CN105997969B - 基于巴氯芬和阿坎酸的神经性障碍疗法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗与谷氨酸兴奋毒性和淀粉样蛋白β毒性相关的神经性障碍的组合和方法。更具体地，本发明涉及基于巴氯芬和阿坎酸组合的多发性硬化,阿尔茨海默病,阿尔茨海默病相关障碍,肌萎缩侧索硬化,帕金森病,亨廷顿病,神经性疼痛,酒精性神经病,酒精中毒或戒酒,或脊髓损伤的新型组合疗法。

Description

基于巴氯芬和阿坎酸的神经性障碍疗法

本申请是申请日为2012年3月1日，申请号为201280017651.0、发明名称“基于巴氯芬和阿坎酸的神经性障碍疗法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于治疗神经疾病和障碍的组合和方法。更具体地，本发明涉及基于巴氯芬和阿坎酸组合的神经性障碍的新型组合疗法。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是原型皮质痴呆，其特征在于可归因于牵涉皮质相关区域的记忆缺失以及言语障碍症(其中存在说话受损和说话理解受损的语言障碍)，运用障碍(在没有运动或感觉受损下协调和进行某些目的性运动和姿势的无能)和失认症(识别物体、人物、声音、形状或味道的能力)。也可能涉及特种症状如痉挛性轻截瘫(影响下肢的虚弱)(1-4)。

阿尔茨海默病的发病率随着年龄显著增大。AD目前是痴呆的最常见病因。其临床特征在于缓慢进展且留下躺在床上、无节制且依赖于看护的末期患者的认知功能的完全减弱。平均在诊断后9年发生死亡(5)。

AD的发病率随着年龄显著增加。联合国人口预测估计，超过80岁的人数到2050年将达到3亿7000万。目前，据估计，50％的年龄超过85岁的人受到AD侵扰。因此，全世界超过10亿人在50年内将遭受痴呆。需要稳定护理和其他服务的巨大人数将严重影响医学、金钱和人力资源(6)。

记忆缺陷是该疾病的早期特征并且涉及情景记忆(对于今天事件的记忆)。在该疾病的后期涉及语义记忆(对于语文意义和视觉意义的记忆)。相反，工作记忆(涉及用于临时储存和操作信息的结构和过程的短期记忆)和程序记忆(作为技巧和程序的长期记忆的潜意识记忆)被保存直至后期。随着疾病进展，出现另外的语言受损、视觉感知和空间缺陷、失认症和失用症的特征。

阿尔茨海默病的典型描绘是允许在大约80％的病例中鉴定的充分特性(7)。然而，确实出现临床不同并且不仅这对于管理是重要的而且对功能不同形式提供具体药物疗法治疗的进一步暗示。

AD的病理学标志包括含有β-淀粉样蛋白(Aβ)的淀粉质斑块，含有Tau的神经原纤维缠结(NFT)以及神经元和突触功能障碍和损失(9-11)。对于最近十年，已经提出关于AD的病因的两种主要假设：“淀粉样蛋白级联假设”，其说明神经变性过程是由淀粉样蛋白前体单体(APP)的异常加工触发的一系列事件(12)，以及“神经元细胞支架退化假设”(13)，其提出细胞支架变化是触发事件。解释AD进展的最广泛接受的理论仍然是淀粉样蛋白级联假设(14-16)并且AD研究者主要聚焦于确定与Aβ蛋白相关的毒性潜在的机制。微血管通透性和重塑、异常血管发生和血脑屏障破裂已被鉴定为有助于淀粉样蛋白级联中的APP毒性的关键事件(17)。相反，Tau蛋白比淀粉样蛋白受到来自制药工业的显著更少的关注，因为根本性和实际关注两方面。此外，突触密度变化是比另两种与认知受损最佳相关的病理学病变。研究已经揭示，淀粉样蛋白病理学看起来以这样的神经递质特异方式进展，其中胆碱能末端看起来最脆弱，接着谷氨酸能末端并且最后通过γ-氨基丁酸能末端(11)。谷氨酸是哺乳动物神经系统中最丰富的兴奋性神经递质。在病理学条件下，其在突触间隙中的异常积累导致谷氨酸受体过度激活(18)。突触间隙中的谷氨酸的异常积累导致谷氨酸受体的过度激活，这导致病理学过程并且最终导致神经元细胞死亡。这个过程，称为兴奋毒性，通常在极性和慢性神经性障碍期间在神经元组织中观察到。

变得明显的是，兴奋毒性涉及各种病因学的多种障碍的发病机制，如：脊髓损伤，中风，外伤性脑损伤，听力损失，酒精中毒和戒酒，酒精性神经病，或神经性疼痛以及神经变性疾病如多发性硬化，阿尔茨海默病，肌萎缩侧索硬化，帕金森病，和亨廷顿病(19-21)。对于这些疾病的有效治疗的开发由于它们的发病率以及缺乏治愈性治疗而仍然是主要的公众健康问题。

两种药物疗法用来改善或减缓AD的症状，其依赖于NMDA谷氨酸受体的一些乙酰胆碱酯酶调节剂和阻断剂(26-27)。

靶向这种受体的不同位点的NMDAR拮抗剂已被测试以抵抗兴奋毒性。无竞争的NMDAR拮抗剂靶向离子通道孔，由此减少到突触后神经元中的钙进入。它们中的一些达到批准状态。作为一个实例，美金刚目前批准用于中度至严重阿尔茨海默病。其在其他适应症中进行临床测试，这些适应症包括兴奋毒性的组分如酒精依赖(II期)，肌萎缩侧索硬化(III期)，与帕金森病相关的痴呆(II期)，癫痫，亨廷顿病(IV期)，多发性硬化(IV期)，帕金森病(IV期)和外伤性脑损伤(IV期)。然而，这种分子对大多数阿尔茨海默病环状具有有限益处，因为它仅具有适度的针对症状的效果。限制兴奋毒性的另一种方法在于抑制谷氨酸的突触前释放。利鲁唑，目前被批准用于肌萎缩侧索硬化，在缺血和外伤性脑损伤模型中表现出鼓舞人心的结果(22-25)。其目前在早期多发性硬化、帕金森病(不显示比安慰剂更好的任何结果)以及脊髓损伤中处于II期试验测试。在1995年，该药物达到孤儿药物状态，用于治疗肌萎缩侧索硬化并且在1996年，用于治疗亨廷顿病。使用NMDA受体拮抗剂如美金刚，非尔氨酯，阿坎酸和MRZ 2/579用于治疗抑郁症也已在US2010076075中建议。

WO2009133128，WO2009133141，WO2009133142和WO2011054759公开了用于治疗AD的药物组合。

尽管在这个领域的积极研究，但是仍然需要用于神经性障碍并且，特别是，与谷氨酸和/或淀粉样蛋白β毒性相关的神经性障碍的替代或改进的有效疗法。本发明提供用于中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)的这样的神经疾病的新治疗。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于治疗神经性障碍的新治疗方法和组合物。更具体地，本发明涉及基于巴氯芬和阿坎酸的组合的用于治疗与谷氨酸和/或淀粉样蛋白β毒性相关的神经性障碍的组合物和方法。

本发明尤其源于本发明的发明人的出乎意料的发现，即巴氯芬和阿坎酸的组合对患有阿尔茨海默病的患者提供实质性且出乎意料的益处。此外，本发明的发明人以令人惊奇地发现，这种组合物对于神经性障碍中遇到的各种损伤(包括谷氨酸毒性)提供神经元细胞的实质性且出乎意料的保护。因此，这种巴氯芬和阿坎酸组合构成用于遭受、易感染或怀疑遭受神经性障碍的患者的有效治疗。

本发明的一个目的涉及包含组合巴氯芬和阿坎酸的组合物，其用于治疗神经障碍，特别是AD和相关障碍，多发性硬化(MS)，肌萎缩侧索硬化(ALS)，帕金森病(PD)，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，亨廷顿病(HD)和脊髓损伤。

本发明的组合物可以含有巴氯芬和阿坎酸作为仅有的活性成分。可替换地，所述组合物可以包含另外的活性成分。在这方面，本发明的另一个目的涉及一种组合物，其包含巴氯芬、阿坎酸和选自以下中的至少一种第三化合物的组合：磺胺异恶唑，甲巯咪唑，丙胺卡因，二羟丙茶碱，奎纳克林，甘珀酸，氨基己酸，卡麦角林，乙胺嗪，西那卡塞特，桂利嗪，依普利酮，非诺多泮，来氟米特，左西孟旦，舒洛地昔，特比萘芬，唑尼沙胺，依托咪酯，苯乙双胍，曲美他嗪，美西律，艾芬地尔，莫西沙星，溴隐亭或托拉塞米，所述组合物用于治疗需要其的受试者的神经性障碍。

如将在本申请中进一步公开的，本发明组合疗法中的化合物可以同时、单独、依次和/或重复地施用至受试者。

本发明还涉及本身包含上述至少两种化合物的组合的任意药物组合物。

本发明的组合物通常还包含一种或几种药用赋形剂或载体。而且，本发明中使用的化合物可以为盐，水合物，酯，醚，酸，酰胺，外消旋物，或异构体的形式。它们还可以为缓释制剂形式。也可以使用疏水化合物的前药或衍生物。

在一个优选实施方式中，化合物以其本身或以其盐、水合物、酯、醚的形式或缓释形式使用。用于本发明的特别优选的盐是阿坎酸钙。

在另一个优选实施方式中，使用前药或衍生物。

本发明的另一个目的是一种制备药物组合物的方法，所述方法包括在药用赋形剂或载体中混合物巴氯芬和阿坎酸。

本发明的另一个目的涉及一种用于治疗需要其的哺乳动物受试者，优选需要其的人受试者的神经障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的组合。

本发明的另一个目的涉及一种治疗需要其的哺乳动物受试者，优选需要其的人受试者的阿尔茨海默病或相关障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的组合。

本发明的一个优选目的涉及一种治疗需要其的哺乳动物受试者，优选需要其的人受试者的阿尔茨海默病或相关障碍的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或依次施用有效量的巴氯芬和阿坎酸。

本发明的一个更优选目的涉及一种治疗需要其的哺乳动物受试者，优选需要其的人受试者的神经障碍的方法，所述方法包括向所述受试者同时、单独或依次施用有效量的巴氯芬和阿坎酸。

本发明可以用于治疗需要其的哺乳动物受试者，优选需要其的人受试者的神经障碍的方法，在该疾病的任何阶段。如将在实施例中公开的，本发明的组合物能够减轻所述受试者的病理学。

附图说明

图1：人β淀粉样蛋白毒性对用于药物筛选的内皮细胞的实验模型的验证。10nMVEGF的1h预处理显著保护毛细血管网免受这种淀粉样蛋白损伤(相比于淀粉样蛋白中毒，+70％的毛细血管网)。

图2：巴氯芬(BCL)和阿坎酸(ACP)组合疗法对β-淀粉样蛋白中毒HBMEC培养基中的毛细血管网总长度的影响。所述聚结人体淀粉样肽(Aβ_1-422.5μM)产生了显著中毒，相比于载体治疗的细胞，超过40％。这种中毒显著受阻于阿坎酸和巴氯芬(A)的组合而同时，在那些浓度下，阿坎酸(B)和巴氯芬(C)单独对中毒没有显著影响。

p＜0.05，显著不同于Aβ_1-42中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物；″ns″无显著效果(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图3：巴氯芬(BCL)和特比萘芬(TBN)组合疗法对β-淀粉样蛋白中毒的HBMEC培养物中的毛细血管网的总长度的作用。相比于媒介物处理的细胞，人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-422.5μM)产生显著中毒，高于40％。这种中毒通过特比萘芬和巴氯芬的组合防止。*：p＜0.05：显著不同于对照(没有中毒)。

图4：人β淀粉样蛋白毒性对用于药物筛选的神经元细胞的实验模型的验证。雌二醇(150nM)或BDNF(50ng/mL)的1小时预处理显著保护神经元免受这种淀粉样蛋白损害(-94％)，其被视作是用于神经保护的阳性对照。*：p＜0.05：显著不同于对照(没有中毒)；

p＜0.05，显著不同于Aβ_1-42中毒。

图5：阿坎酸(ACP)和巴氯芬(BCL)组合疗法对大鼠原代皮质细胞上的人Aβ_1-42毒性中的LDH释放的影响。相比于媒介物处理的神经元，人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-4210μM)产生显著中毒。这种中毒由阿坎酸和巴氯芬(A)的组合显著防止，而在这些浓度下，阿坎酸(B)和巴氯芬(C)单独对中毒都没有显著效果。

p＜0.05，显著不同于Aβ_1-42中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物；″ns″无显著效果。(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图6：西那卡塞特(CNC)和磺胺异恶唑(SFX)组合疗法对大鼠原代皮质细胞上的人Aβ_1-42毒性中的LDH释放的作用。相比于媒介物处理的神经元，人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-4210μM)产生显著中毒。这种中毒通过西那卡塞特和磺胺异恶唑的组合防止。*：p＜0.05，显著不同于媒介物。

图7：阿坎酸(ACP)和巴氯芬(BCL)组合疗法对β_-淀粉样蛋白中毒的皮层神经元中的神经突网络的总长度的作用。相比于媒介物处理的细胞，人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-422.5μM)产生显著中毒，高于15％。这种中毒通过阿坎酸和巴氯芬显著地防止，而在那些浓度下，阿坎酸和巴氯芬单独对中毒都没有显著效果。

p＜0.05，显著不同于Aβ_1-42中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图8：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对通过Y-迷津测验定义的行为的影响。如通过改变百分比测量的，淀粉样蛋白肽产生认知的显著下降(53.8％对73.5％)。这种有害作用被阿坎酸(0.2mg/kg/天)和巴氯芬(3mg/kg/天)的组合显著防止(48.2％的保护)。◇：p＜0.05，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图9：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对记忆的影响，如通过该被动回避(逃离潜伏期)定义的。相比于对照，如通过逃离潜伏期测量的，淀粉样蛋白肽产生记忆性的显著下降。这种有害作用被阿坎酸(0.2mg/kg)和巴氯芬(3mg/kg)的组合显著防止(完全保护)。◇：p＜0.05，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunn’stest)。

图10：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对记忆的影响，如通过被动回避(步入潜伏期)定义的。相比于对照，如通过步入潜伏期测量的，淀粉样蛋白肽产生记忆性的显著下降，高于44％。这种有害作用被阿坎酸(0.2mg/kg)和巴氯芬(3mg/kg)的组合显著防止(78.8％的保护作用)，而在那些浓度下，阿坎酸和巴氯芬单独对中毒具有较低作用。◇：p＜0.05，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunn’s检验)。

图11：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对海马中的神经元密度的影响。相比于对照，如通过每毫升海马中的神经元数量测量的，淀粉样蛋白肽产生神经元密度的显著下降，高于21％。这种神经元损害通过阿坎酸(0.2mg/kg)和巴氯芬(3mg/kg)的组合显著防止(63.2％的受损神经元被保护)。◇：p＜0.05，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图12：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对血脑屏障完整性的影响。相比于对照，淀粉样蛋白肽影响血脑屏障(BBB)，诱导其渗透性的显著增加，高于51％。对血脑屏障的那些损伤通过阿坎酸(0.2mg/kg)和巴氯芬(3mg/kg)的组合显著防止(66.6％的完整性恢复)，◇：p＜0.05，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图13：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对突触密度的影响，如通过突触囊泡蛋白浓度反映的。相比于对照，淀粉样蛋白肽影响突触功能，诱导脑中的突触囊泡蛋白浓度显著下降，高于34％。对突触密度的那些损伤通过阿坎酸(0.2mg/kg/天)和巴氯芬(3mg/kg/天)的组合显著防止(76％)。◇：p＜0.05，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图14：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对海马中的氧化应激的保护作用。相比于对照，图通过脂质过氧化测量的，淀粉样蛋白肽诱导海马中的氧化应激的显著增加，高于59％。脂质氧化应激通过阿坎酸(0.2mg/kg/天)和巴氯芬(3mg/kg/天)的组合显著防止(65.9％)。◇：p＜0.05，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.05，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图15：巴氯芬和阿坎酸组合疗法对于神经元皮质细胞上的谷氨酸毒性的影响，谷氨酸中毒通过巴氯芬(400nM)和阿坎酸(1.6nM)的组合显著防止，而在那些浓度下，巴氯芬和阿坎酸单独对中毒没有显著效果。◇：p＜0.001，显著不同于谷氨酸中毒；(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图16：多奈哌齐、阿坎酸和巴氯芬组合疗法对行为和认知性的影响，如通过Y-迷津测验定义的。淀粉样蛋白肽产生认知的显著下降，如通过改变的百分比测量的(51.5％对71.8％)。这种有害作用被多奈哌齐(0，25mg/kg/天)、阿坎酸(32μg/kg/天)和巴氯芬(480μg/kg/天)的组合显著防止(98％的保护)，而在那些浓度下，这些药物单独无显著效果。◇：p＜0.01，显著不同于Aβ_25-35中毒；*：p＜0.01，显著不同于媒介物(ANOVA+Dunnett事后检验)。

图17：阿坎酸及其衍生物高牛磺酸对大鼠原代皮质细胞上在人Aβ_1-42毒性测定的预处理的保护作用的比较。相比于媒介物处理的神经元，Aβ_1-42产生显著中毒。中毒通过高牛磺酸和阿坎酸(99％，8nM)同样地显著防止。◇：p＜0.0001：显著不同于Aβ_1-42中毒。

图18：阿坎酸和巴氯芬组合疗法对慢性进展的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的形成的影响，如通过临床评分定义的。免疫诱导物理特征的显著下降，如通过临床评分测量的。这种有害作用被阿坎酸(2mg/kg/天)和巴氯芬(30mg/kg/天)的组合显著防止(p-值＜0.01)。

具体实施方式

本发明提供用于治疗神经性障碍的新方法和组合物。本发明公开了新型药物组合，其允许有效矫正这样的疾病并且可以用于任何哺乳动物受试者。

本发明适用于治疗任何神经性障碍，无论是中枢或者周围，特别是其中涉及神经或神经元损伤、β淀粉样蛋白、BBB破裂或谷氨酸兴奋毒性的障碍。这样的障碍的具体实例包括神经变性疾病，神经病，脊髓损伤，和物质滥用如酒精中毒。

神经变性障碍是指疾病，如阿尔茨海默病和相关障碍，肌萎缩侧索硬化(ALS)，多发性硬化(MS)，帕金森病(PD)，亨廷顿病(HD)，涵盖神经元的功能和死亡的进展性丧失。

神经病是指其中周围神经系统的神经被损害的病症，这包括由遗传因素、炎性疾病、或由化学物质包括药物(长春新碱，奥沙利铂，乙醇)激发的周围神经系统损害。神经病的治疗还包括神经性疼痛的治疗。

本发明特别适用于治疗AD和相关障碍。在本发明上下文中，术语“相关障碍”包括AD类型的老年痴呆(SDAT)，刘易斯体痴呆，血管性痴呆，轻度认知受损(MCI)和年龄相关性记忆缺陷(AAMI)。

如本文使用的，“治疗”包括治疗，防止，预防，延迟或减少由上述疾病或障碍或其病因激发的症状。术语治疗特别包括控制疾病进展和相关症状。术语治疗特别包括在所治疗的受试者中i)针对由淀粉样蛋白β引起的毒性的保护，或所述毒性的减少或延迟，和/或ii)针对谷氨酸兴奋毒性的保护，或所述毒性的减少或延迟。术语治疗还指认知症状的改善或神经元细胞的保护。

在本发明上下文中，具体药物或化合物的名称意味着不仅包括具体命名的分子，而且包括任何化学纯度的其任意药用盐，水合物，衍生物，异构体，外消旋物，结合物，前药或衍生物。

术语“组合或组合治疗/疗法”是指这样的治疗，其中至少巴氯芬和阿坎酸同时施用至受试者以引起生物学作用。在根据本发明的一种组合疗法中，该至少两种药物可以一起或单独地，同时或依次地施用。而且，该至少巴氯芬和阿坎酸可以通过不同路径和方案施用。作为结果，尽管它们可以一起配制，但是组合的药物也可以单独地配制。

如本文所用的，术语“前药”是指本发明的化合物的任何功能性衍生物(或前体)，当施用至生物学系统时，其作为例如自发化学反应、酶、催化化学反应和/或代谢化学反应的结果而产生所述化合物。相比所得药物，前药通常是无活性或活性较低并且可以例如用来改善药物的生理化学性质，将药物靶向特定组织，改善药物的药代学和药动学性质和/或减少不需要的副作用。顺从前药设计的一些常见官能团包括但不限于羧基，羟基，胺基，磷酸/膦酸基和羰基。通常经由这些基团改性产生的前药包括但不限于酯类，碳酸酯(盐)类，氨基甲酸酯类，酰胺类和磷酸酯(盐)类。用于选择合适前药的具体技术指南是公知常识(29-33)。此外，前药的制备可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行。可以用来合成其他前药的方法描述于大量关于该主题的综述(30；34-40)。例如，普阿氯芬(ArbaclofenPlacarbil)列举在ChemID plus Advance数据库(website：chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/)并且普阿氯芬是熟知的巴氯芬的前药(41-42)。

术语化合物的“衍生物”包括与所述化合物功能和/或结构相关的任何分子，如这样的化合物的酸，酰胺，酯，醚，乙酰化变体，羟基化变体，或烷基化(C1-C6)变体。术语衍生物还包括失去了如上列出的一个或多个取代基的结构相关化合物。例如，高牛磺酸是阿坎酸的去乙酰化衍生物。化合物的优选衍生物是具有与所述化合物的显著程度的相似性的分子，如通过已知的方法确定的。类似化合物连同它们与母体分子的相似性指数可以发现于大量数据库如PubChem(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)或药物库(http：// www.drugbank.ca/)。在一个更优选的实施方式中，衍生物应具有与母体药物的大于0.4，优选大于0.5，更优选大于0.6，甚至更优选大于0.7的谷本(Tanimoto)相似性指数。Tanimoto相似性指数广泛用来测量两种分子之间的结构相似性程度。Tanimoto相似性指数可以通过可在线获得(http：//www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/)的软件如the SmallMolecule Subgraph Detector(43-44)计算。优选衍生物应在结构和功能上与母体化合物相关，即它们还应保留母体药物的至少部分活性，更优选它们应针对Aβ或谷氨酸毒性具有保护活性。

术语衍生物还包括药物的代谢物，例如，在施用至有机物后，通常通过专门的催化系统，由所述药物的(生化)改性或加工产生，并且其显示或保留药物的生物学活性的分子。代谢物已被公开为负责母体药物的大部分治疗作用。在一个具体实施方式中，如本文所用的，“代谢物”是指保留母体化合物的至少部分活性，优选针对Aβ毒性或谷氨酸毒性具有保护活性的改性或加工药物。

术语“盐”是指本发明的化合物的药用和相对无毒的、无机或有机酸加成盐。药学盐形成包括用对抗离子配对酸性、碱性或两性离子药物分子以生成该药物的盐形式。在中和反应中可以使用广泛的各种各样的化学物质。本发明的药用盐因此包括通过使主要化合物(充当碱)与无机或有机酸反应以形成盐获得的那些盐，例如，乙酸、硝酸、酒石酸、盐酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、樟脑磺酸、草酸、马来酸、琥珀酸或柠檬酸的盐。本发明的药用盐还包括那些，其中主要化合物充当酸并且与适当碱反应以形成例如钠、钾、钙、镁、铵或胆碱盐。尽管所给出的活性成分的大多数盐是生物等价物，但是其中一些可以具有增加的溶解度或生物利用度性质。现在盐选择是药物开发过程中的普通标准操作，如由H.Stahl和C.GWermuth在他们的手册中教导的(45)。

在一个优选实施方式中，化合物的名称意味着指化合物本身，及其任意药用盐，水合物，异构体，外消旋物，酯或醚。

在一个更优选的实施方式中，化合物的名称意味着指如具体命名的化合物本身，及其任意药用盐。

在一个特别实施方式中，使用化合物的缓释制剂。

如上所述的，本发明涉及特别药物组合，其对神经性障碍中涉及的若干生物学过程具有强的出乎意料作用。因此这些药物组合代表用于治疗神经性障碍，如阿尔茨海默病和相关障碍，多发性硬化，肌萎缩侧索硬化，帕金森病，亨廷顿病，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，和脊髓损伤的新方法。更具体地，本发明公开了组合物，其包含与阿坎酸组合的巴氯芬，其提供对神经性障碍的体内显著作用。

事实上，本发明在实验部分显示，包含巴氯芬和阿坎酸的组合可以实质性地改善受神经性障碍侵袭的患者的病症。特别是，本发明的发明人令人惊奇地发现，巴氯芬和阿坎酸组合对毛细血管网的长度或β-淀粉样蛋白中毒的神经细胞中的LDH释放，并且代表AD的新治疗方法。而且，实施例显示，在本发明的组合疗法中，巴氯芬可以在80nM或以下的剂量是有效的，并且阿坎酸可以在1nM或以下的剂量是有效的。这些结果是显著的并且有利的，在这样低的剂量下，可以避免任何可能的副作用。

此外，这些组合有效地保护神经元细胞免疫各种侵袭如谷氨酸毒性、氧化性应激，并且防止涉及多种神经性障碍的BBB渗透或神经元细胞诱发的死亡。

因此本发明提出基于巴氯芬和阿坎酸组合物的神经性障碍的新型疗法。更特别地，因此本发明提出基于巴氯芬和阿坎酸组合的阿尔茨海默病和相关障碍，多发性硬化，肌萎缩侧索硬化，帕金森病，亨廷顿病，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒的新型疗法。

在这方面，在一个特别实施方式中，本发明涉及包含巴氯芬和阿坎酸的组合物。

在另一个实施方式中，本发明涉及包含巴氯芬和阿坎酸的组合物，其用于治疗AD，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤。

在另一个实施方式中，本发明涉及巴氯芬和阿坎酸用于制备药物的用途，所述药物用于治疗AD，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤。

用于巴氯芬和阿坎酸的示例性CAS号提供在下表1中。表1还以非限制性方式列举用于本发明组合中的这些化合物的常见盐，外消旋物，前药，代谢物或衍生物。

表1

巴氯芬的前药的具体实例提供在Hanafi et al，2011(41)中，特别是巴氯芬酯和巴氯芬氨基甲酸酯，其对于CNS靶向是特别关注的。因此这样的前药特别是适用于本发明的组合物。如前提及的，巴氯芬placarbil也是一种已知的前药并因此可以代替巴氯芬用于本发明的组合物。巴氯芬的其他前药可以在以下专利申请中发现：WO2010102071，US2009197958，WO2009096985，WO2009061934，WO2008086492，US2009216037，WO2005066122，US2011021571，WO2003077902，WO2010120370。

阿坎酸的有用前药如泛解酸酯新戊基磺酰基酯，阿坎酸的新戊基磺酰基酯前药或掩蔽羧酸酯新戊基磺酰基酯前药特别列举在WO2009033069，WO2009033061，WO2009033054WO2009052191，WO2009033079，US 2009/0099253，US 2009/0069419，US 2009/0082464，US2009/0082440和US 2009/0076147中。

巴氯芬和阿坎酸可以单独使用或可以进一步组合另外的化合物。在这方面，在一个特别实施方式中，本发明的组合物可以进一步包含选自以下中的至少一种化合物：磺胺异恶唑，甲巯咪唑，丙胺卡因，二羟丙茶碱，奎纳克林，甘珀酸，氨基己酸，卡麦角林，乙胺嗪，西那卡塞特，桂利嗪，依普利酮，非诺多泮，来氟米特，左西孟旦，舒洛地昔，特比萘芬，唑尼沙胺，依托咪酯，苯乙双胍，曲美他嗪，美西律，艾芬地尔，莫西沙星，溴隐亭或托拉塞米。对于这些化合物每一种的示例性CAS号提供在下表2中：

表2

在一个特别实施方式中，本发明涉及这种组合用于治疗需要其的受试者的AD或相关障碍的用途。

在一个特别实施方式中，本发明涉及这种组合用于治疗需要其的受试者的MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤的用途。

如实施例中公开的，使用至少巴氯芬和阿坎酸的组合物疗法对导致神经元损伤的生物学过程具有强的出乎意料的作用。此外，这些组合还显示矫正神经疾病的症状的体内非常有效的能力。因此这些组合代表用于治疗以下的新型方法：神经性障碍，如阿尔茨海默病，多发性硬化，肌萎缩侧索硬化，帕金森病，亨廷顿病，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，和脊髓损伤。这些组合物有效地防止对神经元细胞的淀粉样蛋白β(Aβ)肽的毒性或谷氨酸兴奋毒性。此外，在体内，这些组合物导致多种认知症状的改善以及神经元细胞的保护。因此它们代表用于治疗这样的障碍的新型和有效方法。

实验部分进一步显示，上述组合物在以下也是有效的：i)协同地在体外保护神经元细胞免于谷氨酸兴奋毒性，和ii)在用于与谷氨酸兴奋毒性相关的疾病的体内模型中提供临床益处。

本发明的组合物可以包含2，3，4或5种不同的药物，更优选2，3或4种不同药物，用于组合治疗需要其的受试者的阿尔茨海默病(AD)，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤。在一个优选实施方式中，本发明的药物以组合用于组合、单独或依次施用，以提供最有效的效果。

本发明的优选组合物，其用于治疗神经障碍如阿尔茨海默病(AD)，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤，包含以下药物组合之一，用于组合、单独或依次施用：

-巴氯芬和阿坎酸，

-巴氯芬和阿坎酸和乙胺嗪，

-巴氯芬和阿坎酸和西那卡塞特，

-巴氯芬和阿坎酸和磺胺异恶唑，

-巴氯芬和阿坎酸和托拉塞米，

-巴氯芬和阿坎酸和艾芬地尔，

-巴氯芬和阿坎酸和美西律，

-巴氯芬和阿坎酸和依普利酮，

-巴氯芬和阿坎酸和左西孟旦，

-巴氯芬和阿坎酸和特比萘芬，或

-巴氯芬和阿坎酸和来氟米特。

如在实验部分中公开的，本发明的组合疗法对改善人受试者的阿尔茨海默病或相关障碍提供显著的治疗和生物学作用。它们诱导针对Aβ毒性的强神经保护作用并且在体内行为表现和生物化学测定提供阳性结果。结果显示本发明的组合物i)有效地矫正在体内由Aβ聚集体触发的分子路径和ii)导致作为神经元存活或突触完整性的在患病动物中观察到的神经生理受损的改善。

此外，呈现的结果还显示，上述组合疗法针对谷氨酸兴奋毒性具有重要的协同神经保护作用(图15)，一种在各种神经疾病如AD，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤中是复杂的路径。这些疗法对于这些疾病在体内外模型中提供阳性结果。

另外，体内结果显示，本发明的组合物有效地恢复血脑屏障完整性，并且防止、延迟或减轻细胞死亡触发，其已知在多种神经疾病中将受损。

此外，对于这两种药物观察到的特别高的协同相互作用允许使用药物浓度当以单个药物治疗使用时不显示作用。此外，如实验部分中显示的，相比于其他治疗组合，巴氯芬和阿坎酸组合对阿尔茨海默病引起增强的治疗益处。这些组合物有效地防止淀粉样蛋白β蛋白或肽对人细胞并且在体内模型中的毒性作用，并且代表用于治疗这样的障碍的新型和有效方法。

因此本发明的一个目的还在于如上所述的组合物，其用于治疗神经障碍如阿尔茨海默病(AD)，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如酒精性神经病或神经性疼痛)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤。

如之前指出的，在本发明的组合疗法中，所述化合物或药物可以一起或单独地配制，并且一起、单独或依次地施用。

本发明的另一个目的在于如上所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗神经障碍如阿尔茨海默病(AD)，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤。

本发明还提供一种用于治疗神经障碍如阿尔茨海默病(AD)，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的如上所述的组合物。

本发明的另一个目的是一种治疗神经障碍如阿尔茨海默病(AD)，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤的方法，所述方法包括同时、单独或依次地向需要其的受试者施用有效量的如上所述的组合物。

在一个优选实施方式中，本发明涉及一种治疗需要其的受试者的神经障碍如阿尔茨海默病(AD)，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤的方法，包括向所述受试者同时、单独或依次地施用有效量的巴氯芬和阿坎酸。

本发明的组合物通常包含一种或多种药用载体或赋形剂。而且，对于本发明中的用途，所述药物或化合物通常与药用赋形剂或载体混合。

在这方面，本发明的另一个目的是一种制备药物组合物的方法，所述方法包括在适当赋形剂或载体中混合上述化合物。

在一个特别实施方式中，所述方法包括在适当赋形剂或载体中混合巴氯芬和阿坎酸。

根据本发明的优选实施方式，如上指出的，所述化合物以其本身或以其药用盐，前药，衍生物，或缓释制剂的形式使用。

尽管在体内外非常有效，但取决于受试者或具体病症，本发明的组合疗法可以进一步结合或联合或组合另外的对所治疗的受试者的神经性病症有益的药物或治疗使用。

联合根据本发明的药物或药物组合使用的其他疗法可以包括一种或多种减轻阿尔茨海默病，AD相关障碍，MS，PD，ALS，HD，神经病(例如神经性疼痛或酒精性神经病)，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤的症状的药物，或可以用于这些障碍的姑息治疗的药物。例如，结果还显示，上述组合疗法当与多奈哌齐组合时具有重要协同神经保护作用(图16)。由此，可以与本发明的组合一起使用的示例性疗法是多奈哌齐(CAS：120014-06-4)，加巴喷丁(CAS：478296-72-9；60142-96-3)，利斯的明(123441-03-2)或美金刚(CAS：19982-08-2)。

在这方面，在一个特别实施方式中，根据本发明的药物或组合物可以进一步与银杏叶(Ginkgo Biloba)提取物组合。合适的提取物包括但不限于银杏叶提取物，改进的银杏叶提取物(例如富集活性成分或减少污染物)或含有银杏叶提取物的任何药物。

根据本发明的疗法可以在家里、医生办公室、医院门诊部或医院提供，使得医生可以密切地观察治疗效果并进行需要的任何调整。

所述疗法的持续时间取决于所治疗疾病的阶段、环状年龄和状况，以及患者对该实例的反应。所述组合各种组分的施用剂量、频率和模式可以独立地控制。例如，一种药物可以口服地施用而第二药物可以肌肉内施用。组合疗法可以在包括休息期的开闭循环中提供以使患者身体具有从任何迄今还没有预见的副作用恢复的机会。所述药物还可以一起配制以使一次施用递送所有药物。

所述组合的每一种药物的施用可以通过导致所述药物的浓度的任何合适方式，该药物浓度于其他组分组合能够减轻患者病症或有效地治疗所述疾病或障碍。

尽管对于药物来说，有可能的是所述组合作为纯化学品施用，优选作为药物组合物提供它们，在本上下文中也称为药物制剂。可能的组合物包括适用于口服、直肠、局部(包括经皮、含服和舌下)，或肠胃外(包括皮下，肌肉内，静脉内和皮内)施用的那些。

更常见地，这些药物制剂以含有多个剂量单位的“患者包装”对患者开处方，或以单个包装(通常是泡罩包装)在不同治疗期期间使用的计量单位施用的其他方式。患者包装相对于传统处方具有优势，其中药剂师从整体供应的药物分开患者的供应，因为患者总是具有到容纳在患者包装中的包装说明书的进口，通常在传统处方中没有。已证实包括包装说明书改善患者与医师说明的相容性。因此，本发明进一步包括与适用于所述制剂的包装材料组合的药物制剂，如本文之前描述的。在这样的患者包装中，用于组合治疗的制剂的意图用途可以通过说明书、设施、供应、改变和/或有助于使用最适用于治疗的其他方式。这样的措施使得患者包装特别适用于和适应于用于与本发明的组合一起的治疗。

药物可以以任何适当量包含在任何合适载体物质中。药物可以以组合物总重量的高达99重量％的提供。所述组合物可以以适于口服、肠胃外(例如静脉内，肌肉内)、直肠、皮下、鼻、阴道、吸入剂、皮肤(贴剂)或眼部使用途径的剂型提供。因此，所述组合物可以为例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、粒剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂包括水凝胶、糊剂、软膏剂、霜剂、硬膏剂、浸透、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂或气溶胶的形式。

药物组合物可以根据常规制药实践进行配制(参见，例如，Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed.A.R.Gennaro，LippincottWilliams&Wilkins，2000and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan，1988-1999，Marcel Dekker，New York)。

根据本发明的药物组合物可以配制成在施用后立即或在施用后任何预定时间或时间期大量释放活性药物。

受控释放制剂包括(i)在延长的时间期内在身体内生成实质上恒定浓度的药物的制剂；(ii)在延长时间期内在身体内在预定延滞时间之后生成实质上恒定浓度的药物的制剂；(iii)通过伴随与活性药物物质的血浆水平的波动相关的不期望副作用的最小化下在身体中维持相对、恒定、有效的药物水平而在预定时间期期间经受药物作用的制剂；(iv)通过例如将受控释放组合物空间放置与患病组织或器官附近或之中而定位药物作用的制剂；以及(v)通过使用载体或化学衍生物使药物作用靶向以将药物递送至特定靶细胞型的制剂。

以受控释放制剂形式的药物施用在以下情况下是特别优选的，其中所述药物具有(i)窄的治疗指数(即，导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度和导致治疗作用的血浆浓度之间的差异较小；一般地，治疗指数TI定义为半数致死剂量(LD50)与半数有效剂量(ED50)的比率)；(ii)胃肠道中的窄吸收窗；或(iii)非常短的生物学半寿命使得每天期间的频繁用药以将血浆水平保持在治疗水平。

可以追随大量策略的任一种可以获得这样的受控释放，其中释放的速率优于所述药物的代谢速率。受控释放可以通过适当选择各种制剂参数和成分获得，包括例如各种类型是受控释放组合物和包衣。因此，药物用适当赋形剂配制成在施用后以受控方式释放药物的药物组合物(单个或多个单位片剂或胶囊组合物，油溶液，混悬剂，乳剂，微胶囊，微球，纳米粒子，斑贴和脂质体)。

用于口服用途的固体剂型

用于口服用途的制剂包括以与无毒药用赋形剂的混合物的本发明的组合物的片剂。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释剂或填料(例如，蔗糖，微晶纤维素，包含土豆淀粉的淀粉，碳酸钙，氯化钠，磷酸钙，硫酸钙，或磷酸钠)；造粒剂和崩解剂(例如，纤维素衍生物包括微晶纤维素，包含土豆淀粉的淀粉，交联羧甲纤维素钠，藻酸钠，或海藻酸)；粘合剂(例如，金合欢，海藻酸，海藻酸钠，明胶，淀粉，预凝胶化淀粉，微晶纤维素，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮，或聚乙二醇)；和润滑剂，助流剂，和抗结合剂(例如，硬脂酸，二氧化硅，或滑石)。其他药用赋形剂可以是着色剂，调味剂，增塑剂，保湿剂，缓冲剂等等。

片剂可以未包衣或者它们可以通过已知的技术进行包衣，可选地延迟胃肠道中的崩解和吸收，并由此提供较长时间内的持续作用。包衣可以适于以预定模式释放活性药物物质(例如，为了获得受控释放制剂)或它可以适于知道通过胃后才释放活性药物物质(肠溶衣)。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如，基于羟丙基甲基纤维素，甲基纤维素，甲基羟基乙基纤维素，羟丙基纤维素，羧甲基纤维素，丙烯酸酯共聚物，聚乙二醇和/或聚乙烯基吡咯烷酮)，或肠溶衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物，纤维素乙酸邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯，聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯，虫胶，和/或乙基纤维素)。可以采用延时材料如，例如，甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。

固体片剂组合物可以包括适于保护组合物免于不希望的化学变化的包衣，(例如，在活性药物物质释放之前的化学降解)。该包衣可以以与制药工艺学百科全书中描述的相同方式涂覆在固体剂型上。

药物可以一起混合在片剂中，或可以分隔开。例如，第一药物包含在片剂内侧上，而第二药物在外侧上，使得大部分的第二药物在第一药物释放之前被释放。

用于口服用途的制剂也可以作为咀嚼片剂，或作为其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，土豆淀粉，微晶纤维素，碳酸钙，磷酸钙或高岭土)混合的硬明胶胶囊或作为其中活性成分与水或油媒介物例如液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊提供。粉剂和粒剂可以在以常规方式在片剂和胶囊下以上提及的成分制备。

用于口服用途的受控释放组合物可以例如构造成通过控制活性药物物质的溶解和/或扩散而释放活性药物。

溶解或扩散受控释放可以通过药物的片剂、胶囊、丸剂或粒剂制剂的适当包衣实现，或通过将药物结合到适当基质中实现。受控释放包衣可以包括上述包衣物质中的一种或多种，和/或例如，虫胶，蜂蜡，三脂蜡(glycowax)，蓖麻蜡，加拿巴蜡(carnauba wax)，硬脂醇，甘油单硬脂酸酯，甘油二硬脂酸酯，甘油棕榈酰硬脂酸酯，乙基纤维素，丙烯酸树脂，dl-聚乳酸，纤维素乙酸丁酸酯，聚氯乙烯，聚醋酸乙烯酯，乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯，聚甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸甲酯，2-羟甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯水凝胶，1，3丁二醇，甲基丙烯酸乙二醇酯，和/或聚乙二醇。在一种受控释放基质制剂中，基质材料也可以包括例如，水合甲基纤维素，加拿巴蜡和硬脂醇，卡波普(carbopol)934，硅酮，甘油三硬脂酸酯，丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯，聚氯乙烯，聚乙烯和/或卤代氟碳。

含有一种或多种所要求保护的组合的药物的受控释放组合物也可以为漂浮片剂或胶囊形式(即，在口服施用后，在胃内容物上方漂浮一定时间的片剂或胶囊)。药物的漂浮片剂制剂可以通过对药物与赋形剂和20-75％w/w的水解胶体如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维的混合物进行造粒而制备。所获得的颗粒然后可以压缩成片剂。在接触胃液后，该片剂在其表面周围形成基本上不透水的凝胶屏障。这种凝胶屏障参与将密度维持小于1，由此允许该片剂可以保持漂浮在胃液中。

用干口服施用的液体

通过添加水而适用于制备水混悬液的粉剂、可分散粉剂或粒剂是方便的用于口服施用的剂型。作为混悬液的制剂提供在具有分散或润湿剂、悬浮剂、以及一种或多种防腐剂的混合物中的活性成分。合适的悬浮剂是例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，海藻酸钠等等。

肠胃外组合物

药物组合物可以还可以通过注射、灌注或植入(静脉内，肌肉内，皮下等)在含有常规、无毒药用载体和佐剂的剂型、制剂中或经由合适递送装置或植入物中肠胃外地施用。这样的组合物的配置和制备对于药物制剂领域的技术人员是熟知的。

用于肠胃外用途的组合物可以以单位剂型提供(例如，在单剂量安剖中)，或在含有多个剂量的小瓶中并且其中可以添加适当防腐剂(参见以下)。所述组合物可以为溶液、悬浮液、乳液、灌注装置或用于植入的递送装置的形式，或它可以作为要用水或其他合适媒介物在使用前重建的干燥粉末提供。除了活性药物，所述组合物可以包括适当胃肠外可接受的载体和/或赋形剂。活性药物可以结合到微球、微胶囊、纳米粒子、脂质体等中用于受控释放。所述组合物可以包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH-调节剂和/或分散剂。

根据本发明的药物组合物可以我适于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，适当活性药物溶解或悬浮在胃肠外可接受的液体媒介物。在可接受的媒介物和溶剂中，可以采用水，通过加入适量的盐酸、氢氧化钠或适当缓冲剂调节至适当pH的水、1，3-丁二醇、林格溶液和等张氯化钠溶液。含水制剂还可以含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中药物中的一种仅难溶或微溶于水的情况下，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可以包括10-60％w/w的丙二醇等。

受控释放胃肠外组合物可以为含水悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液或乳液的形式。可替换地，活性药物可以结合到生物相容性载体、脂质体、纳米粒子、植入物或灌注装置。用于制备微球和/或微胶囊的材料是例如生物可降解/生物可侵蚀聚合物如聚催乳激素、聚-(氰基丙酸异丁酯)，聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺(glutamnine))。当配制受控释放胃肠外制剂时可以使用的生物相容性载体是碳水化合物(例如，糊精)，蛋白质(例如，白蛋白)，脂蛋白，或抗体。用于植入物中的材料可以是非生物可降解的(例如，聚二甲基硅氧烷)或生物可降解的(例如，聚(己内酯)，聚(乙醇酸)或聚(原酸酯))。

可替换途径

尽管较不优选且较不方便，但是可以考虑其他使用途径，并因此其他制剂。在这方面，对于直肠施加，用于组合物的合适剂型包括栓剂(乳剂或混悬剂类型)以及直肠明胶胶囊(溶液或混悬剂)。在典型栓剂制剂中，活性药物与适当药用栓剂基质如可可脂、酯化脂肪酸、甘油化明胶和各种水溶性或可分散性基质如聚乙二醇组合。可以结合各种添加剂、增强剂或表面活性剂。

药物组合物还可以局部地施用到皮肤上以在含有常规无毒的药用载体和赋形剂的剂型或制剂的经皮吸收，包括微球和脂质体。所述制剂包括霜剂，软膏剂，洗剂，搽剂，凝胶，水凝胶，溶液，混悬剂，贴剂(sticks)，喷雾剂，糊剂，硬膏剂，及其他种类的透皮药物递送系统。药用载体或赋形剂可以包括乳化剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、保湿剂，穿透促进剂、凝胶形成剂、软膏基质、芳香剂，和皮肤防护剂。

防腐剂、保湿剂、穿透增强剂可以是对羟基苯甲酸类(parabens)，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，和苄烷铵、甘油、丙二醇、脲等。

用于局部施用于皮肤上的上述药物组合物也可以连同施用到要治疗的身体部分上或附近进行试验。所述组合物可以适于直接施用或借助于特殊药物递送装置如敷料或可替换地硬膏剂、垫子、海绵或其他形式的适当柔性材料施加。

治疗的剂量和持续时间

应当理解，所述组合的药物可以相伴地，在相同或不同药物制剂中，或依次地施用。如果有顺序施用，施用第二(或另外的)活性成分的延时不应失去活性成分的组合的有效作用的益处。对于根据本说明书的组合的最低要求是所述组合应用于组合物使用，具有活性成分的组合的有效作用的益处。组合的所需用途可以通过设施、供应品、适应和/或其他装置推断以有助于使用根据本发明的组合。

本发明的组合中的药物的治疗有效量包括，例如，有效减少阿尔茨海默病症状，拦截或减慢疾病(一旦它已是临床显现)的进展、或防止或减少形成该疾病的风险的量。

尽管本发明的活性药物可以以分开的剂量施用，例如每天两次或三次，但是组合中的各个药物的单个日剂量是优选的，其中单个药物组合物(单位剂型)中的所有药物的单个日剂量是最优选的。

施用可以每天一次或几次持续几天至几年，并且可以甚至持续患者一生。慢性或至少周期性重复的长期施用在大多数情况下指明。

术语“单位剂型”是指物理分离的单位(如胶囊，片剂，或加载注射器圆柱体)，适合作为单一剂量用于人受试者，每个单位含有预定量的活性材料或联合所需药物载体经计算产生期望治疗效果的材料。

优选单位剂量组合物中的每个药物的量取决于多种因素，包括施用方法、患者体重和年龄，疾病阶段、潜在副作用的风险，考虑要治疗的人员的总体健康状况。另外，关于特定环状的药物基因组学(基因型对药动学、药代学的作用，或治疗的效力分布)信息可以影响所使用的剂量。

除了当响应于特别损伤性情况时，其中可能需要更高的剂量，所述组合中的每种药物的优选剂量通常将处于不高于通过对于长期维持治疗规定的或证明在第3期临床研究中是安全的剂量的剂量范围内。

本发明的一个显著优势在于，每种化合物可以在组合疗法中以低剂量使用，同时在组合中对患者产生实质性临床益处。所述组合疗法可以事实上在其中化合物具有单个地低或没有效果的剂量下是有效的。因此，本发明的特定优势在于利用每种化合物的最适度以下剂量的能力，即，低于通常规定的治疗剂量，优选为1/2的治疗剂量，更优选1/3，1/4，1/5，或甚至更优选1/10的治疗剂量的剂量。在特定实施例中，使用低至1/20，1/30，1/50，1/100，或甚至更低的治疗剂量的剂量。

在这样的亚治疗剂量下，所述化合物将表现出没有副作用，同时根据本发明的组合在治疗阿尔茨海默病中完全有效。

一个优选剂量对应于1％直至50％的通常规定用于长期维持治疗的剂量的量。

最优选的剂量可以对应于1％直至10％的通常规定用于长期维持治疗的剂量的量。

用于本发明的药物的剂量的具体实例提供如下：

-阿坎酸为1至1000mg/天，优选小于400mg/天，更优选小于200mg/天，甚至更优选小于50mg/天，这样的剂量特别适用于口服施用。

-巴氯芬为0.01至150mg/天，优选小于100mg/天，更优选小于50mg/天，甚至更优选小于25mg/天，这样的剂量特别适用于口服施用。

-氨基己酸，口服，为0.1g至2.4g/天，

-溴隐亭，口服，为0.01至10mg/天，

-乙胺嗪，口服，为0.6至600mg/天，

-卡麦角林，口服，为1至10μg/天，

-西那卡塞特，口服，为0.3至36mg/天，

-桂利嗪，口服，为0.6至23mg/天，

-二羟丙茶碱，口服，为9至320mg/天，

-依普利酮，口服，为0.25至10mg/天，

-艾芬地尔，口服，为0.4至6mg/天，

-来氟米特，口服，为0.1至10mg/天，

-左西孟旦，口服，为0.04至0.8mg/天，

-美西律，口服，为6至120mg/天，

-莫西沙星，口服，为4至40mg/天，

-苯乙双胍，口服，为0.25至15mg/天，

-奎纳克林，口服，为1至30mg/天，

-磺胺异恶唑，口服，为20至800mg/天，

-舒洛地昔，口服，为0.05至40mg/天，

-特比萘芬，口服，为2.5至25mg/天，

-托拉塞米，口服，为0.05至4mg/天，

-曲美他嗪，口服，为0.4至6mg/天，

-唑尼沙胺，口服，为0.5至50mg/天.

当所述组合物作为活性成分仅包含巴氯芬和阿坎酸时，这两种化合物可以以不同比率施用，例如，以重量比阿坎酸/巴氯芬为0.05至1000(W∶W)，优选为0.05至100(W∶W)，更优选为0.05至50(W∶W)。

应当理解，实际施用的药物的量由医师依照相关情形确定，包括要治疗的病症或多种病症，要施用的确切组合物、个体患者的年龄、体重和反应，患者症状的严重度，以及所选的使用途径。因此，以上剂量范围用于提供一般指导和对于本文教导的支持，但不用了限制本发明的范围。

给出以下实施例用于举例说明的目的而不是限制的目的。

实施例

动物的照料和管理以及实验依照I.A.S.P.(1983)的研究和伦理问题委员会(Committee for Research and Ethical Issue of the I.A.S.P.(1983))的指南进行。

A)与Aβ毒性相关的疾病的治疗

在此一系列实验中，已测试了候选组合它们防止或减少人Aβ_1-42的毒性作用。Aβ_1-42是构成在来自受AD侵袭的人患者的活组织检查中发现的聚集体的全长肽。该作用决定于各种细胞型，以进一步记载所述组合在体外模型中的活性，其例示了AD的不同生理学特征。还在小鼠模型中进行体内研究以通过评价所述组合对以下的作用来确认此保护作用：i)动物的认知性能和ii)AD的分子标识(细胞凋亡诱导，氧化性应激诱导，炎症路径诱导)。

I.巴氯芬阿坎酸组合治疗在体外防止人Aβ_1-42的毒性

I.1Aβ_1-42肽对人HBME细胞的毒性的作用

人脑微血管内皮细胞培养物用来研究由候选化合物对Aβ_1-42毒性提供的保护。

人脑微血管内皮大脑细胞(HBMEC，ScienCell细胞编号：1000，在第10传代冷冻)在+37℃的水浴中快速解冻。将上清立即放入9ml含有10％的胎牛血清(FCS；GIBCO ref10270-106)的达尔伯克(Dulbecco)改良伊格尔(Eagle)培养基(DMEM；Pan Biotech编号：P04-03600)。细胞悬浮液在+4℃以180x g离心10min并且沉淀物悬浮在CSC无血清培养基(CSC无血清，细胞系统，Ref：SF-4Z0-500-R，批次51407-4)，其具有1.6％的无血清RocketFuel(细胞系统，Ref：SF-4Z0-500-R，批次54102)，2％的青霉素10.000U/ml和链霉素10mg/ml(PS；Pan Biotech ref：P06-07100批次133080808)，并以密度20 000细胞/孔接种在96孔板(基质胶层生物涂层血管发生系统，BD，Ref 354150，批次A8662)，最终体积为100μl。在基质胶支持上，内皮大脑细胞自发地开始毛细血管网形态发生的过程(33)。

每种条件下实施三种独立培养基，每种条件6个孔。

试验化合物和人淀粉样蛋白-β_1-42处理

简言之，Aβ_1-42肽(Bachem，编号：H1368批次1010533)以20μM(母液)在定义培养基中重建并在黑暗中在+37℃缓慢振荡3天。对照培养基在相同条件下制备。

在3天后，人淀粉样蛋白肽在HBMEC上以在对照培养基中稀释的2.5μM使用(最佳温育时间)。在基质胶上HBMEC接种后2小时加入Aβ_1-42肽进行18小时温育。

在基质胶上HBMEC接种后1小时，试验化合物和VEGF-165溶解在培养基(+0.1％DMSO)中，然后在Aβ_1-42施加前用HBMEC预温育1小时(最终体积/培养孔为100μl)。试验化合物或VEGF温育后1小时(在基质胶上细胞接种后两小时)，在试验化合物或VEGF存在下，将100μl的Aβ_1-42肽加入至在对照培养基中稀释的最终浓度为2.5μM(以200μl总体积/孔)，以避免进一步的药物稀释。

培养板的组织

已知是VEGF-A的促血管形成亚型的VEGF-165用于此研究中的所有实验作为参考化合物。VEGF-165是牵涉血管形成的最丰富VEGF亚型之一。VEGF以10nM用作参考试验化合物(图1)。

评估以下条件：

●阴性对照：单独的培养基+0.1％DMSO

●中毒：淀粉样蛋白-β_1-42(2.5μM)for 18h

●阳性对照：VEGF-165(10nM)(1种参考化合物/培养)在Aβ_1-42(2.5μM)添加前1h，持续18h温育时间。

●试验化合物：试验化合物，在Aβ_1-42(2.5μM)添加前1h，持续18h温育时间。

毛细血管网定量

每孔，在透光下使用InCell AnalyzerTM 1000(GE Healthcare)用4x镜头摄取2张图片。所有照片在相同条件下摄取。血管发生网络的分析使用Developer软件(GEHealthcare)进行。评估毛细血管网的总长度。

数据处理

数据表示为对照条件(无中毒，无淀粉样蛋白＝100％)的百分比以表达淀粉样蛋白损害。所有值表示为3次培养(n＝6孔/条件)的平均值+/-SEM(s.e.mean)。统计学分析在不同条件下进行(当允许时，单侧(ONE-WAY)ANOVA，接着Dunnett检验，Statview软件版本5.0)。

结果

巴氯芬-阿坎酸组合对于HBMEC模型中的人Aβ_1-42肽的毒性给出显著保护作用(观察到减少24％的Aβ_1-42肽损害)，如图2所示。该结果明确表明，通过人淀粉样蛋白肽(Aβ_{1- 42}2.5μM)的中毒被所述药物组合显著防止，而在那些浓度下，单独的药物在上述实验条件中对中毒不具有显著效。

相反，巴氯芬和特比萘芬的组合(这里提供其仅用于比较的目的)对于Aβ_1-42提供较弱的保护(观察到减少15％的Aβ_1-42肽损害)(图3)。

因此，尽管这两种组合允许针对Aβ_1-42进行保护，但是组合巴氯芬-阿坎酸明显突出。事实上，在单独不具有作用的浓度下的这些药物允许当以组合使用时对于Aβ_1-42显著保护。此外，巴氯芬-阿坎酸组合比巴氯芬-特比萘芬组合更有效。这样的巴氯芬和阿坎酸的效果相比于例如巴氯芬-特比萘芬的组合的效果代表60％的显著提高。

此外，用于巴氯芬-阿坎酸组合的巴氯芬浓度显著低于巴氯芬-特比萘芬组合中使用的巴氯芬浓度(25-倍降低)。

I.2人Aβ_1-42肽对原代原代皮质神经元细胞的毒性的作用

原代皮质神经元的培养

大鼠皮质神经元如由Singer等所述进行培养(47)。简言之，15天孕期的怀孕雌大鼠通过颈椎脱位处死(大鼠Wistar)并且从子宫取出胎儿。取出皮层并置于含有2％的青霉素10.000U/ml和链霉素10mg/ml以及1％的牛血清白蛋白(BSA)的Leibovitz(L15)的冰冷介质中。皮层在37℃(0.05％)通过胰蛋白酶离解20min。反应通过加入含有DNA酶1II级和10％的胎牛血清(FCS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)终止。然后细胞通过3次连续通过10ml吸液管机械地离解并在+4℃以515x g离心10min。抛弃上清并将细胞沉淀物再悬浮在确定培养基中，该确定培养基由补充有B27(2％)的Neurobasal、L-谷氨酰胺(0.2mM)、2％的PS溶液和10ng/ml的BDNF组成。存活细胞使用台盼蓝不相容试验在Neubauer血细胞计数器中计数。细胞以密度为30 000细胞/孔接种在96孔板中(孔用聚-L-赖氨酸(10μg/ml)预涂覆)并在+37℃在加湿空气(95％)/CO2(5％)气氛中进行培养。

每种条件进行三次独立培养，6个孔/条件。

试验化合物和人淀粉样蛋白-β1-42治疗

简言之，Aβ_1-42肽以40μM(母液)在确定培养基中重建并在黑暗中在+37℃缓慢振荡3天。对照培养基在相同条件下制备。

在3天后，该溶液在原代皮质神经元上使用如下：

在10天神经元培养后，将试验化合物溶解在培养基(+0.1％DMSO)中然后在Aβ_1-42施加(以最终体积/培养孔为100μl)之前用神经元预温育。在试验化合物温育后1小时，将100μl的Aβ_1-42肽加入至在药物存在下稀释的最终浓度为10μM，以避免进一步的试验化合物稀释。皮质神经元被中毒24小时。每种条件进行三次单独的培养，6个孔/条件。

BDNF(50ng/ml)和雌二醇-β(150nM)分别用作阳性对照和参考化合物。每种条件进行三次单独的培养，12个孔/条件。

培养板的组织150nM的雌二醇-β用作阳性对照(图4)。

雌二醇-β溶解在培养基中并在淀粉样蛋白-β_1-42施加前预温育1h。

评估以下条件：

-对照板：12个孔/条件

●阴性对照：单独的培养基+0.1％DMSO

●中毒：淀粉样蛋白-β_1-42(10μM)持续24h

●参考化合物：雌二醇(150nM)1h。

-药物板：6个孔/条件

●阴性对照：单独的培养基+0.1％DMSO

●中毒：淀粉样蛋白-β_1-42(10μM)持续24h

●试验化合物(s)：试验化合物-1h，接着淀粉样蛋白-β_1-42(10μM)持续24h

乳酸脱氢酶(LDH)活性测定

在中毒后24小时，去掉上清液并用细胞毒性检测试剂盒(LDH，Roche AppliedScience，编号：11644793001，批次：11800300)进行分析。用于细胞毒性定量的这种比色测定基于从死亡细胞的细胞溶质释放到上清中的乳酸脱氢酶(LDH)活性的测量。

数据处理

数据表示为对照条件(无中毒，无淀粉样蛋白＝100％)的百分比以表示淀粉样蛋白损害。所有值表示为3次培养的平均值+/-SEM(s.e.mean)(n＝6个孔/条件)。统计分析在不同条件下进行(当允许时，单侧ANOVA，接着Dunnett检验，Statview软件版本5.0)。

结果

巴氯芬和阿坎酸的组合在原代皮质神经元细胞中针对人Aβ_1-42肽的毒性诱导显著保护作用(提高34％的细胞存活)，如图5所示。结果明显表明，由人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 10μM)的中毒由所述组合显著防止，而在这些浓度下，巴氯芬或阿坎酸单独都对中毒没有显著效果。

相反，尽管在这种模型中的活性，但是磺胺异恶唑和西那卡塞特的组合针对Aβ_1-42提供更弱的保护(19％，图6)。

因此，尽管这两种组合允许针对Aβ_1-42的保护，但是所述组合巴氯芬-阿坎酸明显突出。事实上，在单独不具有作用的浓度下，但以组合使用时，所述药物针对Aβ_1-42引起原代皮质神经元细胞的显著保护作用。此外，巴氯芬-阿坎酸组合比磺胺异恶唑-西那卡塞特组合显著更有效。相比于例如磺胺异恶唑和西那卡塞特的组合的效果，这样的巴氯芬和阿坎酸的效果代表60％的显著改善。

这些结果一起表明，巴氯芬-阿坎酸组合在阿尔茨海默病的多种体外模型中的出乎意料且显著的积极效果。观察到的该效果高度优于由其他基于巴氯芬的组合疗法(例如，巴氯芬-特比萘芬)，或其他活性组合疗法(磺胺异恶唑-西那卡塞特)触发的效果。

已经进行了对皮质细胞的阿坎酸和高牛磺酸保护活性的比较(图17)。这些结果表明，阿坎酸的衍生物，称为高牛磺酸，允许针对Aβ_1-42的有效保护。在本发明上下文中，因此巴氯芬或阿坎酸可以由它们的衍生物代替，条件是这些衍生物在本文所述的测定中是有效的。

I.3.在神经突生长和突触功能模型中针对Aβ_1-42的毒性的保护

大鼠皮质神经元如Singer等所述进行培养(35)。简言之，15天孕期的怀孕雌大鼠通过颈椎脱位处死(大鼠Wistar)并且从子宫取出胎儿。取出皮层并置于含有2％的青霉素10.000U/ml和链霉素10mg/ml以及1％的牛血清白蛋白(BSA)的Leibovitz(L15)的冰冷介质中。皮层在37℃(0.05％)通过胰蛋白酶离解20min。反应通过加入含有DNA酶1II级和10％的胎牛血清(FCS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)终止。然后细胞通过3次连续通过10ml吸液管机械地离解并在+4℃以515x g离心10min。抛弃上清并将细胞沉淀物再悬浮在确定培养基中，该确定培养基由补充有B27(2％)的Neurobasal、L-谷氨酰胺(0.2mM)、2％的PS溶液和10ng/ml的BDNF组成。存活细胞使用台盼蓝不相容试验在Neubauer血细胞计数器中计数。细胞以密度为30 000细胞/孔接种在96孔板中(孔用聚-L-赖氨酸(10μg/ml)预涂覆)并在+37℃在加湿空气(95％)/CO2(5％)气氛中进行培养。

在10天培养后，细胞用药物温育。在温育后1小时，细胞通过在没有BDNF但与药物一起的确定培养基中的2.5μM的β-淀粉样蛋白(1-42；Bachem)中毒。皮质神经元中毒持续24小时。BDNF(10ng/ml)用作阳性(神经保护性)对照。每个条件进行三次独立培养，6个孔/条件。

神经突长度和突触定量

在中毒24小时后，去掉上清并将皮质神经元通过乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定5min。在用0.1％的皂苷渗透后，细胞用含有1％胎牛血清的PBS封闭2h。然后，细胞用单克隆抗体抗微管结合蛋白2(MAP-2；Sigma)或用抗突触囊泡蛋白(SYN，S5798，Sigma)连同抗PSD95(P246，Sigma)抗体温育以定量突触。这些抗体特异地染色细胞体和神经元的神经元神经突(MAP2)或突触前后元件(分别是SYN和PSD95)。

这些抗体用Alexa Fluor 488羊抗-小鼠IgG(Molecular probe)。神经元的核通过荧光标记物(Hoechst solution，SIGMA)标记。

每个孔，使用InCell AnalyzerTM 1000(GE Healthcare)以20x放大率摄取10张图片。所有照片在相同条件下摄取。神经突网络的分析使用Developer软件(GE Healthcare)进行以评估神经突网络的总长度。

结果

巴氯芬和阿坎酸的组合在原代皮质神经元细胞中针对人Aβ_1-42肽的毒性诱导显著保护作用(提高80％的神经突网络)，如图7所示。结果清楚地表明，通过人淀粉样蛋白肽(Aβ_1-42 2.5μM)的中毒由所述组合显著防止，而在这些浓度下，巴氯芬或阿坎酸单独对中毒都不具有显著效果。

此外，用这种组合治疗的神经突网络的总长度不再显著不同于对照细胞。因此，这种组合允许针对人Aβ_1-42肽的毒性允许有效保护皮质神经元细胞而且相当于健全皮质神经元细胞的神经突生长。

II.巴氯芬-阿坎酸组合疗法在体内防止人Aβ_25-35的毒性

动物

在整个研究中使用雄性瑞士小鼠。动物圈养在塑料笼中，自由获取实验食品和水，除了行为实验期间，并且保持在调节的环境中，以12h亮/黑循环(在早上8：00亮)。在在隔声和空调实验室进行实验，在每个实验前小鼠进行驯化至少30min。

组合治疗

药物通过填喂法(经口)每日施用。β25-35肽和乱序β25-35肽(对照)已溶解在无菌双蒸馏水水中，并处处在-20℃直至使用。然后β-淀粉样蛋白肽脑室内地(i.cv.)施用。简言之，每只小鼠用醚轻微麻醉，并且计量不锈钢针头单侧地插入至与每只眼相等的中线点的右边，以眼和耳之间的等同距离并垂直于头骨平面。肽或媒介物在大约3s内逐渐递送。小鼠在注射后1min内表现出正常行为。施用部位通过在初步实验中注射墨汁检查。针头插入和媒介物注射都不对存活、行为反应或认知功能具有显著影响。

药物治疗

在第-1天，即Aβ_25-35肽注射前24h，通过填喂法每天两次(在8：00am和6：00pm)施用药物组合或媒介物溶液。

在第0天(在10：00am)，小鼠以最终体积为3μl(3mM)i.cv.注射Aβ25-35肽或乱序Aβ25-35肽(对照)。

在第0天和第7天之间，通过填喂法每天一次或两次(在8：00am和6：00pm)经口施用药物、药物组合或媒介物溶液。一个动物组通过填喂法以单次注射(在8：00am)经口接受多奈哌齐(参考化合物-1mg/kg/天)。药物在水中溶解并且在每次填喂法施用前才新鲜制备。

在第7天，所有动物在Y-迷津测验中测试自发交替性能，空间工作记忆指数。

在第7天和第8天，动物的环境有关的长期记忆利用逐渐降低型被动回避程序进行评估。

在第8天，牺牲动物。切除它们的脑并保持在-80℃用于进一步分析。

中毒动物的化合物增强行为和认知表现

自发交替性能-Y迷津测验

在第7天，所有动物在Y-迷津中测试自发交替性能，空间工作记忆的指数。Y-迷津由灰色聚氯乙烯制成。每个臂为40cm长，13cm高，底部3cm宽，顶部10cm宽，并以等角收拢。每只小鼠放置在一个臂的端部并允许在8min时间期间自由移动通过迷津。系列臂进口，包括可能返回到相同的臂，都目视检查。交替定义为在连续机会进入所有三个臂。最大交替的数量因此是臂进口的总数减去二并且交替的百分比计算为(试剂交替/最大交替)x 100。参数包括交替百分比(记忆指数)和臂进口的总数(探索指数)。表现出极端行为(交替百分数＜25％或＞85％或入臂数＜10)的动物被淘汰。通常，这占0-5％的动物。这种试验偶尔用来在行为水平分析由Aβ25-35注射在小鼠中诱导的影响和失忆效果。

被动回避试验

设备是两隔室(15x 20x 15cm高)盒子，其中一个用白色聚氯乙烯壁照明而另一个用黑色聚氯乙烯壁和格子地板变黑。断头门分隔开每个室。位于设备上方40cm的60W灯在实验期间照亮白色隔室。乱序足部电极(0.3mA持续3s)可以使用电击基因大鼠或扰频器(Lafayette Instruments，Lafayette，USA)递送至格子地板。断头门在训练时间期间最开始封闭。每只小鼠放入白色隔室。在5s后，门升高。当小鼠进入变黑的隔室并将所有它的爪放到格子地板上时，门关闭并递送足部电击持续3s。记录步入潜伏期，即进入变黑的隔室中花费的潜伏期，和发声的数量。保留试验在训练后24h进行。每只小鼠再次放入白色隔室。在5s后，门升高，记录步入潜伏期和逃离潜伏期，即返回到白色隔室花费的时间，直至300s。

在行为性能方面观察到积极结果并且在β25-35肽icv注射后7天进行生物化学测定。

巴氯芬和阿坎酸的组合对中毒动物的行为和认知性能诱导显著保护作用，如图8、9和10所示。

在图8，在仅53.8％的交替下，中毒小鼠相比于对照表现出强烈受损空间工作记忆。在相比于对照超过它们的交替百分比的48％提高下，在用巴氯芬和阿坎酸治疗的小鼠上受损被显著防止。

类似地，图9和10显示，中毒动物分别根据它们的逃离潜伏期和不如潜伏期的评分表现出受损的行为和认知性能。在两种试验中，巴氯芬和阿坎酸的组合允许显著矫正受损。用此组合治疗的小鼠的逃离潜伏期不再显著不同于对照小鼠(图9)并且步入潜伏期(图10)通过本发明的组合显著增大，相比于单独的要求具有增强的组合的效果。

记忆缺陷是阿尔茨海默病的早期特征并且这些结果清楚显示淀粉样蛋白肽对行为和认知性能(包括记忆)的毒性作用被本发明的组合线束防止。

此外，图16显示，极低剂量的巴氯芬(480μg/kg/天)、阿坎酸(32μg/kg/天)和多奈哌齐(0，25mg/kg/天)可以进行组合而允许完全保护小鼠的行为和认知性能，如通过Y-迷津测验测量的。而多奈哌齐，在此浓度下，对空间工作记忆不具有显著效果(32％保护)，其与巴氯芬和阿坎酸组合联合使用允许中毒小鼠认知性能的完全保护(98％)。本发明的组合因此可以进一步与其他疗法组合以加强它们的作用。

组合改善神经疾病的神经生理问题

组合疗法在Aβ中毒的体内模型中进行测试。评估它们对在神经疾病中受影响的多个参数的影响：

-Caspase(半胱天冬酶)3和9表达水平，被认为是细胞凋亡的指示，

-脂质过氧化作用，被认为是用于氧化应激水平的标记，

-GFAP表达测定，被认为是脑发炎水平的标记，

-血脑屏障完整性，

-总体突触完整性(突触囊泡蛋白ELISA)。

-CA1中的存活神经元的定量

血脑屏障完整性

关于通过Aβ的动物中毒的实验设计与第III部分相同。

对血脑屏障(BBB)完整性的组合疗法的潜在保护作用在注射后7天，在脑室内(i.c.v.)注射寡聚淀粉样蛋白-β25-35肽(Aβ25-35)或乱序Aβ25-35对照肽(Sc.Aβ)的小鼠中进行分析。

在Aβ_25-35注射后第7天，测试动物以通过使用EB(伊文斯蓝(Evans Blue))法确定BBB完整性。EB染料已知在外周注射后结合至血清白蛋白并且已被用作用于血清白蛋白的示踪剂。

EB染料(2％，在盐水中，4ml/kg)在经心脏灌注之前3h腹膜内(i.p.)注射。小鼠然后用i.p.200μl的预混合氯胺酮80mg/kg、赛拉嗪10mg/kg麻醉，打开胸腔。小鼠经心脏灌注250ml的盐水持续大约15min直至来自右心房的流体变为无色。在断头后，取出脑并切割成三个区域：大脑皮层(左+右)，海马(左+右)，间脑。容纳后，每个脑区域称重用于定量测量EB-间脑溢出物。

样品在磷酸缓冲盐水溶液中均化并通过在加入60％三氯乙酸后涡旋进行混合以衬底所述蛋白。样品在4℃冷却，然后在4℃、以10,000g离心30min。上清使用分光光度计在610nm测量EB的吸光度。

EB定量为以下两种：

■μg/mg的脑组织，通过使用标准曲线，通过已知浓度的EB-问脑获得。

■μg/mg的蛋白。

总体突触完整性(突触囊泡蛋白ELISA)

突触囊泡蛋白已被选择作为突触完整性的标记并使用商业ELISA试剂盒(USCN，编号：E90425Mu)测定。样品制备自海马组织并在对如制造商和参考文献所述特异的提取缓冲液中均质化。

组织在冰冷PBS(0.02mol/l，pH 7.0-7.2)漂洗以彻底除去过量血液并在氮气冷冻和-80℃储存之前称重。将组织切割成小片并用玻璃均化器在1ml冰冷磷酸缓冲盐水(PBS)中均化。所得悬浮液用超声细胞破裂器进行超声处理或经过两个冷冻-解冻循环以进一步破坏细胞膜。然后，均化物以5,000g离心5min并立即对上清液进行测定。

所有样品一式三份地测定。

蛋白的定量用Pierce BCA(双金鸡宁酸)蛋白测定试剂盒(Pierce，Ref.#23227)进行以评价提取性能并允许标准化。

总蛋白浓度然后从标准曲线稀释液计算并用来标准化ELISA结果。

Cal中的存活神经元的定量

在第8天，每只小鼠用200μl i.p.的氯胺酮80mg/kg和赛拉嗪10mg/kg的预混合物麻醉并经心脏灌注100ml的盐水溶液，接着100ml的4％低聚甲醛。移出脑并在4℃在4％低聚甲醛中保持24h后固定。

在后固定之后，脑在磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中洗涤，然后移出小脑并将前脑置于振动磨机平台(Leica VT100OS，Leica，Wetzlar，Germany)用于切片。

使用振动磨机(Leica VT 100OS，Leica，Wetzlar，Germany)在冠状切片(20μm厚度)中切割脑。连续切片置于具有PBS的24-孔板上。然后选择它们以包括海马结构并将9个切片放入明胶涂覆在载玻片中(一侧/动物用于甲酚紫)。所有载玻片在室温干燥48h以避免分开。载玻片储存在室温直至甲酚紫染色。

切片用0.2％甲酚紫试剂(Sigma-Aldrich)染色，然后用分级乙醇脱水，用甲苯处理，并用Monutex媒介物(BDH Labotatory Supplies，Poole，Dorset，UK)安装。

在安装后，载玻片在室温保持24h干燥。CA 1区域的检查使用光学显微镜(Dialux22，Leitz)进行，其中切片通过带有

v1.63软件(NIH)的CCD照相机(Sony XC-77CE，Sony，Paris，France)数字化。Cal测量和锥体细胞计数使用

(NIH)处理。数据表示为每组的CA 1锥体细胞/mm的9个切片的平均值(左右海马CAI计数)(49)。

氧化应激测定

小鼠通过斩首牺牲并快速取出两个海马，称重并保持在液氮直至测定。在解冻后，海马均化于冷甲醇(1/10w/v)中，在5min期间，以1,000g离心并且将上清液放入微量离心管(eppendorf tube)。每个匀浆物的反应体积添加到FeSO₄1mM，H₂SO₄0.25M，二甲酚橙1mM，并在室温温育30min。在580nm读出吸光度(A580 1)后，将10μl的氢过氧化枯烯1mM(CHP)加入到样品中并在室温温育30min，以确定最大氧化水平。吸光度在580nm测量(A580 2)。根据以下将脂质过氧化的水平确定为CHP当量(CHPE)：CHPE＝A580 1/A580 2 x[CHP]并表示为CHP当量/重量的组织和作为对照组数据的百分比。

Caspase(半胱天冬酶)途径诱导测定和GFAP表达测定

小鼠通过斩首牺牲并快速取出两个海马，在冰冷PBS(0.02mol/l，pH 7.0-7.2)中漂洗以彻底除去过多的血液，称重并保持在液氮中直至测定。组织切成小片并用玻璃均化器在1ml冰冷PBS中均质化。所得悬浮液用超声细胞破裂器超声处理并进行两个冷冻-解冻循环以进一步破裂细胞膜。然后，在5min期间将匀浆物以5,000g离心并立即测定上清。

实验用商业分析试验完成：Caspase-3(USCN-E90626Mu)，Caspase-9(USCN-E90627Mu)，GFAP(USCN-E90068。

蛋白的定量用Pierce BCA(双金鸡宁酸)蛋白测定试剂盒(Pierce，编号#23227)以评价提取性能并允许标准化。

巴氯芬和阿坎酸的组合对中毒动物的升级生理功能诱导显著的保护作用，如图11，12，13和14所示。

在相比于未治疗的中毒动物超过60％的保护下，所述组合有效用于保护神经元(图11)和突触密度(图13)。

类似地，图12显示巴氯芬和阿坎酸的组合相比于未治疗的中毒动物保护BBB完整性(76％)。

最后，当相比于未治疗的中毒动物时，这种组合疗法有效减少治疗动物的脑中由Aβ诱导的总氧化应激(图14)。

如实施例的A部分中所示，在许多神经性障碍，包括神经变性障碍如阿尔茨海默病及相关障碍中受损的多种神经功能通过所述组合巴氯芬-阿坎酸保护并且症状延迟或减少。

B)在神经元细胞上的谷氨酸毒性的防止

在这个另一组实验中，测试候选化合物它们防止或减少谷氨酸毒性对神经元细胞的毒性作用的能力。谷氨酸毒性涉及神经疾病或障碍如多发性硬化，阿尔茨海默病，肌萎缩侧索硬化，帕金森病，亨廷顿病，神经病，酒精中毒或戒酒，或脊髓损伤的致病机理。所述药物首先单个地测试，接着测定它们的组合作用。

方法

本发明的药物组合的效力在原代皮质神经元细胞上进行评估。在这些测定中使用的方案与以上第A.I.2节所述相同。

谷氨酸素性测定

化合物的神经保护作用通过神经突网络的定量(神经丝染色(NF))进行评估，其特异地揭示谷氨酸能神经元。

神经元培养12天后，候选组合的药物溶解在培养基(+0.1％DMSO)中。候选组合然后在谷氨酸损害之前用神经元预温育1小时。在温育后一小时，加入谷氨酸达20min，至最终浓度为40μM，在候选组合存在下，以避免进一步药物稀释。在温育结束时，培养基用具有候选组合但没有谷氨酸的培养基改变。培养物在谷氨酸损害后固定24小时。MK801(地卓西平氢马来酸盐，77086-22-7-20μM)用作阳性对照。

在用皂苷(Sigma)与渗透后，细胞用含有10％羊血清的PBS封闭2h，然后细胞用针对神经丝抗体(NF，Sigma)的小鼠单克隆原代抗体温育。这种抗体用Alexa Fluor 488羊抗-小鼠lgG揭示。

细胞的核通过荧光标记物(Hoechst溶液，SIGMA)标记，并将神经突网络定量。六个孔/条件用来评估三个不同培养中的神经元存活。

结果

组合巴氯芬-阿坎酸对于皮质神经元细胞针对谷氨酸毒性提供保护作用。如图15例示的，本发明的组合在上述实验条件下强烈保护神经元免于谷氨酸毒性。值得注意的是，注意到使用单独使用药物具有较低保护作用的药物浓度下的有效保护作用。巴氯芬和阿坎酸的组合相比于单独的阿坎酸诱导超过200％的提高并且相比于单独使用的巴氯芬超过47％。

C)涉及谷氨酸兴奋毒性的其他障碍使用本发明的组合的改善

本发明的药物和药物组合针对谷氨酸毒性的上述体外保护作用组合本文中在若干AD模型中例举的保护作用，促使本发明的发明人在也涉及谷氨酸毒性的致病机理的其他疾病如MS，ALS和神经性疼痛的一些模型中测试这些药物和组合。

I)组合在多发性硬化的体内模型中的保护作用

其中髓磷脂-少突胶质细胞糖蛋白-免疫的(MOG-免疫的)小鼠形成慢性进展的EAE的模型用来证实本发明的组合物在多发性硬化治疗中的有益效果。

动物和化学品

C57L/6J雌性小鼠(8周龄)购自Janvier(France)；在驯化两周后，雌性小鼠(10周龄)在用MOG(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白)肽免疫化之后形成慢性瘫痪。实验性脑脊髓炎用用于EAE诱导(EK-0110，EK-0115；Hooke laboratories)的Hooke试剂盒MOG_35-55/CFAEmulsion PTX(百日咳毒素)进行诱导。对照试剂盒是CK-0115(Hooke laboratories)。

实验程序

实验性脑脊髓炎通过以下程序诱导：

第0天，进行各自0.1ml的两个皮下注射；一个在小鼠的上背而另一个在下背。每个注射含有100μg的MOG_35-55肽(MEVGWYRSPFSRV VHLYRNGK)，200μg的灭活结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra并且在弗氏完全佐剂(CFA)(Hooke laboratories)中乳化。该乳液提供对于扩展和分化MOG-特异性自身免疫T细胞所需的抗原。

500ng在PBS(Hooke kit)中的百日咳毒素(Pertussis toxin)的两次腹膜内注射在MOG注射后2小时(第0天)和24小时(第1天)进行。百日咳毒素通过提供额外的佐剂而增强EAE形成。

小鼠在免疫化后8天形成EAE并且在实验持续时间里停留慢性地瘫痪。在免疫化之后，以双盲程序每日观察小鼠临床症状。动物保持在常规无致病原实施中并且所有实验依照由现有生物伦理学的地方委员会规定进行并由其批准。

实验组和药物 治疗：

所述披露的雌性小鼠的组在免疫之前按重量计分均匀：

-对照组：在EAE小鼠的相同条件下的媒介物注射(从第-1天至第28天，每天给予安慰剂)

-EAE组：MOG注射(第0天)+百日咳毒素注射(第0和1天)-从第-1天至第28天，每天经口给予安慰剂

-EAE+阳性对照：MOG注射(第0天)+百日咳毒素注射(第0和1天)-从第-1天至第28天，每天经口给予地塞米松。

-EAE+治疗组：MOG注射(第0天)+百日咳毒素注射(第0和1天)。

治疗在免疫化之前一天开始并持续直至第28天。

临床评分在第0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28天测量。

统计软件(Statsoft Inc.)在整个过程中用于统计学分析。ANOVA分析和学生t检验(Student’s t test)用来分析临床疾病评分。P＜0.05认为是显著性的。

疾病发病率延迟、临床评分和死亡延迟已利用Kaplan-Meier曲线和Cox模型(R包装“存活”(R package‘survival’))在每组与参考“免疫”(“immu”)组之间进行比较。所得的p-值是单侧的并且测试该假设好于参考“immu”组。

总临床评分由以下描述的尾巴评分、后肢评分、前肢评分和膀胱评分构成：

尾巴评分：

评分＝0	正常小鼠在活动时保持其尾巴直立。
		评分＝1	如果尾巴的末端软弱，具有下落的趋势。
评分＝2	如果尾巴完全软弱并且拖在桌子上。

后肢评分：

前肢评分：

膀胱评分：

评分＝0	正常小鼠具有对其膀胱的完全控制。
		评分＝1	当其下体被尿液浸泡时认为小鼠失禁。

对每只动物的全部评分通过加合所有上述类目确定。对于活着的动物的最大评分为10。

结果-组合疗法在MS模型中是有效的

全部临床评分的显著改善在“EAE+治疗组”小鼠中对于巴氯芬和阿坎酸组合观察到。

巴氯芬(30mg/kg/天)和阿坎酸(2mg/kg/天)的组合针对慢性进展的EAE的形成诱导显著的保护作用并因此证实所述组合物在多发性硬化治疗中的有益效果(图18)。在所述症状超高跟30％减少下，所述结果清楚显示，所述组合从第13天诱导疾病形成的显著减少。这个结果确认巴氯芬-阿坎酸组合对神经元保护，包括脱髓鞘及其并发症的显著阳性作用。

总起来，这些结果表明，针对在神经疾病形成中涉及的许多应激如β淀粉样蛋白，BBB破裂，谷氨酸兴奋毒性或脱髓鞘，这种组合能够提供神经元的有效保护。

II.组合在ALS模型中的保护作用

根据本发明的组合疗法对ALS的效果已在体外，在共培养模型中，并且在体内，在ALS小鼠模型中证实。方案和结果在这部分中提供。

II.1针对在神经-肌肉共培养物的原代培养物中的谷氨酸毒性的保护作用

神经-和肌肉细胞的原代共培养物

人体肌肉从健康患者的生物活检的部分根据之前描述的方法制备(48)。肌肉细胞从离解细胞(10000细胞/孔(井))构建，在48孔板上铺板于明胶-涂覆的0.1％并生长于由MEM培养基和M199培养基的混合物构成的增生培养基。

在卫星细胞融合后马上，将13-天龄大鼠胚胎脊髓(附着有背根神经节(DRG))的整个横切片放到肌肉单层，1个外植体/孔(在中心区域)。DRG对于获得良好的神经支配比是必需的。神经支配的培养物保持在混合培养基中。在24h后，在通常共培养物中，观察到神经炎从脊髓外植体长出。它们形成与肌管的接触并且在8天后诱导第一次收缩。之后快速地，位于该脊髓外植体附近的神经支配肌肉纤维可见地连续收缩。神经支配的纤维在形态和空间上不同于非神经支配的纤维并且可以容易地区分它们。

进行一次共培养(6个孔/条件)。

谷氨酸损害

在第27天，共培养物在谷氨酸中毒(60μM)达20min之前用候选化合物或利鲁唑温育1小时。然后，洗涤共培养物并加入候选化合物或利鲁唑持续另外的48h。在此温育时间后，未固定的共培养物在室温用浓度为500nmol/L的偶联有Alexa 488的α-银环蛇毒素温育15min。接着，共培养物在室温通过PFA固定20min。在用0.1％的皂苷渗透后，共培养物用抗神经丝抗体(NF)温育。

这些抗体用Alexa Fluor 568羊抗-小鼠IgG(Molecular probe)检测。神经元的核通过荧光标记物(Hoechst solution)标记。

端点是(1)总神经突长度，(2)运动单元的数量，(3)总运动单元区域，它们是运动神经元存活和功能的指示。

对于每种条件，使用InCell AhalyzerTM 1000(GE Healthcare)以20x放大率摄取2x 10图片/孔。所有照片在相同条件下摄取。

结果

巴氯芬和阿坎酸组合在共培养模型中有效地保护运动神经元和运动单元。

II.2-组合疗法在ALS小鼠模型中有效

实验在雄性小鼠上进行。在这组实验中选择转基因雄性小鼠B6SJL-Tg(SOD1)2Gur/J小鼠和它们的对照(分别是来自Jackson Laboratories，Ben Harbor，USASN2726和SN2297并且由Charles River in France分配)以模拟ALS。

患病小鼠表示SOD1-G93A转基因，设计有突变人SOD1基因(在密码子93处的甘氨酸至丙氨酸的单个氨基酸取代)，由其内源人SOD1启动子驱动。对照小鼠表示对照人SODl基因。

动物的随机化：

组指定和动物的随机化基于体重；对于每个组，随机化在首次治疗前一天进行。

药物施用

小鼠在出生后第60天直至死亡给予在媒介物中稀释的候选药物治疗剂。药物候选的稀释溶液在要开始施用前在室温用水制备。

●在饮用水中：

利鲁唑以在5％环糊精中的6mg/ml最终浓度(调节至每组平均体重)加入到饮用水中。由于小鼠饮用约5ml/天，所以估算的施用剂量为30mg/kg/天，其是显示增大小鼠存活的剂量。

-环糊精从母液(环糊精20％)在室温以在水中稀释的5％的最终浓度用作媒介物。

●口服施用(经口)：

-药物组合每天经口施用。

-环糊精从母液(环糊精20％)在室温以在水中稀释的5％的最终浓度用作媒介物。

临床观察

每天进行每只小鼠的临床观察，从治疗的第一天(60天龄)直至死亡(或处死)。临床观察由研究行为实验构成：瘫痪发作，“失去展开(splay)”，“失去翻直反射”，和一般步态观察：

-瘫痪的发作：观察由每个肢体的瘫痪观察构成。瘫痪的发作对应于瘫痪第一征兆的天数。

-失去展开试验由颤抖或抖动通知以及当小鼠通过尾巴悬浮时后肢的位置(悬挂或展开)。

-失去翻直反射试验评价小鼠在被翻到任一侧的30秒内翻直自身的能力。翻直反射在小鼠不能翻直自身时失去。失去翻直反射确定疾病的结束阶段：不能翻直自身的小鼠被安乐死。

结果-组合疗法在体内模型中对ALS有效

对用巴氯芬和阿坎酸组合治疗的患病动物观察疾病的改善。

III)组合在对于神经性疼痛的体内模型中在奥沙利铂诱导神经病中的保护作用

本发明的组合疗法在外周神经病的适当模型，即奥沙利铂-诱导神经病的急性模型和奥沙利铂-诱导神经病的慢性模型中在体内进行测试。在这部分中呈现动物、方案和结果。

动物饲养管理

使用Sprague-Dawley大鼠(CERJ，France)，在奥沙利铂治疗实验开始(D₀)时称重150-175g。动物在温度(19.5℃-24.5℃)和相对湿度(45％-65％)受控室中在首先访问动物设施中圈养，以12h-亮/暗循环，其中在整个研究期间随意访问标准成粒实验室食品和水。动物圈养4或5只/笼并且在任何测试前观察一周驯化期。

实验设计

在所有实验中使用以下四组大鼠：

对照组：

第1组：奥沙利铂的媒介物(蒸馏水)，i.p./候选组合的媒介物(蒸馏水)，p.o.每天。

第2组：奥沙利铂(蒸馏水)，i.p./候选组合的媒介物(蒸馏水)，p.o.每天。

第3组：奥沙利铂3mg/kg i.p./在蒸馏水中的单个药物，p.o.每天x 9。

测试组合物组：

第4组：奥沙利铂3mg/kg i.p./候选组合，在蒸馏水中，p.o.每天x9。

第5组：奥沙利铂3mg/kg i.p./加巴喷丁(100mg/kg)，在蒸馏水中，p.o.，在测试当天(即D₁和D₈)；

媒介物和试验项目从D-1至D7(最后测试当天前一天)递送，而加巴喷丁在测试当天(试验前120分钟)施用。所有治疗当可能时以编码和随机顺序施用。依据游离活性物质表示剂量。

神经病诱导

急性神经病通过单次腹膜内注射奥沙利铂(3mg/kg)诱导。

慢性外周神经病通过在第0，2，4和7(CD＝12mg/kg，i.p.)重复腹膜内注射奥沙利铂(3mg/kg，i.p.)诱导。人的慢性神经病也累积并且在以下患者中最常见到，该患者已接受总的奥沙利铂剂量＞或＝540mg/m²，这对应于在大鼠中累积的～15mg/kg(CersosimoR.J.2005)。

奥沙利铂-诱导的大鼠的疼痛性神经病再现在奥沙利铂-治疗患者中的疼痛症状：

-热痛觉过敏是最早的症状。它可以用丙酮试验或尾巴浸泡试验测量；

-机械痛觉过敏在后来显现。它可以用冯弗雷(Von Frey)试验或爪压力试验定量。

动物给药和测试

所有药物组合从首次腹膜内注射奥沙利铂3mg/kg前一天(D-1)施用并每天经口地持续直至D7。在试验当天(即，D1和D7)期间，所述药物组合在试验后施用。来自参考治疗组(加巴喷丁)的动物仅在实验当天期间给予。

丙酮试验

冷异常性疼痛在D1(在第一次注射奥沙利铂3mg/kg后约24h)(奥沙利铂的急性效果)和D8(奥沙利铂的慢性效果)通过测量对热非-感受伤害刺激的反应施用丙酮试验评估。

在丙酮试验中，猴爪收缩的潜伏期在将丙酮液滴施加至两个后爪平面后(反应时间)进行测量并且对反应的强度进行评分(冷评分)。丙酮的冷却效果的反应时间在丙酮施加后20秒(截止值)内测量。对丙酮的反应也分级为以下4分量表：0(无反应)；1(快速收缩，爪拍动)；2(延长收缩或爪显著拍动)；3(在舔或咬下爪重复拍动)。

对于每个实验组，结果表示为：

-反应时间定义为引起爪反应所需的以秒表示的时间(对每只大鼠共6次测量的平均值±SEM)。

-对每只大鼠累积冷评分总和为6分±SEM。最低评分为0(对6个试验任一个都没有反应)并且最高可能评分为18(在6次试验每一个上重复拍动和舔或咬)。

统计学分析

进行学生检验，单侧，类型3。显著性水平设置为p＜0.05；所有组与患病+媒介物组(奥沙利铂治疗组)进行比较。平均值和标准偏差平均值在图上显示。

结果

奥沙利铂在时间过程期间在丙酮施加(患病组+媒介物)后诱导爪收缩的反应时间的显著降低。相比于媒介物组，这种降低从第1天(奥沙利铂-诱导神经病的急性模型)至第8天(慢性模型)是进展性的和显著的。

●在奥沙利铂-诱导神经病的急性模型和慢性模型中的抗痛(Anti-allodynic)作用

巴氯芬和阿坎酸组合在奥沙利铂-诱导神经病的两种模型中进行测试。相比于奥沙利铂-媒介物治疗组，它诱导累积冷评分的显著降低和反应时间的显著增加。总之，这种药物组合保护免于慢性和急性神经病。

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Claims (11)

1.一种用于治疗与谷氨酸和/或淀粉样蛋白β毒性相关的神经性障碍的组合物，其包含巴氯芬和阿坎酸和多奈哌齐，或其药用盐，其中巴氯芬和阿坎酸是15:1的相对重量比。

2.根据权利要求1的组合物，其还包含一种或几种药学上合适的赋形剂或载体。

3.根据权利要求1或2的组合物的用途，用于制备用于治疗与谷氨酸和/或淀粉样蛋白β毒性相关的神经性障碍的药物。

4.一种用于治疗与谷氨酸和/或淀粉样蛋白β毒性相关的神经性障碍的药物，其包含巴氯芬和阿坎酸和多奈哌齐，或其药用盐，其中巴氯芬和阿坎酸是15:1的相对重量比。

5.根据权利要求4的药物或根据权利要求1或2的组合物，其中巴氯芬的剂量小于100mg/天。

6.根据权利要求4或5的药物或根据权利要求1或2的组合物，其中巴氯芬的剂量小于50mg/天。

7.根据权利要求4或5的药物或根据权利要求1或2的组合物，其中阿坎酸的剂量小于1000mg/天。

8.根据权利要求4或5的药物或根据权利要求1或2的组合物，其中阿坎酸的剂量小于400mg/天。

9.根据权利要求4或5的药物或根据权利要求1或2的组合物，其中阿坎酸的剂量小于200mg/天。

10.根据权利要求4或5的药物或根据权利要求1或2的组合物，其中阿坎酸的剂量小于50mg/天。

11.根据权利要求1或2的组合物或根据权利要求4或5的药物，用于治疗阿尔茨海默病。

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