含反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含以下序列：TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO：1)中的至少10个核碱基。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列中至少11个核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列中至少12个核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列中至少13个核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列中至少14个核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列中至少15个核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列中至少16个核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列中至少17个核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有包括此序列的核碱基的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸具有由此序列的核碱基组成的核碱基序列。在某些实施方式中，反义寡核苷酸由10-18个连接的核苷组成，且具有的核碱基序列与序列：TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO：1)的等长部分具有100％同一性。
7.某些对象
在某些实施方式中，对象具有一个或多个SMA指征。在某些实施方式中，对象的一块或多块肌肉的电活性下降。在某些实施方式中，对象具有突变的SMN1基因。在某些实施方式中，对象的SMN1基因缺失或无法产生功能性的SMN蛋白。在某些实施方式中，通过遗传检测诊断对象。在某些实施方式中，通过肌肉组织活检识别对象。在某些实施方式中，对象不能坐直。在某些实施方式中，对象不能站立或行走。在某些实施方式中，对象的呼吸和/或进食需要帮助。在某些实施方式中，通过肌肉电生理检测和/或肌肉组织活检识别对象。
在某些实施方式中，对象患有I型SMA。在某些实施方式中，对象患有II型SMA。在某些实施方式中，对象患有III型SMA。在某些实施方式中，诊断在子宫中的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断出生一周内的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断出生一个月内的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断年龄为3个月的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断年龄为6个月的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断年龄为1岁的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断年龄为1至2岁的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断年龄为1至15岁的对象患有SMA。在某些实施方式中，诊断年龄为15岁以上的对象患有SMA。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物的第一次给药在子宫内。在某些此类实施方式中，第一次给药于血脑屏障发育完全以前。在某些实施方式中，第一次给药为向处于子宫内的对象全身给药。在某些实施方式中，第一次给药为血脑屏障形成后向子宫内给药。在某些实施方式中，第一次给药为向CSF给药。
在某些实施方式中，当对象的年龄小于一周时完成本发明药物组合物的第一次给药。在某些实施方式中，当对象的年龄小于一个月时完成本发明药物组合物的第一次给药。在某些实施方式中，当对象的年龄小于3个月时完成本发明药物组合物的第一次给药。在某些实施方式中，当对象的年龄小于6个月时完成本发明药物组合物的第一次给药。在某些实施方式中，当对象的年龄小于一岁时完成本发明药物组合物的第一次给药。在某些实施方式中，当对象的年龄小于2岁时完成本发明药物组合物的第一次给药。在某些实施方式中，当对象的年龄小于15岁时完成本发明药物组合物的第一次给药。在某些实施方式中，当对象的年龄大于15岁时完成本发明药物组合物的第一次给药。
8.某些剂量
在某些实施方式中，本发明提供给药剂量和频率。在某些实施方式中，药物组合物通过推注给药。在某些此类实施方式中，推注给药的剂量为0.01至25毫克反义化合物每千克对象体重。在某些此类实施方式中，推注给药的剂量为0.01至10毫克反义化合物每千克对象体重。在某些此类实施方式中，所述剂量为0.05至5毫克反义化合物每千克对象体重。在某些此类实施方式中，所述剂量为0.1至2毫克反义化合物每千克对象体重。在某些此类实施方式中，所述剂量为0.5至1毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，此类剂量每月给药两次。在某些实施方式中，此类剂量每月给药一次。在某些实施方式中，此类剂量每2个月给药一次。在某些实施方式中，此类剂量每6个月给药一次。在某些实施方式中，此类剂量通过推注给药至CSF。在某些实施方式中，此类剂量通过鞘内推注给药。在某些实施方式中，此类剂量通过全身推注注射(例如，皮下、肌内或静脉注射)。在某些实施方式中，对象接受向CSF的推注注射和全身推注注射。在此类实施方式中，各次CSF推注和全身推注的剂量可以相同或不同。在某些实施方式中，CSF和全身给药的频率不同。在某些实施方式中，本发明提供的给药方案包含至少一次鞘内推注注射和至少一次皮下推注注射。
在某些实施方式中，通过连续输注给药药物组合物。此类连续输注可以通过输液泵完成，其将药物组合物递送至CSF。在某些实施方式中，此类输液泵递送药物组合物至IT或ICV。在某些实施方式中，给药剂量为每日0.05至25毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，给药剂量为每日0.1至10毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，给药剂量为每日0.5至10毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，给药剂量为每日0.5至5毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，给药剂量为每日1至5毫克反义化合物每千克对象体重。在某些实施方式中，本发明提供的给药方案包含输注至CNS和至少一次全身推注注射。在某些实施方式中，本发明提供的给药方案包括输注至CNS和至少一次皮下推注注射。在某些实施方式中，对剂量进行调整，无论是推注还是输注，使得反义化合物的浓度达到或维持在0.1至100毫克每克CNS组织。在某些实施方式中，对剂量进行调整，无论是推注还是输注，使得反义化合物的浓度达到或维持在1至10毫克每克CNS组织。在某些实施方式中，对剂量进行调整，无论是推注还是输注，使得反义化合物的浓度达到或维持在0.1至1毫克每克CNS组织。
在某些实施方式中，向对象的给药分为诱导期和维持期。在某些此类实施方式中，在诱导期的给药剂量高于在维持期的给药剂量。在某些实施方式中，在诱导期的给药剂量低于在维持期的给药剂量。在某些实施方式中，诱导期通过推注注射完成，维持期通过连续输注完成。
在某些实施方式中，本发明提供反义化合物的全身给药，以单用的方式进行或与递送至CSF联用。在某些实施方式中，全身给药的剂量为0.1mg/kg至200mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为0.1mg/kg至100mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为0.5mg/kg至100mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为1mg/kg至100mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为1mg/kg至50mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为1mg/kg至25mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为0.1mg/kg至25mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为0.1mg/kg至10mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为1mg/kg至10mg/kg。在某些实施方式中，全身给药的剂量为1mg/kg至5mg/kg。在某些实施方式中包含全身和CSF递送，独立地确定这两种途径的剂量。
a.计算适宜的人用剂量
在某些实施方式中，所述对象是人。在某些实施方式中，通过动物实验的数据，例如本文所描述的那些，计算或估计人用剂量。在某些实施方式中，通过猴和/或小鼠实验的数据，例如本文所描述的那些，计算或估计人用剂量。在某些实施方式中，通过小鼠实验的数据，例如本文所描述的那些，计算或估计人用剂量。在某些实施方式中，可以采用小鼠药代动力学数据，结合脑重和/或脑脊液(CSF)更新速度，计算适宜的人用剂量。例如，小鼠脑重约0.4g，其约占体重的2％。对人而言，平均脑重为1.5kg，其约占体重的2.5％。在某些实施方式中，给药至CSF使得部分化合物通过脑组织的摄取和随后的代谢而被消除。利用人与小鼠脑重量的比率作为换算因子，可以计算通过脑组织的消除和清除估计值。此外，可以使用CSF更新速度，估计化合物从CSF中消除到血液中的情况。小鼠CSF的更新速度为每日约10-12次(以0.325μl/min的速度产生0.04mL)。人CSF的更新速度为每日约4次(以350-400μl/min的速度产生100-160mL)。可以依据脑重量的消除换算，和/或CSF的更新换算，确定清除率以及给药剂量。外推得到的人CSF清除率可以用于估算近似于小鼠给药剂量的人用等同剂量。这样，依据脑重量和CSF更新速度，可以估计出考虑了组织代谢差异的人用剂量。用于计算和估算的此类方法是本领域技术人员所熟知的。
作为非限制性的例子，在某些实施方式中，可以由期望的小鼠剂量估算出人用等同剂量，通过将mg/kg的小鼠剂量乘以约0.25至约1.25的因子，该因子取决于特定化合物的已确定的清除率和消除值。因此，例如，在某些实施方式中，与20g小鼠的0.01mg给药剂量相等同的人用剂量范围为，对70kg人的约8.75mg至约43.75mg的总剂量。同样地，在某些实施方式中，与4g新生小鼠的0.01mg给药剂量相等同的人用剂量范围为，对3kg新生儿的约1.9mg至约9.4mg的总剂量。这些例子仅用于说明本领域技术人员是如何确定适宜的人用剂量的，其并非旨在限制本发明。
在某些实施方式中，通过动物实验的数据，如本文所描述的那些，来计算或估算全身递送(不论是单用或是与CSF递送联用)的人用剂量。通常，用于全身给药的适宜的人用剂量(以mg/kg计)为动物用有效剂量的0.1至10倍。因此，仅作为举例，对2g新生小鼠皮下给药50μg，其剂量为25mg/kg。预计在人体内的相应剂量为2.5mg/kg至250mg/kg。对于3千克重的婴儿而言，相应的剂量为7.5mg至750mg。对于25kg重的儿童而言，相应剂量为62.5mg至6250mg。
9.治疗方案
在某些实施方式中，对上述给药剂量、给药频率、给药途径、诱导期和维持期、以及第一次给药时间进行组合，以提供对患有SMA对象的给药方案。可以对此类给药方案进行选择和调整，以改善SMA的一种或多种症状和/或减轻或避免药物组合物的给药所导致的毒性或副作用。在某些实施方式中，对象在子宫内或为新生儿。在此类实施方式中，药物组合物的给药，特别是通过连续输注给药，存在特定挑战。因此，在某些实施方式中，当对象在子宫内或年龄非常小时，本发明通过推注给药的方式提供药物组合物的给药，此后当对象年龄更大且安放植入的输液泵更为现实时，通过这种泵连续输注给药。进一步地，在某些实施方式中，当对象长大后，增加绝对剂量，以获得相同或相近的剂量：体重比率。下表旨在举例说明治疗方案，而并非意在限制本领域技术人员容易想到的可能存在的治疗组合。
*注释：方案3的第4次给药期为连续CSF输注与周期性全身给药联用的例子。这些治疗方案旨在举例，并非意在限制本发明。
在某些实施方式中，给药方案包含全身给药，单用或与给药至CSF联用(例如方案3，见上文)。下表对此类方案进一步举例。
这些治疗方案旨在举例，并非意在限制本发明。根据本申请的内容，并基于多种因素，如状态的严重程度以及对象的总体健康状况和年龄等，本领域技术人员能够选择给药剂量和递送方式的适宜组合。
10.联合给药
在某些实施方式中，本发明的药物组合物与至少一种用于治疗SMA和/或用于治疗一种或多种与SMA相关症状的其他药物组合物联合给药。在某些实施方式中，此类其他药物组合物选自曲古霉素-A丙戊酸、利鲁唑、羟基脲以及丁酸盐或丁酸盐衍生物。在某些实施方式中，本发明的药物组合物与曲古霉素-A联合给药。在某些实施方式中，本发明的药物组合物与喹唑啉衍生物联合给药，例如在Thurmond，et al.，J.Med Chem.2008，51，449-469中所描述。在某些实施方式中，本发明的药物组合物与至少一种其他药物组合物在相同时间联合给药。在某些实施方式中，本发明的药物组合物与至少一种其他药物组合物在不同时间联合给药。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物与基因治疗剂联合给药。在某些此类实施方式中，基因治疗剂给药至CSF，且本发明的药物组合物全身给药。在某些此类实施方式中，基因治疗剂给药至CSF，且本发明的药物组合物给药至CSF和全身给药。在某些实施方式中，本发明的药物组合物和基因治疗剂在相同时间联合给药。在某些实施方式中，本发明的药物组合物和基因治疗剂在不同的时间联合给药。已报道了用于SMA治疗的某些基因治疗方法(例如，Coady et al.，PLoS ONE 2008 3(10)：e3468；Passini et al.，J Clin Invest2010 Apr 1，120(4)：1253-64)。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物与至少一种用于SMA的其他疗法联合给药。在某些实施方式中，此类用于SMA的其他疗法为手术。在某些实施方式中，此类其他疗法为物理治疗，包括但不限于，对呼吸所必须的肌肉进行力量增强的锻炼，如咳嗽治疗。在某些实施方式中，其他治疗为物理介入，如饲喂管或呼吸辅助设备。
在某些实施方式中，本发明的药物组合物与一种或多种药物组合物联合给药，所述药物组合物能够降低本发明药物组合物的不希望的副作用。
11.表型效应
在某些实施方式中，给药至少一种本发明的药物组合物使得对象的表型改变。在某些实施方式中，此类表型改变包括，但不限于：包含外显子7的SMN mRNA的绝对量增加；包含外显子7的SMN mRNA与缺乏外显子7的SMN mRNA的比率升高；包含外显子7的SMN蛋白的绝对量增加；包含外显子7的SMN蛋白与缺乏外显子7的SMN蛋白的比率升高；肌肉力量改善，至少一块肌肉的电活性改善；呼吸改善；体重增加；以及存活。在某些实施方式中，在对象运动神经元检测到至少一种表型改变。在某些实施方式中，给药至少一种本发明的药物组合物使得对象能够端坐、站立和/或行走。在某些实施方式中，给药至少一种本发明药物组合物使得对象在没有帮助的情况下能够进食、饮水和/或呼吸。在某些实施方式中，通过对肌肉进行电生理评估评价治疗效果。在某些实施方式中，给药本发明的药物组合物改善SMA的至少一种症状且具有较少或没有炎症作用。在某些此类实施方式中，通过治疗后未出现Aifl水平的显著增加，来确定未出现炎症作用。
在某些实施方式中，给药至少一种本发明药物组合物能延迟SMA的至少一种症状的出现。在某些实施方式中，给药至少一种本发明药物组合物能延缓SMA的至少一种症状的进展。在某些实施方式中，给药至少一种本发明药物组合物能降低SMA至少一种症状的严重程度。
在某些实施方式中，给药至少一种本发明药物组合物使得产生不期望出现的副作用。在某些实施方式中，识别出治疗方案，使得症状获得所需的改善，且避免不期望出现的副作用。
12.剂量单位
在某些实施方式中，将本发明的药物组合物制成用于给药的剂量单位。某些此类剂量单位的浓度选自0.01mg至100mg。在某些此类实施方式中，本发明的药物组合物所包含的反义化合物的剂量选自0.01mg、0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、20mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、和200mg。在某些实施方式中，药物组合物所包含的寡核苷酸的剂量选自0.1mg、03mg、1mg、5mg、10mg、25mg、和50mg。
13.试剂盒
在某些实施方式中，本发明提供的试剂盒包含至少一种药物组合物。在某些实施方式中，此类试剂盒进一步包含一种递送工具，例如注射器或输液泵。
本发明还提供了以下实施方式：
实施方式1.一种方法，包括向对象给药包含反义寡核苷酸的反义化合物，该反义寡核苷酸互补于人SMN2 mRNA前体的编码核酸的内含子7，其中所述反义化合物给药至脑脊液。
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述给药是至鞘内空隙。
3.根据实施方式1所述的方法，其中所述给药是至脑内的脑脊液。
4.根据实施方式1-3任意一项所述的方法，其中所述给药包含推注注射。
5.根据实施方式1-3任意一项所述的方法，其中所述给药包含利用递送泵输注。
6.根据实施方式1-5任意一项所述的方法，其中所述反义化合物给药的剂量为0.01至10毫克反义化合物每千克对象体重。
7.根据实施方式6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至10毫克反义化合物每千克对象体重。
8.根据实施方式6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至5毫克反义化合物每千克对象体重。
9.根据实施方式6所述的方法，其中所述给药剂量为0.05至1毫克反义化合物每千克对象体重。
10.根据实施方式6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至0.5毫克反义化合物每千克对象体重。
11.根据实施方式6所述的方法，其中所述给药剂量为0.05至0.5毫克反义化合物每千克对象体重。
12.根据实施方式6-11任意一项所述的方法，其中每日给药所述剂量。
13.根据实施方式6-11任意一项所述的方法，其中每周给药所述剂量。
14.根据实施方式6-11任意一项所述的方法，其中连续给药所述反义化合物，且其中所述剂量是每日给药的剂量。
15.根据实施方式1-13任意一项所述的方法，包括在诱导期给药至少一个诱导剂量，且在维持期给药至少一个维持剂量。
16.根据实施方式15所述的方法，其中所述诱导剂量为0.05至5.0毫克反义化合物每千克对象体重。
17.根据实施方式15或16所述的方法，其中所述维持剂量为0.01至1.0毫克反义化合物每千克对象体重。
18.根据实施方式15-17任意一项所述的方法，其中所述诱导期的持续时间为至少1周。
19.根据实施方式15-18任意一项所述的方法，其中所述维持期的持续时间为至少1周。
20.根据实施方式15-19任意一项所述的方法，其中各诱导剂量和各维持剂量均包含单次注射。
21.根据实施方式15-19任意一项所述的方法，其中各诱导剂量和各维持剂量均独立地包含两次或更多注射。
22.根据实施方式1-21任意一项所述的方法，其中在至少1周的治疗期内，给药所述反义化合物至少2次。
23.根据实施方式22所述的方法，其中所述治疗期为至少一个月。
24.根据实施方式22所述的方法，其中所述治疗期为至少2个月。
25.根据实施方式22所述的方法，其中所述治疗期为至少4个月。
26.根据实施方式15-25任意一项所述的方法，其中通过一次或更多推注注射给药所述诱导剂量，和通过输注泵给药所述维持剂量。
27.根据实施方式1-26任意一项所述的方法，包括评估反义化合物的所述耐受性和/或有效性。
28.根据实施方式1-27任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药不耐受的指征时，降低反义化合物的给药剂量或频率。
29.根据实施方式1-28任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药有效的指征时，维持或降低反义化合物的给药剂量或频率。
30.根据实施方式1-29任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药无效的指征时，增加反义化合物的剂量。
31.根据实施方式1-30任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药有效的指征时，降低反义化合物的给药频率。
32.根据实施方式1-31任意一项所述的方法，其中当出现所述反义化合物给药无效的指征时，增加反义化合物的给药频率。
33.根据上述实施方式任意一项所述的方法，包括将所述反义化合物与至少一种其他疗法联合给药。
34.根据实施方式33所述的方法，其中将所述反义化合物与至少一种其他疗法同时联合给药。
35.根据实施方式34所述的方法，其中在至少一种其他治疗给药前，给药所述反义化合物。
36.根据实施方式34所述的方法，其中在至少一种其他治疗给药后，给药所述反义化合物。
37.根据实施方式33-36任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗包括，给药丙戊酸、利鲁唑、羟基脲和丁酸盐中的一种或更多种。
38.根据实施方式33-37任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗包括给药曲古霉素-A。
39.根据实施方式33-38任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗包括给药干细胞。
40.根据实施方式33-39任意一项所述的方法，其中所述至少一种其他治疗为基因治疗。
41.根据上述实施方式任意一项所述的方法，其中所述反义化合物的给药浓度为约0.01mg/ml、约0.05mg/ml、约0.1mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约5mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml、或约100mg/ml。
42.根据实施方式1-41任意一项所述的方法，其中在对象的运动神经元中，SMN2mRNA对外显子7的包含增加。
43.根据实施方式1-42任意一项所述的方法，其中在对象的运动神经元中，SMN2多肽对外显子7的氨基酸的包含增加。
44.一种在对象的运动神经元中增加SMN2 mRNA对外显子7的包含的方法，包括向对象给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，进而在对象的运动神经元中增加SMN2 mRNA对外显子7的包含。
45.一种在对象的运动神经元中增加SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含的方法，包括向对象给药含有反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，进而在对象的运动神经元中增加SMN2多肽对外显子7氨基酸的包含。
46.根据实施方式1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有SMA。
47.根据实施方式1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有I型SMA。
48.根据实施方式1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有II型SMA。
49.根据实施方式1-45任意一项所述的方法，其中所述对象患有III型SMA。
50.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在子宫内进行第一次给药。
51.根据实施方式50所述的方法，其中在血脑屏障完全形成前进行所述第一次给药。
52.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生1周内进行第一次给药。
53.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生1个月内进行第一次给药。
54.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生3个月内进行第一次给药。
55.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在对象出生6个月内进行第一次给药。
56.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在对象1至2岁时进行第一次给药。
57.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在对象1至15岁时进行第一次给药。
58.根据实施方式1-49任意一项所述的方法，其中在对象15岁以上时进行第一次给药。
59.根据实施方式1-58任意一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
60.根据实施方式59所述的方法，其中所述对象是人。
61.根据实施方式1-60任意一项所述的方法，包括识别患有SMA的对象。
62.根据实施方式61所述的方法，其中通过测定对象一块或更多块肌肉的电活性来识别所述对象。
63.根据实施方式61所述的方法，其中通过遗传检测以确定对象的SMN1基因中是否具有突变来识别所述对象。
64.根据实施方式61所述的方法，其中通过肌肉组织活检来识别所述对象。
65.根据实施方式42所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少10％。
66.根据实施方式65所述的方法，其中含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少20％。
67.根据实施方式65所述的方法，其中含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少50％。
68.根据实施方式65所述的方法，其中含有外显子7的SMN2 mRNA的量增加至少70％。
69.根据实施方式43所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少10％。
70.根据实施方式69所述的方法，其中含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少20％。
71.根据实施方式69所述的方法，其中含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少50％。
72.根据实施方式69所述的方法，其中含有外显子7氨基酸的SMN2多肽的量增加至少70％。
73.根据实施方式1-72任意一项所述的方法，其中所述反义化合物的给药能在所述对象中减轻SMA的至少一种症状。
74.根据实施方式73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得在所述对象中的运动功能改善。
75.根据实施方式73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得在所述对象中运动功能丧失被推迟或减少。
76.根据实施方式73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得呼吸功能改善。
77.根据实施方式73所述的方法，其中所述反义化合物的给药使得生存期改善。
78.根据实施方式1-77任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖配基。
79.根据实施方式78所述的方法，其中所述至少一个修饰的糖配基包含2’-甲氧乙基糖配基。
80.根据实施方式1-79任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的各核苷基本上均包含修饰的糖配基。
81.根据实施方式80所述的方法，其中所述包含修饰糖配基的核苷均包含相同的糖修饰。
82.根据实施方式81所述的方法，其中各修饰的糖配基均包含2’-甲氧乙基糖配基。
83.根据实施方式1-79任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的各核苷均包含修饰的糖配基。
84.根据实施方式83所述的方法，其中所述核苷均包含相同的糖修饰。
85.根据实施方式84所述的方法，其中各修饰的糖配基均包含2’-甲氧乙基糖配基。
86.根据实施方式1-85任意一项所述的方法，其中至少一个核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
87.根据实施方式86所述的方法，其中各核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
88.根据实施方式1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由10至25个连接的核苷组成。
89.根据实施方式1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由12至22个连接的核苷组成。
90.根据实施方式1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由15至20个连接的核苷组成。
91.根据实施方式1-87任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
92.根据实施方式1-91任意一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸具有至少90％的互补性。
93.根据实施方式92所述的方法，其中所述反义寡核苷酸与人SMN2的编码核酸具有完全的互补性。
94.根据实施方式1-93任意一项所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：1的核碱基序列中的至少10个连续核碱基。
95.根据实施方式94所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：1的核碱基序列中至少15个连续核碱基。
96.根据实施方式94所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：1的核碱基序列。
97.根据实施方式94所述的方法，其中所述寡核苷酸具有核碱基序列，所述核碱基序列由SEQ ID NO：1的核碱基序列组成。
98.根据实施方式1-97任意一项所述的方法，其中所述反义化合物包含缀合基团或末端基团。
99.根据实施方式1-97任意一项所述的方法，其中所述反义化合物由反义寡核苷酸组成。
100.根据实施方式1-99任意一项所述的方法，其中所述反义化合物还可以全身给药。
101.根据实施方式100所述的方法，其中所述全身给药是通过静脉或腹腔注射。
102.根据实施方式100或101所述的方法，其中所述全身给药和给药至中枢神经系统同时进行。
103.根据实施方式100或101所述的方法，其中所述全身给药和给药至中枢神经系统在不同时间进行。
104.一种包含反义寡核苷酸的反义化合物，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，所述反义化合物用于实施方式1-103任意一项所述的方法。
105.根据实施方式104所述的反义化合物，所述反义化合物用于治疗与运动神经元存活基因1(SMN1)有关的疾病或状态。
106.一种包含反义寡核苷酸的反义化合物用于生产药物的用途，所述反义寡核苷酸互补于人SMN2编码核酸的内含子7，所述药物用于前述任意实施方式所述的方法。
107.根据实施方式106所述的用途，其中该药物用于治疗与运动神经元存活基因1(SMN1)有关的疾病或状态。
非限制性公开和通过引用并入
尽管已经根据一些实施方式专门描述了本发明所述的一些化合物、组合物以及方法，下列实施例仅用以描述本发明所述化合物且非旨在对其限制。本申请中所引用的各参考文献、GenBank登录号等等均通过引用整体并入。
尽管在本文件所附的序列表中按照要求将各序列标注为“RNA”或“DNA”，但实际上，可以采用任意组合的化学修饰对这些序列进行修饰。本领域技术人员容易理解，用如“RNA”或“DNA”这样的命名来描述修饰的寡核苷酸，在某些例子中是专断的。例如，包含含有2’-OH糖配基和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可以被称为具有修饰糖基的DNA(将天然DNA的2’-H修饰为2’-OH)或具有修饰碱基的RNA(将天然RNA的尿嘧啶修饰为胸腺嘧啶(甲基尿嘧啶))。
因此，本申请提供的核酸序列，包括但不限于序列表中列出的序列，意在包括含有天然或修饰RNA和/或DNA的任意组合的核酸，包括但不限于具有修饰核碱基的此类核酸。作为进一步举例且非限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的寡聚化合物包括具有此类核碱基序列的任意寡聚化合物，无论其是修饰或未修饰，包括但不限于，包含RNA碱基的此类化合物，例如具有序列“AUCGAUCG”的，以及具有某些DNA碱基和某些RNA碱基的，如“AUCGATCG”，以及具有其他修饰碱基的寡聚化合物，如“ATmeCGAUCG”，其中meC表示5-位包含甲基的胞嘧啶碱基。
实施例1-靶向作用于SMN2的反义化合物
采用此前报道的标准技术合成下述寡核苷酸。
参考编号# 序列 长度 化学 SEQ ID
ISIS396443 TCACTTTCATAATGCTGG 18 全长2’-MOE；全长PS 1
ISIS396449 TTTCATAATGCTGGC 15 全长2’-MOE；全长PS 2
PS＝硫代磷酸酯核苷间连接
实施例2-Smn-/-SMN转基因小鼠
在适宜的动物模型中可以对上文所述的反义化合物的治疗作用和安全性进行检测。例如，与人类疾病的表现极其接近的动物模型包括特定疾病的自发发生率较高或被诱导成发生率较高的动物品系。
特别地，SMA的动物模型是已知的。如上文所阐述的，SMA是常染色体退行性神经肌肉病变，其分子机制为运动神经元存活基因1(SMN1)的纯合性缺失。在人体内发现了与SMN1基因基本相同的拷贝，称为SMN2，其能够调节疾病的严重程度。与人类不同，小鼠具有一个与SMN1等同的单基因(Smm)。该基因的纯合性缺失对胚胎是致命的，且导致大量细胞死亡，提示Smn基因产物对细胞的存活和功能是必要的。在缺乏SMN的小鼠中引入2个拷贝的SMN2，可以挽救其对胚胎的致命性，得到具有SMA表型的小鼠(Monani et al.，Hum.Mol.Genet.(2000)9：333-339)。高拷贝数的SMN2可以挽救小鼠，因为运动神经元中产生了充足的SMN蛋白。还可以参见Hsieh-Li，et al.，Nat.Genet.(2000)24：66-70，其报道了表达人SMN2的转基因小鼠品系的生产。特别地，在Smn-/-的背景下引入了SMN2的转基因小鼠在脊髓和骨骼肌中显示出的病理学改变与SMA患者接近。这些小鼠病理变化的严重程度与含有外显子7编码区域的SMN蛋白的量相关。缺乏一个Smn拷贝的杂合小鼠称为Smn-/+，其是SMA严重程度较低型，III型的模型。
SMA表型的严重程度与小鼠中的人SMN2拷贝数相关。“台湾”品系具有人SMN2的4个拷贝，这种小鼠具有中度至重度SMA表型，与I型或II型接近。
Δ-7小鼠(Smn-/-，hSMN2+/+，SMNΔ7+/+)也缺乏小鼠Smn且表达人SMN2。Δ-7小鼠具有更为严重的表型，其在出生后较短时间内死亡，一般约为出生后15-20天。
实施例3-在Smn-/-SMN2(台湾品系)中用反义化合物在体内进行全身给药
对台湾小鼠通过腹腔注射，给药生理盐水，或35mg/kg ISIS396443，或错配反义寡核苷酸对照，每日一次，连续5天，并在2天后即第7天处死小鼠。收集肝脏和肾脏，通过标准技术分离RNA。通过RT-PCR观察含有或不含外显子7的SMN2。与给药生理盐水和错配对照的动物相比，给药ISIS396443使得来自肾脏和肝脏的SMN2中，对外显子7的包含大量增加。
实施例4-在Smn-/-SMN2(台湾品系)中用反义化合物在体内进行脑室内(ICV)给药
对台湾小鼠通过ICV注射，给药生理盐水或150μg ISIS396443，每日一次，连续7天。在第8天处死小鼠，从脑和脊髓中提取RNA。RT-PCR分析显示，给药ISIS396443的动物的脑和脊髓样品中，SMN2对外显子7的包含大量增加。这些结果提示，使用靶向作用于SMN的反义寡核苷酸进行ICV给药，可以挽救SMA状态，因为对外显子7的排除与SMA的表型相关。
剂量-应答
对台湾小鼠通过ICV注射生理盐水或10、50、100或150μg的ISIS396443(每个治疗组5只小鼠)，每日一次，连续7天，并在第8天将动物处死。分离RNA，使用RT-PCR进行分析。10μg治疗组显示出中等程度的对外显子7的包含。50μg、100μg和150μg组均显示出大量的对外显子7的包含。
应答持续时间
为确定效应持续时间，对24只小鼠通过ICV注射50μg的ISIS396443，每日一次，连续7天。在末次给药时(0时刻)处死四只小鼠，在末次给药后1周、2周、4周和8周分别处死四只小鼠。通过RT-PCR检测显示，所有治疗小鼠均显示大量的对外显子7的包含，在第8周时的效果与其他组之间不存在差异，如图1所示：
这些结果提示，通过ICV，每天给药50μg的ISIS396443，连续7天，能够在治疗后至少8周有效。
重复实验以检测更长的时间点。对III型小鼠通过ICV输注，以50μg/天给药ISIS396443，连续7天。在为期7天的输注期结束后的0、0.5、1、2、4、和6个月处死小鼠。从脊髓中收集RNA，采用northern印迹进行分析。如下图所示，ISIS396443输注的效应可以在输注后持续6个月，如图2所示。针对这种长效作用存在若干种可能的解释。其可能反映出ISIS396443的稳定性、修正后的SMN蛋白的稳定性和/或给药剂量足够高，使得化合物即使通过代谢而减少，其剩余剂量仍持续提供效果。因此，这些数据可以支持采用更低的给药剂量和给药频率。
实施例5-通过连续脑室内(ICV)输注进行反义化合物给药
采用微型渗透泵(Azlet渗透泵，Cupertino，CA，USA)，在带有人SMN2转基因的成年III型Smn+/-或Smn-/-SMA小鼠(台湾品系)中，将ISIS396443通过右侧脑室递送至脑脊液(CSF)中。剂量依赖性研究揭示，在脑室内(ICV)输注ISIS396443可以使脊髓中SMN2对外显子7的包含增至～90％，而经生理盐水治疗的小鼠为～10％。Western印迹和免疫组化分析显示，脊髓运动神经元中人转基因SMN蛋白的水平表现出稳健的增加。这些结果提示，通过CNS输注给药反义寡核苷酸ISIS396443，可以挽救SMA状态，因为对外显子7的排除与SMA的表型相关。
实施例6-胚胎给药
在妊娠第15天(E15)，对胚胎台湾小鼠通过单次ICV注射20μg或10μg的ISIS396443。在出生后第7天(P7)处死动物。从腰椎脊髓中分离RNA，使用RT-PCR进行分析。单次胚胎给药ISIS396443，得到大量的对外显子7的包含。这些结果提示，在子宫内使用反义寡核苷酸ISIS396443治疗，可以挽救SMA状态，因为对外显子7的排除与SMA的表型相关。
重复上述实验并在第11周处死动物。未治疗的台湾小鼠出现坏死的尾部，其随时间的推移而变短。单次胚胎注射给药20μg的ISIS396443，可以明显推迟尾部降解的发生，如图3A所示。这些结果提示，采用靶向作用于SMN的反义寡核苷酸进行胚胎治疗，能够推迟SMA发病。
这些结果在另外一项研究中得到确证，其采用相同条件，但检测时采用的剂量为20μg和10μg的ISIS396443，且该研究包括正常小鼠作为对照。实验结果见图3B。
实施例7-在Δ-7小鼠模型中进行的体内给药
将杂合子(SMN+/-、hSMN2+/+、SMNΔ7+/+)繁育配子进行交配，并于出生当日(P0)对新生幼仔给药ISIS396443(18-mer，SEQ ID NO.1)、ISIS396449(15-mer，SEQ ID NO.2)、ISIS387954(20-mer，SEQ ID NO.7)或乱序对照ASO(ISIS439273；18-mer)。通过双侧注射，向小鼠大脑外侧的脑室给药总共8μg的剂量(每个外侧脑室4μg)。全部注射均使用已描述过的极细拉制玻璃微量吸管针进行(Passini et al，J.Virol.(2001)75：12382-12392)。注射后，通过剪去幼仔的足趾和鉴定其基因型(Le et al.，Hum.Mol.Genet.(2005)14：845-857)，以识别SMA(SMN-/-、hSMN2+/+、SMNΔ7+/+)、杂合子和野生型(SMN+/+、hSMN2+/+、SMNΔ7+/+)小鼠。将整窝淘汰至剩余7只幼仔，以控制存活窝的规模。某些窝未进行注射，以作为未治疗的对照组。
在SMA小鼠中，在注射后14天检测到脊髓中广泛分布有18-mer，包括脊髓的胸段、腰段和颈段。此外，采用ChAT进行的共定位研究确证了，在脊髓中ISIS396443靶向作用的大量细胞为运动神经元。在未经治疗的对照小鼠中未检测到该信号。
在第14天进行Western印迹分析的结果显示，在脑和脊髓中SMN的量为野生型水平的40-60％，而未经治疗的SMA对照为10％。在给药乱序ASO的对照小鼠中，未检测到高于背景值的信号。Western印迹的结果参见图4。
与未经治疗的SMA小鼠或给药乱序ASO的SMA小鼠相比，给药SMA ASO的SMA小鼠还表现出体重、移动功能(翻正反射和抓握力)和协调性(后肢张开)的显著增加，不管ASO的长度如何。与未经治疗的SMA小鼠相比，给药乱序ASO的SMA小鼠的体重、移动功能(翻正反射和抓握力)和协调性未出现显著增加。结果参见图5和图6。
重要的是，给药ASO的SMA小鼠，不管ASO的长度如何，其平均生存期显著增加，如图7所示。与未经治疗的SMA对照(16.0天)相比，自出生时起的生存期为31.5(15-mer)、27.0(18-mer)和28.0(20-mer)天。而与之相反的是，对SMA小鼠给药18-mer的乱序对照后，不能改善其生存期。这些结果表明，采用靶向作用于SMN的反义寡核苷酸进行治疗，可以延长患有SMA对象的寿命。
如图8所示，SMA ASO还可以增加脊髓中运动神经元细胞的计数。
采用RT-PCR对SMN RNA进行检测。与未经治疗的SMA小鼠相比，给药SMA ASO的动物中SMN RNA水平增加。图9显示了给药20-mer ASO的小鼠与未经治疗SMA小鼠的比较结果。
为确定给药第二个剂量是否能够进一步延长生存期，在第21天时以额外的20μg剂量重复上述实验。结果见图10。上面的图显示第0天时第一个8μg剂量的作用。在P21天时，对一半的治疗小鼠进行第二次治疗。
图11显示了第二次治疗的作用与仅接受第一次治疗小鼠的比较结果。该结果显示，使用反义寡核苷酸进行第二次ICV治疗能够进一步延长存活期。
实施例8-在SMA III型小鼠中的活性
在SMA小鼠模型中，对两种反义化合物和一种对照化合物进行检测。化合物如下表所述。
在台湾品系SMA小鼠中检测的化合物
台湾品系的SMA III型小鼠来自杰克逊实验室(Bar Harbor，Maine)。这些小鼠缺乏小鼠SMN，并且是人SMN2的纯合子(mSMN-/-；hSMN2+/+)。对这些小鼠的描述参见Hsieh-LiHM，et al.，Nature Genet.24，66-70 2000。
每天对小鼠给药3、10、30、或100μg的ISIS396443或ISIS449220，或每天给药30或100μg对照化合物ISIS439272，溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中。对照小鼠仅给药PBS(剂量为0)。全部治疗药物均采用Azlet 1007D渗透泵进行脑室内(ICV)输注给药。各剂量均设置5只动物，但是，ISIS449220的最高剂量组中有两只小鼠在研究完成前死亡。在第9天处死动物(末次给药后两天)，收集各只动物的脑和脊髓腰段。对各样品进行实时PCR检测，以确定包含外显子7((+)外显子7)的人SMN2的量，和缺乏外显子7((-)外显子7)的人SMN2的量。同时还通过实时PCR检测，确定同种异体移植物炎症因子(AIF1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)的表达水平。
利用GADPH水平对(+)外显子7和(-)外显子7的表达水平进行归一化处理。随后用这些归一化的表达水平除以给药PBS的对照小鼠经GADPH归一化的水平。在下表17中报告了得到的对照值的倍数。数据表示为各组中全部五只小鼠的对照值倍数的平均值，但ISIS449220最高剂量组除外，其表示3只存活小鼠的值。
ISIS396443给药导致外显子7的包含显著增加。在10μg/天剂量下，ISIS396443使得在脑内保留了外显子7的SMN2几乎是未经治疗的对照的2倍(1.8倍)，在脊髓腰段为高于2倍。
在SMA小鼠中反义化合物改变剪接的能力
*该剂量下的数据仅来自3只小鼠
将同种异体移植物炎症因子(AIF1)的表达量作为炎症指标进行检测。将所有样品以(GADPH)归一化后，用各治疗组的AIF1比率除以PBS对照的值。即使在最高剂量水平，ISIS396443也未使AIF1增加。ISIS449220使脑和腰段脊髓的AIF1增加。表18中的数据表示各组全部五只小鼠的对照值倍数的平均值，但ISIS449220最高剂量组除外，其表示3只存活小鼠的值。
在SMA小鼠中反义化合物的毒性
*该剂量下的数据仅来自3只小鼠
实施例9-对猴给药
使用短尾猴评估ISIS395443在不同剂量和给药途径下的分布。对2只猴给药ISIS395443。通过ICV输注对一只猴给药3mg的剂量，通过IT输注对另外一只猴给药3mg的剂量。两次输注的递送时间均为24小时。在输注期结束96小时后，处死猴并收集其组织。检测脊髓颈段、胸段和腰段样品中ISIS396443的浓度。结果汇总于下表。
由于短尾猴约为3kg，因此该给药剂量约为1mg/kg。
为进一步评估ISIS39644的分布，将二十六只猴如下表所示分为六组。
各组的输注速率均为100μL/小时。所有猴均接受溶于生理盐水的总剂量为3mg的ISIS39644，但第1组除外，其仅使用生理盐水。输注结束后5天处死猴并收集组织。
采用标准技术评估猴组织样本中ISIS39644的浓度。结果汇总于图12的图表中。还采用组织学方法对样本进行评估。组织学检测并未显示出治疗存在任何不良反应，且确证了ISIS396443的存在。没有证据显示Purkinje细胞减少。
与慢速输注相比，快速输注似乎具有更多的ISIS396443。这些结果提示，在某些实施方式中可以优选更快的输注速率或推注注射。由于推注给药与输注相比具有某些实际的优点，因此在某些实施方式中优选通过该方法给药至CSF。在某些实施方式中，给药至CSF的优选方法为通过推注IT注射。
实施例10-严重SMA小鼠模型的产生和ICV治疗
已产生出具有严重SMA表型(sSMA小鼠)的小鼠。纯合性sSMA小鼠携带2个拷贝的人SMN2且无小鼠SMN。其平均寿命约为10天。此外，SMA小鼠更小，且具有更短的尾部。杂合子携带小鼠SMN且发育正常。
为研究在这些sSMA小鼠中反义化合物的效应，在P1天通过ICV注射给药20μg的ISIS396443。治疗使得平均生存期由9.9天(给药生理盐水的对照)增至16.7天。RT-PCR分析结果显示，在治疗组小鼠的组织中，全长SMN RNA的量增加。
实施例11-ISIS 396443全身给药
将sSMA小鼠和健康杂合对照小鼠按照如下方式分组，以研究通过推注ICV注射和/或推注皮下注射(SC)时，ISIS396443的效应：
第1组-ICV+SC
在P1或P2(出生后第1天或第2天)进行一次20μg的ICV注射；在P0和P3之间递送两次50μg/g的皮下注射。
第2组-SC+SC
在P0和P3之间递送两次50μg/g的SC注射；在P5和P6之间递送一次50μg/g的皮下注射；在P9和P10之间递送一次50μg/g的皮下注射。
第3组-SC
在P0和P3之间递送两次50μg/g的SC注射。
第4组-SMA生理盐水对照
在P1或P2进行一次生理盐水的ICV注射；在P0和P3之间递送两次生理盐水皮下注射。
第5组-杂合子对照
在P1或P2进行一次20μg的ICV注射；在杂合小鼠的P0和P3之间递送两次50μg/g的皮下注射。
各组均包含14至22只小鼠。各组中各只小鼠的存活期(以天计)参见下表。在撰写本专利申请时，本研究中的很多小鼠仍然存活。因此，以“＞”表示的值是指已经存活了这些天数且仍存活的小鼠。
实施例12-SC给药的剂量应答
通过下述给药组，评估sSMA小鼠在接受不同剂量皮下给药ISIS396443时的存活期。
第1组-SC400(剂量范围为80mg/kg至180mg/kg)
在P0至P3之间通过两次SC注射向每只小鼠递送总剂量400μg，第一个剂量是在P0或P1时的150μg(体积为3μl)，第二个剂量是在P2或P3时递送的250μg(体积为5μl)。
第2组-SC200(剂量范围为40mg/kg至90mg/kg)
在P0至P3之间通过两次SC注射向每只小鼠递送200μg的总剂量，第一个剂量在P0-P1时的75μg(体积为1.5μl)，第二个剂量是在P2或P3时递送的125μg(体积为2.5μl)。
第3组-SC100(剂量范围为20mg/kg至45mg/kg)
在P0至P3之间通过两次SC注射向每只小鼠递送100μg的总剂量，第一个剂量是在P0或P1时的40μg(体积为2μl)，第二个剂量是在P2或P3时递送的60μg(体积为3μl)。
第4组-SMA生理盐水(阴性对照)
在P0和P3之间通过两次SC注射生理盐水，第一个剂量是在P0或P1(体积为5μl)，第二个剂量在P2或P3时递送(体积为5μl)。
第5组-杂合子对照(阳性对照)
未接受任何治疗的小鼠。
各组均包含14至26只小鼠。各组中各只小鼠的存活期(以天计)参见下表。在撰写本专利申请时，本研究中的很多小鼠仍然存活。因此，以“＞”表示的值是指已经存活了这些天数且仍存活的小鼠。
实施例13-ICV输注对比ICV推注
比较了对脑室内推注注射(ICV推注)给药与连续脑室内输注(ICV输注)给药。对III型SMA转基因小鼠给药ISIS387954。对ICV输注小鼠给药，总剂量为0(PBS对照)、87.5μg、175μg、350μg、或700μg，输注7天，并于2天后处死动物。通过单次ICV注射，对ICV推注小鼠给药相同的总剂量，0(PBS对照)、87.5μg、175μg、350μg、或700μg，并于9天后处死动物。各组均有5只小鼠。收集腰段脊髓的RNA，并采用实时PCR进行分析。使用生理盐水对照对内含子7的包含进行归一化处理。结果汇总于下表。
在此项实验中，与ICV输注7天进行的递送相比，通过ICV推注递送相同的剂量可获得更高的活性。
还通过实时PCR检测，确定同种异体移植物炎症因子(AIF1)的表达水平，以便对炎症进行评估。经治疗小鼠的样本与对照小鼠的样本相比，均不存在显著差异。
实施例14-ICV推注的剂量应答
在附加剂量下对脑室内推注给药进行检测。通过单次推注ICV注射，对转基因小鼠给药0、10.9μg、21.9μg、43.4μg、87.5μg、或175μg的ISIS387954，并在9天后处死小鼠，如实施例13所述。收集脑和腰段脊髓样本。制备RNA并采用RT-PCR，分析内含子7的包含的变化和AIF1的变化。与对照相比，没有样本显示出AIF1改变。内含子7的包含的结果汇总于下表。ED50在22μg左右。
序列表
<110> 比奥根MA公司
冷泉港实验室
C. Frank Bennett
Gene Hung
Frank Rigo
Adrian R. Krainer
Yimin Hua
Marco Passini
Lamya Shihabuddin
Seng H. Cheng
Katherine W. Klinger
<120> 用于在对象中调节SMN2剪接的组合物和方法
<130> CORE0086WO
<150> 61/218,031
<151> 2009-06-17
<160> 24
<170> 供Windows使用的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
attcactttc at 12
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
agtaagattc acttt 15

Claims (10)

1.一种方法，包括向对象给药包含反义寡核苷酸的反义化合物，该反义寡核苷酸互补于人SMN2 mRNA前体的编码核酸的内含子7，其中所述反义化合物给药至脑脊液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述给药是至鞘内空隙。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述给药是至脑内的脑脊液。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述给药包含推注注射。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其中所述给药包含利用递送泵输注。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其中所述反义化合物给药的剂量为0.01至10毫克反义化合物每千克对象体重。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至10毫克反义化合物每千克对象体重。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至5毫克反义化合物每千克对象体重。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.05至1毫克反义化合物每千克对象体重。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药剂量为0.01至0.5毫克反义化合物每千克对象体重。
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