CN106148501A - 一种检测Septin9基因甲基化的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测Septin9基因甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液和聚合酶，所述PCR反应液由dNTP、引物、探针和溶剂组成，所述聚合酶为Taq酶BCIUS2，本发明还提供了一种采用该试剂盒提取血浆DNA的方法，以及在检测Septin9基因甲基化中的应用，利用本发明的检测方法和试剂盒可实现大肠癌Septin9基因甲基化的简便快速检测，特异性好、灵敏度高，可用于临床大肠癌的辅助诊断，可用于临床大肠癌患者的早期筛查。

Description

一种检测Septin9基因甲基化的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种检测大肠癌Septin9基因甲基化的试剂盒。

背景技术

大肠癌是常见恶性肿瘤，全世界每年约90万人发病，是最常见的消化道恶性肿瘤之一。大肠恶性肿瘤起源于粘膜上皮或粘膜下间叶组织。其中由大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性肿瘤统称为大肠癌。大肠癌发生部位为盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠，为结肠癌和直肠癌的总称，也称大肠癌。

大肠癌是一种严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，世界范围内的流行病学调查资料表明，大肠癌在各类恶性肿瘤中的发病率居第3位。是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。直肠癌发病率仅次于胃和食管癌。

在我国，大肠癌的早期诊断率很低，在确诊的青年人大肠癌中，已经在中晚期的患者占了50％～80％，而20岁以下的患者，一旦确诊，几乎全部是中晚期。美国国家息肉研究工作组提示，切除早期发现的息肉可明显减低大肠癌的发病率。日本应用免疫法粪便隐血试验(FOBT)进行的病例对照研究提示，早发现可使大肠癌死亡率下降81％。以上结果说明，提高早期诊断率不但能降低大肠癌的死亡率，还可降低其发病率。

目前，对于大肠癌的检测主要有直肠指检、大便隐血(FOBT)试验、内镜检查、钡剂灌肠等。FOBT是一种非创伤性的检测手段，但因其收取粪便样品不便，准确性不理想，从而造成依从性差，临床应用不普遍。而作为大肠癌诊断的金标准—肠镜是一种创伤性的检测手段，过程痛苦且有感染出血等风险，显然不适合作为筛查手段。

大肠癌Septin9基因检测是一种基于荧光定量PCR方法，针对外周血血浆中生物标记物的甲基化进行检测，其样品采集方便，检测周期短。该技术采用了一种基于荧光定量PCR技术针对EDTA抗凝血血浆中肿瘤细胞释放的游离DNA—Septin9基因甲基化进行定量分析进行大肠癌筛查，已通过欧盟认证(CE MARK)并在FDA认证中。一项针对中国人群的研究中表明，对1074例受试者(300例大肠癌患者，774例非大肠癌患者)的检测发现，Septin9甲基化检测的灵敏性和特异性分别为73.0％和97.5％。因其灵敏度高，特异性强，无创伤性等特点在美国、欧洲和加拿大广泛应用于临床和商业实验室，在美国有80％的人群愿意定期接受使用外周血筛查方法的检测。

Epigenomics AG公司的Septin9基因甲基化检测试剂盒Epi proColon 2.0CE提供了一种通过PCR荧光探针法检测Septin9基因甲基化的方法，但是，该方法在临床检测中存在着诸多的不便因素，如对血浆的用量较大，患者存在抵触情绪，不便于检测方法的推广；适用机型为ABI 7500fast/fast DX及Roche 480I/II，而上述机型的普及率很低，导致很多医院无法顺利开展该检测，临床的推广和普及更加困难。因此，若想顺利推广Septin9基因甲基化的临床检测，血浆需求量和适用机型是两个必须要解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明创新性的将血浆用量缩减至1.5-1.75mL(为Epi proColon 2.0 CE的一半)，并且完成了国内更加普及的ABI 7500荧光定量PCR仪(软件版本2.0.5或1.4)的适用性研究(通过一系列试剂的优化筛选，实现了不同机型、不同软件版本的等效性检测校准)，实现了低血浆量要求、普通仪器的高灵敏检测，可有效替代现有的检测方法。本发明的一个目的是提供一种检测大肠癌Septin9基因甲基化的试剂盒。

一种检测Septin9基因甲基化的试剂盒，包括PCR反应液和聚合酶，所述PCR反应液由dNTP、引物、探针和溶剂组成，所述聚合酶为Taq酶BCIUS2。

在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；其中，阴性对照品包括牛血清蛋白和Septin9基因非甲基化的正常人基因组DNA，所述阳性对照品包括牛血清白蛋白、Septin9基因甲基化的人基因组DNA和Septin9基因非甲基化的正常人基因组DNA。

在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包括提取血浆中游离的DNA，并将提取出来的DNA进行亚硫酸盐转化的血浆处理试剂和工具。

在根据本发明的一个实施方案中，所述血浆处理试剂和工具包括裂解吸附液、浓缩洗液A、浓缩洗液B、磁珠T；其中，所述裂解吸附液和浓缩洗液A由异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷和纯化水组成，异硫氰酸胍的终浓度为5M，三羟甲基氨基甲烷的终浓度为30nM；所述浓缩洗液B为无核酸酶的水。

本发明进一步提供了一种采用上述的试剂盒提取血浆中游离DNA的方法，所述方法包括：

1)将1.75ml的裂解吸附液与1.5～1.75ml的血浆样品混匀，在15～30℃的条件下孵育10分钟；

2)以磁珠吸附法提取所述血浆样品中的游离DNA；

3)将步骤2)提取的游离DNA进行亚硫酸盐转化，得到BisDNA。

在根据本发明的一个实施方案中，所述方法的步骤2)中还包括以将浓缩洗液A与等体积的无水乙醇混匀，得到洗液A，所述洗液A用于磁珠吸附法中的洗涤步骤。

在根据本发明的一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

4)将步骤3)得到的BisDNA与所述洗液A、磁珠混匀，得到吸附有BisDNA的磁珠；

5)以体积比为7：40的比例将浓缩洗液B与无水乙醇混匀，得到洗液B；将步骤4)所述吸附有BisDNA的磁珠以所述洗液B洗涤1次或多次，然后洗脱。

优选地，步骤2)所述磁珠吸附法中所用的磁珠为磁珠T。

本发明更进一步地提供了上述试剂盒在制备检测Septin9基因甲基化或诊断大肠癌的装置中的应用，所述应用包括步骤：

a)以20：1的体积比将所述PCR反应液与所述聚合酶混匀，得到PCR预反应液；

b)将等体积BisDNA与所述PCR预反应液加入到PCR反应容器中，并密封；优选地，所述BisDNA和PCR反应液的体积分别为30μl；更优选地，所述BisDNA浓度≥18pg/mL；

c)以下述扩增程序进行PCR扩增：

阶段1：94℃活化20分钟；

阶段2：62℃反应5秒、55.5℃反应35秒、93℃反应30秒，循环45次；

阶段3：40℃反应5秒；

其中，荧光信号的收集在阶段2完成。

更具体地反应程序如下表所示：

在根据本发明的一个实施方案中，所述方法是通过ABI 7500荧光定量PCR仪实现扩增的。

在根据本发明的一个实施方案中，所述方法中以ACTB为PCR扩增的内参。

本发明的有益效果在于：

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)更高的检测灵敏度

相比较于Epi ProColon试剂盒，本发明将检测体积扩大，通过本发明的反应体系，将灵敏度提高到了79.3％，比Epi ProColon试剂盒提高了6.3％，更加适用于肿瘤的临床筛查。

(2)更少的血浆用量

本发明将检测的重复数量减少一半以上，从而减少血浆用量，比EpiProColon试剂盒的血浆用量减半，同时检测性能还优于Epi ProColon试剂盒。

(3)降低了检测的复杂性和成本

本发明将检测的重复数量减少一半以上，从而减少人为操作和试剂耗材用量。

(4)提高了检测效率，性价比和顺应性

本发明使检测Septin 9基因的甲基化的灵敏度提高，人工试剂成本降低，减少受试者血浆用量。

(5)优化的血浆游离DNA处理方法

本发明通过更换Epi ProColon试剂盒中的磁珠、裂解吸附液和浓缩洗液A等试剂，相对于Epi ProColon试剂盒，本方法具有成本低、提取效率高的优势。

(6)更优化的检测体系

本发明通过优化反应体系和适用仪器的适用性研究，本发明通过采用单管60μl PCR反应体系和ABI 7500荧光定量PCR仪实现了扩增甲基化的Septin 9基因，而Epi ProColon的适用机型为ABI 7500fast/fast DX及Roche480I/II，由于ABI 7500fast/fast DX及Roche 480I/II的普及率非常低，绝大部分的临床机构并没有配备这些设施，造成很多医院无法顺利开展该检测，临床的推广和普及非常困难。目前国内临床检测机构普遍配备的机型为ABI7500荧光PCR仪，仪器的软件版本多为SDS2.0.5/SDS1.4，为建立不同软件版本的ABI 7500荧光PCR仪的适用性和等效性研究，本发明建立了适用2种常见软件的ABI 7500荧光PCR仪检测方法。

(7)更高扩增效率PCR聚合酶的应用

本发明采用的PCR聚合酶为Taq酶BCIUS2，相比较于Epi ProColon试剂盒，本发明具有更加高效的扩增效率，而且成本远低于Epi ProColon试剂盒。

附图说明

图1为磁珠T与适用裂解吸附液、浓缩洗液A的替换测试结果图；其中，曲线二表示Septin9的扩增曲线；曲线一表示ACTB的扩增曲线。

图2为酶替换的测试结果图；其中，曲线二表示Septin9的扩增曲线；曲线一表示ACTB的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的方法。。

Taq酶(BCIUS2)购自BioChain Institute，Inc.。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：试剂盒组成

检测实验所需材料如表1和表2所示。

1.试剂盒组成：

表1 试剂盒I：血浆处理试剂盒

表2 试剂盒II：大肠癌甲基化基因检测试剂盒

说明：

1)试剂盒I中除其中裂解吸附液、浓缩洗液A和磁珠为本发明替换的优选试剂外，其他试剂购自Epigenomics的Epi ProColon；试剂盒II中除Taq酶为本发明替换的优选试剂，其他均购自Epigenomics的Epi ProColon。

2)磁珠T购自BioChain Institute，Inc.。

3)裂解吸附液和浓缩洗液A为自行配制，裂解吸附液配方如表3所示，浓缩洗液A如表4所示：

表3 裂解吸附液配方

名称	添加量	终浓度/体积
			异硫氰酸胍	590.8g	5M
三羟甲基氨基甲烷	2.425g	30nM
			纯化水	定容至1000ml	---

表4 浓缩洗液A配方

名称	添加量	终浓度
			异硫氰酸胍	590.8g	5M
三羟甲基氨基甲烷	2.428g	30nM
			纯化水	定容至1000ml	---

4)Taq酶(BCIUS2)购自BioChain Institute,Inc.

2.仪器设备

检测实验所需设备如下所示：15ml磁力架、2.0ml磁力架、恒温震荡仪、旋转混合器、ABI7500荧光PCR仪、-20℃冰箱、高速离心机、微量移液器和连续加样器、超净工作台。

实施例2：血浆游离DNA的提取

针对相比于Epi ProColon 3.5mL血浆量的提取方法，本发明将血浆量减至1.5-1.75mL，一方面降低了临床抽血时病人的抵触心理，同时本发明对DNA提取方法进行了技术改进，有效提高了DNA的回收率，更加利于PCR检测。具体改进包括：

1)每一步骤最优试剂用量的建立，通过测试阴阳性对照品和血浆对比试验，建立了最适于1.5-1.75mL血浆量的检测方法，显著降低了对同样样本进行检测的试剂成本。

2)通过步骤39)的引入，有效提高了回收DNA溶液的纯度，提高了PCR反应的效率和检测的灵敏性。

具体方法如下：

1)加60ml无水乙醇到60ml洗液A浓缩液中，颠倒混匀5次。

2)加40ml无水乙醇到7ml洗液B浓缩液中，颠倒混匀5次。

3)融化阴阳性对照品以及样本，并做好标记。

4)加入1.75ml裂解吸附液，盖好管盖，震荡混匀，室温(15℃-30℃)孵育10分钟。

5)加入45μl磁珠(新鲜悬浮)，1.25ml无水乙醇，盖好管盖，颠倒混匀5-6次，在旋转混合器上室温孵育45分钟，振荡速度10-20rpm，旋转角度约35-45°。

6)预设恒温振荡器至80℃。

7)放置15ml管子在DynaMag^TM-15磁性试管架上吸附5-10分钟，使磁珠形成沉淀颗粒小心倒掉上清液，不要倒掉磁粒，在干净的纸上控干液体。

8)加入0.75ml洗液A,震荡混匀磁珠用22cm超长一次性移液管将磁珠悬浮液移至2.0ml管中,再一次用移液管吸取残留磁珠悬浮液并将其转移至2.0ml管。

9)放置2.0ml离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上吸附2-6分钟。

10)保持离心管在磁架上，用干净的移液管尽量去除液体，小心不要丢弃磁性颗粒(沉淀物)，短暂离心，去除管盖上的液体。

11)放置2.0ml离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上吸附2-6分钟。

12)保持离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用10-100ul枪头除去残余液体。

13)加入0.75ml洗液A,震荡混匀磁珠用22cm超长一次性移液管将磁珠悬浮液移至2.0ml管中,再一次用移液管吸取残留磁珠悬浮液并将其转移至2.0ml管。

14)放置2.0ml离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上吸附2-6分钟。

15)保持离心管在磁架上，用干净的移液管尽量去除液体。

16)短暂离心，去除管盖上的液体，放置2.0ml离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上吸附2-6分钟。

17)保持离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用10-100ul枪头除去残余液体。

18)将离心管移至无磁性试管架上，加入50μl洗脱液。

19)盖好管盖，振荡混匀重悬磁珠，将离心管置于恒温振荡器上1000rpm80℃孵育10分钟。

20)短暂离心，去除管盖上的液体，将离心管置于DynaMag^TM-2磁性试管架上2-6分钟。

21)保持离心管在磁架上，将全部洗脱液转移(约50μl)到一个新的2.0ml管中。

22)加入75μl亚硫酸盐溶液、12.5μl保护液到含有DNA洗脱物的2.0ml离心管中。

23)盖好管盖，震荡混匀，短暂离心，去除管盖上的液体，将离心管置于恒温振荡器上，80℃孵育45分钟，不要振荡。

24)将上述含有亚硫酸盐反应液的离心管进行短暂离心。

25)加入500μl洗液A、10μl磁珠(新鲜悬浮)到2ml离心管中，盖好管盖，震荡混匀。

26)将离心管置于恒温振荡器上，23℃孵育45分钟，振荡速度1,000rpm。

27)短暂离心，去除管盖上的液体，放置离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上2-6分钟。

28)保持管子在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用干净的一次性移液管尽量去除液体，注意不要吸取磁珠！

29)将样品从磁性试管架取下，加入400μl洗液A，震荡重悬。

30)短暂离心，去除管盖上的液体.放置离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上2-6分钟。

31)保持离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用干净的一次性移液管尽量去除液体，不要吸取磁珠！

32)将样品从磁性试管架取下，加入400μl洗液B，震荡重悬。

33)短暂离心，去除管盖上的液体，放置管子在DynaMag^TM-2磁架上2-6分钟。

34)保持离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用干净的一次性移液管尽量去除液体，注意不要吸取磁珠！

35)将样品从磁性试管架取下，加入200μl洗液B，震荡重悬。

36)短暂离心，去除管盖上的液体，放置管子在DynaMag^TM-2磁性试管架中2-6分钟。

37)保持离心管在DynaMag^TM-2磁性试管架上，用干净的一次性移液管尽量去除液体，注意不要吸取磁珠！

38)重复步骤36-37。

39)再次重复步骤36-37。

40)打开管盖，将离心管放在恒温振荡器上，静孵育23℃,10分钟，不要振荡。

41)将离心管移至无磁性的试管架上，加入40μl洗脱液。

42)将离心管放在恒温振荡器上，23℃孵育10分钟，振荡速度1,000rpm。

43)短暂离心，去除管盖上的液体，放置管子在DynaMag^TM-2磁性试管架上2-6分钟。

44)用10-100μl枪头，将所有的洗脱液(大约35μl)移至EP管中。

实施例3：甲基化Septin9基因的检测

相比于Epi ProColon，本发明减少了血浆样品用量，通过扩大检测体积、优化反应体系，降低了检测的复杂性和成本，提高了检测效率、性价比和顺应性。本发明的检测方法如下所述：

1)按照表5配制PCR预反应液

表5 PCR预反应液配制

2)震荡混匀PCR预反应液，加30μl至选定好的96孔板中。

3)将30μl亚硫酸盐转化的DNA(BisDNA)加入至PCR板对应的孔中，用Optical Adhesive Film胶膜密封。

4)转速1000rcf离心1分钟。

5)运行ABI7500荧光PCR仪，打开7500 Software V2.0.5软件。

6)点击“New Document”→点击“Experiment Properties”标签进行以下设置：7500(96Wells)、Quantitation-Standard Curve、Reagents、Standard(～2hours to complete a run)。

7)点击“Plate Setup”标签→点击“Define Targets and Samples”，设置如下：

8)点击“Add New Target”然后设置如下：

9)点击“Assign Targets and Samples”→点击“View Plate Layout”选择板的所有96孔，在Target的Septin 9与ACTB的Assign框中对应。

10)检查Passive Reference选项是否为“(none)”→到“Run Method”标签中打开“Graphical View”选项→Reaction Volume Per Well：60μl。

11)设置运行程序如下，在标识“X”阶段收集荧光信号：

12)打开PCR托盘，将PCR反应板放入，注意A1孔在左上角，关闭PCR托盘，点击“Start”开始运行，并将文件储存于相应的文件夹中。

实施例4：检测结果的判读

1、适用于SDS v2.05或V1.4版本

1)SDS v2.05设置：基线10-22个循环，设置Septin9阈值30000，ACTB阈值14000；

SDS V1.4设置：基线10-22个循环，设置Septin9阈值100000，ACTB阈值60000；

2)用对照样品验证PCR反应的有效性：阳性对照septin9的Ct值≤41.1，ACTB的Ct值≤29.8；阴性对照septin9的Ct值无，ACTB的Ct值≤37.2；任何一个条件不符合，本次定义本次实验结果“无效”。

3)样本结果解释：如果ACTB的Ct值≤32.1，Septin9的Ct值≤41.0，定义该样本为阳性；如果ACTB的Ct值≤32.1，Septin9的Ct值>41.0，定义该样本为阴性；如果ACTB的Ct值＞32.1，定义该PCR反应为“无效”。

2、以下以2例血浆的实际检测结果为例进行判读(如表6所示)：

表6 检测结果判读示例

1)PC的ACTB的Ct值为28.47小于29.8，Septin9的Ct为35.33小于41.1，PC检测有效；NC的ACTB的Ct值为32.01小于37.2，Septin9无Ct值，NC检测有效；PC/NC均有效，因此样本1和样本2的数据可做进一步分析。

2)样本1的ACTB的Ct值为28.27，小于32.1，因此该样本的数据有效，可进一步分析Septin9的数据，而其Ct值无，因此判定该样本为阴性；样本2的ACTB的Ct值为28.96，小于32.1，因此该样本的数据有效，可进一步分析Septin9的数据，而其Ct值为38.67，小于41.0，因此判定该样本为阳性。

实施例5：磁珠和适用Buffer的替换

根据实施例2的技术方案，使用磁珠T以及优选的裂解吸附液和浓缩洗液A及其他试剂对RC(模拟血浆)进行处理，然后按照实施例3的技术方案进行PCR扩增，比较替换磁珠、裂解吸附液和浓缩洗液A后Ct值与Epigenomics公司的EpiProColon试剂盒的大小。从表3的结果可以看出磁珠T与裂解吸附液和浓缩洗液A共同替换后其性能优于Epi ProColon试剂盒。测试结果如表7所示。使用本发明提供的裂解吸附液和浓缩洗液A，对3个批次磁珠T的批间差性能进行了评价，结果显示3批磁珠T间无明显差异，性能优于Epi试剂盒，其检测结果如表8所示。

表7 磁珠和适用Buffer替换后的测试结果

表8 不同操作人、不同批次磁珠T的检测结果

实施例6：酶的替换

根据实施例2及实施例3的技术方案，使用实施例2的提取方法处理RC，然后使用BCIUS2酶进行PCR扩增测试，并与Epigenomics公司的EpiProColon试剂盒对比，结果显示BCIUS2的重复性良好，检测结果优于EpiProColon试剂盒，详见表9所示，扩增曲线见图2。

表9 酶替换后的测试结果

实施例7：临床样本的检测

共收集到218例临床样本，其中包括：53例肠道未发现异常样本、50例非肿瘤性病变样本、39例非进展期腺瘤样本、35例高危低级别样本、12例高级别瘤变样本、2例I期样本、6例II期样本、15例III期样本、4例IV期样本和2例分期不明的样本(均有肠镜和病理结果)，符合消化内科的样本自然分布。依据技术方案对磁珠T、裂解吸附液、浓缩洗液A和BCIUS2酶的替换进行实验验证。临床样本的检测结果显示其检测的特异性为94.3％，灵敏度为79.3％(如表10、表11所示)。

表10 与肠镜结果的比较

表11.真实性计算分析

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种检测Septin9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液和聚合酶，所述PCR反应液由dNTP、引物、探针和溶剂组成，所述聚合酶为Taq酶BCIUS2。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品；其中，所述阴性对照品包括牛血清蛋白和Septin9基因非甲基化的正常人基因组DNA，所述阳性对照品包括牛血清白蛋白、Septin9基因甲基化的人基因组DNA和Septin9基因非甲基化的正常人基因组DNA。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括提取血浆中游离的DNA，并将提取出来的DNA进行亚硫酸盐转化的血浆处理试剂和工具。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述血浆处理试剂和工具包括裂解吸附液、浓缩洗液A、浓缩洗液B和磁珠T；其中，所述裂解吸附液和浓缩洗液A由异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷和纯化水组成，异硫氰酸胍的终浓度为5M，三羟甲基氨基甲烷的终浓度为30nM；所述浓缩洗液B为无核酸酶的水。

5.一种采用如权利要求3或4所述的试剂盒提取血浆中游离DNA的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

1)将1.75ml的裂解吸附液与1.5～1.75ml的血浆样品混匀，在15～30℃的条件下孵育10分钟；

2)以磁珠吸附法提取所述血浆样品中的游离DNA；

3)将步骤2)提取的游离DNA进行亚硫酸盐转化，得到BisDNA。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中还包括以将浓缩洗液A与等体积的无水乙醇混匀，得到洗液A，所述洗液A用于磁珠吸附法中的洗涤步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

4)将步骤3)得到的BisDNA与所述洗液A、磁珠混匀，得到吸附有BisDNA的磁珠；

5)以体积比为7：40的比例将浓缩洗液B与无水乙醇混匀，得到洗液B；将步骤4)所述吸附有BisDNA的磁珠以所述洗液B洗涤1次或多次，然后洗脱。

8.如权利要求5～7的任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述磁珠吸附法中所用的磁珠为磁珠T。

9.一种如权利要求1～4的任一项所述的试剂盒在制备检测Septin9基因甲基化或诊断大肠癌的装置中的应用，其特征在于，所述应用是通过包括下述步骤的方法实现的：

a)以20：1的体积比将所述PCR反应液与所述聚合酶混匀，得到PCR预反应液；

b)将等体积BisDNA与所述PCR预反应液加入到PCR反应容器中，并密封；优选地，所述BisDNA和PCR反应液的体积分别为30μl；更优选地，所述BisDNA浓度≥18pg/mL；

c)以下述扩增程序进行PCR扩增：

阶段1：94℃活化20分钟；

阶段2：62℃反应5秒、55.5℃反应35秒、93℃反应30秒，循环45次；

阶段3：40℃反应5秒；

其中，荧光信号的收集在阶段2完成。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是通过ABI 7500荧光定量PCR仪实现扩增的；优选地，所述应用是以ACTB为PCR扩增的内参。