CN106496329A - 一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种带有重组的胶原蛋白结合结构域的融合蛋白，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2所示。本发明的融合蛋白为溶液制剂，可用于制备抗肿瘤药物，通过局部瘤内注射的方式给药，一次性给足治疗剂量。本发明的融合蛋白中，由胶原结合结构域CBD所形成的局部的缓释系统，很好的避免了IFN‑γ扩散到周围组织所引起的强烈的免疫应答。同时无需重复多次给药，这既减少了多次给药所造成的创伤给病人带来的痛苦及反复多次用药所耗费的巨大的治疗费用，同时又降低大剂量频繁用药所引起的毒副作用。

Description

一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及含有基质金属蛋白酶（MMP2）的胶原蛋白结合结构域（collagen binding domain, CBD）的和伽马干扰素（IFN-γ）活性结构域的重组蛋白及其融合蛋白，特别是具有多重活性的融合蛋白。

背景技术

肿瘤是世界范围导致疾病和死亡的首要原因之一。它严重威胁着人类的健康，也引起了人们的高度关注。过去的20多年间，大量的研究聚焦在肿瘤进展中所涉及到的肿瘤的发生与信号通路之间的相关分子事件。研究发现肿瘤细胞与肿瘤微环境之间复杂的相互作用的分子机制在肿瘤的进展中发挥了重要的作用。同时40多年的研究表明有大量的证据支持细胞外基质重塑蛋白酶如基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs)，是主要的癌症进展中微环境变化的调节者。MMPs也被认为是多种不同肿瘤不同发展阶段的一个潜在性的诊断和预后指标。基于MMP在肿瘤的发生发展中所起的重要作用，设计合成出能够抑制某种MMPs活性位点特异性结合并且与其它的MMPs没有一点交叉反应的抑制剂或单克隆抗体就显得相当必要。目前，MMP的多种抑制剂在实验中均表现出不同程度的抗肿瘤活性，但在临床试验中均以治疗效果不佳而宣告失败。

为了尽可能地克服抑制剂设计的这个难题，就需要找到一个相关的在底物结合位点发挥作用的物质，它定位于活性位点外，却是水解过程中外部定位必须的物质分子。而大量的研究证据表明特异性的外部物质结合位点定位于催化位点之外，是基质金属蛋白酶定位水解物质分子必不可少的。因此，可以阻断外部物质介导的相互作用的物质作为高度选择性的MMP抑制剂将是较好的选择。而MMP2的CBD就正好符合上述特点。有研究报道称CBD与配体结合的相互作用的大量特征表明CBD几乎负责了MMP2与胶原结合的所有特性。而在多种病理状态下包括肿瘤、炎症、感染性疾病、脑血管疾病的退化性疾病发现明胶酶活性增加。明胶酶主要分为明胶酶A和明胶酶B，其中明胶酶A主要是指 MM2，明胶酶B主要是指MMP9。虽然MMP-2和MMP-9这两个明胶酶在许多方面有共同之处，但据文献报道只有MMP2的CBD被报道能够有效的与IV型胶原结合，并能够结合一些天然和变性胶原类型，以及弹性蛋白和肝素。而且，CBD介导的结合酶底物和其它细胞外基质分子是MMP-2和细胞迁移两者发挥正常功能必不可少的要素。

因此，如果能将与体内MMP2的CBD完全相同的蛋白分离出来，并置于体内胶原含量丰富且发生由MMP上调引起如肿瘤的侵袭和转移的病理状况的部位，与体内的CBD竞争性地结合相同的胶原结合位点，那么上调的MMP就不能引起相应的病理状态，在肿瘤的发生过程中就能抑制相应的侵袭和转移。而且如果此时再在局部加以细胞因子进行刺激，一方面能增强肿瘤局部的免疫应答同时又有直接杀伤肿瘤的效果，那么肿瘤的发生和转移很可能就被完全抑制了。

干扰素(IFN-γ)主要由T细胞产生，结构由一段分泌肽和一个活性结构域组成，在分泌出细胞的过程中分泌肽被剪切掉，形成成熟的IFN-γ。IFN-γ具有直接抑制肿瘤细胞增殖，增加表面MHC抗原和肿瘤坏死因子表达，抗肿瘤血管生成等多种抗肿瘤作用。20世纪70年代起科学家开始探索干扰素的基因工程生产。1993年，美国FDA 批准基因工程IFN-γ投放市场。随着国产基因工程干扰素的不断上市，在临床上的应用逐渐增多，收到了较好的疗效。但是，由于IFN-γ分子量较小，易被肾小球滤过，而临床应用时，一般是肌肉和皮下注射的方式，全身给药，而且血浆半衰期较短，需要大剂量频繁用药，如每周2～3次，而IFN-γ治疗肝炎、肿瘤、多发性硬化症、类风湿等疾病时，治疗周期常常长达数月至数年，这种长期大剂量频繁用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易产生毒副作用如发热（90%的病人会发生）主要是由于IFN-γ是单核／巨噬细胞的重要激活剂，它能够诱发和促进机体局部或全身强烈的炎症反应所引起的，骨髓抑制 、体重减轻、厌食等，严重制约了它的应用。

综上所述，MMP2可以促进肿瘤的发生和发展，但单独的MMP2的CBD可以结合细胞间质的胶原蛋白，同时可以竞争性抑制MMP2对胶原蛋白的降解；IFN-γ的活性结构域具有多重抗肿瘤活性，但也会引起严重的毒副反应。如果将这两种结构融合在一起，并且保证在融合蛋白中保持各自原有的功能和活性，这样的蛋白分子将会对肿瘤的发生、发展起到有效的抑制作用。融合蛋白的设计和实践中，面临多重技术难关，包括：1.如何精确寻找并定位到有医用价值的蛋白质功能结构域；2. 不同结构域的多肽片段可能会相互影响折叠和空间结构，最终导致功能和活性的丧失，如何让两个或个结构域都能保持各自原有的功能和活性，是设计和制备多功能融合蛋白分子的关键所在；3. 不同蛋白值的结构域组合起来后，在发挥各自原有的功能的基础上，如何实现功能有机组合，实现功能协同强化，优、劣势互补，从而达到卓越的治疗效果； 4.正确的设计和适当的实验条件，保证融合蛋白表达出来之后具有稳定性和可溶性，且易于分离纯化。这些技术瓶颈的存在，使得多功能融合蛋白从设计、制备到应用过程中面临重重困难。

本发明，基于大量的科学文献检索、阅读和筛选，找到两个潜在的抗肿瘤活性结构域，利用分子生物学技术设计构建融合蛋白编码序列，采用原核表达技术和蛋白亲和纯化技术表达和纯化。经过开展大量的软件合理预测和实验测试，成功设计和构建了原核表达载体，摸索出能高效表达和纯化出可溶蛋白的实验条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种带有重组的胶原蛋白结合结构域的融合蛋白。一方面，它能够发挥与细胞外基质和基底膜上的胶原蛋白结合结构域结合的作用，从而抑制肿瘤细胞分泌的MMP2的胶原结合位点与胶原的结合，起到抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用；同时又增强了肿瘤局部的IFN-γ浓度，减轻了重组IFN-γ的毒副反应。另一方面，该融合蛋白中的另一成分IFN-γ就能够被滞留在肿瘤局部，既可以发挥直接的肿瘤杀伤效应，又可以增强肿瘤局部机体的免疫应答，减少肿瘤细胞的免疫逃逸。

本发明的另一个目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列。包括与鼠干扰素（IFN-γ）氨基酸mat_peptide序列相同的第一区和与人MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）氨基酸mat_peptide 序列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与鼠IFN-γ氨基酸mat_peptide序列相同，第二区与人MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）氨基酸mat_peptide 序列相同。中间未添加任何连接肽的融合蛋白。正是这样的设计思路，我们所纯化出的融合蛋白在后期的实验探究中，发现它既保留了IFN-γ的所有活性，又保留了CBD域的所有特征，是真正意义上的融合蛋白。

在基因工程菌或基因工程细胞的构建过程中，首先需要获得并扩增表达融合蛋白的基因，我们采用的是PCR法，并采用了重叠延伸 PCR 法。 在大量获得表达融合蛋白的基因后需使用合适的载体将表达的基因转入所选载体中从而构建重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供表达本发明融合蛋白编码基因的宿主。本发明中我们选用的表达宿主为工程菌BL21。

本发明提供的技术方案是：一种带有重组的胶原蛋白结合结构域的融合蛋白，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2所示。

本发明的融合蛋白为溶液制剂，通过局部瘤内注射的方式给药，一次性给足治疗剂量。本发明的融合蛋白中，由胶原结合结构域CBD所形成的局部的缓释系统，很好的避免了IFN-γ扩散到周围组织所引起的强烈的免疫应答。同时无需重复多次给药，这既减少了多次给药所造成的创伤给病人带来的痛苦及反复多次用药所耗费的巨大的治疗费用，同时又降低大剂量频繁用药所引起的毒副作用。

本发明的融合蛋白包括人来源的MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）及鼠来源的IFN-γ。其中人来源的MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）所编码的氨基酸序列与鼠的氨基酸序列对比后，发现所构建的人的MMP-2的CBD的核心结构域与鼠的MMP2的CBD 核心结构域并未发生改变。

在本发明的融合蛋白中，我们去除了IFN-γ的信号肽部分，也去MMP2蛋白分子中除了胶原蛋白结合结构域（CBD）之外的其它部分。

在本发明的融合蛋白中，我们将IFN-γ位于融合蛋白的N-末端，MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）位于融合蛋白的C-末端。在IFN-γ与MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）之间并未引入任何连接肽。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的DNA分子。所述DNA分子的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1所示。

进一步地，本发明提供了包含上述DNA分子的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。本发明的重组表达载体为PET-28(a)+ 质粒。

本发明所述融合蛋白可用于制备抗肿瘤药物。

本发明所用的转化方法为YC转化法，通过抗性标志筛选出阳性菌落，然后再通过菌液PCR或摇菌提质粒酶切鉴定的方法，进一步对成功转化的细菌进行鉴定，最终通过测序，来进行序列的对比，找到氨基酸序列一致的细菌，来进行表达。

在本发明的融合蛋白中，我们采用了异丙基硫代半乳糖苷作为诱导剂进行蛋白的诱导表达，同时也将单独的CBD域和IFN-γ表达出来了。在进行蛋白的诱导表达中，我们知道如果蛋白存在于上清中，就比较容易进行后期的纯化实验。但很不幸地，除了IFN-γ所表达的蛋白质存在于上清中，我们所表达的其余两种蛋白无论采取何种表达方式，换用何种方法，如我们分别探究了不同的诱导时间，不同的诱导浓度和不同的诱导温度对蛋白进行诱导表达，所表达的蛋白始终存在于沉淀中。这就增加了后期纯化的难度。

本发明的融合蛋白中，我们所诱导表达的蛋白是带有6个his标签的，分离纯化时我们借助6个his与镍柱的竞争亲和结合而把目的蛋白分离纯化出来。

在本发明的融合蛋白中，我们所诱导表达出来的蛋白有分泌性的也有以包涵体形式存在的。对以分泌形式表达出来的蛋白一般都具有相应的生物学活性。可以直接上镍柱纯化，透析后冻干，使用时溶解在PBS中即可使用。

对于以包涵体形式存在的蛋白，需经镍柱纯化后还需透析复性处理才能得到有生物活性的蛋白。对此，我们做了一番努力。虽然，在表达的时候我们用了多种方法以使蛋白存在于上清中，但最终都无法逆转存在于沉淀中这一事实。因此，我们做好了各种准备。首先，我们查阅了多种有关蛋白纯化的文献资料，分析了可能会影响表达的包涵体蛋白正确复性的各种因素，总结出了一套自己的有利于蛋白复性的缓冲液系统。其次，对于如何将所提取的包涵体裂解然后过镍柱然后进行进一步的透析复性，我们参考了默克公司的融合蛋白纯化操作手册，采用盐酸胍对包涵体进行变性，通过不同的PH梯度来得到我们所需要的没有活性的蛋白，接着，采用我们总结出的复性缓冲液对蛋白进行了一系列透析复性，经过一系列努力和后续实验的鉴定，我们成功获得了有活性的融合蛋白。

本发明中所采用的复性缓冲液系统如下：

（1）6M尿素缓冲液：0.1M NaH₂P04；0.01M Tris-HCI，6M尿素，PH：7.2。透析12小时～24小时。

（2）复性缓冲液：20mMTris, 2mM GSH, 5mM EDTA and 50mM Glycine，PH8.0。透析24小时～48小时，中间更换一次新的复性缓冲液。

（3） 2M尿素缓冲液：0.1M NaH2P04；0.01M Tris-HCI，2M尿素，PH：7.2。透析12小时。

（4）50mM Tris-HCl缓冲液：50mM Tris，200 mM NaCl,PH:7.4。透析24小时，中间更换一次新的缓冲液。

所有复性过程均在4℃条件下进行。

我们首次将MMP2的胶原蛋白结合结构域（CBD）用于开发抑制肿瘤转移的药物，测试证明CBD能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移作用。融合蛋白CBD-IFN-γ中，CBD和IFN-γ的抑制肿瘤转移的作用发挥了协同作用；另一方面CBD与胶原蛋白的结合作用，又能将融合蛋白CBD-IFN-γ长时间结合在肿瘤微环境的细胞外基质中，从而长时间高浓度地保留在肿瘤局部，即肿瘤组织富含的IV胶原作为融合蛋白CBD-IFN-γ的天然的缓释系统。这不仅大大加强了IFN-γ的抗肿瘤活性，同时还避免IFN-γ的全身大剂量频繁用药所引起的毒副，同时降低了IFN-γ用药量。CBD-IFN-γ的两个结构域之间CBD-IFN-γ在肿瘤局部可以发挥直接的肿瘤细胞杀伤作用、抑制肿瘤血管生成、促进杀伤肿瘤细胞的T细胞活性。

融合蛋白设计的DNA编码序列：

ATG（起始密码）GGCAGCAGC（1#连接序列）CATCATCATCATCATCAC（His标签1）AGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTC（2#连接序列）CACGGCACAGTCATTGAAAGCCTAGAAAGTCTGAATAACTATTTTAACTCAAGTGGCATAGATG TGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGATATCTGGAGGAACTGGCAAAAGGATGGTGACATGAAAATCCTGCAGAGCCAG ATTATCTCTTTCTACCTCAGACTCTTTGAAGTCTTGAAAGACAATCAGGCCATCAGCAACAACATAAGCGTCATTGA ATCACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCAACAGCAAGGCGAAAAAGGATGCATTCATGAGTATTGCCAAGTTTGAGG TCAACAACCCACAGGTCCAGCGCCAAGCATTCAATGAGCTCATCCGAGTGGTCCACCAGCTGTTGCCGGAATCCAGC CTCAGGAAGCGGAAAAGGAGTCGCTGC（选取的IFN活性结构域）GAAGGCCAAGTGGTCCGTGTGAAGTATGG GAACGCCGATGGGGAGTACTGCAAGTTCCCCTTCTTGTTCAATGGCAAGGAGTACAACAGCTGCACTGATACCGGCC GCAGCGATGGCTTCCTCTGGTGCTCCACCACCTACAACTTTGAGAAGGATGGCAAGTACGGCTTCTGTCCCCATGAA GCCCTGTTCACCATGGGCGGCAACGCTGAAGGACAGCCCTGCAAGTTTCCATTCCGCTTCCAGGGCACATCCTATGA CAGCTGCACCACTGAGGGCCGCACGGATGGCTACCGCTGGTGCGGCACCACTGAGGACTACGACCGCGACAAGAAGT ATGGCTTCTGCCCTGAGACCGCCATGTCCACTGTTGGTGGGAACTCAGAAGGTGCCCCCTGTGTCTTCCCCTTCACT TTCCTGGGCAACAAATATGAGAGCTGCACCAGCGCCGGCCGCAGTGACGGAAAGATGTGGTGTGCGACCACAGCCAA CTACGATGATGACCGCAAGTGGGGCTTCTGCCCTGACCAAGGG（选取的CBD序列）AAGCTTGCGGCCGCACTCGAG（3#连接序列）CACCACCACCACCACCAC（His标签2）TGA(终止密码)

融合蛋白的多肽序列：

M（起始甲硫氨酸）-GSS（1#连接序列）-HHHHHH（His标签1）-SSGLVPRGSHMASMTGGQQMGR（2#连接序列）-HGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSRC（选取的IFN活性结构域）-EGQVVRVKYGNADGEYCKFPFLFNGKEYNSCTDTGRSDGFLWCSTTYNFEKDGKYGFCPHEALFTMGGNAEGQPCKFPFRFQGTSYDSCTTEGRTDGYRWCGTTEDYDRDKKYGFCPETAMSTVGGNSEGAPCVFPFTFLGNKYESCTSAGRSDGKMWCATTANYDDDRKWGFCPDQG（选取的CBD序列）—KLAAALE（3#连接序列）—HHHHHH（His标签2）

本发明提供的方案具以下优点：

本发明的融合蛋白虽然是以包涵体的形式表达出来的，但是通过一系列的透析复性，它具有生物学活性，而且是融合蛋白两个结构域各自的生物学活性的总和。

本发明中的融合蛋白主要是以瘤内注射为主要治疗方式，融合蛋白测完浓度后以冻干粉末储存，使用时加入一定量无菌的PBS溶液进行溶解，BSA再次测完浓度后使用。使用剂量可通过融合蛋白相对于商品化IFN-γ的效价计算出，而单一的融合蛋白CBD则以相对于IFN-γ-CBD相同摩尔数使用。均为一次性给药，结合CBD域与细胞外基质胶原具有亲和结合的特性在肿瘤局部形成一个天然的缓释系统。

本发明的融合蛋白及其衍生物或其与其他药物的联合使用，拥有胶原结合结构域这一特性使其具有较好的局部缓释效果，其与MMP的竞争抑制作用也妨碍了MMP介导的肿瘤的侵袭转移从而抑制肿瘤的远处转移；同时IFN-γ作为细胞因子，其本身不仅具有较好的直接杀伤肿瘤作用和抑制血管生成作用，而且在CBD域的协助下能够更好的增强肿瘤局部的免疫应答，促进体内正向免疫应答的发生，提高肿瘤的杀伤效果，其自身因免疫过强而对机体可能导致的毒副作用也可因被滞留在肿瘤局部而被减小甚至消失。

附图说明

图1为PCMV-Tag2A CBD质粒的克隆和PCMV-Tag2A IFN-γ质粒的克隆的酶切鉴定。

图2 为PET-28(a)+ CBD质粒的酶切鉴定和PET-28(a)+IFN-γ质粒的酶切鉴定。

图3为PET-28(a)+ IFN-γ-CBD质粒克隆好后，经ECORⅠ和HindⅢ双酶切后，跑1%的DNA胶鉴定图，用的是DL5000 marker。

图4为PET-28(a)+ CBD，PET-28(a)+ IFN-γ和PET-28(a)+IFN-γ-CBD在大肠杆菌中IPTG的诱导表达的SDS-PAGE 分析。

图5 为纯化的PET-28(a)+IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD的SDS-PAGE 分析。

图6为纯化的PET-28(a)+IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD的his标签抗性的western blot分析。

图7为纯化的蛋白的IFN-γ活性分析。

图8左图为transwell迁移实验。

图9为通过CCK8检测可明显看出带有IFN-γ域的融合蛋白具有明显的杀伤细胞的作用。

图10上图为通过光密度分析来确定matrigel胶中残留蛋白样，即Matrigel中胶原所能与CBD域结合的蛋白量，下图为通过his标签做western blot来确定在不同的时间点matrigel中能与胶原结合的融合蛋白的量。

图11为通过CCK8检测的融合蛋白对4T-1肿瘤细胞的杀伤效果。

图12为纯化的蛋白在乳腺癌肿瘤小鼠体内的抗肿瘤效果。

图13为纯化的蛋白在乳腺癌小鼠体内对肺转移的影响。

图14为统计的黑色素肿瘤小鼠的生存情况，发现IFN-γ–CBD治疗明显延长了黑色素瘤小鼠的生存期。

图15为本发明融合蛋白设计和工作原理模式图。

具体实施方式

参见图15，金属基质蛋白-2(MMP2)的蛋白结构包括两个部分，胶原蛋白结合结构域（CBD）和催化结构域，前者作用是使MMP2结合细胞外基质，后者作用是降解细胞外基质。伽马干扰素（IFN-γ）编码蛋白序列包括具有分泌功能的信号肽和具有生物学活性的成熟的IFN-γ两个部分。

本发明利用分子生物学的方法，将MMP2的CBD和IFN-γ的生物活性结构域一起构建成一个新的人工基因，并连接到可表达融合蛋白的原核载体上，在大肠杆菌中诱导表达和纯化出这种人工的融合蛋白质分子CBD：：IFN-γ。通过测试，证明了我们发明的这种人工蛋白分子，不仅具有CBD功能，即结合肿瘤组织细胞外基质，而且具有IFN-γ抗肿瘤功能，即直接杀伤肿瘤细胞、抑制血管生成和活化招募淋巴细胞。

依据我们的设计，CBD可以让这种人工的融合蛋白分子CBD：：IFN-γ可以结合肿瘤组织细胞外基质，实现以下抗肿瘤效果：

1. 融合蛋白与细胞外基质的胶原蛋白结合，竞争性抑制肿瘤MMP2结合和降解细胞外基质，从而抑制肿瘤细胞转移；

2. CBD：：IFN-γ可以在肿瘤长时间存在，并维持局部高浓度，从而增强IFN-γ直接杀伤肿瘤细胞的作用、抑制血管生成的作用以及活化和招募抗肿瘤的淋巴细胞的作用；

3. 在临床测试中，给予低剂量的可溶的IFN-γ，会导致发热和系统的炎症反应，高剂量的IFN-γ可致死。CBD：：IFN-γ肿瘤组织的胶原蛋白结合，避免有活性的IFN-γ的扩散，从而降低IFN-γ的系统性炎症反应。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：人CBD基因的克隆和鼠IFN-γ基因的克隆

从已有的人MMP2中克隆出CBD的基因序列。

IFN-γ基因的克隆：

（1）.采用LA酶以<CTCGAG>Xhol与<GAATTC> EcoR1为酶切位点，引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，用纯水稀释成10μM的工作液浓度，引物设计所依据的IFN-γ基因序列来源NCBI Reference Sequence: NM_008337.3）。

(2).模板的制备：小鼠细胞中提取RNA,然后逆转录获得cDNA作为PCR反应的模板

(3).PCR反应体系：50ul反应体系中含有：ddH₂O 37.5ul；10×LA buffer 5ul；10mMdNTP 4ul；Primer（F+R）2ul;mcDNA 1ul;LA酶0.5ul。PCR反应参数：95 ℃ 1 min；94 ℃30 s，57.9 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s ，40个循环。72 ℃ 5 min；16 ℃ ∞。

(4).PCR完成后，取2ul PCR 产物+ 2ul 10×loading buffer,进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

(5).条带大小与目标相符后，进行DNA切胶回收，胶回收试剂盒，胶回收后测出所含DNA浓度（Nanodrop 1000），然后与PCMV载体进行连接。

(6).PCMV载体与切胶回收产物进行连接，连接体系如下：PCMV 3ul; IFN-γ14ul;10×T4buffer 2ul;T4 DNA ligase 1ul,共20ul体系。连接反应条件：20℃，2h.

(7).连接好之后进行YC法转化，转化在无菌条件下进行（酒精灯，无菌EP管，枪头），操作如下：50ul体系含有：连接产物20ul；5×KCM 10ul；ddH2O(无菌)20ul。加完后，混匀，再加入一支感受态细胞（-80℃保存，用前置冰上），加完后，混匀EP管，冰上放置20 min,再室温放置10 min ,再加入500ul LB(无菌，无抗性)。摇床上振摇50 min (200 r,37℃)后，取出，3000 r × 5 min ,弃去大半上清后，吹散，吸入无菌枪头，打入kan+抗性平皿中，用酒精烧过且晾干的涂布棒均匀涂抹整个平皿，置37℃ 温箱，一个小时后将平皿倒置，37℃ 温箱培养过夜（不超过16h）。

(8).对转化平板中的菌落，挑单菌落，加入100ulkan+抗性培养基，摇菌1h后，进行菌液PCR。PCR反应体系如下：20ul体系含有：ddH2O 8ul；2×mix 10ul；IFN-γ引物（F+R）1ul; 菌液1ul。反应条件：95 ℃ 5 ;94 ℃ 30 s, 57.9 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s, 40个循环。72 ℃ 5 min；16 ℃ ∞。

(9).转化结果的鉴定：PCR 完成后，配DNA胶进行电泳，选择与目的条带大小一致且亮度较高者进行摇菌，保菌后送测序, 测序公司为武汉擎科生物技术有限公司，测序引物为通用引物，由公司提供。测序后在PubMed 上blast一下，发现基因序列完全正确，即将所保菌落PCR的菌液取出，接菌，摇菌（保菌）提质粒。

附图1为PCMV-Tag2A CBD质粒的克隆和PCMV-Tag2A IFN-γ质粒的克隆的酶切鉴定。其中1A为PCMV-Tag2A CBD 质粒克隆好后，跑1%的DNA胶鉴定图，M条泳带代表的是DL2000 marker，a泳带代表的是构建好的PCMV-Tag2A CBD质粒经EcoRⅠ和HindⅢ 双酶切后，分别切出了PCMV-Tag2A和hMMP2的CBD。附图1B为pCMV-tag2A IFN-γ质粒克隆好后，跑1%的DNA胶鉴定图，M条泳带代表的是DL5000 marker，b泳带代表的是构建好的pCMV-tag2AIFN-γ质粒经EcoRⅠ和XholⅠ酶切后，分别切出了PCMV-tag2A和mouse IFN-γ。

实施实例2：将克隆出的人的MMP2的 CBD 及鼠IFN-γ的DNA序列的CDS区sigpeptide插入到表达载体PET28a(+)的EcoR1和HindⅢ两个酶切位点之间。采用融合重组的方法。

(1).首先设计融合重组的引物。

(2).片段的PCR,片段PCR反应体系：50ul反应体系，ddH₂O 37.5ul；10×LA buffer5ul；10mMdNTP 4ul；Primer（F+R）2ul;质粒 1ul;LA酶0.5ul。PCR反应参数：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，40个循环。72℃5 min；16℃∞。PCR克隆PCR完成后，取2ul PCR 产物+ 2ul 10×loading buffer,进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

(3).载体线性化的PCR反应体系：50ul反应体系中含有：ddH₂O 33ul；10×KODbuff 5ul；2mMdNTP 5ul；25Mm MgSO4：3ul；Primer（F+R）2ul;质粒 1ul; KOD酶1ul。PCR反应参数：95℃1min；95℃30s，66℃30s，68℃3 min，35个循环。68℃10min；16℃ ∞。

(4).PCR克隆PCR完成后，取2ulPCR 产物+ 2ul 10×loading buffer,进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

(5).电泳确定条带大小正确后，进行沉淀回收，具体操作如下：PCR产物 + ddH2O补齐100ul；+250ul无水乙醇；+ 10ul(3M PH5.2) NaAc。混匀后，-20℃，30 min。拿出，离心12,000r×10min。弃上清，沉淀中加入500ml 75%乙醇，轻晃混匀，再次离心，12,000 r×5min；重复此操作两次，弃全部上清，剩余未吸尽上清，再次离心12,000r×5min，吸干水，再在室温晾干(5～15min),再加入20ul ddH20,用Nanodrop测出DNA浓度。

(6). DPn1酶切, 将沉淀回收产物用DPn1 进行酶切，DPn1酶切体系如下：片段：20ul；PET28a (+) HindⅢ- EcoR1：18.8ul；10×buff T：3ul；DPn1酶：1ul, 用 ddH20补足30ul体系， 酶切37℃。酶切完成后。

(7).切胶回收,将全部酶切产物进行DNA胶电泳，电泳一定程度后观察条带大小后在紫外仪下进行切胶。将切取的目标胶块放入EP管中，称重后进行DNA胶回收。

(8). 融合PCR, 将切胶回收产物进行融合PCR, 融合PCR反应体系如下：ddH20：24ul PET28a (+)H-E：5ul；Homo CBD：7ul；2mMdNTP：5ul；10×KOD buff：5ul；25mM MgSO4：3ul；KOD酶：1ul，50ul体系。PCR反应参数：95℃1min；95℃30s，66℃30s，68℃3min，35个循环。68℃10min；16℃ ∞。融合PCR完成后，将PCR产物进行转化，转化操作方法同上。

(9).转化结果的鉴定：将转化后所长出的菌落用无菌小枪头挑起放入加有一定量Kan﹢培养基中，摇菌过夜，提质粒，质粒提取说明书（北京庄盟国际生物基因科技有限公司），然后做酶切鉴定，酶切体系如下：20ul体系，质粒：16ul；10×buff M:2ul；EcoR1:1ul；HindⅢ:1ul；20ul体系，37℃酶切2h。酶切完成后进行DNA胶鉴定，鉴定结果发现条带大小正确，因此送公司进行测序鉴定，鉴定发现个别碱基突变但编码的氨基酸序列不变，即此构建完成。

附图2为PET-28(a)+ CBD质粒的酶切鉴定和PET-28(a)+ IFN-γ质粒的酶切鉴定。其中附图2A 为PET-28(a)+ CBD质粒克隆好后，跑1%的DNA胶鉴定图，其中M条泳带代表的是DL5000 marker，c泳带代表的是构建好的PET-28(a)+ CBD质粒经ECORⅠ和HindⅢ双酶切后，分别切出了PET-28(a)+和CBD。附图2B为PET-28(a)+ IFN-γ质粒克隆好后，跑1%的DNA胶鉴定图，其中M条泳带代表的是DL5000 marker，d泳带代表的是构建好的PET-28(a)+ CBD质粒经ECORⅠ和HindⅢ双酶切后，分别切出了PET-28(a)+和IFN-γ。

实施实例3：将克隆出的mouse的IFN-γDNA序列的CDS区的sig peptide插入到PET-28(a)+ CBD中人的MMP2的 CBD 的DNA序列的CDS区的上游

操作方法仍是融合重组，PET-28(a)+ CBD作为载体，PET-28(a)+ IFN-γ作为片段，操作同PET-28(a)+ CBD，PET-28(a)+ IFN-γ的构建。

图3为PET-28(a)+ IFN-γ-CBD质粒克隆好后，跑1%的DNA胶鉴定图, 其中M条泳带代表的是DL5000 marker，e条泳带代表的是构建好的PET-28(a)+ IFN-γ-CBD质粒经ECORⅠ和HindⅢ双酶切后，分别切出了 PET-28(a)+ 和IFN-γ-CBD。

实施实例4： PET-28(a)+ CBD，PET-28(a)+ IFN-γ，PET-28(a)+ IFN-γ-CBD在大肠杆菌中IPTG的诱导表达的SDS-PAGE分析

其中只有PET-28(a)+ IFN-γ存在于上清中，其余均存在于沉淀中，下面主要是以PET-28(a)+ CBD的诱导表达为例来进行说明。

诱导前先将之前所构建的PET28a(+)CBD，PET28a(+)IFN-γ，PET28a(+)IFN-γ-CBD的质粒；分别转化表达感受态BL21，然后挑取单个菌落摇菌，保菌，进行蛋白的诱导表达。

1.IPTG诱导时间的探索

(1).取8支试管分别加入5mL Kan﹢液体培养基，并将所保菌PET28a(+)CBD BL21摇菌过夜所得的菌液各加入0.5 mL，摇1.5h左右，至菌液OD≈0.8。

(2).再在管上分别编号0,1，2，3,4,5,6,7；并各加 100mM IPTG 50ul，即IPTG浓度为1mM,37℃，200r，摇菌。

(3).再分别在0，1,2,3,4,5,6,7，h后分别拿出对应编号的试管，离心4000r ×10min,弃上清，再次离心，直至吸不到上清为止，至4℃保存。

(4).将所有的试管都收集好后，各加入1 mL PBS重悬，离心4000r ×10min,重复一次，吸尽上清后放-20℃保存。

(5).第二天将上述菌液沉淀取出置冰上，各加入500ul PBS,再加入6ul PMSF（终浓度为1mM），然后置冰上超声（125W,50%功率，超3S,停5S）重复（20次左右）至完全透明。

(6).离心，12,000r ×10min，吸取上清至新的EP管中，至沉淀中完全吸不到上清（操作中始终冰置）。

(7).测出上清中蛋白浓度（BCA蛋白浓度测定法），根据测出的蛋白浓度，选最低浓度20ul的蛋白总量为标准进行蛋白制样。

(8).跑SDS-PAGE胶，先用70V电压跑，待溴酚蓝跑到浓缩胶与分离胶分界线处，换用90V电压跑，待距玻璃板底部1㎝时停止电压。

(9).取出胶块置大玻璃缸中倒入考马斯亮兰染液，染色过夜（振摇，用塑料袋封口）。

(10).第二天倒掉染色液，加入脱色液进行脱色（振摇），待胶块脱色至透明，取出，拍照，胶可泡在ddH₂O中。

(11).从跑胶结果可以发现诱导3h时蛋白表达量达峰值，再延长时间，蛋白表达量并不增加，以及蛋白是以包涵体形式存在的，表达出的蛋白大小与预先估计的并无差异。如附图4A。

2.IPTG诱导浓度的探索

具体操作如上，只是当菌液OD≈0.8时，分别加入IPTG 1（0ul），2（2.5ul），3（5ul），4（10ul），5（20ul），6（30ul），7（40ul），8（50ul）；3h后收样。其它与IPTG诱导时间的探索相同，同样地发现蛋白是存在于包涵体中，当加入IPTG量为5ul即IPTG浓度为0.1mM时，所表达的蛋白量最多，再增加IPTG浓度，蛋白表达量并不增加，图略。

3.IPTG诱导温度的探索

具体操作如上，只是当菌液OD≈0.8时，取出，分别编号0,4h,8h,20h，除编号0外并各加入5ul IPTG，25℃,200 r.并分别在相应时间点取出相关编号试管（如4 h后取出编号4h的试管），0的与4h的同时取出。其它与IPTG诱导时间的探索相同，同样地发现即使是在低温下进行诱导表达，蛋白仍是以包涵体形式存在的，表达出的蛋白大小与预先估计的并无差异。即以上诱导表达都说明蛋白是存在于沉淀中，以包涵体形式存在。图略。

4.PET-28(a)+ IFN-γ的诱导表达采用了PET-28(a)+ CBD诱导表达的最优条件，选择的IPTG浓度为0.1mM，对诱导时间进行了探索，分别选用的0,1,2,4h，诱导后发现蛋白在上清有表达，而且量不低,在2h时，蛋白表达量已达到峰值。如附图4B。

5.PET-28(a)+ IFN-γ-CBD的诱导表达同样采用了PET-28(a)+ CBD诱导表达的最优条件，选择的IPTG浓度为0.1mM，对诱导时间进行了探索，分别选用的0,1,2,4h，诱导后发现在上清中无蛋白的表达，只有沉淀中有大量蛋白的表达，即蛋白存在于包涵体中而且也是2h时，蛋白表达量达到峰值，如附图4C。

实施实例5：融合蛋白的镍柱纯化：

1.天然条件下镍柱纯化IFN-γ蛋白

(1).将之前所保菌PET28a(+)IFN-γ BL21 各取50ul接种于两支试管中。每支各加入5mL Kan﹢液体培养基，然后摇菌过夜。

(2).配制1L Kan﹢液体培养基，将上述所摇菌液（10 mL）加入，200r,37℃,摇4 h左右，至OD≈0.8

(3).加入1 mL IPTG诱导2 h 后，取出置于50 mL离心管中离心，10000 r ×5min，未离的部分置于冰上，全部离好后，再离一次，弃尽上清，置-20℃保存。

(4).将菌液沉淀取出，各加2 mL PBS，吹悬后，离心10000 r ×5min，弃尽上清，再洗一次，至吸不出上清为止。

(5).沉淀中加入1× Ni-NTA 结合缓冲液重悬，并入一管中，补足20 mL后，加入400ul PMSF，冰上超声（125W,50%功率，超3S,停5S）超到底部透明时，再高速离心10000 r×5min，吸取上清于干净的离心管中即蛋白滤液，用0.45μm滤器过滤蛋白液于新的离心管中。

(6).安置好重力柱，加入1.5 mL基质（Ni-NTA his﹒Bind Resin购自 Novagen上海玉博生物科技有限公司），再用0.22μm 滤器过滤1× Ni-NTA 结合缓冲液加入柱中，除去柱下端封闭盖子，洗出柱内的酒精（2倍柱长体积）滴完后，加入蛋白滤液，并用干净的管子收集流出液（可重复），4℃保存用于 SDS-PAGE 电泳分析。以 10ml用0.22μm 滤器过滤过的 1× Ni-NTA 漂洗缓冲液漂洗 2 次，收集漂洗组分，用于 SDS-PAGE 电泳分析.用一定量0.22μm 滤器过滤过的1× Ni-NTA 洗脱缓冲液逐渐滴加洗脱目的蛋白，用1.5 mL EP管收集流出液，边收集边用Nanodrop 1000测蛋白浓度，待显示值为负时，停止滴加洗脱缓冲液，收集洗脱组分，用于 SDS-PAGE 电泳分析。

(7).SDS-PAGE 电泳分析发现蛋白被纯化出来了，且纯度≥90%，即纯化完成。

(8).再用50mM Tris-HCl缓冲液， 4℃透析过夜。将蛋白测浓度后分装冻干成粉末。-80℃保存。

2.包涵体（不可溶性蛋白）CBD的镍柱纯化

(1).将之前所保菌PET28a(+)CBD BL21 各取50ul接种于两支试管中。每支各加入10mLKan﹢液体培养基，然后摇菌过夜。

(2).配制1L Kan﹢液体培养基，将上述所摇菌液（20 mL）加入，200r,37℃,摇2h左右，至OD≈0.8，

(3).加入1 mL IPTG诱导2 h 后，取出置于50 mL离心管中离心，10000 r ×5min，未离的部分置于冰上，全部离好后，再离一次，弃尽上清，置-20℃保存。

(4).将菌液沉淀取出，各加2 mL PBS，吹悬后，离心10000 r ×5min，弃尽上清，再洗一次，至吸不出上清为止。加PBS重悬，并入一管中，补足20 mL后，加入400ul PMSF，冰上超声（125W,50%功率，超3S,停5S）超到底部透明时，再高速离心10000 r ×5min，吸弃上清后，加入20 mL变性裂解／结合缓冲液，50ulβ-巯基乙醇，再加入400ul PMSF，冰上振摇过夜至充分溶解（即为溶解蛋白液）。

(5).安置好重力柱后，加入1.5 mL基质（吸附柱），再用0.22μm 滤器过滤变性裂解／结合缓冲液加入柱中，除去柱下端封闭盖子，洗出柱内的酒精（2倍柱长体积）滴完后，加入蛋白溶解液，并用干净的管子收集流出液（可重复），4℃保存用于 SDS-PAGE 电泳分析。以 10ml用0.22μm 滤器过滤过的变性漂洗缓冲液漂洗2 次，收集漂洗组分，用于 SDS-PAGE电泳分析.用一定量0.22μm 滤器过滤过的变性洗脱缓冲液逐渐滴加洗脱目的蛋白，用1.5mL EP管收集流出液，边收集边用Nanodrop 1000 测蛋白浓度，待显示值为负时，停止滴加洗脱缓冲液，收集洗脱组分，用于 SDS-PAGE 电泳分析。

(6).由于含盐酸胍的样品在用 SDS 处理时会形成沉淀，在进行 SDS-PAGE 电泳前，样品须用水稀释（ 1:6 稀释），或透析、或采用 TCA 沉淀除去盐酸胍。

(7).SDS-PAGE 电泳分析发现蛋白被纯化出来了，且纯度≥90%，即纯化完成。

(8).将含有 8M尿素的重组蛋白洗脱液放入透析袋中，于6M尿素缓冲液中，4℃，透析过夜。

(9).然后在复性Buffer中，4℃，透析24h，并更换一次复性Buffer。

(10).再于2M尿素缓冲液中，4℃透析过夜。

(11).在50mMTris-HCl缓冲液，4℃透析过夜以交换Buffer。将蛋白测浓度后分装冻干成粉末。-80℃保存

IFN-γ-CBD的镍柱纯化方法同CBD。

（天然条件下纯化所需溶液： 1× Ni-NTA 结合缓冲液： 50mM NaH₂PO4，PH 8.0，300mM NaCl， 10mM 咪唑。 1× Ni-NTA 漂洗缓冲液： 50mM NaH₂P04， PH 8.0， 300mMNaCI， 20mM 咪唑。 1× Ni-NTA 洗脱缓冲液： 50mM NaH₂PO4， PH8.0， 300mM NaCI，250mM 咪唑。

变性条件下纯化所需溶液：变性裂解／结合缓冲液：6M GuHCI； 0.1M NaH₂P04；0.01M Tris-HCI，PH8.0。变性漂洗缓冲液：8M尿素；0.1M NaH₂P04；0.01M Tris-HCI，PH6.3。变性洗脱缓冲液：8M 尿素；0.1M NaH₂P04；0.01M Tris-HCI，PH4.5。复性Buffer：20mMTris, PH8.0, 2mM GSH, 5mM EDTA and 50mM Glycine。

透析袋的处理：剪取合适长度的透析袋，分别置于溶液1（含8%NaHCO3的0.5MEDTA，PH8.0）和溶液2（0.5MEDTA，PH8.0）中各煮沸10min，然后用去离子水彻底清洗，备用。

图略。

实施实例6：融合蛋白分子量大小及His抗性鉴定

一．实验过程

1.将冻干的蛋白粉末IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD用一定量PBS溶解

2.测得浓度，各取一定量，分别制两份蛋白样，跑SDS-PAGE胶，一份做考马斯亮蓝染色，一份做 western blot检测his抗性。

二．实验分析

附图5 为纯化的PET-28(a)+ IFN-γ，CBD和IFN-γ-CBD跑在同一块12%的的SDS-PAGE胶上，经考马斯亮蓝染色的结果，M代表的是蛋白marker,代表的分子量大小均已标出，1,2,3分别代表IFN-γ, CBD，IFN-γ-CBD。由图可以看出不论是通过上清的方法纯化出的IFN-γ，还是以沉淀的形式纯化的又经过透析复性的CBD和IFN-γCBD，均具有较高的纯度。

附图6为用his抗性所做的western blot，M代表的是蛋白marker, 1,2,3分别代表IFN-γ, CBD，IFN-γ-CBD。由图可以看出，所纯化的蛋白均带有his标签，且相对无带有his标签的杂蛋白存在。

实施实例7:融合蛋白中IFN-γ免疫活性检测

一．实验过程

1.4T-1细胞长满后均匀铺在多个90㎝皿中。

2.待皿中细胞密度长至80%-90%时，各加入BSA, IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD；1000ng/ml。

3.上述蛋白刺激15 min 后，用细胞刮刮取细胞，离心2000 r×5min，取上清，加入一定量（200ul）PBS及蛋白酶抑制剂（1.5ul cooktail）后，冰上超声（30W，3S,5次），再次离心12000 r×10min取上清，BCA法测出上清中蛋白浓度。

4.每个蛋白选80ug作为总量，各制两份样，跑SDS-PAGE胶，做BSA,IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD，分别检测Stat1，β-actin；PStat1，β-actin。

二．实验分析

附图7为通过western blot检测IFN-γ这一结构域对STAT1磷酸化的情况，所用细胞系为4T-1乳腺癌细胞系，图中BSA作为阴性对照蛋白存在，IFN-γ和CBD也均为融合蛋白的对照。由图可以看出CBD不具有刺激STAT1磷酸化的活性，而IFN-γ具有刺激STAT1磷酸化的活性，且连上胶原结合结构域CBD后，这一刺激STAT1磷酸化的仍然存在，即本发明的融合蛋白应具有IFN-γ相对应的免疫活性。

实施实例8：融合蛋白中CBD抑制迁移活性检测，Transwell migration实验

一．实验过程

1.实验前准备：一大一小各一个冰盒，分装的Matrigel（冰上进行稀释，不然会凝固），一块板有12个小室；有四个蛋白需要做（BSA，IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD）。

2.配制Matrigel与蛋白的混合液，将Matrigel：1640（0%FBS）按1:2稀释即10ulMatrigel+20ul 1640培养基，故3个小室（配4个小室的量，以防不够）总量为66.7ulMatrigel+133.3ul 1640EP管4支，（其中蛋白各10ug，蛋白体积用PBS补齐后，再加1640补足160ul）放在冰上，充分混匀，注意尽量不要产生气泡，且胶不能过火，也不能喷酒精。

3.每个蛋白样3个小室各加入50ul上述混合液，注意一定不能产生气泡，枪头处可残留一部分液体，避免产生气泡，且滴加时对着底部悬空加，摇匀，充分覆盖小室底部，放置孵育箱内5h，待胶充分凝固后，再接种细胞。

4.制备细胞悬液,先用胰酶消化细胞2-5分钟，加含10%血清培养基终止消化后离心弃上清，用含10%血清培养基重悬细胞，镜下计数，调整细胞数，每个小室接种为1×10⁵个。

5.接种细胞,上室中加入200ul细胞悬液，下室加入含10%FBS（血清）的培养基，每孔加入500ul。放入孵育箱中，3 h后改用无血清培养基培养48h。

6.进行细胞结晶紫染色、拍照，在另一排孔中加入500ul 4%多聚甲醛固定30 min后，用500ul 0.1% 结晶紫染色液染色30min，再在新的24孔板中个加入PBS 1ml/孔，将Transwell小室转移至含PBS的孔中，清洗，将Transwell室转移至新PBS中轻轻晃动，洗涤细胞。

7.用棉球擦去上室内的细胞，注意轻柔，将小室倒扣风干30min，在显微镜下拍照，计数每个小室中穿过去的细胞总数。

二．实验分析

附图8左边为Transwell迁移实验中，在显微镜下拍摄的比较典型的，经结晶紫染色的，在Transwell小室背侧面迁移过去的4T-1细胞。右图为量化的结果，计数了整个小室所有穿过去的细胞数量。

BSA作为正常对照，由图我们可以明显的得出结论，相对于BSA而言，三种蛋白IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD均具有抑制4T-1细胞迁移的活性。其中，IFN-γ-CBD相比于其它蛋白有更强的抑制细胞迁移的效果，即本发明的融合蛋白具有胶原结合结构域CBD抑制细胞迁移的活性。

实施实例9：融合蛋白对肿瘤细胞的直接杀伤活性检测，主要是CCK8检测

一．实验过程

1.先铺matrigel于96孔板中，Matrigel：1640（0%FBS）按1:2稀释，4个副孔，配5倍体积，加4个孔。

2.每孔20ul，每孔加蛋白BSA，IFN-γ，CBD，IFN-γ-CBD 各1ug。37℃放5h。

3.铺4T-1细胞2000个/100μl,均匀铺在加有matrigel胶96孔板中.同时铺4T-1细胞2000个/100μl,均匀铺在没有加matrigel胶的空白96孔板中。

4.48小时后做CCK8检测，每孔加入CCK8试剂10ul,2 h 后，检测450nm处吸光度值。

二．实验分析

本实验的主要目的为检测IFN-γ对肿瘤细胞的直接杀伤活性，检测指标为CCK8（细胞活力的检测），其中BSA作为对照蛋白。由附图9可以看出单纯的IFN-γ具有直接的杀伤肿瘤细胞的效果，使细胞活力下降，CBD并没有这一作用，当把IFN-γ和CBD 融合在一起，即本发明的融合蛋白仍然具有杀伤肿瘤细胞的效果，引起肿瘤细胞活性的下降。

实施实例10：Matrigel中融合蛋白释放实验

一．实验过程

1.分别取15个15ml离心管，平均分为3组，各标记为IFN-γ，CBD, IFN-γ-CBD 三组;每组再标记0，1，3，7，14天。

2.配制如下体系，每管分装相应的蛋白与Matrigel各100ul。每管体系如下：（蛋白5ug + PBS为50ul : Matrigel=1:1）,各配6倍体积的体系，然后混匀。

3．各取上述混合液100ul于各管，注意不要产生气泡，将胶放入37℃,5h。

4.待胶完全凝固后，各加入10mlPBS,编号为0组（直接放-20℃冰箱保存）除外，放入37℃温箱中。

5.分别在1,3,7,14天将上清吸出，放入4℃冰箱保存，沉淀中上清吸尽后置-20℃保存。

6.待全部样本都收集齐后，将胶块溶解，进行制样(加25ul 5×SDS Loadingbuffer，在金属浴中煮5min ,待胶块完全溶解为液态，离心将溶胶液甩到管底，吸入1.5ml离心管中制样)做western blot，通过检测his抗性来检测融合蛋白对胶原的结合能力。

二．实验分析

附图10上图为通过his标签做western blot来确定在不同的时间点matrigel中的蛋白的剩余量，下图为通过降上图western blot的条带进行光密度分析来确定的matrigel中残留蛋白样，即各种蛋白在Matrigel中的胶原中所能达到的缓释效果。

由图可以看出单独的CBD及本发明的融合蛋白IFN-γ-CBD在matrigel中具有一定的缓释功能，说明所纯化的带有CBD域的蛋白是有与胶原结合的能力，虽然matrigel不是纯的胶原。当然IFN-γ-CBD比CBD有更长时间的缓释效果可能还与分子量大，存在的滞留效应有关。

实施实例11: IFN-γ-CBD既具有CBD与胶原结合的活性同时具有IFN-γ活性

一．实验过程

1.先铺matrigel于96孔板中，Matrigel：1640（0%FBS）按1:2稀释，4个副孔，配5倍体积，加4个孔.每种蛋白总量4ug，每孔20ul,37℃放5h。

2.待胶万全凝固后，加入PBS浸泡，每隔8h 换一次液，换3天。

3.然后开始铺4T-1细胞2000个/100μl,均匀铺在加有Matrigel的96孔板中。

4.培养48小时后做CCK8检测，加入CCK8检测试剂10ul后，继续孵育2h，450nm处测吸光度值。

二．实验分析

图12为通过CCK8检测的融合蛋白对4T-1肿瘤细胞的杀伤效果。BSA作为对照蛋白存在，未经过PBS洗涤的IFN-γ作为阳性对照，之前实验已表明IFN-γ和IFN-γ-CBD具有直接降低4T-1细胞活力的作用。本次实验主要是想证明本发明的融合蛋白确实是两种蛋白的融合而不是单纯的两种蛋白的混合物。由附图12 分析可得，本发明的融合蛋白是IFN-γ和CBD的融合物而不是混合物。

实施实例12: 本发明的融合蛋白对4T-1恶性乳腺癌的生长和转移的抑制效果。

Balb/c雌性小鼠,5﹣6周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，4%水合氯醛麻醉后。在每个小鼠的第二个乳房垫内注入100ul 1×10⁷ 个4T-1细胞/ml。种植肿瘤6天后，测肿瘤大小，按照肿瘤大小差异进行分组，确保每组肿瘤大小相当，较大与较小肿瘤互补分为一下5组：

每个蛋白的治疗剂量以我们所做的融合蛋白的活性定量为参考， 以IFN-γ10000U /只小鼠，IFN-γ-CBD治疗剂量以与IFN-γ同等活性作为参考，而CBD则以它与IFN-γ-CBD分子量大小的差别进行计算而得。治疗后，每三天测一次肿瘤大小，直到32天后将小鼠处死，取出完整的肿瘤组织和肺部，肿瘤组织直接取出放入多聚甲醛中，肺组织取出后，先计数转移灶的大小，然后放入多聚甲醛，4℃保存。图12显示了各组小鼠的生长曲线，图13显示了各组小鼠的肺转移灶数量。

由图12可以看出本发明的融合蛋白与对照组相比，具有较明显的抑制肿瘤生长的作用。由图13可以看出，本发明的融合蛋白与对照组相比，亦具有明显的抑制肿瘤转移的效果，肺部转移灶的数目被明显的抑制了。**代表P<0.01.同时与对照组相比，可以发现即使将等

活性的IFN-γ和CBD加在一起治疗，也不能起到像治疗组同样的抑制肿瘤生长和转移，体现了本发明的融合蛋白将两种结构用基因工程的方法融合在一起的优越性。

实施实例13：本发明的融合蛋白具有很好的延长黑色素肿瘤的生存时间的效果。

一．实验过程

C57BL/6的雄鼠6～8周龄，购自北京华阜康生物科技股份

有限公司。4%水合氯醛麻醉后，在每只小鼠的背部皮下注入2.5×10⁴B16-OVA：P2肿瘤细胞。5天后随机分为5组，分别设置如下：

每个蛋白的治疗剂量以我们所做的融合蛋白的活性定量为参考， 以IFN-γ10000U /只小鼠，IFN-γ-CBD治疗剂量以与IFN-γ同等活性作为参考，而CBD则以它与IFN-γ-CBD分子量大小的差别进行计算而得。治疗后，每天观察小鼠的生存情况。并做好记录，整个过程一直持续了80多天。图14显示了各组小鼠的生存曲线。

由图14可以看出相对于对照组而言，本发明的融合蛋白具有明显的延长肿瘤小鼠的生存时间的效果，而等活性的IFN-γ和CBD加在一起治疗，也不能起到像治疗组同样的延长肿瘤的生存时间的效果。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白

<160>2

<210>1

<211>1083bp

<212>DNA

<220>

<221>CDS

<400>1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcca cggcacagtc

attgaaagcc tagaaagtct gaataactat tttaactcaa gtggcataga tgtggaagaa

aagagtctct tcttggatat ctggaggaac tggcaaaagg atggtgacat gaaaatcctg

cagagccaga ttatctcttt ctacctcaga ctctttgaag tcttgaaaga caatcaggcc

atcagcaaca acataagcgt cattgaatca cacctgatta ctaccttctt cagcaacagc

aaggcgaaaa aggatgcatt catgagtatt gccaagtttg aggtcaacaa cccacaggtc

cagcgccaag cattcaatga gctcatccga gtggtccacc agctgttgcc ggaatccagc

ctcaggaagc ggaaaaggag tcgctgcgaa ggccaagtgg tccgtgtgaa gtatgggaac

gccgatgggg agtactgcaa gttccccttc ttgttcaatg gcaaggagta caacagctgc

actgataccg gccgcagcga tggcttcctc tggtgctcca ccacctacaa ctttgagaag

gatggcaagt acggcttctg tccccatgaa gccctgttca ccatgggcgg caacgctgaa

ggacagccct gcaagtttcc attccgcttc cagggcacat cctatgacag ctgcaccact

gagggccgca cggatggcta ccgctggtgc ggcaccactg aggactacga ccgcgacaag

aagtatggct tctgccctga gaccgccatg tccactgttg gtgggaactc agaaggtgcc

ccctgtgtct tccccttcac tttcctgggc aacaaatatg agagctgcac cagcgccggc

cgcagtgacg gaaagatgtg gtgtgcgacc acagccaact acgatgatga ccgcaagtgg

ggcttctgcc ctgaccaagg gaagcttgcg gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac

tga

<210>2

<211>360

<212>PRT

<220>

<221>MUTAGEN

<400>2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

Gly Ser Glu Phe His Gly Thr Val Ile Glu Ser Leu Glu Ser Leu Asn

Asn Tyr Phe Asn Ser Ser Gly Ile Asp Val Glu Glu Lys Ser Leu Phe

Leu Asp Ile Trp Arg Asn Trp Gln Lys Asp Gly Asp Met Lys Ile Leu

Gln Ser Gln Ile Ile Ser Phe Tyr Leu Arg Leu Phe Glu Val Leu Lys

Asp Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Ile Ser Val Ile Glu Ser His Leu

Ile Thr Thr Phe Phe Ser Asn Ser Lys Ala Lys Lys Asp Ala Phe Met

Ser Ile Ala Lys Phe Glu Val Asn Asn Pro Gln Val Gln Arg Gln Ala

Phe Asn Glu Leu Ile Arg Val Val His Gln Leu Leu Pro Glu Ser Ser

Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Arg Cys Glu Gly Gln Val Val Arg Val

Lys Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe

Asn Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly

Phe Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr

Gly Phe Cys Pro His Glu Ala Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu

Gly Gln Pro Cys Lys Phe Pro Phe Arg Phe Gln Gly Thr Ser Tyr Asp

Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr

Thr Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr

Ala Met Ser Thr Val Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Val Phe

Pro Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly

Arg Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Asp

Asp Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Lys Leu Ala Ala Ala

Leu Glu His His His His His His

Claims (5)

1.一种含有胶原蛋白结合结构域的融合蛋白，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2所示。

2.一种编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子。

3.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1所示。

4.一种包含权利要求2或3所述DNA分子的载体。

5.权利要求1所述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。