CN110988345A

CN110988345A - 一种利用纳米孔检测凝血酶的方法

Info

Publication number: CN110988345A
Application number: CN201911321946.7A
Authority: CN
Inventors: 刘国魁; 葛亚仙; 刘丽萍; 崔梦洁; 房真; 郗冬梅
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明公开了一种利用纳米孔检测凝血酶的方法，属于生化分析技术领域。该方法基于一个双链DNA探针。探针由适配体、cDNA‑16和捕获臂组成。通过生物素‑链霉亲和素作用，将该双链DNA探针固定在链霉亲和素磁珠表面，形成的双链DNA‑磁珠复合物作为探针。适配体连接在磁珠上，当凝血酶存在时，适配体与凝血酶特异性结合，然后磁性分离，将捕获臂与cDNA的杂交产物(输出DNA)释放下来。释放的DNA进行纳米孔检测，产生特征性的阻断电流信号。凝血酶的浓度越高，释放的DNA越多，在纳米孔中的阻断电流信号越多，信号频率与凝血酶的浓度成一定的比例关系。所以通过分析信号频率能够实现蛋白质的定量检测。

Description

一种利用纳米孔检测凝血酶的方法

技术领域

本发明涉及一种利用纳米孔检测凝血酶的方法，属于生化分析技术领域。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一。统计数据显示，2015年我国新发癌症病例数429.2万，相当于平均每天新发1.2万例；有281.4万癌症死亡病例，相当于平均每天7700人死于癌症。研究认为，癌症的死亡率较高主要与癌症早期检测灵敏度低和确诊率低有关。有报告指出，按照目前的医疗水平，早期癌症患者治疗后的5年生存率可超过80％，而对晚期患者治疗后的5年生存率仍低于10％。因此，癌症的早期发现对于癌症的治疗具有极为重要的意义。目前，癌症的临床诊断方法仍主要基于影像学检查，分辨率较低，难以满足癌症的早期诊断需求。肿瘤标志物作为诊断肿瘤的重要指标，通过对恶性肿瘤细胞内活性物质的检测可实现癌症的早期筛查，且对预后起到十分关键的作用。因此，建立特异性好、灵敏度高的肿瘤标志物检测新方法，对于癌症的早期诊断和治疗具有重要的科学意义和临床价值。凝血酶(thrombin)是一种多功能丝氨酸蛋白酶，可以识别多种大分子底物，具有促凝和抗凝功能。早期临床研究发现，凝血系统在大多数恶性肿瘤患者身上处于激活状态，凝血酶促进肿瘤细胞的增长、侵袭和自发性转移，同时也刺激肿瘤的血管新生。作为许多生理病理进程的重要参与者，凝血酶是癌症、阿茨海默症等一些疾病诊断的标识物。因此凝血酶的检测在医学上有重要意义。

近年来，纳米孔传感技术因其快速、低成本、无需荧光标记等优点，在化学和生物等诸多研究领域得到广泛应用，已发展成为一种新颖的、独具特色的单分子分析手段。工作原理是在外加电场力的驱动下，单个待测分子被限制在纳米尺寸的通道中，由于单个分子在纳米孔中的物理占位作用等，改变了通道的电阻，从而引发流经纳米孔的离子电流发生变化，形成阻断电流信号。每一个信号的阻断程度和阻断时间等可反映分子的组成、结构特征等信息，信号频率可反映分子的浓度。将纳米孔传感技术应用于生物标志物的灵敏检测，对于疾病的诊断筛查和指导治疗具有重要的科学意义和临床价值。

如何设计有效的策略从而实现凝血酶的简单、高效、快速、灵敏检测，是本领域内亟待解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用纳米孔检测凝血酶(thrombin)的方法。

本发明采用以下技术方案：

一种利用纳米孔检测凝血酶的方法，它包括以下步骤：

(1)双链DNA底物探针的制备：分别取适量捕获臂Throm-DNA、cDNA-16和适配体Throm-apt在缓冲液中混合，混合均匀后在95℃反应5分钟，使其充分杂交，再缓慢冷却至室温得到双链反应液，取双链反应液与链霉亲和素磁珠混合，放入恒温振荡器中37℃孵育15分钟，反应结束后磁性分离，去掉上清液，得到与磁珠结合的双链DNA底物探针；

(2)凝血酶与底物探针混合孵育反应：向双链DNA底物探针中分别加入不同浓度的凝血酶100μL，放在恒温振荡器中37℃孵育半小时；凝血酶与连接在磁珠上的适配体特异性识别并结合，通过磁性分离获取上清液，取100μL上清液进行α-溶血素纳米孔检测；

(3)α-溶血素纳米孔的组装：用000号貂毛笔在1mL trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液，将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1mL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加+100mV电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜；在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃，在+160mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为160±10pA；

(4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测分子逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号；实验产生的电流通过Axopatch 200B放大采集，通过DigitalData1440A数模转换器转换为数字量，并传输到电脑上；通过PClamp 10.6软件实时观测并记录纳米通道单分子实验数据，利用OriginLab9.0进行数据分析，实现对凝血酶的定量分析检测。

所述步骤(1)中

cDNA-16的序列为AACCACACAACCTACC；Throm-DNA的序列为C₃₀GGTAGGTTGTGTGGTTAT(CCC)AGTCACCCCAAC；所述Throm-apt序列为Biotin-T₁₀AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；其中C₃₀是指30个C，T₁₀是指10个T，下划线CCC表示接到单链DNA上的分支。

所述步骤(1)中捕获臂Throm-DNA、cDNA-16、适配体Throm-apt的浓度均为10^-6M，用量均为20μL；缓冲液用量为20μL。

优选的，所述缓冲液组成为150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.9。

所述步骤(1)中双链反应液与链霉亲和素磁珠混合的具体方法为：先用1mL 1×BW缓冲液将50μL磁珠洗三次，然后将25μL双链反应液、25μL超纯水和洗过的磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟后磁性分离，将上清液倒出，保留磁珠。

所述步骤(2)中双链DNA底物探针用量为100μL，浓度为2×10^-7M。

所述步骤(3)中磷脂溶液为30mg/mL的磷脂正葵烷溶液。

所述步骤(3)中电解质溶液cis池中为:1.0M KCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH7.8；trans池中为:1.0M KCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8。

所述步骤(3)中α-溶血素加入量为1μL 5μg/mL。

本发明所述检测方法的原理为：原理图如图1所示，所述方法基于一个双链DNA探针。探针由适配体(Throm-apt)、cDNA-16和捕获臂(Throm-DNA)组成。通过生物素-链霉亲和素作用，将该双链DNA探针固定在链霉亲和素磁珠表面，形成的双链DNA-磁珠复合物作为探针。适配体连接在磁珠上，当凝血酶存在时，适配体与凝血酶特异性结合，然后磁性分离，将捕获臂与cDNA的杂交产物(输出DNA)释放下来。释放的DNA进行纳米孔检测，产生特征性的阻断电流信号。凝血酶的浓度越高，释放的DNA越多，在纳米孔中的阻断电流信号越多，信号频率与凝血酶的浓度成一定的比例关系。所以通过分析信号频率能够实现凝血酶的定量检测。为了提高DNA与纳米孔作用的特异性，通过点击化学反应在捕获臂上连接一个短的分支DNA(5’-CCC-3’)。由于分支DNA的存在，使得输出DNA穿过α-溶血素纳米孔时产生高度特征性的电流信号，从而大大提高了凝血酶检测的特异性。由于纳米孔检测技术具有无需标记、灵敏度高等优点，因此该方法可以实现凝血酶的灵敏、高效、高特异性、免标记、免扩增检测。

本发明所述链霉亲和素磁珠是指从公司Invitrogen(California,U.S.A.)购买得到的DynabeadsMyOne^TM Streptavidin T1(10mg/mL，直径1.0μm)。

本发明的有益效果是：

(1)特异性好：由于本方法是基于凝血酶与适配体的特异性识别和结合，反应的特异性极高；不仅如此，发明人对具体的反应条件也进行了较为全面细致的优化，因此几乎不发生非特异性反应；生成的产物在纳米孔中会产生高度特征性的阻断信号，这也大大提高了该方法的特异性。

(2)灵敏度高：纳米孔是一种非常灵敏的单分子分析手段，而且实验操作时使用了较高的电压160mV，大大提高了检测的灵敏度，本发明所述方法检测下限可达3.11×10^-12M。

(3)无需标记和循环放大：本方案中没有进行任何标记或信号放大，没有引入任何循环扩增，仅仅利用纳米孔的高灵敏度优点即可实现凝血酶的灵敏检测。这是其他检测方法如荧光法、比色法做不到的。

(4)应用范围广：只需改变底物探针中的适配体序列，即可实现其他蛋白质、核酸或小分子的高特异、高灵敏检测。

附图说明

图1为利用纳米孔检测凝血酶的原理图。

图2为DNA杂交产物H16-fork检测数据图。其中A为电流信号示意图，B为对大量阻断电流事件统计分析的散点图。

图3为检测不同浓度的凝血酶TB数据图。图A为检测TB引起的特征电流事件频率图。图B为事件频率与TB浓度的相关性。

图4为正常人体血清中靶蛋白回收试验结果。图A为电流信号示意图，图B为不同浓度(10^-10-10^-8M)的TB加入人体血清检测后的回收率数据。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步测详细说明。

实施例1

一种利用纳米孔检测凝血酶的方法，它包括以下步骤：

(1)双链DNA探针的制备：双链DNA探针是将捕获臂DNA、cDNA和适配体(浓度均为10^-6M)三者各取20μL在20μL缓冲液(150mM NaCl,20mM Tris-HCl,pH 7.9)中混合，95℃温度孵育5分钟后逐渐冷却至室温，最后得到以dsDNA为基础的杂交双链反应液；将双链DNA探针固定在链霉亲和素磁珠(MB)表面：先用1mL 1×BW缓冲液(1M NaCl,1mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH 7.5)将磁珠(50μL,10mg/mL)洗三次，然后将25μL双链DNA反应液、25μL超纯水和磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟，反应完毕后，磁性分离去掉上清液，得到与磁珠结合的双链DNA底物探针。

(2)适配体与凝血酶特异性结合并释放杂交链(H16-fork)。取双链DNA底物探针100μL，浓度为2×10^-7M，然后加入凝血酶TB(100μL，10^-8M)，放在恒温振荡器中37℃下孵育40分钟，偶有旋涡，磁性分离后收集上清液，得到100μL杂交DNA用于纳米孔检测。。由于凝血酶能够特异性识别双链DNA底物中的适配体，因此双链DNA-磁珠复合物与凝血酶孵育后形成两部分，一部分是自由的Throm-DNA/DNA16杂交链，另一部分是磁珠-单链DNA复合物。磁性分离后收集的上清液中含有的自由Throm-DNA/DNA16杂交链进行下一步分析。

(3)α-溶血素纳米孔的组装。将磷脂氯仿溶液抽空抽干，加入正癸烷配置成30mgmL^-1溶液。用000号貂毛笔在1mL trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹30mg mL^-1磷脂正癸烷溶液。将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1mL电解质溶液((cis:1.0M KCl,10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8；trans:1.0M KCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8)。将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加+100mV电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜。在cis检测池中加入1μL 5μgmL^-1的α-溶血素。当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃。在+160mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为160±10pA。

(4)利用α-溶血素纳米孔检测上清液。将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测分子逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号。实验产生的电流通过Axopatch 200B(Axon Instruments公司,美国)放大采集，通过DigitalData1440A数模转换器(Axon Instruments公司，美国)转换为数字量，并传输到电脑上。通过PClamp 10.6软件(Axon Instruments公司，美国)实时观测并记录纳米通道单分子实验数据。利用OriginLab 9.0进行数据分析。

实施例2

利用本发明的方法对凝血酶进行检测时，适配体与凝血酶特异性结合并释放Throm-DNA/DNA16杂交链(H16-fork)，在160mV，1M KCl中对DNA双链底物Throm-DNA/DNA16进行纳米孔分析，如图2所示。(A)电流信号示意图显示杂交产物H16-fork几乎完全消除了孔隙电流。(B)绿色点代表Throm-DNA/DNA16通过孔产生的信号散点图，它的阻断时间集中在0.7ms到30ms之间，阻断程度集中在0.97到1之间(其中I为堵塞的孔隙电流，I₀为打开的孔隙电流)。

实施例3

本发明还将靶标蛋白凝血酶TB(0-10^-7M)与探针混合，分析靶标蛋白的特征电流事件频率与浓度的相关性，以及单独检测TB引起的特征电流事件频率，具体结果如图3所示。靶标蛋白的特征电流频率随着靶标浓度的增大而逐渐增加。其中凝血酶的浓度范围在5×10^-12M到10^-7M之间。这些数据是在1M KCl的+160mV电压下获得。误差线代表三次实验的标准偏差。

实施例4

为了进一步探究分析真实生物样品此方法的适用性，将不同浓度(10^-10-10^-8M)的TB加入人体血清，然后用标准方法检测不同浓度的蛋白，计算回收率。结果图4所示。原始血清样本的电流信号中，有一个低水平的噪音样尖峰，但添加蛋白后产生了大量的特征性电流信号，这些信号很容易区分(图4A)。图4B中凝血酶的加标回收率在90％到110％之间。所有数据均在1M KCl+160mV电位下采集误差线代表三次实验的标准偏差。

序列表

<110> 临沂大学

<120> 一种利用纳米孔检测凝血酶的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaccacacaa cctacc 16

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttttttttt agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 39

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccccccccc cccccccccc cccccccccc ggtaggttgt gtggttatcc cagtcacccc 60

aac 63

Claims

1.一种利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

(4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测分子逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号；实验产生的电流通过Axopatch 200B放大采集，通过DigitalData1440A数模转换器转换为数字量，并传输到电脑上；通过PClamp 10.6软件实时观测并记录纳米通道单分子实验数据，利用OriginLab 9.0进行数据分析，实现对凝血酶的定量分析检测。

2.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中cDNA-16的序列为AACCACACAACCTACC；Throm-DNA的序列为C₃₀GGTAGGTTGTGTGGTTAT(CCC)AGTCACCCCAAC；所述Throm-apt序列为Biotin-T₁₀AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；其中C₃₀是指30个C，T₁₀是指10个T，Throm-DNA序列中下划线标注的CCC表示接到单链DNA上的分支。

3.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中捕获臂Throm-DNA、cDNA-16、适配体Throm-apt的浓度均为10^-6M，用量均为20μL；缓冲液用量为20μL。

4.根据权利要求3所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述缓冲液组成为150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH 7.9。

5.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中双链反应液与链霉亲和素磁珠混合的具体方法为：先用1mL 1×BW缓冲液将50μL磁珠洗三次，然后将25μL双链反应液、25μL超纯水和洗过的磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟后磁性分离，将上清液倒出，保留磁珠。

6.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中双链DNA底物探针用量为100μL，浓度为2×10^-7M。

7.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷脂溶液为30mg/mL的磷脂正葵烷溶液。

8.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中电解质溶液cis池中为:1.0M KCl,10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8；trans池中为:1.0MKCl,10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8。

9.根据权利要求1所述的利用纳米孔检测凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中α-溶血素加入量为1μL 5μg/mL。