CN114317762B - 用于检测早期肝癌的三标记物组合物及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测早期肝癌的cfDNA三标记物组合物及其试剂盒，属于生物检测技术领域。该cfDNA三标记物组合物由cfDNA甲基化标记物、cfDNA片段化标记物和蛋白标记物组合而成。该标记物组合物与肝癌发生相关，可用于辅助医生诊断肝癌的发病情况。该试剂盒通过对在不同时期肝癌患者的cfDNA甲基化、cfDNA片段化以及肝癌相关蛋白水平的变化的研究，继而提出采用三标记物组合物的结合，用于辅助医生对早期肝癌作出判断。公开了十个与肝癌发生相关的甲基化标记物结合片段化标记物以及三个蛋白标记物能够显著提高结果检出率和准确率，降低假阴、假阳概率，并鉴于离体血液样本检测的无创性，适于大规模推广应用。

Description

用于检测早期肝癌的三标记物组合物及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测早期肝癌的三标记物组合物及其试剂盒。

背景技术

肝癌是全世界发病率第六和死亡率第三的恶性肿瘤疾病。根据世界卫生组织国际癌症研究机构2020年发布的数据，肝癌在肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌之后为中国发病率第五的癌症，死亡率仅次于肺癌排第二。如此高的死亡率意味着，大多数的肝癌都是中晚期才被发现。在临床实践中，对肝癌的早期诊断依然是个巨大的挑战，肿瘤确诊时仅有20-30%的切除率，术后5年生存率为30-50%。因此，肝癌的早期发现具有显著降低肝癌死亡率的潜力。

当前肝癌早筛的手段有影像学检查、血清学分子标志物检查和病理学诊断等几种，然而影像学检查可以检测出直径>=1cm的腺瘤，但是对于更早期的病变灵敏度较低，而且存在一定辐射，可能诱发癌性病变。病理学诊断对肝癌患者的身心会造成创伤，受患者身体及心理素质的影响较大，且短时间内无法进行多次检查。甲胎蛋白（AFP）是目前唯一可用于检测和监测肝癌的血清学分子标志物，然其临床效用受到低灵敏度的限制。

DNA甲基化是一种表观调控修饰，在不改变碱基序列的情况下参与调控蛋白质的表达。在肿瘤细胞普遍存在着DNA甲基化状态的改变，而且对于早期肿瘤的发生，甲基化的修饰也起着至关重要的作用。

传统的依靠单一类型的分子特征的检测：如单一甲基化、单一蛋白肿瘤标记物的检测等技术，具有高假阳性率和高假阴性率的问题。因此，综合各类肿瘤标记物来进一步开发更加精确的肝癌辅助检测产品对实现肝癌的早筛早诊具有非常重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术存在的对于早期肝癌辅助诊断的流程多是采用单一种类标记物进行检测，该种方式多会导致检测结果不准确或是存在较多的假阳/阴性的问题，本发明目的在于提供一种用于检测早期肝癌的三标记物组合物及其试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：一种用于检测早期肝癌的三标记物组合物，所述三标记物组合物包括cfDNA甲基化标记物、cfDNA片段化标记物和蛋白标记物；

所述cfDNA甲基化标记物包含人类基因组中的cg00067742，cg00217080，cg00306838，cg01426968，cg04892643，cg06830441，cg09170112，cg14818277，cg15486123和cg23229261中的一种或多种的组合物；

所述cfDNA片段化标记物包含人类基因组中的chr1:161451891-161452085，chr1:213090124-213090244，chr2:91923773-91923893，chr5:1394573-1394693，chr5:2175269-2175389，chr6:34071136-34071329，chr11:66494117-66494237，chr14:106411591-106411951，chr17:31437589-31437709和chr22:46526763-46527190中的一种或多种的组合物；

所述蛋白标记物包括甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原中的一种或多种的组合物。

作为优选地，每个所述cfDNA片段化标记物内包含多个cfDNA短片段和多个cfDNA长片段。

上述cfDNA片段化标记物，计算的是上述公开的目标基因组区域内检测到的cfDNA短片段和cfDNA长片段的比值。

作为优选地，所述cfDNA短片段大小为80-150bp。

作为优选地，所述cfDNA长片段大小为150-200bp。

作为优选地，所述人类基因组为hg19人类基因组。

一种用于检测早期肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的三标记物组合物；以及三标记物组合物的探针和蛋白定量抗体。

作为优选地，所述探针用于杂交捕获含有所述三标记物组合物的DNA序列片段。

作为优选地，所述蛋白定量抗体包括甲胎蛋白抗体、甲胎蛋白异质体抗体和异常凝血酶原抗体。

该试剂盒cfDNA成分可以使用以下检测平台：PCR扩增法，数字PCR，荧光定量PCR，甲基化芯片法，液相芯片法，重亚硫酸盐测序，一代测序，二代测序，三代测序或者它们的组合所使用的试剂。优选采用二代测序法。

该试剂盒蛋白成分的检测优选采用免疫荧光定量法。

本发明的有益效果为：

（一）本发明提供了一种用于检测早期肝癌的三标记物组合物，该三标记物组合物与肝癌发生相关，包括cfDNA甲基化标记物、cfDNA片段化标记物以及蛋白标记物。通过三种标记物的结合后输出的数据，适用于辅助医生对早期肝癌作出判断。

（二）本发明的标记物组合物中包含一种新颖的肿瘤生物标记物，即cfDNA片段化标记物。该种标记物通过检测特定基因区域内的cfDNA片段长度的变化，即cfDNA短片段与cfDNA长片段数目的比值变化，来检测肿瘤的存在。该种肿瘤生物标记物具有较高的检测准确性，适用于辅助医生对早期肝癌作出判断。

（三）本发明提供的该试剂盒采用NEBNext Enzymatic Methyl-seq kit进行胞嘧啶到尿嘧啶的转化。相比于传统的重亚硫酸盐转化，该试剂盒采用的方法不会造成cfDNA的断裂，因此可以在检测甲基化标记物的同时可以检测片段化标记物。

（四）本发明提供的该试剂盒是通过对单独使用cfDNA甲基化修饰、cfDNA片段化或者蛋白标记物在不同时期肝癌患者的检测性能的局限性，继而提出采用三种标记物结合后输出的数据，适用于辅助医生对早期肝癌作出判断。

（五）本发明公开了十个与肝癌发生相关的甲基化标记物并结合十个cfDNA片段化标记物和三个蛋白标记物，能够显著提高检出率和准确率，并鉴于离体血液样本检测的无创性，适于大规模推广应用。

附图说明

图1是本发明实施例1中肝癌血液离体样本cfDNA甲基化标记物、cfDNA片段化标记物的筛选及肝癌的检测流程示意图；

图2是本发明实施例2中cg00067742，cg00217080，cg00306838，cg01426968，cg04892643，cg06830441，6个甲基化标记物在TCGA肝癌样本中独立预测的ROAUC示意图；

图3是本发明实施例2中cg09170112，cg14818277，cg15486123，cg23229261，4个甲基化标记物在TCGA肝癌样本中独立预测的ROAUC示意图；

图4是本发明实施例2中10个甲基化标记物组合在TCGA肝癌样本中预测的ROAUC示意图；

图5是本发明实施例2中cg00067742，cg00217080，cg00306838，cg01426968，cg04892643，cg06830441，6个甲基化标记物在血液离体样本中独立预测的ROAUC示意图；

图6是本发明实施例2中cg09170112，cg14818277，cg15486123，cg23229261，4个甲基化标记物在血液离体样本中独立预测的ROAUC示意图；

图7是本发明实施例2中6个cfDNA片段化标记物在血液离体样本中独立预测的ROAUC示意图；

图8是本发明实施例2中4个cfDNA片段化标记物在血液离体样本中独立预测的ROAUC示意图；

图9是本发明实施例2中蛋白标记物在血液离体样本中独立预测的ROAUC示意图；

图10是本发明实施例3中10个甲基化标记物结合10个cfDNA片段化标记物和3个蛋白标记物组合在血液离体样本中预测早期肝癌的ROAUC示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

该实施例1公开了用于检测肝癌的cfDNA甲基化标记物和cfDNA片段化标记物的筛选以及检测的流程和实验方法。

为了解决血液cfDNA含量较低以及重亚硫酸盐对DNA的损伤问题，本发明采用NEBNext Enzymatic Methyl-seq kit进行胞嘧啶到尿嘧啶的转化。

如图1所示，为肝癌血液离体样本cfDNA甲基化标记物和cfDNA片段化标记物的筛选及结合蛋白标记物进行肝癌检测的流程示意图，公开了三标记物组合物的研发流程。

1、肝癌血液离体样本cfDNA甲基化标记物和cfDNA片段化标记物的筛选具体步骤如下：

步骤1，根据TCGA公共数据库挖掘肝癌发生相关的DNA甲基化标记物和DNA片段化标记物；

步骤2，肝癌相关的甲基化标记物的捕获探针的设计以及合成，探针覆盖所选甲基化位点上下游150bp的基因区域；

步骤3，血液cfDNA的提取，酶转化以及甲基化cfDNA建库；

步骤4，肝癌特异性panel靶向捕获甲基化cfDNA文库；

步骤5，文库定量后进行二代测序；

步骤6，测序数据进行质量控制以及预处理后，计算目标位点的甲基化水平作为cfDNA甲基化标记物、每个探针覆盖的基因区域的cfDNA短片段（80-150bp）数目与cfDNA长片段（150-200bp）数目的比值作为cfDNA片段化标记物。

步骤7，分析筛选出在肝癌的组织与血液中具有一致性甲基化差异的甲基化标记物以及在肝癌样本中发生片段化模式改变的基因区域作为cfDNA片段化标记物，并结合蛋白标记物用于构建检测的算法模型并验证。

2、用于肝癌检测的血液蛋白浓度与cfDNA甲基化标记物和cfDNA片段化标记物的检测方法：

2.1 蛋白标记检测具体实验步骤如下：

1、样本处理：在静脉采血后24小时内分离血清，溶血、脂血样本不得用于检测，需重新采样。

2.检测前准备：先打开仪器(MQ60 PLUS 全自动化学发光免疫分析仪)电源开光，开始初始化，仪器开机30min后方可进行检测。将分离处理的血清样本取出，如果样本冷冻，需解冻，室温平衡30min，同时试剂盒及标准品取出后室温平衡30min。

3.定标：向校准品1和校准品2中各加500µL校准品稀释液进行复溶，复溶后可轻轻振荡，使干粉完全溶解后静置。在仪器操作界面选择定标品，然后选择“两步法”，后依据所选择蛋白标志物进行定标。拿出提前平衡好的试剂条，加入100µL复溶好的标准品进行检测，标准品1和2设置复孔检测。定标完成后查看标准曲线，显示定标成功，可检测样本。

4.样本检测：每次使用新批号试剂的时候，需录入试剂批号，如果已经有该批次，则不需要再次录入，准备好对应数量的试剂条和样本，将试剂条装入卡槽，同时加入100µL样本到对应试剂条中，将样本及足够枪头放入仪器，点击开始，仪器开始检测。仪器检测结束后清理废液盒，清理台面，关闭仪器。

2.2 cfDNA甲基化标记物以及片段化标记物检测具体实验步骤如下：

1、血液cf DNA提取：血液cf DNA提取具体操作步骤按照“游离DNA提取试剂盒（抽滤法）操作说明书”结合真空抽滤泵进行：将血液用蛋白酶K和裂解液裂解，使用真空抽滤泵和DNA结合柱结合DNA，并用洗涤液和无水乙醇洗涤，最后用洗脱缓冲液洗脱。

2、使用磁珠对cfDNA进行片段筛选：

①往cfDNA中加入0.75倍于cfDNA产物的SPRIselect 磁珠，涡旋混匀，室温孵育5分钟；置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液到新的1.5mL离心管中，备用；

②往上一步的上清液中加入1.05倍于cfDNA产物的SPRIselect 磁珠，吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清液；

③用新配制的80%乙醇洗涤，并弃上清液，重复该步骤一次；晾干，用洗脱缓冲液洗脱。

3、质控品准备：每个样本中需加入10 µL的0.1 ng/µL CpG甲基化的pUC19和10 µL的2 ng/µL非甲基化的λDNA；两种质控品需提前使用Covaris M220超声波打断仪打断并片段筛选至200 bp左右。

4、 cfDNA的文库构建：使用NEBNext Enzymatic Methyl-Seq试剂盒进行建库。

4.1 末端修复和3′端加“A”

4.1.1取50 ng待测样本，用NF水稀释至50μL，然后加入以下试剂进行反应。

4.1.2置于PCR仪中按以下程序进行反应。

4.2 接头连接

4.2.1往末端修复产物中加入以下试剂进行反应

4.2.2置于PCR仪中，按下表条件设置PCR反应程序：60℃，60min，热盖关闭。

4.2.3接头连接产物纯化

A、将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；

B、按照无水乙醇：无核酸酶水=8:2比例，配制80%乙醇，备用；

C、分别向连接产物中加入55μL 纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80%乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用15μL 洗脱缓冲液洗脱，吸取14μL上清进行下一步反应。

4.3 甲基化：氧化反应

4.3.1 配制buffer：

a. 往100ul E1反应缓冲液补充液中加入400ul E1 反应缓冲液振荡混匀，标记配制日期；

b 取10μL 500mM的Fe（Ⅱ）加入到1249μL的无核酸酶水中，稀释后的溶液立即使用，现配现用，不可保存；

c 使用无核酸酶水按1:10的比例稀释终止缓冲液。

4.3.2往14μL 纯化后的连接产物中加入以下试剂并混匀，然后再往已加入氧化酶的纯化后连接产物中加入10μL 稀释后的Fe（Ⅱ）并混匀离心。

4.3.3 置于PCR仪上，按照以下条件反应：37℃，1h，热盖温度≧45℃。

4.3.4 反应完成后往产物中加入1μL稀释后的反应终止液，并置于PCR仪上，按以下条件反应：37℃，30min，热盖温度≧45℃。

4.3.5氧化反应产物纯化

A、将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；

B、按照无水乙醇：无核酸酶水=8:2比例，配制80%乙醇，备用；

C、分别向连接产物中加入45μL NEB Next Sample 纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80%乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用9.5μL 洗脱缓冲液洗脱，吸取8μL上清进行下一步反应。

4.4甲基化：胞嘧啶脱氨基

4.4.1 变性：

a PCR仪提前预热至85℃，热盖开启；

b向8 μL 纯化后的氧化反应产物中加入2 μL 甲酰胺，涡旋振荡混匀，瞬时离心。

4.4.2 往变性后产物中加入以下试剂进行反应。

4.4.3置于PCR仪上，按以下条件反应：37℃，3h，热盖温度≧45℃。

4.4.4胞嘧啶脱氨基反应产物纯化

a 将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；

b 按照无水乙醇：无核酸酶水=8:2比例，配制80%乙醇，备用；

c 分别向连接产物中加入50μL NEB Next Sample 纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80%乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用11μL 洗脱缓冲液洗脱，吸取10μL上清进行下一步反应。

4.5 PCR扩增及纯化

4.5.1 向以上纯化产物中加入以下试剂进行反应。

4.5.2 置于PCR仪上，按以下条件反应。

4.5.3 PCR扩增产物纯化

a 将纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀纯化磁珠；

b 按照无水乙醇：无核酸酶水=8:2比例配制80%乙醇，备用；

c 分别向连接产物中加入22.5μL NEB 纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80%乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用15μL 洗脱缓冲液洗脱，吸取14μL上清，进行质检。

5、杂交洗脱

5.1 杂交：

a 每个待杂交文库取10ng，计算合并杂交所需的文库体积，并将12个文库混在一起；

b 向文库混合液中加入以下试剂进行反应；

c 打开真空浓缩仪，设置V-AQ模式，常温下浓缩成干粉；

d立即取20μL 杂交混合液加入到浓缩完成的干粉中，混匀并室温静置5分钟后，加入30μL 杂交增强液混匀离心；

e 置于PCR仪上，按以下条件进行反应。

表1试剂组分表

表2PCR反应条件表

5.2捕获洗脱

5.2.1 buffer预热：

将快速结合液、快速洗涤液2在48℃预热至沉淀溶解，快速洗涤液1在63℃预热至沉淀溶解，链霉亲和素磁珠室温平衡至少30min。

5.2.2 磁珠捕获

a 涡旋振荡混匀已平衡至室温的链霉亲和素磁珠；

b 取70μL链霉亲和素磁珠加入到1.5mL 离心管中；

c 加入20μL结合缓冲液，吹打混匀，瞬时离心后置于磁力架上，静置1min，弃上清液；

d 重复b和c步骤两次，共进行三次链霉亲和素磁珠清洗；

e 加入20μL结合缓冲液重悬链霉亲和素磁珠；

f 转移20μL重悬的链霉亲和素磁珠到杂交反应管中，然后全部液体转移到1.5mL离心管中；

g 室温条件下，在混匀仪上混匀30分钟，不可涡旋；

h 混匀完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1分钟，弃上清。

5.2.3 洗脱

a 加入200μL 54℃预热的快速清洗缓冲液1，吹打混匀，置于恒温金属浴中54℃孵育5min；

b 孵育完成后，瞬时离心，转移所有液体至新的1.5mL离心管中，去除结合在离心管表面的非特异性捕获片段；

c 置于磁力架上，静置1分钟，弃上清；

d 加入200μL 63℃预热的清洗缓冲液1，吹打混匀，置于恒温金属浴中54℃孵育5分钟；

e 孵育完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min，弃上清；

f 加入200μL 54℃预热的清洗缓冲液2，吹打混匀，置于恒温金属浴中54℃孵育5分钟；

g 孵育完成后，瞬时离心，置于磁力架上，静置1分钟，弃上清；

h 重复a到g步骤两次，共进行三次清洗；

i 瞬时离心，用10μL吸头弃掉残留的上清，立即加入45μL无核酸酶水，吹打混匀，冰上孵育。

5.3 捕获产物PCR富集

5.3.1 取22.5μL捕获产物（链霉亲和素磁珠悬浮液）加入以下试剂，进行反应。

置于PCR仪上，按以下条件进行反应。

5.3.2 PCR产物纯化

a 将DNA 纯化磁珠室温平衡30min，涡旋仪上充分混匀；

b 按照无水乙醇：无核酸酶水=8:2比例配制80%乙醇，备用；

c 分别向连接产物中加入90μL DNA 纯化磁珠吹打混匀，室温孵育5分钟，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；用新配制的80%乙醇洗涤，并弃上清，重复该步骤一次；晾干，用32μL 洗脱缓冲液洗脱，吸取30μL上清进行质控，并上机测序。

6 测序数据的分析：

下机的原始数据首先使用fastQC过滤低质量的序列(phred33 score <= 20)以及read中的接头序列和polyA/T序列。过滤后的高质量reads使用BSMAP回帖到hg19人类基因组，并筛选出回帖质量较高的reads。使用picard去除PCR重复后再通过samtools选择回帖到目标基因组区域（DNA甲基化标记物所对应的区域）的reads并计算各个DNA甲基化标记物的甲基化水平。

cfDNA片段化标记物计算的是每个探针覆盖的基因区域内长度在80bp-150bp的cfDNA片段数目与长度范围在150bp-200bp的cfDNA片段数目的比值。

实施例2

本实施例2公开了用于检测肝癌血液离体样本中的cfDNA甲基化标记物。首先基于TCGA公共数据库中51例肝癌癌旁组织样本，379例肝癌组织样本挖掘出200个在肝癌样本中发生显著差异甲基化的DNA甲基化标记物。进一步地，该实施例使用125例肝病，122例肝癌病人的血液离体样本并利用随机森林模型筛选出预测性能最好的10个cfDNA甲基化标记物，包含cg00067742，cg00217080，cg00306838，cg01426968，cg04892643，cg06830441，cg09170112，cg14818277，cg15486123，cg23229261。

如图2、3结果所示，这些位点单独在区分肝癌癌旁组织和肝癌组织时均有很高的AUC值。

如图4结果所示，上述这10个位点组合区分肝癌癌旁组织和肝癌组织时的AUC值高达0.991。

如图5、6结果所示，在血液游离DNA中，使用10个单一甲基化标记物分别构建出的模型同样均能够较好地区分肝病患者血液样本和肝癌患者血液样本。

本实施例同时公开了用于检测肝癌血液离体样本中的cfDNA片段化标记物，包含chr1:161451891-161452085，chr1:213090124-213090244，chr2:91923773-91923893，chr5:1394573-1394693，chr5:2175269-2175389，chr6:34071136-34071329，chr11:66494117-66494237，chr14:106411591-106411951，chr17:31437589-31437709和chr22:46526763-46527190。

如图7、8结果所示，在血液游离DNA中，使用10个单一cfDNA片段化标记物分别构建出的模型均能够较好地区分肝病患者血液样本和肝癌患者血液样本。

本实施例同时公开了用于检测肝癌血液离体样本中的蛋白标记物，甲胎蛋白，甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原。

如图9结果所示，三个蛋白检测肝癌血液离体样本的AUC值分别为0.851、0.801和0.780。

由此可见，本实施例所公开的cfDNA甲基化标记物、cfDNA片段化标记物以及蛋白标记物在检测肝癌血液离体样本时均具有较好的准确性。

实施例3

本实施例3将122例肝癌血液离体样本中的85例晚期肝癌样本和125例肝病样本中随机选取的88例样本作为训练集；而37例早期肝癌样本和剩余的37例肝病样本作为验证集。使用不同类型的标记物或者三标记物组合在训练集中构建出检测肝癌离体血液样本的机器学习模型，并在独立的验证集样本中评估模型预测早期肝癌离体血液样本的准确性。

如图10结果所示，所有10个甲基化标记物组合所构建出的模型区分良性肝病血液和早期肝癌血液的AUC值为0.942。所有cfDNA片段化标记物组合所构建出的模型区分良性肝病血液和早期肝癌血液的AUC值为0.884。而所有蛋白标记物组合所构建出的模型区分良性肝病血液和早期肝癌血液的AUC值为0.823。

最后，10个cfDNA甲基化标记物结合10个cfDNA片段化标记物和3个蛋白标记物所构建的综合机器学习模型在区分良性肝病血液和早期肝癌血液的AUC值高达0.990。

综上所述，说明了结合使用本发明所公开的10个cfDNA甲基化标记物、10个cfDNA片段化标记物以及3个蛋白标记物在辅助检测早期肝癌中具有显著的实际应用价值。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，均属于本发明的保护范围。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种用于检测早期肝癌的三标记物组合物，其特征在于，所述三标记物组合物包括cfDNA甲基化标记物、cfDNA片段化标记物和蛋白标记物；

所述cfDNA甲基化标记物为人类基因组中的cg00067742，cg00217080，cg00306838，cg01426968，cg04892643，cg06830441，cg09170112，cg14818277，cg15486123和cg23229261中的一种或多种的组合物；

所述cfDNA片段化标记物为人类基因组中的chr1:161451891-161452085，chr1:213090124-213090244，chr2:91923773-91923893，chr5:1394573-1394693，chr5:2175269-2175389，chr6:34071136-34071329，chr11:66494117-66494237，chr14:106411591-106411951，chr17:31437589-31437709和chr22:46526763-46527190中的一种或多种的组合物；

所述蛋白标记物为甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体和异常凝血酶原中的一种或多种的组合物。

2.根据权利要求1所述的用于检测早期肝癌的三标记物组合物，其特征在于，每个所述cfDNA片段化标记物内包含多个cfDNA短片段和多个cfDNA长片段。

3.根据权利要求2所述的用于检测早期肝癌的三标记物组合物，其特征在于，所述cfDNA短片段大小为80-150bp。

4.根据权利要求2所述的用于检测早期肝癌的三标记物组合物，其特征在于，所述cfDNA长片段大小为150-200bp。

5.根据权利要求1所述的用于检测早期肝癌的三标记物组合物，其特征在于，所述人类基因组为hg19人类基因组。

6.一种用于检测早期肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5任一项所述的三标记物组合物；以及三标记物组合物的探针和蛋白定量抗体；

所述探针用于杂交捕获含有权利要求1所述三标记物组合物的DNA序列片段；

所述蛋白定量抗体包括甲胎蛋白抗体、甲胎蛋白异质体抗体和异常凝血酶原抗体。

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