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CN106574915A - 阳离子交换色谱载体及其使用方法 - Google Patents

阳离子交换色谱载体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

一种阳离子交换色谱载体，其为具备膜状基材、和固定于膜状基材的表面的共聚物的阳离子交换色谱载体，共聚物含有(甲基)丙烯酰胺类化合物和/或(甲基)丙烯酸酯类化合物作为单体单元，单位体积的该载体以高于30毫摩尔/L的密度具有一种或多种阳离子交换基团，所述阳离子交换基团至少含有弱阳离子交换基团。

Description

阳离子交换色谱载体及其使用方法
技术领域
本发明涉及具有弱阳离子交换基团的离子交换色谱载体、以及使用了其的生物体分子的纯化方法。
背景技术
免疫球蛋白(抗体)为掌管免疫响应的生理活性物质。近年，在药物、诊断药或所对应的抗原蛋白质的分离纯化材料等用途中，其利用价值升高。抗体由进行了免疫的动物的血液或者拥有抗体产生能力的细胞的细胞培养液或动物的腹水培养液获得。但是，这些含有抗体的血液、培养液包含抗体以外的蛋白质、或源自细胞培养中使用的原料液的复杂的夹杂成分，为了由这些杂质成分分离纯化抗体，通常需要繁杂且长时间的操作。
液体色谱对于抗体的分离纯化而言是重要的。作为用于分离抗体的色谱手法，有凝胶过滤色谱、亲和色谱、离子交换色谱和反相色谱等，通过将这些手法组合，将抗体分离纯化。
离子交换色谱为通过将吸附剂表面的离子交换基团作为固定相而可逆地吸附存在于流动相中的平衡离子来进行分离的方法。作为吸附剂的形状，可采用珠子、或平膜和中空纤维等膜等，在这些基材键合阳离子交换基团或阴离子交换基团而成的物质作为吸附剂市售。
对于具有阳离子交换基团的吸附剂，通常进行下述纯化：通过使得低盐浓度的抗体溶液与吸附材料接触，吸附抗体，通过提高流动相的盐浓度，将所吸附的生理活性物质洗脱。进而，作为更良好的方法，也提出了以下说明的利用流通方式进行的目的物质的纯化。
流通方式指的是由目的物质使得杂质选择性地吸附于吸附剂的纯化方法的方式。因此，与以往的利用了吸附、洗脱的方法相比，实现缓冲液的节约、工序的简化。另外认为，若可以以高流速对抗体溶液进行处理，则流通纯化的优点进一步发挥作用。
另外，在阳离子交换工序中，往往目的在于，将抗体单体与抗体二聚体等聚集体分离。但是，由于抗体单体与抗体聚集体的等电点大致相等，因此在流通纯化中，特别难以将抗体单体与抗体二聚体分离，需要以阳离子交换基团的密度为首的阳离子交换体的细致设计。另外，抗体由于各自性质不同，即使进行周密的设计，对于全部抗体而言，相同的设计也并非是最合适的，认为存在适于各抗体的阳离子交换基团密度。
专利文献1中公开了在树脂上键合具有芳香族和弱阳离子交换基团的低分子化合物而成的流通纯化中使用的多峰色谱树脂。
专利文献2中公开了在二氧化硅珠子键合具有弱阳离子交换基团的共聚物而成的色谱载体。
专利文献3中公开了将具有强阳离子交换基团的单体和非带电(中性)单体接枝聚合于载体而成的适于流通的色谱载体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4776615号公报
专利文献2：日本专利第5234727号公报
专利文献3：日本特开2013-189427号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明人等发现，专利文献1中公开的多峰色谱载体为珠子状，因此不能以高流速进行处理，不能有效利用流通纯化的优点。
本发明人等发现，专利文献2中公开的在二氧化硅珠子键合共聚物而成的色谱载体也不能以高流速进行处理。
另外，专利文献3中公开的阳离子交换膜的特征在于，固体载体上的低密度(1～30毫摩尔/L)的阳离子交换基团的使用，阳离子交换基团密度有限制。
如此，没有公开能够对应于抗体的性质来调节电荷密度、能够进行高流速处理的阳离子交换体。因此，本发明的目的在于，提供在流通纯化中能够进行高流速处理、能够调整电荷密度的阳离子交换体。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题，从各种角度进行研讨，进行研究开发。其结果发现，若使用键合有具有弱阳离子交换基团的聚合物的载体，则能够进行高流速处理以及电荷密度的调节，适于蛋白质的流通纯化，从而完成了本发明。
根据本发明的方式，提供一种阳离子交换色谱载体，其为具备膜状基材、和固定于膜状基材的表面的共聚物的阳离子交换色谱载体，共聚物含有(甲基)丙烯酰胺类化合物和/或(甲基)丙烯酸酯类化合物作为单体单元，单位体积的该载体以高于30毫摩尔/L的密度具有一种或多种阳离子交换基团，所述阳离子交换基团至少含有弱阳离子交换基团。
上述阳离子交换色谱载体的共聚物中，具有阳离子交换基团的单体单元以外的单体单元为不带电荷的中性单体，中性单体为疏水性单体单元和/或亲水性单体单元为宜。
上述阳离子交换色谱载体的共聚物含有至少一种疏水性单体单元作为单体单元为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，疏水性单体单元具有碳数为4以上的直链或支链状的烷基为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，弱阳离子交换基团源自丙烯酸单体、甲基丙烯酸单体、丙烯酸化合物单体和甲基丙烯酸化合物单体中的任意种为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，弱阳离子交换基团源自甲基丙烯酸单体为宜。
上述阳离子交换色谱载体的共聚物中，疏水性单体单元和/或亲水性单体单元的质量比率高于阳离子交换基团单体单元的质量比率为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，一种或多种阳离子交换基团仅包含弱阳离子交换基团为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，一种或多种阳离子交换基团为弱阳离子交换基团和强阳离子交换基团的混合为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，强阳离子交换基团为磺酸基为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，共聚物通过共价键合而固定于膜状基材的表面为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，共聚物含有(甲基)丙烯酰胺类化合物作为亲水性单体单元为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，共聚物含有异丙基丙烯酰胺作为亲水性单体单元为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，共聚物含有(甲基)丙烯酸酯类化合物作为亲水性单体单元为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，共聚物含有甲基丙烯酸2-羟基乙酯作为亲水性单体单元为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，膜状基材含有聚乙烯为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，接枝聚合于膜状基材的共聚物的接枝率为20～200％为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，膜状基材为聚偏二氟乙烯为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，接枝聚合于膜状基材的共聚物的接枝率为5～100％为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，共聚物实质上不具有交联结构为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，共聚物包含含有两个以上聚合性官能团的单体单元为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，聚合性官能团源自(甲基)丙烯酰胺或(甲基)丙烯酸酯为宜。
上述阳离子交换色谱载体为生物体分子纯化用的阳离子交换色谱载体为宜。生物体分子为抗体为宜。
上述阳离子交换色谱载体中，相对于载体1mL，将含有单体和聚集体的抗体100mg进行流通纯化时，聚集体比率降低50％以上为宜。
另外，根据本发明的方式，提供一种从含有杂质和生理活性物质的混合溶液纯化生理活性物质的纯化方法，其使混合溶液接触上述阳离子交换色谱载体，得到纯度提高了的生理活性物质。
上述纯化方法为流通式为宜。
上述纯化方法中，生理活性物质的回收率为80％以上为宜。
上述纯化方法中，生理活性物质为抗体蛋白质的单体为宜。
上述纯化方法中，杂质含有抗体蛋白质的二聚体以上的聚集体为宜。
上述纯化方法中，在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序之前或之后使用阴离子交换色谱载体进行纯化为宜。
上述纯化方法中，阴离子交换色谱载体为膜状为宜。
上述纯化方法中，阴离子交换色谱载体为在基材上具有接枝聚合物的结构为宜。
上述纯化方法中，利用阴离子交换色谱载体进行的纯化为流通式为宜。
上述纯化方法中，在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间不进行缓冲液交换为宜。
上述纯化方法中，利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序是连续的为宜。
上述纯化方法中，在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间，加入酸或碱，由此使得缓冲液的氢离子指数变化为宜。
上述纯化方法中，其在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间具有使得电导率变化0.01mS/cm以上的工序为宜。
上述纯化方法中，其在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序之前具有利用亲和色谱进行的纯化工序为宜。
上述纯化方法中，亲和色谱工序中的生理活性物质的洗脱后，不进行缓冲液交换为宜。
上述纯化方法中，亲和色谱工序中的生理活性物质的洗脱所使用的洗脱缓冲液的主要成分为一元酸为宜。
上述纯化方法中，亲和色谱工序中的生理活性物质的洗脱所使用的洗脱缓冲液为乙酸缓冲液为宜。
上述纯化方法中，亲和色谱工序中的生理活性物质的洗脱所使用的洗脱缓冲液的电导率为10mS/cm以下为宜。
上述纯化方法中，在亲和色谱工序之后，通过酸性处理进行病毒灭活为宜。
发明的效果
若使用本发明的阳离子交换色谱载体，则能够以高流速进行处理，进而能够以对应于蛋白质的性质的电荷密度纯化蛋白质。
附图说明
图1为将实施例1的抗体溶液施加于尺寸排阻色谱时的吸光度的图。
图2为图1的图的放大图。
图3为表示实施例1～29以及比较例1～3的结果的表。
图4为表示实施例30～32的结果的表。
图5为表示实施例33～40的结果的表。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施方式(以下称为“实施方式”)进行详细说明。需要说明的是，以下所示的实施方式例示出用于将本发明的技术上的思想具体化的装置、方法，对于本发明的技术上的思想而言，构成构件的组合等不特定于下述内容。本发明的技术上的思想可以在专利权利要求书中附加各种变更。
实施方式的阳离子交换色谱载体具备膜状基材、和固定于膜状基材表面的共聚物，共聚物含有(甲基)丙烯酰胺类化合物和/或(甲基)丙烯酸酯类化合物作为单体单元，单位体积的该载体以高于30毫摩尔/L的密度、优选高于40毫摩尔/L的密度、更优选高于45毫摩尔/L的密度具有一种或多种阳离子交换基团，所述阳离子交换基团至少含有弱阳离子交换基团。
“(甲基)丙烯酰胺类化合物”指的是基本骨架中具有丙烯酰胺的单体或单体单元，通过基本骨架以外的结构，能够形成亲水性或疏水性。另外，“(甲基)丙烯酸酯类化合物”指的是基本骨架中具有丙烯酸酯的单体或单体单元，通过基本骨架以外的结构，能够形成亲水性或疏水性。
“密度”指的是以每1升阳离子交换色谱载体的阳离子交换基团的摩尔数的浓度通常所表示的、阳离子交换色谱载体中的阳离子交换基团的浓度。“cation”也表示为阳离子、“anion”也表示为阴离子。另外，“载体”也表示为交换体、吸附剂、固定相。
实施方式的阳离子交换色谱载体例如用于生理活性物质的纯化。生理活性物质例如指的是抗体蛋白质的单体成分。杂质例如指的是抗体蛋白质的二聚体以上的聚集体。
作为生理活性物质的一例的抗体蛋白质如生物化学中的通常定义那样，为作为脊椎动物的感染防御机构的B淋巴细胞所产生的糖蛋白分子(也称为γ球蛋白或免疫球蛋白)。例如用实施方式的阳离子交换色谱载体纯化的抗体蛋白质作为人的药物使用，具有与处于作为给药对象的人的体内的抗体蛋白质实质上相同的结构。
抗体蛋白质可以为人抗体蛋白质、也可以为源自人以外的牛和小鼠等哺乳动物的抗体蛋白质。或者，抗体蛋白质可以为与人IgG的嵌合抗体蛋白质、和人源化抗体蛋白质。与人IgG的嵌合抗体蛋白质指的是可变区源自小鼠等人以外的生物、而其它恒定区置换为源自人的免疫球蛋白的抗体蛋白质。另外，人源化抗体蛋白质指的是可变区中、互补性决定区(complementarity-determining region：CDR)源自人以外的生物，而其它的框架区(framework region：FR)源自人的抗体蛋白质。人源化抗体蛋白质与嵌合抗体蛋白质相比，免疫原性进一步降低。
对于作为实施方式的阳离子交换色谱载体的纯化对象的一例的抗体蛋白质的类型(class)(同种型(isotype))和亚型(subclass)没有特别限定。例如抗体蛋白质根据恒定区的结构不同而分类为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE这五种类型。但是，成为实施方式的阳离子交换色谱载体的纯化对象的抗体蛋白质可以为五种类型中的任意种。另外，人抗体蛋白质中，IgG存在IgG1～IgG4这四种亚型，IgA存在IgA1和IgA2这两种亚型。但是，成为实施方式的阳离子交换色谱载体的纯化对象的抗体蛋白质的亚型可以为任意种。需要说明的是，在Fc区域结合蛋白质而成的Fc融合蛋白质等抗体相关蛋白质也能够包含于成为实施方式的阳离子交换色谱载体的纯化对象的抗体蛋白质。
进而，抗体蛋白质也可以根据来源而分类。但是，成为实施方式的阳离子交换色谱载体的纯化对象的抗体蛋白质可以为天然的人抗体蛋白质、利用基因重组技术制造的重组人抗体蛋白质、单克隆抗体蛋白质、和多克隆抗体蛋白质中的任意种。这些抗体蛋白质中，作为成为实施方式的阳离子交换色谱载体的纯化对象的抗体蛋白质，从作为抗体药物的需要、重要性的观点考虑，优选为人IgG，但是不限于此。
对于实施方式的阳离子交换色谱载体所具备的膜状基材的形状没有特别限定，作为形状，可列举出中空纤维状、平膜状、无纺布状、独石柱(monolith)、毛细管、烧结体、圆板或圆筒状等。另外，材料也不受特别限定，但是优选由聚烯烃系聚合物、聚酰胺(尼龙)、聚酯、聚醚砜、纤维素等构成。
作为聚烯烃系聚合物，可列举出例如乙烯、丙烯、丁烯和偏二氟乙烯等的烯烃均聚物，该烯烃的两种以上的共聚物，或者一种或两种以上的烯烃与全卤化烯烃的共聚物等。作为全卤化烯烃，可列举出四氟乙烯和/或氯三氟乙烯等。它们之中，从机械的强度优异并且得到蛋白质等夹杂物的高吸附容量的观点考虑，优选为聚乙烯或聚偏二氟乙烯。另外，作为聚酰胺，不受特别限定，可列举出尼龙6(ε-己内酰胺的缩聚体)、尼龙11(十一烷内酰胺的缩聚体)、尼龙12(十二烷内酰胺的缩聚体)、尼龙66(六亚甲基二胺与己二酸的共缩聚物)、尼龙610(六亚甲基二胺与己二酸的共缩聚物)、尼龙6T(六亚甲基二胺与对苯二甲酸的共缩聚物)、尼龙9T(壬二胺与对苯二甲酸的共缩聚物)、尼龙M5T(甲基戊烷二胺与对苯二甲酸的共缩聚物)、尼龙621(己内酰胺与十二烷内酰胺的共缩聚物)、对苯二胺与对苯二甲酸的共缩聚物、间苯二胺与间苯二甲酸的共缩聚物等。作为聚酯，不受特别限定，可列举出聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸1,3-丙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸丁二醇酯等。
膜状基材例如具有多个细孔。对于细孔直径没有特别限定，基材为中空纤维状的情况下例如为5～1000nm、优选为10nm以上、更优选为50nm以上、进一步优选为100nm以上、特别优选为150nm以上、或者400nm以上。另外，从基材膜表面积的观点考虑，优选为900nm以下、更优选为800nm以下、进一步优选为700nm以下、特别优选为650nm以下。若细孔直径为5nm以下则存在可以分离的抗体蛋白质的分子量降低的倾向。另外若细孔直径为1000nm以上则该膜状基材的表面积减少，存在杂质的结合容量减少的倾向。
另外，在后述的接枝率高的情况、共聚物中的亲水性单体所占的比率高的情况下，存在中空纤维膜的细孔容易堵塞的倾向，这种情况下，特别优选为400～650nm左右的孔径。
另外，基材为平膜状、无纺布状的情况下，以膜形式使用基材时，能够使用支承体、能够进行层叠来使用，因此细孔直径的优选范围变宽。作为优选的范围，为10nm～1mm、优选为100nm以上、更优选为200nm以上、进一步优选为300nm以上。另外从表面积的观点考虑，优选为500μm以下、更优选为300μm以下、进一步优选为100μm以下。
实施方式的阳离子交换色谱载体至少具有弱阳离子交换基团，并且单位体积的该载体以高于30毫摩尔/L的密度具有一种或多种阳离子交换基团。
作为弱阳离子交换基团，可列举出羧酸基、膦酸基和磷酸基等。弱阳离子交换基团通过流动相的pH，能够改变电荷量。因此，通过改变流动相的pH，能够调整阳离子交换色谱载体的电荷密度。
作为弱阳离子交换基团的导入方法，存在共聚具有弱阳离子交换基团的单体的方法。作为这种单体，可列举出丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸化合物、和甲基丙烯酸化合物等。作为丙烯酸化合物，可列举出2-丙烯酰氧基乙基琥珀酸、2-丙烯酰氧基乙基六氢邻苯二甲酸和2-丙烯酰氧基乙基邻苯二甲酸等。作为甲基丙烯酸化合物，可列举出2-甲基丙烯酰氧基乙基琥珀酸、2-甲基丙烯酰氧基乙基六氢邻苯二甲酸和2-甲基丙烯酰氧基乙基邻苯二甲酸等。
另外，也可以共聚能够转换为弱阳离子交换基团的单体、然后通过官能团转换、导入弱阳离子交换基团。作为这种官能团，存在酯类等，可列举出丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸苄酯、丙烯酸烯丙酯、和甲基丙烯酸烯丙酯等单体。将它们作为单体用于共聚后，通过酸性条件进行脱保护，可以转换为羧酸基。
对于实施方式中的阳离子交换色谱载体，若具有至少一种弱阳离子交换基团则可以具有强阳离子交换基团、或者可以不具有强阳离子交换基团、仅具有弱阳离子交换基团，按阳离子交换基团的总计计，单位体积的该载体的密度高于30毫摩尔/L即可。
通过导入强阳离子交换基团，使得电荷量变化对于pH不敏感，能够提高再现性。由于大致全部强阳离子交换基团在抗体纯化中的实用的抗体溶液的pH区域带电，因此电荷量恒定。因此，通过在阳离子交换色谱载体中存在强阳离子交换基团，总是保证一定以上的电荷量。进而，通过改变pH，调整弱阳离子交换基团的电荷量，可以微调阳离子交换色谱载体整体的电荷量。通过在阳离子交换色谱载体中存在强阳离子交换基团，能够抑制由于pH的微变化而极大地支配阳离子交换色谱载体的性能。作为强阳离子交换基团，可列举出磺酸基等。
若与30毫摩尔/L相比、阳离子交换基团的总计密度降低则能够带电的阳离子交换基团量减少，吸附容量低，存在可以处理的抗体量降低的倾向。专利文献3中，使用强阳离子交换基团，使得阳离子交换基团的密度为30毫摩尔/L以下，由此表现出流通纯化中的抗体的单体与聚集体的选择性，但是由于密度低，因此吸附容量减少，可以处理的抗体量少。另外，若阳离子交换基团的密度为30毫摩尔/L以下则能够带电的量的范围变窄，存在可以适用的抗体种类变窄的倾向。
需要说明的是，按阳离子交换基团的总计计，单位体积的该载体的密度高于30毫摩尔/L即可，其中，若弱阳离子交换基团的密度为5摩尔/L以上、优选10摩尔/L以上、更优选15毫摩尔/L以上则能够调整电荷密度。
对于实施方式中的阳离子交换色谱载体所具备的共聚物，被固定于膜状基材，例如通过共价键合而固定于膜状基材。该载体至少具有弱阳离子交换基团并且以最终形成高于30毫摩尔/L的密度的方式具有一种或多种阳离子交换基团即可。
作为在膜状基材固定共聚物的方法，存在接枝聚合。作为接枝聚合法，可列举出辐射线接枝聚合法、表面活性自由基聚合法。
通过辐射线接枝聚合法在膜状基材表面固定共聚物的情况下，为了在膜状基材生成自由基，可以采用任意手段，但是若对于膜状基材照射电离性辐射线则在膜状基材整体生成均匀的自由基，所以优选。作为电离性辐射线的种类，可以利用γ射线、电子束、β射线和中子射线等，但是对于工业规模的实施而言优选为电子束或γ射线。电离性辐射线由钴60、锶90和铯137等放射性同位素，或者通过X射线拍摄装置、电子束加速器和紫外线照射装置等得到。
电离性辐射线的照射剂量优选为1kGy以上且1000kGy以下、更优选为2kGy以上且500kGy以下、进一步优选为5kGy以上且200kGy以下。照射剂量不足1kGy时，存在难以均匀地生成自由基的倾向。另外，若照射剂量超过1000kGy则存在引起膜状基材的物理上的强度降低的倾向。
利用电离性辐射线的照射进行的接枝聚合法通常大致分为：在膜状基材生成自由基后、接着使得自由基与反应性化合物接触的前照射法；和，在使得膜状基材与反应性化合物接触的状态下在膜状基材生成自由基的同时照射法。实施方式中，任意方法都能够适用，但是优选为低聚物的生成少的前照射法。
对于实施方式中用于共聚物的聚合时的溶剂，若可以均匀地溶解反应性化合物则没有特别限定。作为这种溶剂，可列举出例如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等醇类，二乙基醚、四氢呋喃等醚类，丙酮、2-丁酮等酮类，水、或它们的混合物等。
共聚物在其组成中，除了具有阳离子交换基团的单体单元之外，还含有丙烯酰胺类、甲基丙烯酰胺类、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类的化合物一种或多种作为单体单元。共聚物可以仅包含丙烯酰胺类、甲基丙烯酰胺类、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类的组合，也可以仅包含甲基丙烯酸酯类。进而，共聚物在其组成中可以含有作为不带电荷的中性单体的、亲水性和/或疏水性的化合物一种或多种作为单体单元。这些单体单元对于洗涤阳离子交换色谱时的现实的酸、碱条件而言是稳定的，不易产生由于洗涤所导致的性能降低，进而存在膜的强度不易降低的倾向。认为通过使得这些亲水性和/或疏水性单体与具有阳离子交换基团的单体共聚，由此分开阳离子交换基团之间的距离，更容易选择性地吸附抗体聚集体。作为该其它单体单元的例子，例如有丙烯腈，但是丙烯腈由于容易被碱水解，因此若使用丙烯腈作为单体单元则存在由于碱洗涤而性能受损的倾向，所以不优选。另外，含有苯乙烯类等芳香族的单体单元由于存在使得膜坚硬、变脆的倾向而不优选。进而，从使抗体单体和抗体聚集体的吸附力差别化的观点考虑，共聚物中，作为中性单体的、亲水性单体单元和/或疏水性单体单元的质量比率，优选高于具有阳离子交换的单体单元的质量比率、更优选为2倍以上、进一步优选为3倍以上。
实施方式中，共聚物由于仅包含具有阳离子交换基团的单体和中性单体，因此具有阳离子交换基团的单体的质量、和中性单体的质量可以如下所述求出。
(阳离子交换基团单体质量)＝(阳离子交换基团密度×载体体积×阳离子交换基团单体分子量)
(中性单体的质量)＝(阳离子交换载体质量-基材载体质量-阳离子交换基团单体质量)
通过这些质量比，可以求出具有阳离子交换基团的单体单元的质量比率和中性的单体单元的质量比率。
另外，抗体由于具有疏水性相互作用的性质，因此若膜状基材的疏水性强则由于疏水性相互作用而抗体被膜状基材吸附，目的的抗体的回收率有可能降低。对于这种现象，通过在共聚物的聚合时导入亲水性单体，可以防止抗体吸附到膜状基材。作为这种亲水性单体，可列举出丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、以及(二甲基)丙烯酰胺、(二甲基)甲基丙烯酰胺、(二乙基)丙烯酰胺、(二乙基)甲基丙烯酰胺、N-(甲基)丙烯酰胺、N-(甲基)甲基丙烯酰胺、N-(乙基)丙烯酰胺、N-(乙基)甲基丙烯酰胺、N-(异丙基)丙烯酰胺、N-(异丙基)甲基丙烯酰胺、N-(羟基甲基)丙烯酰胺、N-(羟基甲基)甲基丙烯酰胺、N-(2-羟基乙基)丙烯酰胺、和N-(2-羟基乙基)甲基丙烯酰胺等(甲基)丙烯酰胺化合物。或者，作为上述的亲水性单体，可列举出丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、以及丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、丙烯酸3-羟基丙酯、甲基丙烯酸3-羟基丙酯、丙烯酸4-羟基丁酯、甲基丙烯酸4-羟基丁酯、丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯、和甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯等(甲基)丙烯酸酯化合物。
或者，也可以在共聚物的聚合时导入疏水性单体，有效利用疏水性相互作用，由此提高抗体单体和抗体聚集体的吸附选择性。通常抗体聚集体表现出比抗体单体强的疏水性相互作用。通过选择合适的疏水性单体，抗体单体与抗体聚集体的疏水性相互作用之差显著，能够实现高的选择性。作为这种疏水性单体，有苯乙烯类、(烷基)丙烯酰胺类、(烷基)甲基丙烯酰胺类、丙烯酸烷基酯类、和甲基丙烯酸烷基酯类等，但是从力学的强度的观点考虑，优选为(烷基)丙烯酰胺类、(烷基)甲基丙烯酰胺类、丙烯酸烷基酯类、和甲基丙烯酸烷基酯类。关于烷基，若为碳数为4以上的直链或支链状的烷基则对于抗体能够实质上表现出疏水性相互作用。
另外，共聚物可以不包含含有两个以上的聚合性官能团的单体单元、不具有交联结构。或者，共聚物也可以在单体单元中包含含有两个以上的聚合性官能团的单体单元、具有交联结构。但是，共聚物优选实质上为非交联结构。实质上非交联指的是，即使具有交联结构也为实质上对于抗体聚集体的吸附性能不会造成影响的程度的低交联度。共聚物实质上非交联的情况下，含有两个以上的聚合性官能团的单体单元的质量比率例如为10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、或0.1％以下，越低越优选。
对于单体中含有两个以上的聚合性官能团的单体没有特别限定，作为聚合性官能团，可列举出烯烃。作为这种单体，可列举出(甲基)丙烯酰胺系单体、(甲基)丙烯酸酯系单体、或这些官能团混合而成的单体。作为(甲基)丙烯酰胺系单体，可列举出N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、N,N’-亚乙基双丙烯酰胺、N,N’-亚丙基双丙烯酰胺、N,N’-(1,2-二羟基亚乙基)双丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺、N,N’-亚乙基双甲基丙烯酰胺、N,N’-亚丙基双甲基丙烯酰胺、和N,N’-(1,2-二羟基亚乙基)双甲基丙烯酰胺等。
作为(甲基)丙烯酸酯系单体，可列举出乙二醇二丙烯酸酯、1,3-丁二醇二丙烯酸酯、1,4-丁二醇二丙烯酸酯、1,5-戊二醇二丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯、1,9-壬二醇二丙烯酸酯、1,10-癸二醇二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、二甘醇二丙烯酸酯、三甘醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、一缩二丙二醇二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、2-羟基-1,3-丙二醇二丙烯酸酯、4,4’-二巯基二苯硫醚二丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,4-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,5-戊二醇二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯、1,9-壬二醇二甲基丙烯酸酯、1,10-癸二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、二甘醇二甲基丙烯酸酯、三甘醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、一缩二丙二醇二甲基丙烯酸酯、三丙二醇二甲基丙烯酸酯、2-羟基-1,3-丙二醇二甲基丙烯酸酯、4,4’-二巯基二苯硫醚二甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和季戊四醇四甲基丙烯酸酯等。
利用接枝聚合得到的接枝链的键合率(接枝率)，根据基材膜的密度不同而最合适值有可能不同。基材膜为聚乙烯时，从吸附容量的观点考虑优选为20％以上、更优选为25％以上、进一步优选为30％以上。另外，从力学上确保稳定的强度的观点考虑，优选为200％以下、更优选为150％以下、进一步优选为100％以下。接枝率通过以下式子表示。
dg(％)＝(w1-w0)/w0×100
在此，w0为反应前的多孔中空纤维的重量、w1为导入了接枝链的多孔中空纤维的重量。
基材膜为聚偏二氟乙烯时，聚偏二氟乙烯与聚乙烯相比，密度高，因此合适的接枝率与聚乙烯时不同。基材膜为聚偏二氟乙烯时，从吸附容量的观点考虑优选为5％以上、更优选为10％以上、进一步优选为15％以上。另外，从力学上确保稳定的强度的观点考虑，优选为100％以下、更优选为80％以下、进一步优选为70％以下。
另外，通过具有阳离子交换基团的共聚物被固定于膜状基材，与在膜状基材表面上分布阳离子交换基团的情况相比，能够立体上进行吸附。因此，与抗体单体相比，抗体聚集体更牢固地吸附于基材，能够以高的纯度得到抗体单体。因此，优选共聚物至少具有弱阳离子交换基团、具有一种或多种阳离子交换基团。另外，若共聚物为交联结构则通过抑制共聚物的起立，存在抑制通液压的优点，但是由于抗体聚集体立体上吸附于基材被阻碍，因此从与抗体单体相比，更牢固地吸附抗体聚集体，能够以高的纯度得到抗体单体的观点考虑，优选共聚物实质上为非交联结构。
另外，若共聚物中亲水性单体少，则共聚物伸缩而不能进行抗体聚集体的立体上的吸附，因此为了进行抗体聚集体的立体上的吸附，需要某种程度以上的含量。作为这种共聚物中的亲水性单体的质量比率，优选为30％以上、更优选为40％以上、进一步优选为50％以上、特别优选为60％以上。另外，优选与疏水性单体的质量比率相比、亲水性单体的比率高。优选为1.3倍以上、更优选为1.5倍以上、进一步优选为1.7倍以上、特别优选为1.9倍以上。亲水性单体和疏水性单体的质量比率能够由最终生成物通过热分解GC/MS检出。或者，也可以与合成时的投料组成比一致来算出。若为接枝聚合则为投料时的全部单体之中的亲水性单体的重量比率。
作为求出全部阳离子交换基团密度的方法，存在使用强酸等将阳离子交换基团全部质子化后，使用碱进行中和，通过返滴定来测定的方法。另外，也存在将阳离子交换基团的抗衡阳离子置换为锂离子后，用强酸进行处理，测定所溶出的锂的量的方法。通过这些方法，可以测定全部阳离子交换基团密度。
另外，作为测定强阳离子交换基团密度的方法，例如可以通过使用强酸等将强阳离子交换基团全部质子化后，加入氯化钠水溶液，对于所溶出的氯化氢进行滴定来测定。
弱阳离子交换基团密度可以由全部阳离子交换基团密度减去强阳离子交换基团密度来求出。
实施方式提供的得到纯度提高了的生理活性物质的纯化方法为从含有杂质和生理活性物质的混合溶液中纯化生理活性物质的纯化方法，其包括使混合溶液接触上述阳离子交换色谱载体。利用实施方式提供的纯化方法得到的生理活性物质的回收率例如为80％以上。回收率基于下式算出。
回收率＝(抗体回收量×处理后单体成分纯度)/(抗体处理量×处理前单体成分纯度)
流通指的是意图使得目的的生理活性物质在材料中流通的纯化方法。例如抗体蛋白质的单体为目的物、抗体蛋白质的聚集体为杂质的情况下，抗体蛋白质单体在吸附剂中流动，抗体蛋白质的聚集体与吸附剂结合。此时，抗体蛋白质的单体也可以被吸附剂吸附，但是抗体蛋白质的聚集体更选择性地被吸附剂吸附，由此将抗体蛋白质的单体纯化。
作为使用了阳离子交换载体的流通纯化的实施方式的色谱的流动相，利用强酸、强碱以外的缓冲液(buffer)即可，无需有机溶剂。在此，缓冲液指的是含有盐类的水溶液，具体而言，可列举出磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、和乙酸缓冲液等，若为通常利用的缓冲液则没有特别限定。其盐类的浓度为0～100毫摩尔/L、优选为0～50毫摩尔/L、更优选为0～30毫摩尔/L。另外，缓冲液浓度为1～100毫摩尔/L、优选为2～70毫摩尔/L、进一步优选为5～50毫摩尔/L。在此，缓冲液浓度指的是缓冲液的有效成分的浓度。例如若为乙酸缓冲液则通常由乙酸和乙酸钠调整，为此时的乙酸和乙酸钠的总浓度。另外，对于Tris缓冲液而言，指的是三羟基甲基氨基甲烷的浓度。另外，对于如乙酸-Tris缓冲液等那样记载的缓冲液，为前者的浓度，对于乙酸-Tris而言，若为乙酸、Tris-乙酸，则为Tris的浓度。另外，本实施方式中，几乎不具有缓冲能力的pH的溶液(例如pH 3.4的乙酸缓冲液)也可以用于色谱。
若缓冲溶液中的无机盐类的浓度高于100毫摩尔/L，则离子交换基团的偏离度降低，存在难以保持聚集体等杂质的倾向。
若盐类的浓度以电导率这种尺度表示则优选为0.5～20mS/cm、更优选为0.5～15mS/cm、进一步优选为0.5～10mS/cm、特别优选为0.8～5.0mS/cm。
缓冲液的氢离子浓度，根据所处理的抗体蛋白质的等电点、尺寸等不同而不同，需要适当研究最合适条件，例如pH为4.0～10.0、优选为5.0～9.5、进一步优选为6.0～9.0、特别优选为6.5～8.0。若为抗体蛋白质的等电点左右则抗体蛋白质之间的静电排斥减小，存在容易聚集的倾向。另外，若pH低于4.0则产生抗体蛋白质的变性，存在引起活性降低、聚集体的纯化等品质降低的倾向。
对于阳离子交换色谱工序中的抗体负载量，若可以去除杂质则不受特别限定，相对于载体1mL为100mg以上，从有效地进行纯化等观点考虑，相对于载体1mL优选为300mg以上、更优选为500mg以上、进一步优选为700mg以上、另外进一步优选为0.8g以上、特别优选为1g以上。
本实施方式中实施的阳离子交换色谱工序中，相对于载体1mL，将含有单体和聚集体的抗体100mg以上流通纯化时，抗体中的抗体聚集体的比率降低50％以上、更优选降低60％以上、进一步优选降低70％以上。需要说明的是，抗体聚集体的比率的降低率指的是由处理前的聚集体成分(1)、(2)的含有率而得到处理后的聚集体成分(1)、(2)的含有率之差，该差除以处理前的聚集体成分(1)、(2)的含有率得到的值的百分率表示。聚集体成分(1)、(2)的各自的含有率由色谱图的峰面积算出。
另外，除了本实施方式中实施的利用阳离子交换色谱进行的纯化工序之外，通过还与阴离子交换色谱工序组合，能够进一步提高纯化物的纯度。
以往的通常的利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序中，通过使得目的物质暂且吸附于载体、进行洗脱来进行纯化，因此能够同时去除具有比目的物质的pI高的pI的杂质、以及具有比目的物质的pI低的pI的杂质。另一方面，本实施方式的流通纯化中，有可能难以去除具有比目的物质pI低的pI的杂质。但是，具有比目的物质pI低的pI的杂质可以通过利用阴离子交换色谱载体进行的纯化来去除。因此，通过将利用本实施方式的阳离子交换色谱载体进行的纯化工序和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序组合，可以在保持以往的杂质去除性的状态下达成效率良好的纯化。
具有比目的物质pI低的pI的杂质不受特别限定，例如存在源自宿主细胞的蛋白质(HCP)、DNA、和作为源自亲和色谱工序的杂质的蛋白A等。
利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序可以在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序之前或之后。
阴离子交换色谱载体不受特别限定，若为膜状则能够实现高流速，能够进行效率更良好的纯化工序的构筑。另外，阴离子交换色谱载体可以为在基材上具有接枝聚合链的结构。
阴离子交换色谱载体的结构不受特别限定，但是若为在基材上具有接枝聚合物的结构则可以立体地吸附于杂质，因此可以期待更高的杂质去除性。
对于利用阴离子交换色谱载体进行的纯化方法不受特别限定，但是若为流通纯化则能够更有效地进行纯化。
对于阴离子交换色谱工序中的抗体负载量，若可以去除杂质则不受特别限定，但是从有效地进行纯化的观点考虑，相对于载体1mL优选为0.2g以上、更优选为0.5g以上、进一步优选为1.0g以上、进一步更优选为2.0g以上、特别优选为4g以上。
在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间可以进行缓冲液交换、也可以不进行缓冲液交换。不进行缓冲液交换的情况下，可以更有效地进行纯化。
阳离子交换色谱载体中的纯化工序和阴离子交换色谱载体中的纯化工序可以连续进行，也可以在先前的工序结束之后，暂时储藏于罐，进行以下的工序。
在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间可以进行pH的调整。通过调整pH，具有前者的处理pH左右的pI的杂质的去除性进一步提高。具体而言，首先利用阳离子交换色谱载体进行纯化的情况下，在利用阴离子交换色谱载体进行纯化之前，加入碱，提高pH，由此可以进一步去除杂质。相反地，首先利用阴离子交换色谱载体进行纯化的情况下，在利用阳离子交换色谱载体进行纯化之前加入酸，降低pH，由此可以进一步去除杂质。所变化的pH的值若提高杂质去除性则不受特别限定，可以根据成为标的的杂质任意变化。作为pH的变化量的值，可列举出0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0等，可以为所示的单位，也可以为各自之间的值。
若可以去除杂质则不受特别限定，但是优选的是，若pH变化0.1以上则杂质去除性特别提高。
另外，与pH同样地，在利用阳离子交换色谱载体进行的纯化工序和利用阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间可以进行电导率的调整。所变化的电导率的值若杂质去除性提高则不受特别限定，可以根据成为标的的杂质任意变化。作为电导率的变化量的值，可列举出0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0等，可以为所示的值，也可以为各自之间的值。
另外，通常抗体纯化中，利用亲和色谱进行纯化后，利用离子交换色谱工序进行纯化，在本实施方式中实施的利用阳离子交换色谱进行的纯化工序和阴离子交换色谱工序之前，也可以进行亲和色谱工序。在亲和色谱工序后，通过进行利用上述阳离子交换色谱进行的流通纯化和阴离子交换色谱工序，由此能够得到纯度更高的目的物。
根据本实施方式，通过进行利用阳离子交换色谱进行的流通纯化和利用阴离子交换色谱进行的流通纯化，而不进行亲和色谱工序后的含有抗体的洗脱液的缓冲液交换，由此能够有效地进行纯化。作为这种洗脱液，存在含有一元酸作为主要成分的缓冲液。
通常阴离子交换色谱工序中，若使用以多元酸作为主要成分的洗脱缓冲液，则吸附量降低，存在杂质去除性能降低的倾向，因此在亲和色谱工序中使用以多元酸作为主要成分的洗脱缓冲液的情况下，优选直至阴离子交换色谱以前预先交换缓冲液。但是，若使用以一元酸作为主要成分的洗脱缓冲液进行亲和色谱工序的洗脱，则能够无需交换缓冲液地利用阳离子交换色谱工序和阴离子交换色谱工序进行纯化。
对于以一元酸作为主要成分的洗脱缓冲液，若能够在亲和色谱工序中进行洗脱、在此后的离子交换色谱工序中可以去除杂质则不受特别限定，但是优选为乙酸。
另外，亲和色谱工序的洗脱中使用的洗脱缓冲液不限定于以下，但是从此后的利用阳离子交换色谱进行的流通纯化的杂质去除性的观点考虑，电导率优选为10.0mS/cm以下、更优选为7.0mS/cm以下、进一步优选为5.0mS/cm以下、特别优选为3.0mS/cm以下。
另外，为了保持低的洗脱池的电导率，优选在即将进行亲和色谱工序的洗脱之前，用电导率低的缓冲液洗涤载体。作为缓冲液，以不会洗脱抗体的方式使pH充分高、电导率充分低即可。
作为这种pH，优选为5.0以上、更优选为6.0以上、进一步优选为7.0以上，作为电导率，优选为10.0mS/cm以下、更优选为7.0mS/cm以下、进一步优选为5.0mS/cm以下、特别优选为3.0mS/cm以下。
另外，也可以在亲和色谱工序中的洗脱后，将洗脱液中有可能含有的病毒在酸性(低pH)条件下暴露一定时间，由此进行病毒的灭活。为了灭活病毒，pH优选为4.0以下、优选为3.8以下、更优选为3.6以下、进一步优选为3.5以下、特别优选为3.4以下。
也可以在亲和色谱工序、或与之接着的病毒灭活之后，将碱加入到洗脱液，由此进行洗脱液的pH调整。调整后的pH的值，若接着在离子交换色谱工序中能够进行杂质去除则不受特别限定，但是优选为4.0以上、更优选为5.0以上、进一步优选为6.0以上。
实施例
以下基于实施例对实施方式进行更详细说明，但是它们对实施方式没有任何限定。
(实施例1)
实施例1中，通过辐射线接枝聚合法，合成具有羧酸基的中空纤维状的阳离子交换膜。
1)辐射线接枝聚合
将N-异丙基丙烯酰胺3.09g、甲基丙烯酸丁酯1.54g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.31g、接枝率77％的阳离子交换膜。
测定所得到的1根中空纤维的体积，结果为1.05mL。通过乙醇将该中空纤维亲水化，置换为水。去除水后，加入0.1摩尔/L的氢氧化钠水溶液10mL。放置1小时后，取出氢氧化钠水溶液，加入纯水10mL。进而放置1小时后，回收纯水，由此回收残留于膜内的氢氧化钠。将所回收的氢氧化钠溶液合并，通过0.1摩尔/L盐酸进行滴定，结果中和需要7.98mL。空白为9.77mL，因此可知与氢氧化钠反应的膜所具有的弱阳离子交换基团为179微摩尔。若将其除以所测得的体积则可以求出弱阳离子交换基团密度，阳离子交换基团密度为170毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，作为实施例1的阳离子交换膜1。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.100和0.900。
2)细胞培养液的调整
作为抗体蛋白质，准备含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.115g/L的培养上清液。AE6F4产生细胞由九州大学大学院农学研究院、片仓喜范准教授提供。AE6F4抗体产生细胞的培养参考文献(日本生物工学会讲演要旨集、1994年、65卷、65页)培养。使用过滤膜(Asahi Kasei Medical Co.,Ltd制、商品名BioOptimal(注册商标)MF-SL)将含有AE6F4抗体产生细胞的培养液过滤，获得含有杂质和抗体的抗体溶液(培养上清液)。过滤参考提供者的操作说明书实施。
3)利用蛋白A柱进行的抗体蛋白质的纯化
向用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))150mL平衡化了的蛋白A柱(GE Healthcare Biosciences K.K.制、填充有MabSelect Sure)添加所过滤的抗体溶液2L，使得抗体蛋白质吸附于蛋白A。接着向柱子流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L的磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))20mL进行洗涤后，向柱子流通洗脱缓冲液(100毫摩尔/L柠檬酸钠(pH 3.6))240mL，由蛋白A柱洗脱抗体蛋白质，回收杂质降低了某种程度的抗体溶液。
4)聚集体调整
向所得到的抗体溶液的一部分加入盐酸，调整到pH 3，放置一小时。然后，使用氢氧化钠水溶液进行中和，调整含有大量的聚集体的抗体溶液。
5)含有聚集体的抗体溶液调整
将由蛋白A柱得到的抗体溶液进行缓冲液交换为15毫摩尔/Tris缓冲液(pH 7.0)而成的溶液、和含有大量的聚集体的抗体溶液进行缓冲液交换为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)而成的溶液以任意比率混合，调整含有聚集体的抗体溶液。
6)聚集体量的测定
对于所得到的抗体溶液，通过下述条件，使用尺寸排阻色谱(SEC：Size ExclusionChromatography)装置测定。色谱柱：ACQUITY YPLC BEH200SEC1.7μm(Waters公司制)
柱温：30℃
系统：ACQUITY UPLC H CLASS(waters公司制)
流动相：0.1摩尔/L磷酸氢二钠+0.2摩尔/L L(+)-精氨酸水溶液(用盐酸调整到pH6.7)
其结果得到图1的色谱图，其放大图为图2。图2的(1)和(2)出现的峰为抗体的聚集体，(3)出现的峰为单体。由色谱图的峰的面积算出的聚集体(1)的比率为1.54％、聚集体(2)的比率为2.20％、单体的比率为96.25％。以下的实施例和比较例中，也将首先出现的聚集体的峰称为聚集体(1)、第二出现的聚集体的峰称为聚集体(2)。
7)聚集体的去除
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜1接触。所加入的量为20mL(5.12mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜1。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。需要说明的是，图3中，“聚集体比率降低率”指的是由处理前的聚集体成分(1)、(2)的含有率而得到处理后的聚集体成分(1)、(2)的含有率之差，该差除以处理前的聚集体成分(1)、(2)的含有率得到的值的百分率表示。
(实施例2)
实施例2中，使用以下说明的阳离子交换膜2。阳离子交换膜2如下所述合成。将N-异丙基丙烯酰胺3.09g、甲基丙烯酸丁酯1.03g、甲基丙烯酸1.03g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.32g、接枝率77％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为390毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例2的阳离子交换膜2。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.217和0.783。
实施例2中使用的抗体溶液的聚集体(1)的比率为1.59％、聚集体(2)的比率为1.67％、单体的比率为96.74％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜2接触。所加入的量为20mL(5.29mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜2。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例3)
实施例3中，使用以下说明的阳离子交换膜3。阳离子交换膜3如下所述合成。将N-异丙基丙烯酰胺3.09g、甲基丙烯酸丁酯1.77g、甲基丙烯酸0.28g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.17g、接枝率72％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为59毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例3的阳离子交换膜3。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.035和0.965。
实施例3中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 8.0)、聚集体(1)的比率为1.31％、聚集体(2)的比率为2.04％、单体的比率为96.66％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜3接触。所加入的量为20mL(5.37mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 8.0)10mL洗涤阳离子交换膜3。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例4)
实施例4中，使用阳离子交换膜3和以下说明的抗体溶液。实施例4中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 9.0)、聚集体(1)的比率为2.49％、聚集体(2)的比率为3.19％、单体的比率为94.32％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜3接触。所加入的量为20mL(4.31mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 9.0)10mL洗涤阳离子交换膜3。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例5)
实施例5中，使用以下说明的阳离子交换膜4。阳离子交换膜4如下所述合成。将N-异丙基丙烯酰胺3.83g、甲基丙烯酸丁酯1.92g、甲基丙烯酸0.64g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.32g、接枝率77％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为183毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例5的阳离子交换膜4。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.102和0.898。
实施例5中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为3.25％、聚集体(2)的比率为2.07％、单体的比率为94.68％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜4接触。所加入的量为25mL(5.76mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜4。通过流通工序和洗涤工序回收35mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例6)
实施例6中，使用以下说明的阳离子交换膜5。阳离子交换膜5如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯1.49g、甲基丙烯酸丁酯0.72g、甲基丙烯酸0.36g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到4.35g、接枝率45％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为155毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例6的阳离子交换膜5。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.148和0.852。
实施例6中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.35％、聚集体(2)的比率为1.82％、单体的比率为95.83％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜5接触。所加入的量为20mL(4.73mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜5。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例7)
实施例7中，使用以下说明的阳离子交换膜6。阳离子交换膜6如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.06g、甲基丙烯酸丁酯1.03g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到4.72g、接枝率57％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为178毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例7的阳离子交换膜6。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.134和0.866。
实施例7中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.12％、聚集体(2)的比率为1.56％、单体的比率为96.32％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜6接触。所加入的量为25mL(5.17mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜6。通过流通工序和洗涤工序回收35mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例8)
实施例8中，使用以下说明的阳离子交换膜7。阳离子交换膜7如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.57g、甲基丙烯酸丁酯1.29g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.28g、接枝率76％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为177毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例8的阳离子交换膜7。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.100和0.900。
实施例8中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为3.37％、聚集体(2)的比率为1.94％、单体的比率为94.69％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜7接触。所加入的量为25mL(5.49mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜7。通过流通工序和洗涤工序回收35mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例9)
实施例9中，使用以下说明的阳离子交换膜8。阳离子交换膜8如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.57g、甲基丙烯酸丁酯1.29g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到4.97g、接枝率66％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为174毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例9的阳离子交换膜8。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.114和0.886。
实施例9中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.45％、聚集体(2)的比率为2.39％、单体的比率为95.17％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜8接触。所加入的量为25mL(6.02mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜8。通过流通工序和洗涤工序回收35mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例10)
实施例10中，使用以下说明的阳离子交换膜9。阳离子交换膜9如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.40g、甲基丙烯酸丁酯1.20g、甲基丙烯酸0.77g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到4.82g、接枝率61％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为249毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例10的阳离子交换膜9。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.177和0.823。
实施例10中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为0.72％、聚集体(2)的比率为1.14％、单体的比率为98.14％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜9接触。所加入的量为50mL(5.30mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜9。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例11)
实施例11中，使用以下说明的阳离子交换膜10。阳离子交换膜10如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯3.08g、甲基丙烯酸丁酯1.54g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.31g、接枝率77％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为175毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例11的阳离子交换膜10。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.103和0.897。
实施例11中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为1.57％、聚集体(2)的比率为1.55％、单体的比率为96.88％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为40mL(5.91mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收50mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例12)
实施例12中，使用以下说明的阳离子交换膜11。阳离子交换膜11如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯1.93g、甲基丙烯酸丁酯1.93g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.06g、接枝率69％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为177毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例12的阳离子交换膜11。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.11和0.89。
实施例12中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.71％、聚集体(2)的比率为2.69％、单体的比率为94.60％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜11接触。所加入的量为30mL(5.08mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜Y。通过流通工序和洗涤工序回收40mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例13)
实施例13中，使用阳离子交换膜10和以下说明的抗体溶液。实施例13中使用的抗体溶液为含有10毫摩尔/L的氯化钠的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.47％、聚集体(2)的比率为1.59％、单体的比率为95.94％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.31mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的含有10毫摩尔/L氯化钠的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size ExclusionChromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例14)
实施例14中，使用阳离子交换膜10和以下说明的抗体溶液。实施例14中使用的抗体溶液为含有30毫摩尔/L氯化钠的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.32％、聚集体(2)的比率为2.21％、单体的比率为95.47％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.66mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的含有30毫摩尔/L氯化钠的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size ExclusionChromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例15)
实施例15中，使用阳离子交换膜10和以下说明的抗体溶液。实施例15中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.5)、聚集体(1)的比率为1.32％、聚集体(2)的比率为2.00％、单体的比率为96.68％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.36mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.5)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例16)
实施例16中，使用阳离子交换膜10和以下说明的抗体溶液。实施例16中使用的抗体溶液为含有10毫摩尔/L氯化钠的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.5)、聚集体(1)的比率为1.59％、聚集体(2)的比率为2.20％、单体的比率为96.21％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.63mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的含有10毫摩尔/L氯化钠的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.5)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size ExclusionChromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例17)
实施例17中，使用阳离子交换膜10和以下说明的抗体溶液。实施例17中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 8)、聚集体(1)的比率为1.41％、聚集体(2)的比率为1.81％、单体的比率为96.78％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.30mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 8)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例18)
实施例18中，使用阳离子交换膜10和以下说明的抗体溶液。实施例18中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.30％、聚集体(2)的比率为2.08％、单体的比率为95.62％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.72mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例19)
实施例19中，使用以下说明的阳离子交换膜12。阳离子交换膜12如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.57g、乙二醇二甲基丙烯酸酯1.29g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.11g、接枝率70％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为178毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例19的阳离子交换膜12。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.109和0.891。
实施例19中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.99％、聚集体(2)的比率为2.31％、单体的比率为94.70％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜12接触。所加入的量为22mL(5.33mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜12。通过流通工序和洗涤工序回收32mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例20)
实施例20中，使用以下说明的阳离子交换膜13。阳离子交换膜13如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.69g、乙二醇二甲基丙烯酸酯1.17g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.16g、接枝率70％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为176毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例20的阳离子交换膜13。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.105和0.895。
实施例20中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.48％、聚集体(2)的比率为2.24％、单体的比率为95.29％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜13接触。所加入的量为22mL(5.70mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜13。通过流通工序和洗涤工序回收32mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例21)
实施例21中，使用以下说明的阳离子交换膜14。阳离子交换膜14如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.50g、二甘醇二甲基丙烯酸酯1.36g、甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.16g、接枝率70％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为176毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例21的阳离子交换膜14。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.105和0.895。
实施例21中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.73％、聚集体(2)的比率为2.10％、单体的比率为95.16％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜14接触。所加入的量为40mL(5.52mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜14。通过流通工序和洗涤工序回收50mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例22)
实施例22中，使用以下说明的阳离子交换膜15。阳离子交换膜15如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯3.08g、甲基丙烯酸丁酯1.54g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径2.0mm、内径1.1mm、平均孔径0.45μm的聚偏二氟乙烯多孔中空纤维5.80g(15cm、30根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到8.36g、接枝率46％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为227毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.11mL)，形成实施例22的阳离子交换膜15。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.115和0.885。
实施例22中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为3.14％、聚集体(2)的比率为2.03％、单体的比率为94.82％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜15接触。所加入的量为10mL(5.53mg/mL的浓度)、流速为0.7mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)5mL洗涤阳离子交换膜15。通过流通工序和洗涤工序回收15mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例23)
实施例23中，使用以下说明的阳离子交换膜15。阳离子交换膜16如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯3.85g、甲基丙烯酸丁酯0.77g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径2.0mm、内径1.1mm、平均孔径0.45μm的聚偏二氟乙烯多孔中空纤维5.80g(15cm、30根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到8.26g、接枝率44％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为198毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.11mL)，形成实施例23的阳离子交换膜16。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.104和0.896。
实施例23中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为4.41％、聚集体(2)的比率为2.16％、单体的比率为93.43％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜16接触。所加入的量为18mL(5.53mg/mL的浓度)、流速为0.7mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速0.7mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)5mL洗涤阳离子交换膜16。通过流通工序和洗涤工序回收23mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例24)
实施例24中，使用以下说明的阳离子交换膜17。阳离子交换膜17如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯4.62g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径2.0mm、内径1.1mm、平均孔径0.45μm的聚偏二氟乙烯多孔中空纤维5.80g(15cm、30根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到7.99g、接枝率39％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为214毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.11mL)，形成实施例24的阳离子交换膜17。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.126和0.874。
实施例24中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.42％、聚集体(2)的比率为1.77％、单体的比率为95.81％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜17接触。所加入的量为18mL(5.64mg/mL的浓度)、流速为0.2mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速0.2mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)5mL洗涤阳离子交换膜17。通过流通工序和洗涤工序回收23mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例25)
实施例25中，使用以下说明的阳离子交换膜17。阳离子交换膜18如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯3.85g、甲基丙烯酸丁酯0.77g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径2.0mm、内径1.1mm、平均孔径0.65μm的聚偏二氟乙烯多孔中空纤维5.80g(15cm、30根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到8.29g、接枝率43％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为209毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.11mL)，形成实施例25的阳离子交换膜18。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.108和0.892。
实施例25中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.96％、聚集体(2)的比率为2.01％、单体的比率为95.03％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜18接触。所加入的量为18mL(5.61mg/mL的浓度)、流速为0.7mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速0.7mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)5mL洗涤阳离子交换膜18。通过流通工序和洗涤工序回收23mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例26)
实施例26中，使用以下说明的阳离子交换膜19。阳离子交换膜19如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯4.62g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径2.0mm、内径1.1mm、平均孔径0.65μm的聚偏二氟乙烯多孔中空纤维5.80g(15cm、30根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到8.17g、接枝率41％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为223毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.11mL)，形成实施例26的阳离子交换膜19。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.127和0.873。
实施例26中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.83％、聚集体(2)的比率为1.96％、单体的比率为95.21％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜19接触。所加入的量为18mL(5.69mg/mL的浓度)、流速为0.7mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速0.7mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)5mL洗涤阳离子交换膜19。通过流通工序和洗涤工序回收23mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例27)
实施例27中，使用以下说明的阳离子交换膜20。阳离子交换膜20如下所述合成。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯2.99g、二甘醇二甲基丙烯酸酯1.63g、甲基丙烯酸0.57g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径2.0mm、内径1.1mm、平均孔径0.65μm的聚偏二氟乙烯多孔中空纤维5.80g(15cm、30根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到8.42g、接枝率45％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为241毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.11mL)，形成实施例27的阳离子交换膜20。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.119和0.881。
实施例27中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.54％、聚集体(2)的比率为1.93％、单体的比率为95.53％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜20接触。所加入的量为18mL(5.51mg/mL的浓度)、流速为0.7mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速0.7mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)5mL洗涤阳离子交换膜20。通过流通工序和洗涤工序回收23mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例28)
实施例28中，使用以下说明的阳离子交换膜20。阳离子交换膜21如下所述合成。将N-异丙基丙烯酰胺3.09g、甲基丙烯酸丁酯1.29g、甲基丙烯酸缩水甘油酯0.51g、甲基丙烯酸叔丁酯0.26g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.12g、接枝率71％的阳离子交换膜前体。
将通过辐射线接枝聚合法导入有接枝链的中空纤维投入到亚硫酸钠和IPA的混合水溶液(亚硫酸钠/IPA/纯水＝10/15/75wt％)200g，80℃下进行24小时反应，接枝链中的环氧基转换为磺酸基。反应后，用纯水洗涤该中空纤维。然后，将该中空纤维投入到0.5摩尔/L硫酸中，80℃下进行2小时反应，由此残留于接枝链中的环氧基转换为二醇基。进而，在140mL的氯仿中，与4mL的甲磺酸反应，将叔丁基脱保护，转换为羧基。
用与实施例1相同的方法，测定膜体积和全部阳离子交换基团密度，结果为1.0mL、49毫摩尔/L。
磺酸基密度通过以下的方法求出。浸渍于1摩尔/L的盐酸1小时，将磺酸全部氢化。用纯水洗涤，去除盐酸后，加入1摩尔/L氯化钠水溶液10mL，溶出氯化氢。放置1小时后，回收含有氯化氢的氯化钠水溶液。进而加入1摩尔/L氯化钠水溶液10mL，放置1小时，进行回收，由此回收残留于膜内的氯化氢。将回收物合并，使用0.01摩尔/L氢氧化钠水溶液进行滴定，结果中和需要2.09mL。空白为0.29mL，因此可知膜所具有的磺酸基为18微摩尔。将其除以膜体积则为18毫摩尔/L。羧基可以通过由全部阳离子交换基团密度减去磺酸基密度来求出，为31毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成实施例28的阳离子交换膜21。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.047和0.953。
实施例28中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH 6.0)、聚集体(1)的比率为2.80％、聚集体(2)的比率为3.21％、单体的比率为93.99％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜21接触。所加入的量为20mL(4.99mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH 6.0)10mL洗涤阳离子交换膜21。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(实施例29)
实施例29中，使用阳离子交换膜21和以下说明的抗体溶液。实施例29中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为1.77％、聚集体(2)的比率为1.78％、单体的比率为96.44％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜21接触。所加入的量为20mL(4.74mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜21。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果聚集体成分的含量减少。结果如图3所示。
(比较例1)
比较例1中，使用以下说明的阳离子交换基团密度不足30毫摩尔/L的阳离子交换膜22。阳离子交换膜22如下所述合成。将N-异丙基丙烯酰胺3.09g、甲基丙烯酸丁酯1.86g、甲基丙烯酸0.2g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.22g、接枝率74％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为27毫摩尔/L、为低于30毫摩尔/L的密度。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.017和0.983。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成比较例1的阳离子交换膜22。
比较例1中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.27％、聚集体(2)的比率为1.86％、单体的比率为95.87％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜22接触。所加入的量为20mL(5.13mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜22。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果虽然聚集体成分的含量减少，但是比实施例1多。结果如图3所示。
(比较例2)
比较例2中，使用以下说明的阳离子交换基团密度不足30毫摩尔/L的仅具有强阳离子交换基团的阳离子交换膜23。阳离子交换膜23如下所述合成。将N-异丙基丙烯酰胺3.6g、甲基丙烯酸丁酯1.8g、甲基丙烯酸缩水甘油酯0.6g溶解于50体积％叔丁醇水溶液280mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径3.0mm、内径2.0mm、平均孔径0.25μm的聚乙烯多孔中空纤维3.00g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线200kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到5.11g、接枝率70％的阳离子交换膜前体。
将通过辐射线接枝聚合法导入有接枝链的中空纤维投入到亚硫酸钠和IPA的混合水溶液(亚硫酸钠/IPA/纯水＝10/15/75wt％)200g，80℃下进行24小时反应，接枝链中的环氧基转换为磺酸基。反应后，用纯水洗涤该中空纤维。然后，将该中空纤维投入到0.5摩尔/L硫酸中，80℃下进行2小时反应，由此残留于接枝链中的环氧基转换为二醇基。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为18毫摩尔/L、为低于30毫摩尔/L的密度。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为0.03和0.97。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成比较例2的阳离子交换膜23。
比较例2中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH 6.0)、聚集体(1)的比率为2.03％、聚集体(2)的比率为2.06％、单体的比率为95.91％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜23接触。所加入的量为50mL(4.80mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH 6.0)10mL洗涤阳离子交换膜23。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果虽然聚集体成分的含量减少，但是比实施例多，处理容量多时聚集体去除性能不充分。结果如图3所示。
(比较例3)
比较例3中，使用以下说明的、均聚物被固定于膜状基材表面的阳离子交换膜24。阳离子交换膜24如下所述合成。将甲基丙烯酸0.51g溶解于50体积％叔丁醇水溶液240mL，鼓入氮气30分钟，用作反应液。将外径2.0mm、内径1.1mm、平均孔径0.65μm的聚偏二氟乙烯多孔中空纤维3.0g(15cm、15根)装入到密闭容器，用氮气置换容器内的空气。然后，由容器的外侧用干冰冷却的同时，照射γ射线25kGy，产生自由基。将所得到的具有自由基的聚乙烯多孔中空纤维转移到玻璃容器，减压到200Pa以下，由此去除反应管内的氧。向其中导入调整到40℃的上述反应液140mL，静置16小时。然后，用甲醇洗涤中空纤维，在真空干燥机中进行真空干燥，得到3.28g、接枝率9％的阳离子交换膜。与实施例1同样地进行测定，阳离子交换基团密度为183毫摩尔/L。将其组件化(膜体积0.25mL)，形成比较例3的阳离子交换膜24。另外，阳离子交换基团单体和中性单体的质量比率分别为1.0和0。
比较例3中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为2.12％、聚集体(2)的比率为2.31％、单体的比率为95.57％。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)的抗体溶液与阳离子交换膜24接触。所加入的量为20mL(5.15mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜24。通过流通工序和洗涤工序回收30mL的溶液。将所回收的溶液施加于尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)，结果虽然聚集体成分的含量减少，但是比其它实施例多。结果如图3所示。
(实施例30)
实施例30示出在利用阳离子交换色谱载体进行流通纯化后，利用阴离子交换色谱载体进行流通纯化，由此使杂质降低的例子。
(阳离子交换色谱工序)
实施例30的阳离子交换工序中，使用阳离子交换膜10。实施例30中使用的抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为1.05％、聚集体(2)的比率为1.13％、单体的比率为97.82％。另外，HCP的含量为350ppm、蛋白A的含量为3ppm。
HCP使用CYGNUS TECHNOLOGIES公司的CHINESE HAMSTER OVARY Host CellProteins-3rd Generation ELISA kit，蛋白A使用THCHNOLOGIES公司的PROTEIN A ELISAkit，通过UV测定进行定量。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)以及HCP、蛋白A的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.45mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图4所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例30的阴离子交换工序中，使用体积1mL的Capto Q(GE HEALTHCARE)。向阳离子交换工序中回收的抗体溶液中加入1摩尔/L的Tris缓冲液，使得pH为7.8，与Capto Q接触。所加入的量为50mL(4.01mg/mL的浓度)、流速为1.0mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.0mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.8)5mL洗涤Capto Q。通过流通工序和洗涤工序回收55mL的抗体溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图4所示。
(实施例31)
实施例31示出在利用阴离子交换色谱载体进行流通纯化后，利用阳离子交换色谱载体进行流通纯化，由此使杂质降低的例子。
(阴离子交换色谱工序)
实施例31的阴离子交换工序中，使用体积1mL的Capto Q(GE HEALTHCARE)。抗体溶液为15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.8)、聚集体(1)的比率为0.42％、聚集体(2)的比率为1.14％、单体的比率为98.44％。另外，HCP的含量为306ppm、蛋白A的含量为3ppm。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)以及HCP、蛋白A的抗体溶液与体积1mL的Capto Q接触。所加入的量为50mL(6.28mg/mL的浓度)、流速为1.0mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.0mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.8)5mL洗涤Capto Q。通过流通工序和洗涤工序回收55mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图4所示。
(阳离子交换色谱工序)
实施例31的阳离子交换工序中，使用阳离子交换膜10。向阴离子交换工序中回收的抗体溶液中加入0.1摩尔/L的盐酸，使得pH为7，与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(4.65mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的抗体溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：SizeExclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图4所示。
(实施例32)
实施例32示出在利用阳离子交换色谱载体进行纯化后，利用阴离子交换色谱载体进行流通纯化，由此使杂质降低的例子。
(阳离子交换色谱工序)
实施例32的阳离子交换工序中，使用阳离子交换膜10。抗体溶液为15毫摩尔/LTris缓冲液(pH 7.0)、聚集体(1)的比率为0.91％、聚集体(2)的比率为1.32％、单体的比率为97.77％。另外，HCP的含量为390ppm、蛋白A的含量为3ppm。
使得含有抗体蛋白质的聚集体成分(杂质)和单体成分(目的的生理活性物质)以及HCP、蛋白A的抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所加入的量为50mL(5.33mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL/分钟流通的25℃的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.0)10mL洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收60mL的溶液。进一步重复同样的操作5次，将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：SizeExclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图4所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例32的阴离子交换工序中，使用0.25mL的QyuSpeed D(Asahi Kasei MedicalCo.,Ltd)。向阳离子交换工序中回收的抗体溶液中加入1摩尔/L的Tris缓冲液，使得pH为7.8，使其与QyuSpeed D接触。所加入的量为310mL(3.80mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，用以流速1.5mL流通的15毫摩尔/L Tris缓冲液(pH 7.8)10mL洗涤QyuSpeed D。通过流通工序和洗涤工序回收320mL的抗体溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(pHSEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图4所示。
(实施例33)
实施例33中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱这一系列纯化工序。
(亲和色谱工序)
实施例33的亲和色谱工序中，以流速4mL/分钟(300cm/小时)进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL将填充有MabselectSure 16mL的柱子平衡化，添加含有抗体的培养上清液2.5L，吸附抗体。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL，进而流通Tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/L(pH 8.0))48mL进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH3.4)80mL，由柱子洗脱抗体。向洗脱液中加入1摩尔/L Tris缓冲液，将pH调整为7.0，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有1.7mS/cm的电导率。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阳离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.72％、聚集体(2)的比率为1.04％、单体的比率为98.24％。另外，HCP的含量为298ppm、蛋白A的含量为3ppm。
(阳离子交换色谱工序)
实施例33的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。施加到阳离子交换膜10的抗体溶液的量为82mL(3.67mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向阳离子交换膜10流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.0)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收92mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例33的阴离子交换工序中，使用体积1mL的Capto Q(GE HEALTHCARE)。向阳离子交换工序中回收的抗体溶液加入1摩尔/L的Tris缓冲液，使得pH为7.8，结果电导率为1.8mS/cm。然后使得抗体溶液与Capto Q接触。施加到Capto Q的抗体溶液的量为82mL(2.96mg/mL的浓度)、流速为1.0mL/分钟、温度为25℃。向Capto Q流通抗体溶液后，以流速1.0mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.8)5mL，洗涤Capto Q。通过流通工序和洗涤工序回收总计87mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：SizeExclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(实施例34)
实施例34中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阴离子交换色谱和阳离子交换色谱这一系列纯化工序。
(亲和色谱工序)
实施例34的亲和色谱工序中，以流速4mL/分钟(300cm/小时)进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL将填充有MabselectSure 16mL的柱子平衡化，添加含有抗体的培养上清液2.5L，吸附抗体。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL，进而流通Tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/L(pH 8.0))48mL进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH3.4)80mL，由柱子洗脱抗体。向洗脱液中加入1摩尔/L Tris缓冲液，将pH调整为7.8，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液的电导率为1.8mS/cm。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阴离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.83％、聚集体(2)的比率为1.12％、单体的比率为98.05％。另外，HCP的含量为317ppm、蛋白A的含量为3ppm。
(阴离子交换色谱工序)
实施例34的阴离子交换工序中，使用体积1mL的Capto Q(GE HEALTHCARE)，纯化抗体溶液。施加到Capto Q的抗体溶液的量为81mL(3.72mg/mL的浓度)、流速为1.0mL/分钟、温度为25℃。向Capto Q流通抗体溶液后，以流速1.0mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.8)5mL，洗涤Capto Q。通过流通工序和洗涤工序回收总计86mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阳离子交换色谱工序)
实施例34的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。向阴离子交换工序中回收的抗体溶液中加入乙酸，将pH调整为7.0，结果电导率为1.9mS/cm。然后，使其与阳离子交换膜10接触。所施加的抗体溶液的量为80mL(3.33mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向阳离子交换膜10流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.0)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收总计90mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(实施例35)
实施例35中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱这一系列纯化工序。
(亲和色谱工序)
实施例35的亲和色谱工序中，以流速4mL/分钟(300cm/小时)进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL将填充有MabselectSure 16mL的柱子平衡化，添加含有抗体的培养上清液2.5L，吸附抗体。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL，进而流通Tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/L(pH 8.0))48mL进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH3.4)80mL，由柱子洗脱抗体。向洗脱液中加入1摩尔/L Tris缓冲液，将pH调整为7.0，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有1.7mS/cm的电导率。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阳离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.79％、聚集体(2)的比率为1.16％、单体的比率为98.05％。另外，HCP的含量为390ppm、蛋白A的含量为3ppm。
(阳离子交换色谱工序)
实施例35的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。所施加的抗体溶液的量为82mL(3.71mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向阳离子交换膜10流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.0)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收总计92mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例35的阴离子交换工序中，使用体积0.25mL的QyuSpeed D(Asahi KaseiMedical Co.,Ltd)。向阳离子交换工序中回收的抗体溶液加入1摩尔/L的Tris缓冲液，使得pH为7.8，结果电导率为1.8mS/cm。然后使得抗体溶液与QyuSpeed D接触。施加到QyuSpeedD的抗体溶液的量为82mL(2.99mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向QyuSpeedD流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.8)10mL，洗涤QyuSpeed D。通过流通工序和洗涤工序回收总计92mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(实施例36)
实施例36中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阴离子交换色谱和阳离子交换色谱这一系列纯化工序。
(亲和色谱工序)
实施例36的亲和色谱工序中，以流速4mL/分钟(300cm/小时)进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL将填充有MabselectSure 16mL的柱子平衡化，添加含有抗体的培养上清液2.5L，吸附抗体。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))80mL，进而流通Tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/L(pH 8.0))48mL进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH3.4)80mL，由柱子洗脱抗体。向洗脱液中加入1摩尔/L Tris缓冲液，将pH调整为7.8，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液的电导率为1.8mS/cm。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阴离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.78％、聚集体(2)的比率为1.21％、单体的比率为98.01％。另外，HCP的含量为365ppm、蛋白A的含量为3ppm。
(阴离子交换色谱工序)
实施例36的阴离子交换工序中，使用体积0.25mL的QyuSpeed D(Asahi KaseiMedical Co.,Ltd)。施加到QyuSpeed D的抗体溶液的量为80mL(3.69mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向QyuSpeed D流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.8)10mL，洗涤QyuSpeed D。通过流通工序和洗涤工序回收总计90mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阳离子交换色谱工序)
实施例36的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。向阴离子交换工序中回收的抗体溶液中加入乙酸，将pH调整为7.0，结果电导率为1.9mS/cm。然后使得抗体溶液与阳离子交换膜10接触。所施加的抗体溶液的量为80mL(3.17mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.0)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收总计90mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(实施例37)
实施例37中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱这一系列纯化工序。阴离子交换色谱工序中，单位体积的载体负载4g以上的抗体。
(亲和色谱工序)
实施例37的亲和色谱工序中，以流速20mL/分钟(230cm/小时)进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))300mL将填充有MabselectSure 58mL的柱子平衡化，添加含有抗体的培养上清液7L，吸附抗体。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))300mL，进而流通Tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/L(pH 8.0))180mL进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH3.4)360mL，由柱子洗脱抗体。向洗脱液中加入1摩尔/L Tris缓冲液，将pH调整为7.0，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有1.7mS/cm的电导率。相同操作全部进行2次，合并各洗脱液。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阳离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.56％、聚集体(2)的比率为1.79％、单体的比率为97.65％。另外，HCP的含量为349ppm、蛋白A的含量为4ppm。
(阳离子交换色谱工序)
实施例37的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。所施加的抗体溶液的量为100mL(2.60mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向阳离子交换膜10流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.0)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收总计110mL的溶液。相同操作全部进行5次，合并所回收的溶液，通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例37的阴离子交换工序中，使用体积0.25mL的QyuSpeed D(Asahi KaseiMedical Co.,Ltd)。向阳离子交换工序中回收的抗体溶液中加入1摩尔/L的Tris缓冲液，使得pH为7.8，结果电导率为1.8mS/cm。然后使得抗体溶液与QyuSpeed D接触。施加到QyuSpeed D的抗体溶液的量为500mL(2.08mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向QyuSpeed D流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH7.8)10mL，洗涤QyuSpeed D。通过流通工序和洗涤工序回收总计510mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(实施例38)
实施例38中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱这一系列纯化工序。另外，在阳离子交换工序和阴离子交换工序之间不进行pH调整的操作。
(亲和色谱工序)
实施例38的亲和色谱工序中，以流速20mL/分钟(230cm/小时)进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))300mL将填充有MabselectSure 58mL的柱子平衡化，添加含有抗体的培养上清液7L，吸附抗体。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))300mL，进而流通Tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/L(pH 8.0))180mL进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH3.4)360mL，由柱子洗脱抗体。向洗脱液中加入1摩尔/L Tris缓冲液，将pH调整为7.0，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有1.7mS/cm的电导率。相同操作全部进行2次，合并各洗脱液。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阳离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.99％、聚集体(2)的比率为0.98％、单体的比率为98.03％。另外，HCP的含量为306ppm、蛋白A的含量为2ppm。
(阳离子交换色谱工序)
实施例38的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。所施加的抗体溶液的量为120mL(2.40mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向阳离子交换膜10流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.0)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收总计130mL的溶液。相同操作全部进行5次，合并所回收的溶液，通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例38的阴离子交换工序中，使用体积0.25mL的QyuSpeed D(Asahi KaseiMedical Co.,Ltd)。使得阳离子交换工序中回收的抗体溶液与QyuSpeed D接触。施加到QyuSpeed D的抗体溶液的量为480mL(1.95mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向QyuSpeed D流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH7.0)10mL，洗涤QyuSpeed D。通过流通工序和洗涤工序回收总计490mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(实施例39)
实施例39中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱这一系列纯化工序。另外，在阳离子交换工序和阴离子交换工序之间不进行pH调整的操作。
(亲和色谱工序)
实施例39的亲和色谱工序中，以流速20mL/分钟(230cm/小时)进行操作。首先用磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))300mL将填充有MabselectSure 58mL的柱子平衡化，添加含有抗体的培养上清液7L，吸附抗体。接着流通磷酸盐缓冲液(20毫摩尔/L磷酸钠+150毫摩尔/L NaCl(pH 8.0))300mL，进而流通Tris/乙酸缓冲液(100毫摩尔/L(pH 8.0))180mL进行洗涤后，作为洗脱液，流通25毫摩尔/L乙酸缓冲液(pH3.4)360mL，由柱子洗脱抗体。向洗脱液的一部分加入1摩尔/L Tris缓冲液，将pH调整为7.5，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有2.2mS/cm的电导率。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阳离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.50％、聚集体(2)的比率为0.91％、单体的比率为98.59％。另外，HCP的含量为443ppm、蛋白A的含量为1ppm。
(阳离子交换色谱工序)
实施例39的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。所施加的抗体溶液的量为130mL(2.08mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向阳离子交换膜10流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 7.5)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收总计140mL的溶液。将所得到的抗体溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例39的阴离子交换工序中，使用体积0.25mL的QyuSpeed D(Asahi KaseiMedical Co.,Ltd)。使得阳离子交换工序中回收的抗体溶液与QyuSpeed D接触。施加到QyuSpeed D的抗体溶液的量为125mL(1.79mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向QyuSpeed D流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH7.5)10mL，洗涤QyuSpeed D。通过流通工序和洗涤工序回收总计135mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(实施例40)
实施例40中，作为抗体蛋白质，使用含有AE6F4抗体(人单克隆抗体)0.163g/L的培养上清液，不进行缓冲液交换地进行亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱这一系列纯化工序。另外，在阳离子交换工序和阴离子交换工序之间不进行pH调整的操作。
(亲和色谱工序)
实施例40中，向实施例39的亲和色谱工序中得到的洗脱液的一部分加入1摩尔/LTris缓冲液，将pH调整为8.0，得到抗体溶液。所得到的抗体溶液具有2.3mS/cm的电导率。通过和溶液组成与所得到的抗体溶液相同的、含有大量的聚集体的抗体溶液混合，调整后述的阳离子交换色谱工序中使用的抗体溶液。抗体溶液的聚集体(1)的比率为0.64％、聚集体(2)的比率为1.08％、单体的比率为98.28％。另外，HCP的含量为588ppm、蛋白A的含量为2ppm。
(阳离子交换色谱工序)
实施例40的阳离子交换色谱工序中，使用阳离子交换膜10。所施加的抗体溶液的量为130mL(2.05mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向阳离子交换膜10流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH 8.0)10mL，洗涤阳离子交换膜10。通过流通工序和洗涤工序回收总计140mL的溶液。将所得到的抗体溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。
(阴离子交换色谱工序)
实施例40的阴离子交换工序中，使用体积0.25mL的QyuSpeed D(Asahi KaseiMedical Co.,Ltd)。使得阳离子交换工序中回收的抗体溶液与QyuSpeed D接触。施加到QyuSpeed D的抗体溶液的量为125mL(1.75mg/mL的浓度)、流速为1.5mL/分钟、温度为25℃。向QyuSpeed D流通抗体溶液后，以流速1.5mL/分钟流通组成与抗体溶液相同的缓冲液(pH8.0)10mL，洗涤QyuSpeed D。通过流通工序和洗涤工序回收总计135mL的溶液。将所回收的溶液通过尺寸排阻色谱(SEC：Size Exclusion Chromatography)和ELISA进行分析，结果聚集体成分、HCP和蛋白A的含量减少。结果如图5所示。

Claims (45)

1.一种阳离子交换色谱载体，其为具备膜状基材、和固定于所述膜状基材的表面的共聚物的阳离子交换色谱载体，所述共聚物含有(甲基)丙烯酰胺类化合物和/或(甲基)丙烯酸酯类化合物作为单体单元，单位体积的该载体以高于30毫摩尔/L的密度具有一种或多种阳离子交换基团，所述阳离子交换基团至少含有弱阳离子交换基团。
2.根据权利要求1所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物中，具有所述阳离子交换基团的单体单元以外的单体单元为不带电荷的中性单体，所述中性单体为疏水性单体单元和/或亲水性单体单元。
3.根据权利要求1或2所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物含有至少一种疏水性单体单元作为单体单元。
4.根据权利要求2或3所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述疏水性单体单元具有碳数为4以上的直链或支链状的烷基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述弱阳离子交换基团源自丙烯酸单体、甲基丙烯酸单体、丙烯酸化合物单体和甲基丙烯酸化合物单体中的任意种。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述弱阳离子交换基团源自甲基丙烯酸单体。
7.根据权利要求2～6中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物中，所述疏水性单体单元和/或所述亲水性单体单元的质量比率高于所述阳离子交换基团单体单元的质量比率。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述一种或多种阳离子交换基团仅包含弱阳离子交换基团。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述一种或多种阳离子交换基团为弱阳离子交换基团和强阳离子交换基团的混合。
10.根据权利要求9所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述强阳离子交换基团为磺酸基。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物通过共价键合而固定于所述膜状基材的表面。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物含有所述(甲基)丙烯酰胺类化合物作为亲水性单体单元。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物含有异丙基丙烯酰胺作为亲水性单体单元。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物含有所述(甲基)丙烯酸酯类化合物作为亲水性单体单元。
15.根据权利要求1～11、14中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物含有甲基丙烯酸2-羟基乙酯作为亲水性单体单元。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述膜状基材含有聚乙烯。
17.根据权利要求16所述的阳离子交换色谱载体，其中，接枝聚合于所述膜状基材的所述共聚物的接枝率为20～200％。
18.根据权利要求1～15中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述膜状基材为聚偏二氟乙烯。
19.根据权利要求18所述的阳离子交换色谱载体，其中，接枝聚合于所述膜状基材的所述共聚物的接枝率为5～100％。
20.根据权利要求1～19中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物实质上不具有交联结构。
21.根据权利要求1～20中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述共聚物包含含有两个以上聚合性官能团的单体单元。
22.根据权利要求21所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述聚合性官能团源自(甲基)丙烯酰胺或(甲基)丙烯酸酯。
23.一种权利要求1～22中任一项所述的生物体分子纯化用的阳离子交换色谱载体。
24.根据权利要求23所述的阳离子交换色谱载体，其中，所述生物体分子为抗体。
25.根据权利要求1～24中任一项所述的阳离子交换色谱载体，其中，相对于载体1mL，将含有单体和聚集体的抗体100mg进行流通纯化时，聚集体比率降低50％以上。
26.一种从含有杂质和生理活性物质的混合溶液纯化所述生理活性物质的纯化方法，其使所述混合溶液接触权利要求1～25中任一项所述的阳离子交换色谱载体，得到纯度提高了的生理活性物质。
27.根据权利要求26所述的纯化方法，其中，纯化方法为流通式。
28.根据权利要求26或27所述的纯化方法，其中，生理活性物质的回收率为80％以上。
29.根据权利要求26～28中任一项所述的纯化方法，其中，所述生理活性物质为抗体蛋白质的单体。
30.根据权利要求29所述的纯化方法，其中，所述杂质含有所述抗体蛋白质的二聚体以上的聚集体。
31.根据权利要求26～30中任一项所述的纯化方法，其中，在利用所述阳离子交换色谱载体进行的纯化工序之前或之后使用阴离子交换色谱载体进行纯化。
32.根据权利要求31所述的纯化方法，其中，所述阴离子交换色谱载体为膜状。
33.根据权利要求31或32所述的纯化方法，其中，所述阴离子交换色谱载体为在基材上具有接枝聚合物的结构。
34.根据权利要求31～33所述的纯化方法，其中，利用所述阴离子交换色谱载体进行的纯化为流通式。
35.根据权利要求31～34中任一项所述的纯化方法，其中，在利用所述阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用所述阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间不进行缓冲液交换。
36.根据权利要求31～35中任一项所述的纯化方法，其中，利用所述阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用所述阴离子交换色谱载体进行的纯化工序是连续的。
37.根据权利要求31～36中任一项所述的纯化方法，其中，在利用所述阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用所述阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间，加入酸或碱，由此使得缓冲液的氢离子指数变化。
38.根据权利要求32～37中任一项所述的纯化方法，其在利用所述阳离子交换色谱载体进行的纯化工序、和利用所述阴离子交换色谱载体进行的纯化工序之间具有使得电导率变化0.01mS/cm以上的工序。
39.根据权利要求26～38中任一项所述的纯化方法，其在利用所述阳离子交换色谱载体进行的纯化工序之前具有利用亲和色谱进行的纯化工序。
40.根据权利要求39所述的纯化方法，其中，所述亲和色谱工序中的所述生理活性物质的洗脱后，不进行缓冲液交换。
41.根据权利要求39或40所述的纯化方法，其中，所述亲和色谱工序中的所述生理活性物质的洗脱所使用的洗脱缓冲液的主要成分为一元酸。
42.根据权利要求39～41中任一项所述的纯化方法，其中，所述亲和色谱工序中的所述生理活性物质的洗脱所使用的洗脱缓冲液为乙酸缓冲液。
43.根据权利要求39～42中任一项所述的纯化方法，其中，所述亲和色谱工序中的所述生理活性物质的洗脱所使用的洗脱缓冲液的电导率为10mS/cm以下。
44.根据权利要求39～43中任一项所述的纯化方法，其中，在所述亲和色谱工序之后，通过酸性处理进行病毒灭活。
45.根据权利要求39～44中任一项所述的纯化方法，其中，在所述亲和色谱工序之后，加入碱，由此进行含有所述生理活性物质的洗脱液的氢离子指数的调整。
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