CN106191230A - 用氨基酸结合脱氧核苷酸进行dna测序的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法。本发明利用氨基酸构建四种不同带电量的脱氧核苷酸类物，四种核苷酸对应四种不同氨基酸，至少包括一个氨基酸，也可以是多个氨基酸组成的不同长度的缩聚物，可以是同种氨基酸的缩聚物或不同氨基酸的缩聚物；然后利用脱氧核苷酸类似和DNA连接酶对DNA模板链进行测序延伸；在延伸的过程中释放结合在dNTP上的氨基酸，利用氨基酸的不同带电量并结合半导体芯片技术，对碱基进行识别，实现DNA序列测定。本方法突破了DNA的光学检测的局限，可以实现低成本的单分子测序，方法简单可靠。

Description

用氨基酸结合脱氧核苷酸进行DNA测序的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA序列测定的方法，具体涉及一种核苷酸结合不同电量的氨基酸进行核酸序列测定的方法。

背景技术

DNA(脱氧核糖核酸)是组成生物体的最基本物质之一，其序列的变化造就了如今这个纷繁美丽的物质世界。几乎可以说地球所有的生命现象都来源于A、T、C、G这几个碱基的不同排列顺序，并且这种序列并非无意义的随机组合，而是蕴含了相当丰富的遗传信息以及生命内涵。通过测序技术就可以有效地获取基因组的核酸序列，极大地方便人们从基因水平上认识生命体的差异性。因此，DNA测序对生命科学研究、疾病诊断、个性化用药等均具有十分重要的意义。

从人类基因组计划完成以来，基因组测序技术得到了迅猛的发展。20世纪70年代中期，由Sanger发明的双脱氧链末端终止法为代表的第一代测序技术帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量测序工作，但是其存在着成本高，速度慢，通量低等不足，已经不能满足研究应用的需要。1995年以后出现了以Roche的454、ABI的Solid和Illumina的Solexa为代表的二代测序技术，其主要是根据模板序列合成或杂交形成互补链，在互补链延伸过程中引入不同颜色荧光标记的dNTP，通过捕获不同荧光信号来获得序列信息，而2010年Ion Torrent推出的PGM，则利用半导体芯片检测碱基聚合反应产生的质子，进行测序，特点是经济快速，但是其准确性不高。相对于一代测序，二代测序有了革命性的改变，其通量、成本和速率都得到了卓越的提升，但是其技术瓶颈是难以克服的，尤其是模板扩增和序列读长。以Pacific Bioscience的SMRT技术为代表的第三代测序也是基于边合成边测序的原理，在聚合酶活性位点上不同颜色荧光标记磷酸基团的dNTP与模板逐个结合，产生荧光信号，通过获取荧光信号读取核酸序列信息。与二代测序相比，第三代测序实现了单分子测序，具有不需要扩增，读长长等优势，但是其准确率还有待提高。

目前上市测序系统，包括第一代、第二代、第三代，绝大多数都是采用四种不同颜色的荧光标记dNTP，检测时通过dNTP与模板聚合释放的荧光信号来识别不同碱基，也就是信号的获取是通过光学检测来实现的。而单分子荧光检测对光学器件的灵敏度和视场背景干扰的消除等技术要求非常苛刻，这也是二代测序此前无法实现单分子测序的一个重要原因。虽然Pacific Bioscience的RS系统利用零模波导原理消除背景，但是其仪器价格非常昂贵，接近100万美元。

此外还有一个非常关键的因素就是价格，人类基因组计划开展伊始阶段，计划30亿美元完成人的基因组测序工作，相当于一个碱基1美元。随着测序技术的发展，如今主流的测序设备完成一个人的需要1万美元，可以看到测序成本已经比十几年前降了6个数量级，但是其大规模应用还是受限，所以必须要在 现有的技术体系上实现突破，直至出现完美的测序技术！

发明内容

基因测序能够揭示基因组DNA的脱氧核苷酸排列顺序，获取生物遗传信息。快速和准确的获取生物的遗传信息对生物和医学具有十分重要的意义。本发明的一个目的在于提供一种基于氨基酸结合dNTP进行DNA测序的方法，本发明利用不同带电量的氨基酸区分不同碱基，通过检测氨基酸基团的电荷实现核酸序列经济、快速地测定，打破荧光检测的局限，有助于降低测序成本。

DNA由A、T、C、G四种脱氧核苷酸组成，为了区分这四种脱氧核苷酸，需要对其进行标记，使其带有不同的电荷或不同的长度标志被检测芯片识别。不同的氨基酸带有不同的电荷量，所以本发明设计四种带不同电荷量的氨基酸四磷酸脱氧核苷酸，其中氨基酸是可离去基团，当DNA进行合成时，每合上一个脱氧核苷酸，它所带的氨基酸基团就会离去并进入半导体芯片上的检测井，不同带电量的氨基酸基团将引起井内流过场效应晶体管的电流的不同变化，从而被芯片捕获并识别，从而测定A、T、C、G排列顺序。

为实现上述发明目的，本发明技术方案为：一种基于氨基酸结合脱氧核苷酸的DNA测序方法，包括以下步骤：

(1)利用dNTP构建氨基酸-磷酸脱氧核苷酸(核苷酸类似物)，首先制备磷酸化氨基酸，然后将磷酸化的氨基酸和脱氧核苷酸的磷酸基团结合，至少包括2个磷酸基团，如图1所示。其中Base代表核苷碱基，包括A、T、G、C或U，AA代表不同带电量的氨基酸基团，n表示磷酸基团个数。不同带电量的氨基酸取代核苷末端磷酸基团的-OH可以得到至少四种氨基酸修饰的核苷酸类似物；

所述不同带电量核苷酸类似物的磷酸基团个数n可以是0，1，2，3，4...；

所述氨基酸可以是赖氨酸，精氨酸，组氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，天冬氨酸等氨基酸基团；

所述氨基酸核苷酸类似物至少包括一个氨基酸基团，也可以是多个氨基酸形成的缩聚物；

所述磷酸基团和氨基酸基团可以直接或间接结合；

作为优选A、T、C、G脱氧核苷酸分别和赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸结合形成脱氧核苷酸类似物；

作为优选磷酸基团个数≥2。

(2)将待测结合有引物的DNA模板及缓冲溶液移至检测芯片中，待测DNA模板进入芯片的井中，每个井容纳零条或一条DNA链，井特定位置固定DNA连接酶，于65℃孵化碱基延伸反应。

所述缓冲溶液包含上述四种氨基酸脱氧核苷酸类似物，20mM Tris-HCl，50mM KCl，5mM MgSO4，0.02％CA-630，pH 9.2；

所述DNA连接酶为TherminatorγDNA聚合酶。

(3)基于边合成边测序的原理，当DNA模板的互补链每结合上一个碱基时，该碱基5’-磷酸与聚磷酸之间的键被切断，其所结合的氨基酸基团释放出来，四种碱基分别释放不同的氨基酸基团，释放出的氨基酸 基团进入半导体芯片的井1中，将引起流过对应井下金属氧化物场效应晶体管6电流的变化，通过检测该电流的变化量并记录该检测井位置，确定氨基酸基团，进而可以确定对应碱基完成排序。

所述氨基酸至少包括一个氨基酸基团，四种核苷酸对应四种不同氨基酸基团，也可以是多个氨基酸的缩聚物，可以是同种氨基酸的缩聚物或不同氨基酸的缩聚物，四种核苷酸可以分别对应四种不同长度的氨基酸缩聚物。

所述δ磷酸与氨基之间的键用碱性磷酸酶切断，释放出游离的氨基酸基团。

所述不同的氨基酸基团所带的电荷量以及不同长度的氨基酸缩聚物所带的电荷量均不相同。

所述的半导体芯片，包括检测井1，井侧壁SiO₂2，井底二氧化钽3，金属氧化物场效应晶体管5，及连接二氧化钽和金属氧化物场效应晶体管栅极的一层或多层铝、铜或含铝或铜的金属混合物4。

(4)根据由氨基酸基团的电荷量引起的流过金属氧化物场效应晶体管的电流变化，得到碱基的排列顺序，获得DNA序列信息。

用氨基酸结合dNTP进行DNA测序的方法，结合半导体芯片技术，通过检测电流信号完成基因测序，没有显微镜和成像装置，结构简单；集成度更高，可同时多个检测；并且可实现单分子检测，突破现有光学测序的瓶颈，迅速降低测序成本。

附图说明

图1是氨基酸标记脱氧核苷酸示意图；图2是半导体芯片井示意图；图3是四种单氨基酸脱氧核苷酸类似物：分别为赖氨酸四磷酸脱氧腺苷、精氨酸四磷酸脱氧胸苷、谷氨酸四磷酸脱氧胞苷、天冬氨酸脱氧鸟苷；图4是用香豆素修饰的赖氨酸8聚体、12聚体、16聚体和20聚体四磷酸脱氧核苷酸：香豆素-8聚赖氨酸-4磷酸脱氧腺苷、香豆素-12聚赖氨酸-4磷酸脱氧胸苷、香豆素-16聚赖氨酸-4磷酸脱氧胞苷、香豆素-20聚赖氨酸-4磷酸鸟苷。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。

实施例1

本实施例中，制备四种不同带电量的氨基酸脱氧核苷酸类似物，赖氨酸四磷酸脱氧腺苷(Lys-dA4P)、精氨酸四磷酸脱氧胸苷(Arg-dT4P)、谷氨酸四磷酸脱氧胞苷(Glu-dC4P)、天冬氨酸四磷酸脱氧鸟苷(Asp-dG4P)，如图3所示。首先通过将氨基酸磷酸化，然后将磷酸化的氨基酸和三磷酸核苷结合得到所需的四种氨基酸脱氧核苷酸类似物。

选取模板链5′-GCACCATATAATCGCTCGCATATTA-3′，在半导体芯片上固定γDNA聚合酶和聚核苷酸模板，加入1X Therminatorγ反应缓冲液[50mM KCl，20mM Tris-HCl，5mM MgSO4，0.02％IGEPAL CA-630(pH 9.2)]。模板起始碱基为A，其互补碱基为T，因此移取精氨酸四磷酸脱氧胸苷作为反应底物， 然后待Arg-dT4P结合上母链后，用碱性磷酸切断N-P键释放Arg，释放的Arg进入芯片的检测井。氨基酸基团所带的电荷，将改变流过检测井下金属氧化物场效应晶体管的电流，带不同电荷量的氨基酸基团导致的电流变化不同，检测该电流变化量并记录井位置就可以对氨基酸基团种类进行识别，传出信号，获得碱基信息。

实施例2

本实施例中，以赖氨酸的缩聚物作为标志物与dNTP结合形成氨基酸脱氧核苷酸类似物。选择用香豆素修饰的赖氨酸8聚体、12聚体、16聚体和20聚体与用二氨基庚烷修饰的四磷酸脱氧核苷酸结合，分别形成香豆素-8聚赖氨酸-4磷酸脱氧腺苷、香豆素-12聚赖氨酸-4磷酸脱氧胸苷、香豆素-16聚赖氨酸-4磷酸脱氧胞苷、香豆素-20聚赖氨酸-4磷酸鸟苷，如图4所示。

本实施例其余步骤与实施例1相似，其余不同点为将单个氨基酸替换为多个氨基酸，检测时可以实现信号放大的作用及减弱分子的热运动速率便于检测。

以上所述仅为本发明的可行实施例具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，包括构建可离去的氨基酸脱氧核苷酸类似物，AA-dNTP：A、T、C、G或U分别结合不同带电量的氨基酸基团；进行模板延伸反应时，碱基结合到模板上释放出其所携带的氨基酸基团；然后通过检测氨基酸基团达到区别碱基的目的，完成DNA测序。

2.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，其特征在于氨基酸基团作为脱氧核苷酸的标志物，也可以是其他带电基团，或者是具有其他不同特性，如不同大小或不同形状的氨基酸基团。

3.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，其特征在于磷酸基团与氨基酸基团直接或间接结合，通过酶切割，将氨基酸等标志物从测序合成链中离去。

4.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，其特征在于磷酸基团个数≥2。

5.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，其特征在于磷酸基团和氨基酸基团可以直接相连，也可以通过连接基团相连，如双氨基烷烃等。

6.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，其特征在于至少包括一个氨基酸，也可以是多个氨基酸的缩聚物，或多种不同氨基酸形成的混合缩聚物。

7.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，其特征在于所述DNA连接酶为TherminatorγDNA聚合酶。

8.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，其特征在于标志物是带电的氨基酸或其他带电基团，可以通过电信号检测获得标志物种类和信号强度的物质。

9.根据权利要求1所述的一种基于不同电量的氨基酸脱氧核苷酸的DNA测序方法，氨基酸基团被释放后进入集成电路芯片的检测井，不同带电量的氨基酸基团引起检测井下金属氧化物场效应晶体管电流的变化，通过检测电流变化量及检测井在集成电路芯片中的位置，达到区别碱基的目的，完成DNA测序。

10.根据权利要求9所述的半导体芯片，其特征在于检测井底材料为二氧化钽等化合物，连接二氧化钽和金属氧化物场效应晶体管栅极的是一层或多层铝、铜或含铝或铜的金属混合物；检测芯片至少包括一个井结构阵列。