CN106290925A - 免疫层析检测方法以及免疫层析检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
一种免疫层析检测方法以及免疫层析检测试剂盒，通过在抗体固定膜上设置环形检测区，在内环区域涂布抗第一检测物抗体，在外环分区域涂布不同浓度的抗第二检测物抗体；在检测时将第一检测物以及第二检测物的发色程度直接对比，根据对比的结果就能够从外环区域的读数中直接确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度，从而能够给出定量的检测结果，并且提高检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测分析领域，尤其是涉及一种免疫层析检测试剂盒以及免疫层析检测试剂盒制备方法。
背景技术
免疫检测技术是以抗体或抗原作为分析试剂，对待测物进行定性或定量分析的检测方法，其基本原理就是抗体和抗原之间的相互作用。免疫检测技术具有特异性强、灵敏度高、简便等优点，是现代生命科学的重要研究手段，在生物分析检测领域有着广泛的应用前景。
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原－抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。免疫层析技术是以以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上移动，同时使样品中待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生特异性、高亲和性的免疫反应。
在层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的检测线，而游离的显色标记物标记的受体则越过检测带，与免疫复合物自动分离，并在后续的层析过程中被富集或截留在层析材料的另一区域(质控带)．通过目测检测带和质控带的颜色，从而实现定性地检测待测物的目的。
免疫层析法检测技术因具有直观、快速、检测效率高、方法简便、无污染、费用低廉、灵敏度高、特异性强等优点，而被广泛应用于临床诊断、野外现场及家庭自我检测，对于挽救生命具有重大意义。
现有技术中，田中贵金属工业株式会社在201510017675.1的发明专利中，提出了一种能够测定临床检测样本中的两种被检测成份比例的免疫层析检测试剂盒，例如用于检测血液样本中HbA1c与HbA0比例的免疫层析检测试剂盒，通过HbA1c与HbA0比例确定检验结果是否属于阴性或者阳性。但是，该发明的免疫层析检测试剂盒中需要设置发色信号确认装置，在确定检测结果时，需要HbA1c以及HbA0的结果分别与发色信号确认装置进行比较，才能够确定是否阴性或者阳性；并且也无法得到定量的结果。
本发明提出了一种改进的免疫层析检测试剂盒，能够解决201510017675.1发明专利中的上述问题,将其全文引用于本发明。
发明内容
作为本发明的一个方面，提供了一种免疫层析检测方法，包括如下步骤：（1）对于样品进行前处理；（2）将该前处理样本以及展开液滴在样品垫上，使其与经标记物标记的抗体发生抗原抗体反应形成复合体；（3）复合体在抗体固定化膜上的环形区域展开并到达内环的抗第一检测物抗体涂布部以及外环不同分区域的抗第二检测物抗体涂布部；（4）复合体分别与内环的抗第一检测物抗体以及外环不同分区域的抗第二检测物抗体反应并且固定；（5）将内环的发色信号与外环不同分区域的发色信号进行比较，确定与内环发色信号最接近的外环分区域，根据该外环分区域的读数确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的第一浓度；（6）通过撕出线将内环的撕出区域撕出，将该撕出区域的发色信号与所述外环分区域的子区域的发色信号进行比较，根据比较结果确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的第二浓度。
优选的，所述第二浓度的精确度大于所述第一浓度。
优选的，所述样品为血液样品。
优选的，所述前处理为使血液中HbA1c的抗原决定基在血红蛋白蛋白质的表面露出。
优选的，所述第一检测物为HbA1c,所述第二检测物为HbA0。
作为本发明的另外一个方面，提供一种免疫层析检测试剂盒，其用于上述免疫层析检测方法。
优选的，所述免疫层析检测试剂盒，包括：粘合垫，其设置于底层，用于与设置于其上的层粘合；抗体固定膜，其粘合在粘合垫上，其上设置抗体涂布区域；垫层，其设置于抗体固定膜的一侧，含有经过标记物标记的抗体；吸水垫，其设置于抗体固定膜另一侧，用于吸收多余样本；样品垫，其设置于垫层一侧，与垫层和抗体固定膜连接侧相对，用于接收样本；其特征在于：所述抗体涂布区域为环形区域，包括内环以及外环；所述内环和外环之间设置阻水区域；所述内环涂布抗第一检测物抗体；所述外环径向分割为多个面积相同的区域，各个区域之间设置阻水区域；所述外环各个区域依次涂布不同浓度的抗第二检测物抗体；所述外环各个区域分别标记读数，该读数表示第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度；所述免疫层析检测试剂盒不设置比色卡；样品在内环涂布区域以及外环涂布区域发生反应后，从外环涂布区域中选择与内环涂布区域的发色信号强度一致的区域，根据该区域的读数确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度。
优选的，设置所述外环的涂布区域的各个分区域的抗第二检测物抗体的浓度，使其中仅有一个分区域的抗第二检测物抗体的浓度对应的第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度为阴性。
优选的，所述外环涂布区域的各个分区域外分别设置多个子区域，各个子区域依次涂布不同浓度的抗第二检测物抗体，子区域涂布的抗第二检测物抗体浓度位于其所属分区域浓度与高于其所属分区域的下一分区域浓度之间；所述各个子区域之间设置阻水区域；所述各个子区域分别标记对应的表示第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度的读数。
优选的，通过打孔装置在所述内环设置一圈间隔的小孔，形成撕出线包围的撕出区域；所述撕出区域粘结撕出条，通过所述撕出条能够将该撕出区域从内环撕出，用于将内环的发色强度与最接近的分区域的子区域的发色强度进行比较。
附图说明
图1是本发明实施例的免疫层析检测试剂盒的俯视图。
图2是本发明实施例的免疫层析检测试剂盒的侧视图。
图3是本发明改进实施例的免疫层析检测试剂盒的抗体固定膜的涂布区域示意图。
图4是本发明实施例的免疫层析检测方法的步骤图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。而且，应当理解，在此描述的各种各样的实施例的特征不互斥，并且能在各种各样的组合和换变过程中存在。
下面以检测血液样本HbA1c相对于HbA0的比例为例，说明本发明的实施例，其中HbA1c为第一检测物，HbA0为第二检测物。应当理解，本发明的技术方案除了能够用于上述被检测物之外，还可以将PSA (Free-PSA/Total-PSA比)、动脉硬化指数即胆固醇(LDL胆固醇/HDL 胆固醇比)、或者肝功能障碍或肾病综合症的标志(白蛋白/球蛋白比) 等作为被检测物质进行分析。
参见图1和图2，本发明实施例的免疫层析检测试剂盒，包括：粘合垫1，抗体固定膜2，垫层3，吸水垫4以及样品垫5。其中，粘合垫1设置于底层，其表面为粘合面，能够将设置于其上的层粘合。抗体固定膜2粘合在粘合垫1上，其上设置抗体涂布区域，抗体固定膜2可使用现有技术中已知的固定膜材料，例如硝酸纤维素膜(NC膜)等。
抗体固定膜2上设置抗体涂布区域，抗体涂布区域包括环形区域21以及线形区域22。其中环形区域21为检测区，其涂布抗检测物抗体，可以使用现有技术已知的制备抗检测物抗体的方案，例如201510017675.1中的方案制备抗HbA1c抗体以及抗HbA0抗体。线形区域22为控制线，其上涂布线形的抗IgG抗体，
环形区域21包括内环211以及外环212，内环211和外环212之间设置阻水区域。内环211涂布抗第一检测物抗体。外环212径向分割为多个面积相同的分区域，各个区域之间设置阻水区域。外环212各个分区域依次涂布不同浓度的抗第二检测物抗体。外环212各个区域分别标记读数，该读数表示第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度。该读数可以预先确定，通过对于已知浓度的抗第二检测物抗体，改变建模样品中的第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度，直到达到的第一检测物以及第二检测物的发光色度相同，此时该建模样品中建模样品中的第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度极为该已知浓度的抗第二检测物抗体对应的读数。
例如外环212可以分为三个区域，各个区域分别涂布0.05mg/ml、0.1mg/ml以及0.3mg/ml的抗HbA0抗体单克隆抗体，其对应的读数为5.5%，6.0%以及7.0%。样品在内环211涂布区域以及外环212涂布区域发生反应后，从外环212涂布区域中选择与内环211涂布区域的发色信号强度一致的区域，根据该区域的读数即可第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度。例如，内环211与外环212中标记为5.5%的区域颜色最相近，即表示该样品中第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度为5.5%。
垫层3设置于抗体固定膜2的一侧，含有经过标记物标记的抗血红蛋白抗体，可以如201510017675.1中的方案制备标记物溶液，其中使标记物溶液中标记的抗血红蛋白单克隆抗体-1以及抗血红蛋白单克隆抗体-2所用的液体中含有的金的量为10:1。吸水垫4，其设置于抗体固定膜2的另一侧，用于吸收多余样本。样品垫5，其设置于垫层3一侧，与垫层3和抗体固定膜2连接侧相对，用于接收样本，可以使用例如纤维素滤纸、玻璃纤维滤纸作为样品垫材料。
通过本发明的上述环形检测区的设置，从而将第一检测物以及第二检测物的发色程度直接对比，根据对比的结果就能够从外环区域的读数中直接确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度。因此具有如下优点：1、不需要使用发色信号确认装置，可以直接进行比较；2、可以进行定量的确定读数；3、内环与外环各个区域都直接临近，可以同时将内环与外环各个区域直接对比。
本发明优选的实施例，参见图3，外环212涂布区域的各个分区域外分别设置多个子区域，各个子区域依次涂布不同浓度的抗第二检测物抗体，子区域涂布的抗第二检测物抗体浓度位于其所属分区域浓度与高于其所属分区域的下一分区域浓度之间。各个子区域分别标记对应的表示第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度的读数。通过上述设置，能够进一步更精确地确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度。优选地，由于在检查结果为阴性时，用户仅需结果正常即可；而检查结果为阳性时，用户更关心确切的检测值。因此，可以设置外环212的涂布区域的各个分区域的抗第二检测物抗体的浓度，使其中仅有一个分区域的抗第二检测物抗体的浓度对应的第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度为阴性。
优选的，可以通过打孔装置在内环211设置一圈间隔的小孔，形成撕出线包围的撕出区域。在该撕出区域粘结撕出条，通过该撕出条能够将该撕出区域从内环211撕出，将该撕出条放置于外环212的分区域的子区域内进行比较发色强度的比较，从而能够更精确的确定检测结果。
本发明的另外一个实施例，提供了上述免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：（1）设置底层的粘合垫；（2）将抗体固定膜粘合在粘合垫上；（3）在抗体固定膜上的内环区域涂布抗第一检测物抗体；（4）在抗体固定膜上的外环分区域涂布不同浓度的抗第二检测物抗体；（5）通过预先确定第一检测物与第二检测物发色强度相同时，第二检测物抗体浓度与第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度的关系，在外环分区域标记第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的浓度值；（6）在所述外环涂布区域的各个分区域外分别设置多个子区域，各个子区域依次涂布不同浓度的抗第二检测物抗体，子区域涂布的抗第二检测物抗体浓度位于其所属分区域浓度与高于其所属分区域的下一分区域浓度之间；（7）在抗体固定膜上与环形区域距离特定距离的位置涂布线形的抗IgG抗体；（8）在抗体固定膜的一侧设置垫层，其含有经过标记物标记的抗体；（9）在抗体固定膜的另一侧设置吸水垫；（10）在垫层的一侧设置样品垫；（11）通过打孔装置在内环设置一圈间隔的小孔，形成撕出线包围的撕出区域；（12）所述撕出区域粘结撕出条，通过所述撕出条能够将该撕出区域从内环撕出。
参见图4，本发明实施例的免疫层析检测方法，包括如下步骤：（1）对于样品进行前处理；（2）将该前处理样本以及展开液滴在样品垫上，使其与经标记物标记的抗体发生抗原抗体反应形成复合体；（3）复合体在抗体固定化膜上的环形区域展开并到达内环的抗第一检测物抗体涂布部以及外环不同分区域的抗第二检测物抗体涂布部；（4）复合体分别与内环的抗第一检测物抗体以及外环不同分区域的抗第二检测物抗体反应并且固定；（5）将内环的发色信号与外环不同分区域的发色信号进行比较，确定与内环发色信号最接近的外环分区域，根据该外环分区域的读数确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的第一浓度；（6）通过撕出线将内环的撕出区域撕出，将该撕出区域的发色信号与所述外环分区域的子区域的发色信号进行比较，根据比较结果确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的第二浓度。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述公开内容之后，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，在不脱离本发明原理前提下，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种免疫层析检测方法，包括如下步骤：（1）对于样品进行前处理；（2）将该前处理样本以及展开液滴在样品垫上，使其与经标记物标记的抗体发生抗原抗体反应形成复合体；（3）复合体在抗体固定化膜上的环形区域展开并到达内环的抗第一检测物抗体涂布部以及外环不同分区域的抗第二检测物抗体涂布部；（4）复合体分别与内环的抗第一检测物抗体以及外环不同分区域的抗第二检测物抗体反应并且固定；（5）将内环的发色信号与外环不同分区域的发色信号进行比较，确定与内环发色信号最接近的外环分区域，根据该外环分区域的读数确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的第一浓度；（6）通过撕出线将内环的撕出区域撕出，将该撕出区域的发色信号与所述外环分区域的子区域的发色信号进行比较，根据比较结果确定第一检测物相对于第一检测物和第二检测物总量的第二浓度。
2.根据权利要求1所述的免疫层析检测方法，其特征在于：所述第二浓度的精确度大于所述第一浓度。
3.根据权利要求2所述的免疫检测方法，其特征在于：所述样品为血液样品。
4.根据权利要求3所述的免疫层析检测方法，其特征在于：所述前处理为使血液中HbA1c的抗原决定基在血红蛋白蛋白质的表面露出。
5.根据权利要求4所述的免疫层析检测方法，其特征在于：所述第一检测物为HbA1c,所述第二检测物为HbA0。
6.一种免疫层析检测试剂盒，其用于权利要求1－5所述的免疫层析检测方法。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170104 |