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CN102260352B - 靶向性白细胞介素融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

靶向性白细胞介素融合蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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CN102260352B
CN102260352B CN2010101855032A CN201010185503A CN102260352B CN 102260352 B CN102260352 B CN 102260352B CN 2010101855032 A CN2010101855032 A CN 2010101855032A CN 201010185503 A CN201010185503 A CN 201010185503A CN 102260352 B CN102260352 B CN 102260352B
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种具有靶向性的白细胞介素融合蛋白、编码该融合蛋白的DNA分子、含有该DNA序列的载体、含该载体的宿主细胞或者转基因动物、该融合蛋白的制备方法以及应用。本发明所述融合蛋白从N端至C端包括靶向连接区、白细胞介素，根据情况可有不多于10个氨基酸组成的连接区，用于连接所述靶向结合区和白细胞介素。作为优选，所述靶向结合区与生长抑素同源。实验表明，本发明所述融合蛋白可以提高靶向组织白细胞介素浓度，同时降低其他组织白细胞介素浓度，提高疗效的同时减低IL-2副作用，可用于肿瘤治疗，具有广泛的应用前景。

Description

靶向性白细胞介素融合蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及白细胞介素融合蛋白及其制备和其在医药领域的应用。
背景技术
传统治疗癌症的方法有手术治疗、化学治疗、放射治疗和激素治疗等。近年来，开发选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的抗肿瘤分子靶向药物已成为重要研究开发方向。肿瘤免疫治疗已成为最活跃的抗肿瘤靶向研究领域之一，单克隆抗体、细胞过继免疫治疗、肿瘤疫苗、细胞因子治疗已显示出与传统疗法的互补性。
白细胞介素2(IL-2)是本领域熟知的一种白细胞介素，发现于1976年，Morgan等人用植物的血球凝集素刺激正常的人淋巴细胞，发现其可以产生一种能选择性促进T淋巴细胞生长的细胞因子，它必须和IL-2受体结合才能发挥生物学效应。IL-2是多种生物功能细胞因子，可刺激细胞毒T淋巴细胞分化、激活细胞毒T淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞的非特异性杀伤功能，也能增强B淋巴细胞的抗体分泌和增殖。因此临床上也主要用于免疫佐剂调动机体的系统免疫，达到辅助治疗控制肿瘤的目的。
作为第一个被分离纯化的白细胞介素分子，80年代美国Cetus公司开发人源重组IL-2用于治疗癌症，直至1993年，IL-2被FDA批准用于治疗肾癌和黑色素瘤；目前IL-2也被批准大剂量用于治疗HIV。临床试验表明IL-2单药治疗癌症的有效率低，副作用大。高剂量治疗黑色素瘤的客观有效率为5-27％，其中只有0-4％的病人病情完全缓解。IL-2的副作用大，病人产生体液储留、腹泻、血压过低等一系列反应，小部分患者死亡，这些毒副作用多与IL-2引发非治疗病灶的全身其他组织免疫过度反应有关。
针对于IL-2临床使用的局限，目前IL-2蛋白质药物研究主要方向是减小药物副作用、提高药效、延长药物半衰期。策略主要包括IL-2的聚乙二醇(PEG)修饰、与人血清白蛋白(HSA)融合延长半衰期，糖基化修饰提高IL-2稳定性，与单克隆抗体融合将药物靶向到特定靶点(如肿瘤细胞)，与其他蛋白(如免疫调节因子)融合产生药物联用效果等。在临床实验中，PEG修饰的IL-2与IL-2相比，并没有显著改善半衰期和有效率，至今未被FDA批准用于癌症治疗。Human GenomeSciences公司开发了HSA-IL-2融合蛋白Albuleukin，静脉注射Albuleukin的血浆半衰期从IL-2的19分钟提高到6小时，目前已进入二期临床实验。天然IL-2的第三位Thr是被糖基修饰的，目前IL-2的糖基化地手段分为真核细胞表达、以及合成的糖基化短肽和IL-2蛋白连接两种策略，Symansis公司用人293细胞表达hcxIL-2已经在市面上出售，国内有若干个实验室都开发酵母表达糖基化的IL-2，目前还处于开发阶段。目前默克公司将抗神经节苷脂GD2的C端融合IL-2的抗体药物EMD273066(hu14.18-IL-2)用于治疗黑色素瘤已经完成I期临床，结果表明33例病人中，8例病情稳定。无4级毒性反应(死亡)发生，但仍发现有低血压、组织缺氧等3级毒性反应。此外也有将IL-2融于其他抗体(如anti-her2antibody，anti-her3，IgG3等)的研究，以增强IL-2诱导的T细胞对肿瘤细胞杀伤特异性。其他IL-2融合蛋白药物，如Aerolysin-IL-2，IL-6-IL-2，GCSF-IL-2、重组人α胸腺素原-白介素2等，产生药物联用的效果。
对于与生物大分子耦联/融合的白介素-2可能存在的问题是，虽然半衰期延长但药物分子量的成倍增加使其更难于穿过生理屏障到达靶组织，尤其对大型实体瘤的浸润性差，使其难于穿过生理屏障到达肿瘤部位。靶向药物的特异性和亲和性不高会造成靶向药物在到达靶组织以前损伤正常细胞，消耗了药效。
针对上述问题，首先要选择特异性高的肿瘤抗原为靶点，另外还要通过蛋白质工程对靶向药物进行合理设计，减小分子质量，提高亲和力和特异性，增加药物在肿瘤组织的浓度和减少在正常组织的分布，减少对正常细胞的毒副作用。可以选择主要靶向于肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞的靶向短肽及非抗体蛋白，其中有针对肿瘤新生血管内皮细胞表面分子氨基肽酶N的NGR和整联蛋白(integrins αvβ3)的RGD。某些利用上述的相关靶向肽的开发药物，已经成功进入临床实验。如Modmed公司开发ARENEGYR就为NGR融合肿瘤坏死因子(NGR-hTNFα)，用于治疗直肠癌、肝癌、间皮瘤已经进入II期临床。GE公司开发用于肿瘤诊断的药物18F-AH111585(放射性标记的RGD)也进入一期临床。
生长抑素(Somatostatin，SST)及生长抑素类似物如伐普肽(Vapreotide)和兰瑞肽(Lanreotide)等作为单药已经分别成功用于心血管疾病(脑血栓等)和类癌、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤等的临床治疗。生长抑素受体(SSTR)发现表达于多种肿瘤细胞，这些研究充分支持了靶向肽选择的合理性和可行性。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向性白介素融合蛋白，该融合蛋白能够特异性结合某些细胞特别是肿瘤组织细胞或其新生血管内皮细胞，显著的增加白细胞介素在靶向组织的浓度，降低其在其他组织的浓度，从而提高治疗效果，降低毒副作用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种融合蛋白，从N端至C端包括(1)特异性结合肿瘤细胞或者肿瘤血管内皮细胞的靶向结合区；(2)白细胞介素。
根据情况，本发明所述融合蛋白可有不多于10个氨基酸组成的连接区，用于连接所述靶向结合区和白细胞介素。
在本发明的一个实施方案中，连接区有三个氨基酸：甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-(GGS)，在另一个实施例中有6个氨基酸：甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGSGGS)。
作为优选，本发明所述融合蛋白中白细胞介素为人源白细胞介素2，具有如SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
作为优选，本发明所述融合蛋白中靶向结合区为人源氨基酸序列。
更优选地，所述靶向结合区与生长抑素同源，所述靶向结合区的氨基酸序列与生长抑素同源性不低于60％。
在具体实施方式中，本发明具体提供一种融合蛋白，其靶向结合区的氨基酸序列为FCYWKSCT，如SEQ ID NO：2所示，或为SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少有80％的一致性，且具有特异结合肿瘤细胞或者肿瘤血管内皮细胞的活性。
在一种实施方案中，本发明所述融合蛋白中靶向结合区可以是包括不少于3个但不多于50个氨基酸的氨基酸序列，优选的序列含有生长抑素同源的不多于15个氨基酸序列，在一个优选的实施方案中，本发明所述融合蛋白的靶向结合区含有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，其N末端可带有大肠杆菌表达的起始密码子翻译的甲硫氨酸，在翻译过程中可能被不均一切除。
作为优选，将如SEQ ID NO：2所示的靶向结合区中酪氨酸由任一含苯环或杂环的氨基酸替换，优选替换为苯丙氨酸或色氨酸，不影响其靶向性。
作为优选，将如SEQ ID NO：2所示的靶向结合区中丝氨酸由任一含有羟基的氨基酸替换或缺失，优选替换为苏氨酸，不影响其靶向性。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种具体的融合蛋白，含有如SEQ IDD NO：3所述的氨基酸序列，记作SIL。为了使融合蛋白质便于纯化，可在氨基(N)末端或羧基(C)末端连接上氨基酸标签，包括但不限于多聚组氨酸(Poly-His通常为6个组氨酸)、多聚精氨酸(Poly-Arg通常为5-6个精氨酸)等。
本发明的另一方面也提供了编码本发明所述融合蛋白的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码含有如SEQ IDD NO：3所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDD NO：4所示。
为了生产本发明的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA分子被整合至表达盒中，随后表达盒被插入合适的表达载体。然后，这一表达载体被转入宿主细胞或者动物用于重组蛋白表达。
表达盒至少包括以下几个内容：(1)转录起始区，(2)可以编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子，该转录是在在转录起始区的调控下进行的，以及(3)转录中止区。
根据用于蛋白表达的宿主细胞的不同，转录起始区和转录中止区可以是天然存在或者人工构建的序列，该序列适合于真核或者原核细胞中的基因转录。此类序列在本技术领域内已为人所熟知。适当的含有转录起始序列的DNA片与适当的含有转录中止区的DNA片段与编码融合蛋白的DNA片段相连接。这种连接方法在本技术领域内已为人所熟知，比如，选择适当的限制性内切酶酶切以及连接。
本发明进一步提供重组了编码本发明所述融合蛋白的DNA分子的表达载体以及表达所述融合蛋白的细胞和转基因动物。所述表达载体优选质粒或病毒。所述细胞可以是哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母或者细菌。转基因动物可以是转基因羊，牛，等等。
在本发明的实施例中，具体提供一种重组了编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子的大肠杆菌，所述大肠杆菌于2010年5月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3867。
另外，本发明也提供了所述融合蛋白的生产方法，包括以下步骤：提供含有编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子的细胞或转基因动物，使该细胞或转基因动物表达所述融合蛋白以及分离所述融合蛋白。
实验表明，本发明所述融合蛋白可通过在肿瘤组织/部位激活NK细胞、CTL细胞、LAK细胞，提高免疫系统杀伤肿瘤细胞的能力，因此本发明还提供了所述融合蛋白的应用，即用于治疗细胞过度增生导致的疾病或制备治疗细胞过度增生导致的疾病如癌症的药物中的用途。
生物保藏说明
分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2010年5月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3867。
附图说明：
图1示本发明所述融合蛋白结构示意图。
A：靶向结合区；B：连接区；C：人源白细胞介素2。
图2示本发明所述融合蛋白SIL表达与纯化后的SDS-PAGE鉴定结果。
泳道1：分子量Marker；从上至下依次为97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
泳道2：表达融合蛋白的宿主菌裂解物；
泳道3：最终洗涤的包涵体；
泳道4：经Ni Sepharose High Performance亲合纯化的目的蛋白。
图3示本发明所述融合蛋白SIL复性的SDS-PAGE结果。
A：15％SDS-PAGE分析，O：非还原电泳；
M：分子量Marker，从上至下依次为97.0kDa、66.0kDa、43.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa；
R：SIL还原电泳；
图4示本发明所述融合蛋白SIL碳18反相高效液相分析图(C18RP-HPLC)，层析柱：ZORBA 300SB-C185um，4.6*250mm；检测波长：280nm；纯度：96.7％。
图5本发明所述融合蛋白SIL体外靶向结合实验结果。
图6示本发明所述融合蛋白SIL结合不同靶细胞后对CTLL-2细胞增殖率影响。
图7示本发明所述融合蛋白SIL高剂量与低剂量与IL-2体内抗肿瘤实验对比结果。
图8示本发明所述融合蛋白SIL与IL-2对接种H22昆明小鼠生命延长率对比。
具体实施方式：
本发明公开了一种白细胞介素融合蛋白及其制备和其在医药领域的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明，一种靶向性的白细胞介素的融合蛋白，从N端至C端包括(1)特异性结合肿瘤细胞或者肿瘤血管内皮细胞的靶向结合区；(2)根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；(3)白细胞介素氨基酸序列
在一种实施方案中，本发明所述融合蛋白中靶向结合区可以是包括不少于3个但不多于50个氨基酸的氨基酸序列，优选的序列含有生长抑素同源的不多于15个氨基酸序列，在一个优选的实施方案中，本发明所述融合蛋白的靶向结合区含有如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，其中N端可带有大肠杆菌表达的起始密码子翻译的甲硫氨酸，在翻译过程中可能被不均一切除；作为优选，将如SEQ ID NO：2所示靶向结合区中酪氨酸由任一含有苯环或杂环的氨基酸替换，优选苯丙氨酸或色氨酸，不影响其靶向性。
作为优选，将如SEQ ID NO：2所示靶向结合区中酪氨酸由任一含有羟基的氨基酸替换或缺失，优选为苏氨酸，不影响其靶向性。
本发明所述融合蛋白的靶向结合区和白细胞介素可以直接由肽键或由连接区连接到一起。视需要而定，连接区可以有2至10个氨基酸连接靶向结合区与白细胞介素2。
在一个实施方案中，连接区有三个氨基酸：甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-(GGS)，在另一个实施例中有6个氨基酸甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGSGGS)。
在一个优选实施方案中，本发明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO：4所述的氨基酸序列，记作SIL。
在一个优选实施方案中，本发明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO：3所述的氨基酸序列。
本发明的另一方面也提供了编码本发明上述的融合蛋白的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了可以编码含有如SEQ IDD NO：3所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDD NO：4所示。
为了生产本发明的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA分子被整合至表达盒中，随后表达盒被插入合适的表达载体。然后，这一表达载体被转入宿主细胞或者动物用于重组蛋白表达。
表达盒至少包括以下几个内容：(1)转录起始区，(2)可以编码本发明所述的融合蛋白的DNA分子，该转录是在在转录起始区的调控下进行的，以及(3)转录中止区。
根据用于蛋白表达的宿主细胞的不同，转录起始区和转录中止区可以是天然存在或者人工构建的序列，该序列适合于真核或者原核细胞中的基因转录。此类序列在本技术领域内已为人所熟知。适当的含有转录起始序列的DNA片与适当的含有转录中止区的DNA片段与编码融合蛋白的DNA片段相连接。这种连接方法在本技术领域内已为人所熟知，比如，选择适当的限制性内切酶酶切以及连接。
表达盒可以被整合插入表达载体，随后这一表达载体被转入宿主细胞或者动物。一般情况下，表达载体还要包括复制起始序列，以及筛选标记，例如，对于细菌的蛋白表达，质粒是一种很有用途的载体。本技术领域内有很多种为人所熟知的可以用于此目的的质粒载体，包括，但是不仅限于，pET15b、pET22b、pET25b、pET28b等等。如果通过酵母细胞来重组表达融合蛋白，酵母表达载体，比如pPIC9，pAO815，pPICZ等等，可以作为表达载体。如果通过哺乳动物细胞来进行蛋白表达，也有很多合适的重组蛋白表达载体。用于哺乳动物细胞表达蛋白的表达载体包含的DNA序列，需要适合以同源重组方式整合插入宿主细胞染色体。哺乳动物细胞表达载体，比如pcDNA3.1，pSI等等。对于通过动物来表达融合蛋白，用于生产含有表达盒的转基因动物(转基因羊，牛，等等)的技术手段，在本技术领域内已为人所熟知。比如pBLG等等，可以作为转基因动物表达的载体。
获得转化的宿主细胞或者转基因动物后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下表达出融合蛋白。通过其理化性质和其它特性的差别运用各种分离方法分离纯化融合蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的，例如：常规的变性复性处理、离心、超声破碎、超滤膜过滤、金属亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、透析、高效液相层析等常规纯化方法及这些方法的结合。
本发明所述融合蛋白通过在肿瘤组织/部位激活NK细胞、CTL细胞、LAK细胞等提高局部组织和/或器官免疫系统杀伤肿瘤细胞的能力。本发明的另一个方面还提供所述融合蛋白的医药用途，或可以生产用于治疗一种疾病的药物。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1.用于表达本发明所述生长抑素同源靶向肽的白介素2融合蛋白质粒的构建
基于融合蛋白的N末端和N末端氨基酸序列以及待加入之N末端附加的靶向结合区氨基酸，设计并合成一对引物，并以聚合酶链反应(PCR)技术从人肝脏cDNA文库中扩增得到编码人白细胞介素2(IL-2)的DNA序列，也可以直接合成编码人白细胞介素2(C125S)的DNA序列作为模板，设计的一对引物为：
5上游引物：
CATATGTTCTGTTTCTGGAAGACGTGCACCGGCGGTAGCGCACCTAC(如SEQ ID NO：5所示)
其中依次含有NdeI位点：CATATG，包括24个核苷酸的靶向结合区编码序列：TTCTGTTTCTGGAAGACGTGCACC，链接区序列：GGCGGT以及其后的白细胞介素2退火序列：AGCGCACCTAC；
3(下游)引物：
CAACACTGACTCACCATCACCATCACCATTGAAGCTT(如SEQID NO：6所示)
其中依次含有退火序列：CAACACTGACT、组氨酸标签序列：CACCATCACCATCACCAT、终止密码子TGA及其后的HindIII位点。
以NdeI和HindIII酶切PCR扩增产物以及pET25b空质粒((工具酶皆购自Takara公司，质粒购自Novage公司)，上述酶切片段均以琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4DNA连接酶连接各片段，所得的重组质粒即为白细胞介素融合蛋白的表达载体，命名为pET-S-IL。融合蛋白结构如图1所示。
首先将连接反应混合物转化大肠杆菌XL-1Blue，在含有青霉素的培养基中保温过夜后，挑选阳性菌落并从中大量制备DNA，经DNA序列分析，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
进一步证实序列正确性后，将此重组质粒转化到携带T7启动子基因的感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Novagen)中，即为表达相应蛋白的工程菌，命名为SIL-BL21，该工程菌分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2010年5月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3867。
实施例2：本发明所述融合蛋白的表达与纯化
将重组质粒pET-S-IL转化的大肠杆菌BL21克隆加在LB培养基的培养瓶中培养(37℃)，待细菌密度达到OD600≈4-6，按接种量5-10％进行5L发酵罐培养，待OD600≈10-20，向培养基中加入0.5-1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，至诱导后OD600不再增加下罐，以10,000g×(15分钟)离心收获菌体。
将收获的菌体重悬于3M尿素100mM磷酸20mM Tris pH8.0缓冲液(buffer)中，室温放置1小时，并将细胞超声处理3次，20,000g离心收集包涵体。然后将包涵体溶解于8M尿素100mM磷酸钠50mM巯基乙醇Tris(pH 8.0)缓冲中放置4小时，以20000g离心20分钟收集上清。
将上清液上样于用上述缓冲液预平衡过的Ni Sepharose HighPerformance(GE公司)亲合柱，用8M尿素100mM磷酸钠20mM咪唑缓冲液以pH 8.0-4.0进行pH递减洗脱，pH4.0时得到纯度大于90％的重组蛋白，如图2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
将按上述方法从Ni+亲合柱洗脱下来的含目的融合蛋白的洗脱物，按1∶10的体积比迅速稀释于含有3M尿素、100mM NaCl、20mMTris-HCl(pH 8.0)、5mM还原态谷胱甘肽和0.05mM氧化态谷胱甘肽的溶液中以使蛋白质重折叠(复性)。经4度放置48小时后透析于PBS中，并用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜浓缩，进行蛋白纯度分析，如图3和图4所示。
实施例3：本发明所述融合蛋白体外靶向性研究
将人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞SMMC-7721、人乳腺癌细胞MB-MDA-231、人胰腺癌细胞PANC-1、人脐静脉内皮细胞HUVEC、人胚胎成纤维细胞M-20体外常规培养，消化离心，将上述细胞分别接种到12孔细胞培养板中，待细胞长至培养板70％-80％左右，加入不同浓度的白细胞介素2及本发明所述融合蛋白S-白介素2(SIL)样品(终浓度分别为2000U/ml、1000U/ml、500U/ml)，设PBS阴性对照组，加药后作用约4h后弃上清，用PBS连续清洗三遍，冲洗干净后加入无IL-2、密度20×104/ml的小鼠T淋巴细胞(CTLL-2)细胞1ml，过夜培养，第二天显微镜下观察，待阴性对照孔CTLL-2细胞基本凋亡时，每孔加入5mg/ml的四甲基噻唑蓝(MTT)约100ul，作用约4h，加入SDS-HCl裂解液过夜，酶标仪570nm下测OD值，计算CTLL-2增殖率。
计算公式：CTLL-2增殖率＝(OD加药组/OD空白组-1)×100％
结果表明：无靶向结合区的白细胞介素2(IL-2)与人胃癌细胞(SGC-7901)不结合，SIL能与之结合且呈剂量相关性，MTT显色结果与显微镜下观察结果一致(如图5)；SIL与人胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤细胞有特异性结合，与内皮细胞略有结合，且呈剂量相关性，与胎儿成纤维细胞基本不能结合(如图6)，说明多种肿瘤细胞及内皮细胞表达生长抑素受体，虽有差异但融合蛋白的靶向结合区可与之结合。
实施例4：SIL体内抗肿瘤活性----抑瘤率实验
昆明小鼠右前肢腋下接种小鼠肝癌(H22)，按1×106/ml，0.2ml/只进行接种，分为生理盐水组、IL-2高剂量组(6000U/只/天)、IL低(3000U/只/天)、SIL高(6000U/只/天)、SIL低(3000U/只/天)，每组10只，接瘤后静脉给药连续给药12天。停药后观察6天，处死小鼠，剥离肿瘤称重，计算每组平均瘤种和抑瘤率。抑瘤率以下式计算。
Figure GSA00000120356100141
结果表明，在高剂量组，SIL与IL-2的抑瘤率对比，无显著差异(P＞0.05)，在低剂量组，SIL与IL的抑瘤率对比，有非常显著差异(P＜0.01)，结果如图7所示；IL-2高剂量组有两只动物死亡，SIL高剂量动物没有死亡，说明SIL富集到肿瘤组织后，降低了对全身其它组织的毒副作用且SIL富集到肿瘤部位后，大大增强了其诱导CTL细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
实施例5：SIL体内抗肿瘤活性——生命延长率实验
昆明小鼠腹腔接种小鼠肝癌(H22)，按5×106/ml，0.2ml/只进行接种，分为生理盐水组、IL-2高剂量组(10000U/只/天)、IL中(5000U/只/天)、IL低(2500U/只/天)、SIL高(10000U/只/天)、SIL中(5000U/只/天、)SIL低(2500U/只/天)，每组10只，接瘤后静脉给药连续给药14天。停药后继续观察，记录各组小鼠生存及死亡情况。
结果表明，截至实验结束(40天)，生理盐水组动物均已死亡，其它各给药组存活动物只数分别为：SIL高(9只)＞SIL中(6只)＞IL高(5只)＝SIL低(5只)＞IL中(4只)＝IL低(4只)，SIL各剂量组存活小鼠数目均多于IL各剂量组，说明增加IL-2的靶向性后，明显增强了其抗肿瘤的活性，结果如图8所示。
以上结果说明，本发明所述连接了与生长抑素同源的靶向结合区的IL-2融合蛋白可与人胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞特异性结合，且呈剂量相关性，显著增强IL-2的靶向性，富集到肿瘤组织后，降低了对全身其它组织的毒副作用且SIL富集到肿瘤部位后，大大增强了其诱导CTL细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>山东先声麦得津生物制药有限公司
<120>靶向性白细胞介素融合蛋白及其制备方法与应用
<130>MP1002482
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>133
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1                   5                       10                    15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                     25                      30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                     40                     45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                     55                    60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                      70                  75                    80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                  85                        90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
              100                    105                    110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
          115                    120                      125
Ile Ser Thr Leu Thr
      130
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Phe Cys Tyr Trp Lys Ser Cys Thr
1                 5
<210>3
<211>144
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Phe Cys Tyr Trp Lys Ser Cys Thr Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
1                 5                       10                      15
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
              20                     25                     30
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
         35                      40                      45
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
    50                     55                      60
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
65                   70                    75                    80
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
                  85                     90                     95
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
                100                     105                    110
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
         115                    120                     125
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
    130                     135                        140
<210>4
<211>456
<212>DNA
<213>artificial
<400>4
atgttctgtt actggaagac gtgcaccggc ggtagcgcac ctacttcaag ttctacaaag     60
aaaacacagc tacaactgga gcatttactg ctggatttac agatgatttt gaatggaatt    120
aataattaca agaatcccaa actcaccagg atgctcacat ttaagtttta catgcccaag    180
aaggccacag aactgaaaca tcttcagtgt ctagaagaag aactcaaacc tctggaggaa    240
gtgctaaatt tagctcaaag caaaaacttt cacttaagac ccagggactt aatcagcaat    300
atcaacgtaa tagttctgga actaaaggga tctgaaacaa cattcatgtg tgaatatgct    360
gatgagacag caaccattgt agaatttctg aacagatgga ttaccttttc tcaaagcatc    420
atctcaacac tgactcacca tcaccatcac cattga    456
<210>5
<211>47
<212>DNA
<213>artificial primer
<400>5
catatgttct gtttctggaa gacgtgcacc ggcggtagcg cacctac
47
<210>6
<211>37
<212>DNA
<213>artificial primer
<400>6
caacactgac tcaccatcac catcaccatt gaagctt
37

Claims (11)

1.一种融合蛋白，其特征在于，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种表达盒，由转录起始区；受转录起始区调控的编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子；以及转录中止区组成。
5.重组了编码权利要求1所述融合蛋白DNA分子的表达载体。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒或病毒。
7.重组了编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子的细胞。
8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母菌或细菌。
9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞属大肠杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3867。
10.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，包括：
提供权利要求7～9任一项所述细胞或转染了编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子且表达所述融合蛋白的转基因动物；
使细胞或者转基因动物表达所述融合蛋白；以及分离所述融合蛋白。
11.如权利要求1所述融合蛋白在制造治疗胃癌、肝癌、乳腺癌或胰腺癌的药物中的用途。
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