CN115323045A - 一种基因测序试剂及基因测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种基因测序试剂及基因测序方法，本方法包括包括：将化合物1‑4和聚合酶同时加入体系中进行核苷酸聚合反应得一中间态复合体；洗去未反应的化合物1‑4维持中间态复合体状态，检测记录每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记，判断DNA模板上对应位置的碱基；将化合物5‑8和聚合酶加入处理后的反应体系中进行核苷酸聚合反应；往反应后的体系中加入切割液洗去化合物5‑8中的可切割保护基团，移除溶液相并用缓冲液冲洗；洗去反应后替换下来的化合物1‑4；本发明最终并入新合成链的碱基为天然碱基，没有疤痕残留，不影响新合成链的柔韧性，聚合酶对链的持续延伸的结合效率，有利于减少碱基互补错配几率，提高测序读长和数据质量。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序技术领域，具体为一种基因测序试剂及基因测序方法。
背景技术
基因测序是医学和生物学发现的重要推动力，随着基因测序技术的迅猛发展，高通量基因测序技术已深入生命科学的各个领域，高通量基因测序采用克隆扩增和边合成边测序(SBS)的测序化学技术，可以实现了快速、准确的测序，经过近十年来的迅猛发展，已经深入到生命科学的各个领域，不仅有力地推动了基础研究的发展，在临床应用阶段也占据重要的角色。在目前最为流行的高通量基因测序平台中，为了测定碱基类型，将荧光染料标记的四种可逆终止核苷酸(Reversible Termination Nucleotide，NRT)加入反应体系，通常的，每个修饰NRT的荧光染料标记通过可切割链连接在碱基上，并在3’-OH端加以可切割的保护基团，不同的NRT会发出独特的荧光信号，该信号可用于确定DNA序列的顺序。目前修饰在NRT上的荧光染料标记通过可切割链连接在碱基上后，大多在洗脱过程中都会出现部分连接链化学结构残留在新合成核苷酸链上的现象，这些残留的化学键会影响新合成链的柔韧性，聚合酶对链的持续延伸的结合效率及碱基互补错配几率，从而影响测序的质量。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种基因测序试剂及基因测序方法，最终并入新合成链的碱基为天然碱基，没有“疤痕”残留，不会影响新合成链的柔韧性，聚合酶对链的持续延伸的结合效率，有利于减少碱基互补错配几率，提高测序读长和数据质量。
为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
一方面，本发明提供一种基因测序方法，包括：
S1，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7和化合物8；
S2，将待测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇；
S3,将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸聚合反应得一中间态复合体；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4维持S3的中间态复合体状态，并检测记录每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记，判断DNA模板上对应位置的碱基；
S5，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶加入S4处理后的反应体系中进行核苷酸聚合反应；
S6，往S5反应后的体系中加入切割液洗去化合物5、化合物6、化合物7、化合物8中的可切割保护基团，移除溶液相并用缓冲液冲洗干净；
S7,洗去S6中反应后替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S8，重复步骤S3至S7一次或多次；
所述化合物1、化合物2、化合物3和化合物4为2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，具备式(I)结构；
所述化合物5、化合物6、化合物7和化合物8为2’-脱氧核苷酸衍生物，具有式(II)的结构；
所述式(I)和所述式(II)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R5各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
L1为连接基团或可切割连接基团中的一种。
进一步，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2各自独立地为可发出不同荧光信号的荧光基团；
R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
进一步，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团，R3不存在；化合物2中R2为不同荧光基团，能够发出与化合物1中R2荧光基团不同的荧光信号，R3不存在；化合物3中的R2为荧光基团与化合物1中R2荧光基团相同，或者是能发出与化合物1中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团，化合物3中的R3则是与化合物2中R2相同的荧光基团，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物4中R2和R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
进一步，所述S4包括：
S4a，洗去未反应得化合物1、化合物2、化合物3，化合物4；
S4b，加入能与化合物3中的R3可反应活性基团快速结合的荧光基团标记的活性基团，从而将第二种荧光基团引入化合物3中，活性基团上标记的荧光基团与化合物2中R2相同，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；
S4c，加入扫描缓冲液，激发光源检测记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液；
所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团，R3不存在；化合物2中R2为不同荧光基团，能够发出与化合物1中R2荧光基团不同的荧光信号，R3不存在；化合物3中的R2荧光基团与化合物1中R2荧光基团相同，或者是能发出与化合物1中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物3中的R3为可反应活性基团，可以与荧光基团标记的活性基团快速结合，活性基团上标记的荧光基团与化合物2中R2相同，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物4中R2和R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
进一步，所述S4包括：
S4a，洗去未反应得化合物1、化合物2、化合物3，化合物4，之后加入扫描缓冲液调节反应环境使得化合物1和化合物2能够被激发发出荧光，检测并记录荧光信号；
S4b，洗去扫描缓冲液，加入化合物1所标记荧光基团的活性基团，将该荧光基团引入化合物3中使得化合物3能发出荧光信号，同时调节反应环境，淬灭化合物2上荧光基团的荧光；
S4c，加入扫描缓冲液，激发光源检测记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液；
所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团；化合物2中R2为环境高敏荧光染料基团，该荧光基团在特定条件下能发出和化合物1的荧光基团相同的荧光信号，且能快速响应反应体系环境变换发生荧光淬灭现象；化合物3中R2为可反应活性基团；化合物4中R2为H或不存在；
R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
另一方面，本发明提供一种基因测序试剂，包括聚合酶、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7和化合物8；
所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4为2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，具备式(I)结构；
所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8为2’-脱氧核苷酸衍生物，具有式(II)的结构；
所述式(I)和所述式(II)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R5各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
L1为连接基团或可切割连接基团中的一种。
进一步，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2各自独立地为可发出不同荧光信号的荧光基团；
R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
进一步，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团，R3不存在；化合物2中R2为不同荧光基团，能够发出与化合物1中R2荧光基团不同的荧光信号，R3不存在；化合物3中的R2为荧光基团与化合物1中R2荧光基团相同，或者是能发出与化合物1中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团，化合物3中的R3则是与化合物2中R2相同的荧光基团，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物4中R2和R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
进一步，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团，R3不存在；化合物2中R2为不同荧光基团，能够发出与化合物1中R2荧光基团不同的荧光信号，R3不存在；化合物3中的R2荧光基团与化合物1中R2荧光基团相同，或者是能发出与化合物1中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物3中的R3为可反应活性基团，可以与荧光基团标记的活性基团快速结合，活性基团上标记的荧光基团与化合物2中R2相同，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物4中R2和R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
进一步，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团；化合物2中R2为环境高敏荧光染料基团，该荧光基团在特定条件下能发出和化合物1的荧光基团相同的荧光信号，且能快速响应反应体系环境变换发生荧光淬灭现象；化合物3中R2为可反应活性基团；化合物4中R2为H或不存在；
R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
进一步，所述碱基或类似物为以下任意一种结构的化合物：
进一步，保护基团为具有以下任意一种结构的基团：
进一步，所述可切割连接基团是具有以下任意一种结构的基团：
其中，R1’，R2’各自独立地为卤素、-H、C1-C5脂肪链中的一种。
本发明的有益效果在于：本发明提供的一种基因测序试剂及基因测序方法，包括2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，其第一特征是5’-端，第一，二个磷酸基团之间的O被CH2基团取代，其第二特征是在核苷酸多磷酸衍生物的碱基上标记有荧光基团或可反应活性基团，这类核苷酸多磷酸衍生物在进行SBS测序过程中，可以被DNA聚合酶识别并将其并入待测DNA链模板上，由于CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，DNA链延长终止，而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸上的2’-OH的缺失也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时核苷酸多磷酸衍生物和聚合酶以及核酸模板链形成一中间态复合体，通过检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物，据此判断DNA模板上对应位置的碱基；拍照结束后，加入可以正常形成磷酸二酯键的3’-保护基团-2’-脱氧三磷酸核苷酸，竞争性的取代上述2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，完成这一轮SBS链增长，3’-保护基团确保每次只增长一个碱基，且每一轮SBS测序后3’-保护基团-2’-脱氧三磷酸核苷酸的保护基团可被切割生成天然的3’-OH-2’-脱氧三磷酸核苷酸，从而不影响下一轮SBS反应，最终并入新合成链的碱基为天然碱基，没有“疤痕”残留，有利于提高测序读长和数据质量。此外，本发明测序方法除了提供四色荧光和双色荧光SBS测序试剂和方法外，还提供单色荧光试剂和测序方法，测序仪仅需配备一个激发光源和一个相机，从而降低了测序仪的制造成本和体积，降低广大医院的开机门槛，有利于测序仪往更广阔的的三四线城市医院和研究机构扩散，适合各级医院本地化检测使用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
一种基因测序试剂，包括聚合酶、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8；
所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4为2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，具备式(I)结构,所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8为2’-脱氧核苷酸衍生物，具有式(II)的结构：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2，R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；荧光基团包括为能够发岀相同荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同或不同荧光信号的荧光基团；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R5各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
L1为连接基团或可切割连接基团中的一种。
在本发明实施例中，使用聚合酶来进行核苷酸聚合反应，聚合酶是指能够催化聚合反应的任何天然或非天然存在的酶或其他催化剂，包括各种已知的天然和改性的核酸聚合酶，例如DNA(脱氧核糖核酸，Desoxyribonucleic Acid)聚合酶、RNA(核糖核酸，Ribonucleic Acid)聚合酶以及逆转录酶。
聚合酶能够以RNA或单链DNA为模板合成新的DNA链，可根据实际需要，选择合适的聚合酶来进行核苷酸聚合反应，也可以选择多种聚合酶的混合来使用。
在本发明实施例中，使用DNA聚合酶进行核苷酸聚合反应(以下简称聚合酶M)。
本发明中各化合物分别为核苷酸A、(T/U)、C和G的衍生物，核苷酸是指核苷-5’-多磷酸化合物或其结构类似物，具有碱基互补配对能力，其可以通过核酸聚合酶掺入以延伸生长的核酸链，可以在一个或多个碱基、糖或磷酸基团上对核苷酸进行修饰，核苷酸可标记有荧光染料或可反应活性基团。
保护基团是能被聚合酶有效识别,能掺入生长中的DNA链中,并在每一轮SBS测序后能被切割脱离的3’-OH修饰基团，所述可切割连接基团是指链接5’磷酸或碱基的荧光基团、环境高敏荧光基团、能发出相同荧光信号的荧光基团、能够进行连接反应的可反应活性基团之间的任意一种小分子基团，所述能发出相同荧光信号的荧光基团是指在同一激发光源波长下能够发出和选用的环境高敏荧光染料一致或接近的发射波长的荧光，并被检测判断为同一荧光信号的非环境高敏荧光染料。保护基团可响应切割剂包括但不限于Na2S2O4)、THP)、TEC、DTT、弱酸、Pd(0)或光照射(例如紫外线照射)等的作用而去保护，保护基团包括但不限于以下几种：
在本发明实施例中核苷酸衍生物修饰有可切割链基团，可切割链基团是指响应于外部刺激(例如，酶、亲核/碱性试剂、还原剂、光照射、亲电/酸性试剂、有机金属和金属试剂或氧化剂)而可正交切割的(例如，可特异性切割)的链基团。在正交切割反应中，使用的切割剂包括但不限于Na2S2O4)、THP)、TEC、DTT、弱酸、Pd(0)或光照射(例如紫外线照射)等，所述可切割连接基团是具有以下任意一种结构的基团：
其中，R1’，R2’各自独立地为卤素、-H、C1-C5脂肪链中的一种。
所述可反应活性基团(Active Group)是能够与携带有荧光基团的互补基团进行特异性正交连接反应的缀合物反应性基团。所述的正交连接反应的化学反应包括但不限于∶施陶丁格连接反应，铜离子催化的叠氮与炔基的环加成反因，环张力驱动的叠氮与炔基的环加成反应，地高辛与地高辛抗体间的结合反应，狄尔斯—阿尔德反应，Suzuki交叉偶联反应，疏基和疏基衍生物的二硫键形成反应，巯基与马来酰亚胺形成硫醚的反应，疏基和烯烃衍生物的光催化自由基加成反应，疏基和炔基衍生物的光催化自由基加成反应，磺酰氟交换反应，生物素与链霉亲和素之间的结合反应，氨基与活化酯之间的反应。
所述荧光基团则来自于如下任意一种或多种荧光染料：AF488、AF532、AF633、AF680、AF660、AF700、AF647、AF 594、AF 555、AF568、CY3、CY5、CY5.5、CY7、CY7.5、ROX、R6G、ATTO 495、ATTO532、ATTO700、ATTO680、ATTO655、ATTO647N、ATTO594、ATTO Rho101、ATTO590、ATTO Thio12、FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CAL Fluor Orange 560、TAMRA、CAL Fluor Red610、TEXAS RED、CAL Fluor Red635、iFluor 488、iFluor 514、iFluor 532、iFluor 546、iFluor 555、iFluor 568、iFluor 590、iFluor610、iFluor 633、iFluor 647、iFluor 680、iFluor700、iFluor710、Quasar705、Quasar670。
所述环境高敏荧光染料是能够快速响应环境的变化，如极性,pH，电压，光源和粘度等而改变发光颜色，荧光发射波长或强度的荧光染料。所述的正交连接反应的化学反应包括但不限于各种已知的广泛用于荧光探针、化学传感器、微环境变化检测、生物成像、分子开关和相分离可视化等领域的环境敏感荧光染料，所述环境高敏荧光染料包括但不局限于如下荧光染料：Cy-7、Dylight 800、IRDye 800、Alexa Fluor 790、HiLyte Fluor 750、Ovster 800、Rhodamine isothiocyanate、Texas Red derivatives、Alexa Fluor 680、DyLight 680、Cy5.5 NHS ester(～67O nm,Lumiprobe)、Alexa Fluor 546、DyLight 549、Oregon Green 514、Carboxylic Acid、pHrodoTM Red、6-Carboxynaphthofluorescein、7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid、SNARFR-5F、SNARFB-4F、SNARFR-1、BCECF、CyPHER5E、HCyC-647、Square-650-pH、6-Carboxy-4,5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein。
一种基因测序方法，包括如下步骤：
S1，分别制备前述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8，所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4为2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，具备式(I)结构,所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8为2’-脱氧核苷酸衍生物，具有式(II)的结构：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2，R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；荧光基团包括为能够发岀相同荧光信号的环境高敏荧光基团、能发出相同或不同荧光信号的荧光基团；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R5各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
L1为连接基团或可切割连接基团中的一种；
S2，将待测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇；
S3,将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入S2体系中进进行核苷酸聚合反应得一中间态复合体；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，维持S3的中间态复合体状态，并检测记录每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记，判断DNA模板上对应位置的碱基；
S5，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶加入S4处理后的反应体中进行核苷酸聚合反应；
S6，往S5反应后的体系中加入切割液洗去化合物5、化合物6、化合物7、化合物8中的可切割保护基团，移除溶液相并用缓冲液冲洗干净；
S7,洗去S6中反应后替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S8，重复步骤S3至S7一次或多次。
根据不同测序需求，可以采用不同的方法来实现，各方法在在个别步骤中有所不同，它们的区别是：
第一种是四色荧光染料的测序方法：
在S1步骤中分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，使化合物1、化合物2、化合物3、化合物4分别标记激发和发射波长均不同的荧光基团，化合物1-4各自独立的具备式(I)结构：
此时R2各自独立地为可发出不同荧光信号的荧光基团；R3为；L1为H或不存在。
步骤S2中则是将待测序的核酸模板连接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，如将测序的核酸模板链接于芯片或微球上形成待测核酸分子簇；
步骤S3中各化合物和聚合酶M同时加入S2反应体系进行核苷酸聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于第一，二个磷酸基团之间的O被CH2基团取代，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止，而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1、化合物2、化合物3、化合物4中的任意一种化合物和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
步骤S4中洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，维持S3步骤的中间态复合体状态；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物，由于化合物1-4各自标记的荧光基团不同，检测到的荧光信号也不同，可据此判断DNA模板上对应位置的碱基；
步骤S5中化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将S3步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中R5可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链；
步骤S6中加入切割缓冲液脱去化合物5-8中的可切割保护性基团R2，移除溶液相用缓冲液冲洗干净，洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，得到天然无疤痕的核苷酸，利于下一个碱基的掺入。
第二种方法是双色荧光染料的测序方法：
步骤S1中，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；化合物1-4各自独立的具备式(I)结构：
此时化合物1中R2为染料A，R3不存在；化合物2中R2为染料B，R3不存在；化合物3中R2为染料A，R3为染料B；化合物4中R2和R3均不存在；染料A和染料B结构不同，能够发出不同的荧光信号；L1各自独立地为连接基团或不存在；
步骤S2中是将待测序的核酸模板连接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，如将核算模板固定在芯片上，通过桥式扩增构建待测核酸分子簇；
步骤S3中聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止，而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
步骤S4中检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物,此时，化合物1在滤光片通道1中能检测到荧光信号，在滤光片通道2中检测不到荧光信号(或信号很弱)；化合物2在滤光片通道1中检测不到荧光信号(或信号很弱)，在滤光片通道2中能检测到荧光信号，化合物3在滤光片通道1和滤光片通道2中都能检测到荧光信号；由于化合物4没有荧光基团标记，在滤光片通道1和滤光片通道2中都检测不到荧光信号，可据此判断并入的核苷酸衍生物类别和DNA模板上对应位置的碱基。
其余步骤则和第一种方法相同。
第三种方法也是双色荧光染料的测序方法：
在步骤S1中，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；化合物1-4各自独立的具备式(I)结构：
此时化合物1中R2为染料A，R3不存在；化合物2中R2为染料B，R3不存在；化合物3中R2为染料A，R3为可反应活性基团(Active Group，比如生物素biotin，biotin可以与荧光标记的亲和素或链链霉亲和素快速结合)；化合物4中R2和R3均不存在；染料A和染料B结构不同，能够发出不同的荧光信号；L1各自独立地为连接基团或不存在。
步骤S2中是将待测序的核酸模板连接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，如将核算模板固定在芯片上，通过桥式扩增构建待测核酸分子簇；
步骤S3中聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止，而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
步骤S4中还需加入能和活性基团特异性结合的携带染料B的活性物质，例如水溶性染料B-链霉亲和素，将染料B引入化合物3，结合反应后洗去多余物质；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物,此时，化合物1在滤光片通道1中能检测到荧光信号，在滤光片通道2中检测不到荧光信号(或信号很弱)；化合物2在滤光片通道1中检测不到荧光信号(或信号很弱)，在滤光片通道2中能检测到荧光信号，化合物3在滤光片通道1和滤光片通道2中都能检测到荧光信号；由于化合物4没有荧光基团标记，在滤光片通道1和滤光片通道2中都检测不到荧光信号，可据此判断并入的核苷酸衍生物类别和DNA模板上对应位置的碱基。
其余步骤则和第一种方法相同。
第四种方法是单色荧光测序方法：
在步骤S1中，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；化合物1-4各自独立的具备式(I)结构：
此时化合物1中R2为染料A，R3不存在；化合物2中R2为染料B，R3不存在；化合物3中R2为可反应活性基团(Active Group，比如生物素biotin，biotin可以与荧光标记的亲和素或链链霉亲和素快速结合)，R3不存在；化合物4中R2和R3均不存在；染料A和染料B结构不同，染料B是环境高敏荧光基团，能发出与染料A相同荧光信号的荧光基团，也能快速响应环境微弱调节，发生荧光淬灭现象；L1各自独立地为连接基团或不存在。
步骤S2中是将待测序的核酸模板连接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇，如将核算模板固定在芯片上，通过桥式扩增构建第一核酸双链分子簇；
步骤S3则是将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止，而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
步骤S4则包括如下步骤：S4a，洗去未反应得化合物1、化合物2、化合物3，化合物4，之后加入扫描缓冲液调节反应环境使得化合物2上标记的染料B能够被激发，染料B发出与染料A相同的荧光信号，检测荧光信号并通过拍照、存储图像来记录荧光信号；S4b，洗去扫描缓冲液，加入染料A标记的活性基团，该活性基团能够与化合物3上的可反应活性基团发生特异性结合反应，从而将荧光基团A引入化合物3，使其发出荧光信号；同时调节反应环境，淬灭化合物2上荧光基团的荧光，此变化对化合物1和化合物4没有影响，但是能够使化合物2上的环境高敏荧光基团荧光淬灭，检测不到荧光信号；S4c，加入扫描缓冲液，激发光源检测荧光信号并通过拍照、存储图像来记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液；
对比前后两次拍照结果，判断并入的核苷酸衍生物类别，此时，化合物1在前后两次拍照中都能检测到荧光信号；化合物2在第一次拍照中能检测到荧光信号，在第二次拍照中检测不到荧光信号(或信号很弱)；化合物3在第一次拍照中检测不到荧光信号(或信号很弱)，在第二次拍照中能检测到荧光信号；由于化合物4没有荧光基团标记，在前后两次拍照中都不能检测到荧光信号；可据此判断并入的核苷酸衍生物类别和DNA模板上对应位置的碱基。
其余步骤则和第一种方法相同。
实施例1
化合物1、化合物2、化合物3、化合物4具有式I-a结构：
化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具有式IIa结构：
Base代表不同的碱基,本实施例中B分别为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)
Dye代表不同激发和发射波长的荧光染料,本实施例中Dye分别为AF532,Cy5,AF568,IF700，
Block为可切割保护性基团，本实施例中Block为N3或S-S-Et基团
具有式Ia的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4的合成路线如下所示：
具有式IIa的化合物5、化合物6、化合物7、化合物8的合成路线如下所示：
在其优选的实施例中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4,化合物5、化合物6、化合物7、化合物8的具体结构：
其基因测序方法如下∶
a)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
b)将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶M同时加入反应体系，进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1-4中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
c)洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，维持步骤b的中间态复合体状态；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物；由于化合物化合物1、化合物2、化合物3、化合物4分别标记着AF532,Cy5,AF568,IF700，检测到的荧光信号完全不同，可据此所并入的核苷酸衍生物以及DNA模板上对应位置的碱基；
d)将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶同时加入以上核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，此时，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将b步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中R2可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链。
e)加入切割缓冲液脱去化合物5-8中的3’-端保护性基团，移除溶液相用缓冲液冲洗干净，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，利于下一个碱基的掺入。
f)重复步骤a-e一次或多次。
实施例2
化合物1、化合物2具备式(I-a)结构,化合物3具备式(I-b)结构；化合物4具备式(I-c)的结构；化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具备式(IIa)的结构，如化合物1、化合物2具有式Ia-1结构：
化合物3具有式I-b结构：
化合物4具有式I-c结构：
化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具有式IIa结构：
Base代表不同的碱基,本实施例中B分别为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)。
Dye A和Dye B各自独立地为能发出不相同荧光信号的荧光基团。
Block为可切割保护性基团，本实施例中Block为N3或S-S-Et基团。
化合物1、化合物2、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8合成路线与具体实施例1中相同。
具有式I-c的化合物3的合成路线如下所示：
在其优选的实施例中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4具体结构如下：
采用其进行基因测序的方法是如下步骤∶
a)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
b)将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶M同时加入反应体系，进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
c)洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3，化合物4，维持步骤b的中间态复合体状态；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物,此时，化合物1标记的染料Cy5在滤光片通道1中能检测到荧光信号，在滤光片通道2中检测不到荧光信号(或信号很弱)；化合物2标记的染料AF532在滤光片通道1中检测不到荧光信号(或信号很弱)，在滤光片通道2中能检测到荧光信号，化合物3同时标记有Cy5和AF532，因此在滤光片通道1和滤光片通道2中都能检测到荧光信号；由于化合物4没有荧光基团标记，在滤光片通道1和滤光片通道2中都不能检测到荧光信号；据此所并入的核苷酸衍生物以及DNA模板上对应位置的碱基；
d)将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶同时加入以上核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，此时，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将S3步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中R2可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链。
e)加入切割缓冲液脱去化合物5-8中的可切割保护性基团R2，移除溶液相，用缓冲液冲洗干净，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，得到天然无疤痕的核苷酸，利于下一个碱基的掺入。
f)重复步骤a-e一次或多次。
实施例3
化合物1、化合物2具备式(I-a)结构,化合物3具备式(I-d)结构；化合物4具备式(I-c)的结构；化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具备式(IIa)的结构，如化合物1、化合物2具有式Ia-1结构：
化合物3具有式I-d结构：
化合物4具有式I-c结构：
化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具有式IIa结构：
Base代表不同的碱基,本实施例中B分别为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)。
Dye A和Dye B各自独立地为能发出不相同荧光信号的荧光基团，AG(ActiveGroup)为能够进行连接反应的可反应性基团。
Block为可切割保护性基团，本实施例中Block为N3或S-S-Et基团。
化合物1、化合物2、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8合成路线与具体实施例1中相同。
具有式I-d的化合物3的合成路线如下所示：
在其优选的实施例中化合物1、化合物2、化合物3、化合物4具体结构如下：
采用其进行基因测序的方法是如下步骤∶
a)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
b)将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶M同时加入反应体系，进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1-3中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
c)加入水溶性AF532-链霉亲和素，特异性的与化合物3上的biotin基团结合，从而将AF322荧光基团引入化合物3，,洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3，化合物4，以及AF532-链霉亲和素，维持步骤b的中间态复合体状态；检测每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记并拍照存储图像来鉴别所述核酸链的3′端所并入的核苷酸衍生物,此时，化合物1标记的染料Cy5在滤光片通道1中能检测到荧光信号，在滤光片通道2中检测不到荧光信号(或信号很弱)；化合物2标记的染料AF532在滤光片通道1中检测不到荧光信号(或信号很弱)，在滤光片通道2中能检测到荧光信号，化合物3同时标记有Cy5和AF532，因此在滤光片通道1和滤光片通道2中都能检测到荧光信号；由于化合物4没有荧光基团标记，在滤光片通道1和滤光片通道2中都不能检测到荧光信号；据此所并入的核苷酸衍生物以及DNA模板上对应位置的碱基；
d)将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶同时加入以上核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，此时，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将S3步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中R2可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链。
e)加入切割缓冲液脱去化合物5-8中的可切割保护性基团R2，移除溶液相，用缓冲液冲洗干净，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3，化合物4，得到天然无疤痕的核苷酸，利于下一个碱基的掺入。
a)重复步骤a-e一次或多次。
实施例4
化合物1、化合物2具备式(I-a)结构,化合物3具备式(I-f)结构；化合物4具备式(I-c)的结构；化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具备式(IIa)的结构，如化合物1、化合物2具有式Ia-1结构：
化合物3具有式I-d结构：
化合物4具有式I-c结构：
化合物5、化合物6、化合物7、化合物8具有式IIa结构：
Base代表不同的碱基,本实施例中B分别为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)。
Dye代表环境敏感荧光染料或能发出相同荧光信号的荧光基团，本实施例中分别为HCyC-647和Cy5；
AG(Active Group)为能够进行连接反应的可反应性基团。
Block为可切割保护性基团，本实施例中Block为N3或S-S-Et基团。
化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8合成路线与具体实施例3中相同或类似。
在其优选的技术方案中，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4的结构一种为：
利用其进行基因测序的方法如下述步骤∶
b)将待测DNA模板固定至芯片上，通过桥式扩增构建核酸双链分子簇；
c)化合物1、化合物2、化合物3，化合物4和聚合酶M同时加入反应体系，进行核苷酸识别聚合反应，聚合酶M能识别相应的化合物并将其任意一种并入生长的核酸链的3′端，由于5’-OH端β-CH2基团的存在，不能正常形成磷酸二酯键，链延长终止。而且2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸的这种结构也确保每次只并入单个核苷酸衍生物；此时化合物1-4中的任意一种和聚合酶M以及核酸模板链形成一中间态复合体；
d)洗去未反应的dNTPs，加入扫描缓冲液，调整pH值为6.8，以640nm光源为激发波长检测荧光信号，拍照，存储图像A；
e)洗去扫描缓冲液，加入水溶性Cy5-链霉亲和素，所述处理对化合物1、化合物2和化合物4没有影响，同时Cy5-链霉亲和素能够特异性的与化合物3上Biotin结合，从而将荧光基团Cy5引入化合物3，使其发出荧光信号；
f)调整pH值为7.5，弱碱性环境对化合物1、化合物3和化合物4没有影响，但是能够使化合物2上的HCyC-647荧光淬灭，640nm光源下检测不到荧光信号；g)加入扫描缓冲液，以640nm光源为激发波长检测荧光信号，拍照，存储图像B；h)洗去扫描缓冲液，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶同时加入以上核酸双链分子簇反应体系进行核苷酸聚合反应，此时，化合物5、化合物6、化合物7、化合物8能将b步骤的中间态复合体中的化合物1、化合物2、化合物3和化合物4替换并形成磷酸二酯键达到链延长的目的，由于化合物5-8中3’-OH可切割保护性基团的存在，每次链延长只有单个碱基掺入DNA链。
i)加入切割试剂THP对芯片进行处理，脱去化合物5、化合物6、化合物7、化合物83’-位置处的保护基团重新生成游离的3’-OH，同时洗去替换下来的化合物1、化合物2、化合物3和化合物4，利于下一个碱基的掺入。
j)重复进行步骤(b)-(h)；
k)在每个循环测试步骤过程中两次拍照获得的图像之后，对同一个位置的核酸双链分子簇的荧光信号进行比较，若在扫描图像A和扫描图像B中均有荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物1(A碱基衍生物，Cy5标记)，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为T；若在扫描图像A和扫描图像B中均无荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物4(G碱基衍生物，无荧光标记)，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为C；若在扫描图像A中有信号，而扫描图像B中无荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物2(T碱基，环境敏感染料HCyC647标记)，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为A；若在扫描图像A中无信号，而扫描图像B中有荧光信号，则并入的核苷酸衍生物的为化合物3(C碱基，Biotin标记)，相应的，可确定该DNA模板上对应位置上的碱基为T。如表1中所示。
表1:实施例4检测结果及对应碱基
使用具体实施例4中所述试剂和方法进行测序验证，测序样本为Lambda DNA片段，测序模式为单端30个碱基，表2展示了部分片段碱基序列，表3展示了测试结果与分析。
表2：部分Lambda DNA片段碱基序列
表3测序结果与分析
测序结果显示整体错误率为0.2847％，分析表明，本具体实施例中的测序试剂和方法可以对样本DNA片段进行精确测序。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种基因测序方法，其特征在于，包括：
S1，分别制备化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7和化合物8；
S2，将待测序的核酸模板链接于测试载体上，通过扩增形成待测核酸分子簇；
S3,将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和聚合酶同时加入S2体系中进行核苷酸聚合反应得一中间态复合体；
S4，洗去未反应的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4维持S3的中间态复合体状态，并检测记录每个并入的核苷酸衍生物的荧光标记，判断DNA模板上对应位置的碱基；
S5，将化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和聚合酶加入S4处理后的反应体系中进行核苷酸聚合反应；
S6，往S5反应后的体系中加入切割液洗去化合物5、化合物6、化合物7、化合物8中的可切割保护基团，移除溶液相并用缓冲液冲洗干净；
S7,洗去S6中反应后替换下来的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4；
S8，重复步骤S3至S7一次或多次；
所述化合物1、化合物2、化合物3和化合物4为2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，具备式(I)结构；
所述化合物5、化合物6、化合物7和化合物8为2’-脱氧核苷酸衍生物，具有式(II)的结构；
所述式(I)和所述式(II)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R5各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
L1为连接基团或可切割连接基团中的一种。
2.根据权利要求1所述基因测序方法，其特征在于，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2各自独立地为可发出不同荧光信号的荧光基团；
R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
3.根据权利要求1所述基因测序方法，其特征在于，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团，R3不存在；化合物2中R2为不同荧光基团，能够发出与化合物1中R2荧光基团不同的荧光信号，R3不存在；化合物3中的R2为荧光基团与化合物1中R2荧光基团相同，或者是能发出与化合物1中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团，化合物3中的R3则是与化合物2中R2相同的荧光基团，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物4中R2和R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
4.根据权利要求1所述基因测序方法，其特征在于，所述S4包括：
S4a，洗去未反应得化合物1、化合物2、化合物3，化合物4；
S4b，加入能与化合物3中的R3可反应活性基团快速结合的荧光基团标记的活性基团，从而将第二种荧光基团引入化合物3中，活性基团上标记的荧光基团与化合物2中R2相同，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；
S4c，加入扫描缓冲液，激发光源检测记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液；
所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团，R3不存在；化合物2中R2为不同荧光基团，能够发出与化合物1中R2荧光基团不同的荧光信号，R3不存在；化合物3中的R2荧光基团与化合物1中R2荧光基团相同，或者是能发出与化合物1中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物3中的R3为可反应活性基团，可以与荧光基团标记的活性基团快速结合，活性基团上标记的荧光基团与化合物2中R2相同，或者是能发出与化合物2中R2荧光基团相同荧光信号的荧光基团；化合物4中R2和R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
5.根据权利要求1所述基因测序方法，其特征在于，所述S4包括：
S4a，洗去未反应得化合物1、化合物2、化合物3，化合物4，之后加入扫描缓冲液调节反应环境使得化合物1和化合物2能够被激发发出荧光，检测并记录荧光信号；
S4b，洗去扫描缓冲液，加入化合物1所标记荧光基团的活性基团，将该荧光基团引入化合物3中使得化合物3能发出荧光信号，同时调节反应环境，淬灭化合物2上荧光基团的荧光；
S4c，加入扫描缓冲液，激发光源检测记录荧光信号，之后洗去扫描缓冲液；
所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；其中，化合物1中R2为荧光基团；化合物2中R2为环境高敏荧光染料基团，该荧光基团在特定条件下能发出和化合物1的荧光基团相同的荧光信号，且能快速响应反应体系环境变换发生荧光淬灭现象；化合物3中R2为可反应活性基团；化合物4中R2为H或不存在；
R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
6.一种基因测序试剂，其特征在于，包括聚合酶、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，化合物5、化合物6、化合物7和化合物8；
所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4为2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸衍生物，具备式(I)结构；
所述化合物5、化合物6、化合物7、化合物8为2’-脱氧核苷酸衍生物，具有式(II)的结构；
所述式(I)和所述式(II)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2和R3各自独立地为荧光基团和可反应活性基团中的一种，或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
R5各自独立地为能够进行正交切割反应的保护基团；
L1为连接基团或可切割连接基团中的一种。
7.根据权利要求6所述基因测序试剂，其特征在于，所述式(I)的结构如下：
其中，R1为不同的碱基或类似物，所述碱基或类似物为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶或类似物中的一种；
R2各自独立地为可发出不同荧光信号的荧光基团；
R3为H或不存在；
R4各自独立地为单磷酸基团、多磷酸基团中的一种；
L1各自独立地为连接基团或不存在。
8.根据权利要求6所述基因测序试剂，其特征在于，所述碱基或类似物为以下任意一种结构的化合物：
9.根据权利要求6所述基因测序试剂，其特征在于，保护基团为具有以下任意一种结构的基团：
10.根据权利要求6所述基因测序试剂，其特征在于，所述可切割连接基团是具有以下任意一种结构的基团：
其中，R1’，R2’各自独立地为卤素、-H、C1-C5脂肪链中的一种。
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