BR112013022112B1

BR112013022112B1 - Composição que compreende baclofeno e acamprosato

Info

Publication number: BR112013022112B1
Application number: BR112013022112-7A
Authority: BR
Inventors: Daniel Cohen; Ilya Chumakov; Serguei Nabirochkin; Emmanuel Vial; Mickaël Guedj
Original assignee: Pharnext
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2012-03-01
Publication date: 2021-09-28
Also published as: DK2560631T3; PL2796132T3; MX2013010043A; LT2796132T; AU2017210501B2; KR20180043844A; PL2727588T3; ES2698927T3; EP2560631B1; IL228177B; CN103596562B; EP2727588B1; BR112013022112A2; EP2727588A1; RS57426B1; KR101937782B1; HRP20140131T1; ES2450074T3; US20200085790A1; US8865769B2

Abstract

composição. a presente invenção refere-se a combinações e métodos para o tratamento de doenças neurológicas relacionadas com excitotoxicidade de glutamato e toxicidade (beta) amilóide mais especificamente, a presente invenção refere-se a novas terapêuticas de composição para a esclerose múltipla, doença de alzheimer, distúrbios relacionadas com a doença de alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, doença de parkinson, doença de huntington, dor neuropática, neuropatia alcoólica, alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool, ou lesões na medula espinhal, baseados na combinação de baclofeno e acamprosato.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de doenças neurológicas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a terapêuticas de compostos inovadoras para o tratamento de doenças neurológicas, baseadas na composição de Baclofeno e Acamprosato.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A doença de Alzheimer (DA) é o protótipo de demência cortical, caracterizada por um défice de memória com disfasia (perturbação da linguagem que consiste na má coordenação das palavras e perturbação na compreensão de palavras), dispraxia (dificuldade em coordenar e efetuar certos movimentos e gestos voluntários, na ausência de deficiência motora) e agnosia (capacidade para reconhecer objetos, pessoas, sons, formas ou cheiros) atribuíveis ao envolvimento de áreas corticais de composição. Sintomas especiais, como a paraparesia espástica (fraqueza que afeta as extremidades inferiores) também podem estar incluídos (1-4).

[003] A incidência da doença de Alzheimer aumenta dramaticamente com a idade. A DA é atualmente a causa mais comum de demência. É clinicamente caracterizada por um declínio global das capacidades cognitivas que progride devagar e deixa os doentes na fase terminal acamados, incontinentes e dependentes de cuidados de terceiros. A morte acontece, em média, 9 anos após o diagnóstico (5).

[004] A taxa de incidência da DA aumenta drasticamente com a idade. As projeções populacionais das Nações Unidas estimam que o número de pessoas com mais de 80 anos vai ser de cerca de 370 milhões no ano de 2050. Atualmente, estima-se que 50% da população com mais de 85 anos sofra de DA. Por isso, mais de 100 milhões de pessoas no mundo irão sofrer de demência nos próximos 50 anos. O vasto número de pessoas que requerem cuidados constantes e outros serviços vai afetar gravemente os recursos médicos, econômicos e humanos (6).

[005] O enfraquecimento da memória é um dos primeiros sinais da doença e envolve a memória episódica (memória de acontecimentos atuais). A memória semântica (memória para o significado verbal e visual) está envolvida nos estágios mais avançados da doença. Em contraste, a memória de trabalho (memória de curta duração envolvendo estruturas e processos usada para armazenamento temporário e manipulação de informação) e memória procedimental (memória inconsciente que é a memória de longo prazo de competências e procedimentos) são preservadas durante mais tempo. Com o progresso da doença, as características adicionais do comprometimento da linguagem, défice de percepção visual e espacial, agnosia e apraxia emergem.

[006] A imagem clássica da doença de Alzheimer é suficientemente característica para permitir a identificação de aproximadamente 80% dos casos(7). Todavia, existe heterogeneidade clínica, sendo importante para o tratamento clínico e proporcionando igualmente mais implicações de tratamentos com medicação específica para diferentes formas funcionais.

[007] O marco patológico da DA inclui placas amilóides que contêm beta-amilóide (Abeta), tranças neurofibrilares (NFT) contendo Tau e perda e disfunção neuronal e sináptica (9-11). Na última década, foram propostas 2 teorias principais sobre a causa da DA: a “Teoria da Cascata Amilóide”, que refere que o processo neurodegenerativo é constituído por uma série de eventos despoletados pelo processamento anómalo da Proteína Precursora Amilóide (APP) (12), e a “hipótese de degeneração cito esquelética neuronal” (13), que propõem que são as mudanças cito esqueléticas que causam a doença. A teoria mais aceite para explicar a DA continua a ser a teoria da cascata amilóide (14-16) e investigadores da DA têm-se concentrado principalmente em determinar os mecanismos subjacentes à toxicidade associada com as proteínas Abeta. A permeabilidade e remodelação microvascular, angiogénese aberrante e o colapso da barreira hematoencefálica têm sido identificados como principais eventos que contribuem para a toxicidade da APP na cascata amilóide (17). Pelo contrário, a proteína Tau tem recebido muito menos atenção da indústria farmacêutica que a amilóide, devido a preocupações fundamentais e práticas. Além disso, a mudança na densidade sináptica é a lesão patológica que se correlaciona melhor com as dificuldades cognitivas do que as outras duas. Estudos revelaram que a doença amilóide aparenta progredir de forma especificamente relacionada com neurotransmissores em que os terminais colinérgicos aparentam ser os mais vulneráveis, seguidos dos terminais glutamatérgicos e, finalmente, os terminais GABAérgicos (11). Glutamato é o neurotransmissor excitatório mais abundante no sistema nervoso dos mamíferos. Em condições patológicas, é a sua acumulação anómala na fenda sináptica que leva à sobre ativação dos receptores de glutamato (18). A acumulação anormal de glutamato na fenda sináptica leva a uma sobre ativação dos receptores de glutamato que dá origem a um processo patológico e finalmente dá origem a morte de células neuronais. Este processo, chamado excitotoxicidade, é normalmente observado no tecido neuronal com doenças neurológicas agudas e crônicas.

[008] Está a tornar-se evidente que a excitotoxicidade está envolvida no processo patológico de vários distúrbios, por exemplo: lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, traumatismo crânio-encefálico, perda de audição, alcoolismo, síndrome de abstinência de álcool, neuropatia alcoólica, ou dor neuropática assim como doenças neurodegenerativas como a esclerose múltipla, a doença de Alzheimer, Esclerose Lateral Amiotrófica, a doença de Parkinson e a doença de Huntington. (13-21). O desenvolvimento de tratamentos eficientes para estas doenças continua a ser um dos principais problemas de saúde pública, devido não só à sua incidência como também à ausência de tratamentos curativos.

[009] Dois tipos de medicação são utilizados para melhorar ou atrasar os sintomas da DA, alguns moduladores da acetilcolinesterase e bloqueadores dos receptores de glutamato NMDA (26-27).

[0010] Os antagonistas do receptor NMDA, que têm como alvo vários pontos deste receptor têm sido testados para neutralizar a excitotoxicidade. Os antagonistas não competitivos dos receptores NMDA têm como alvo o poro do canal de íons, reduzindo assim a entrada de cálcio nos neurônios pós-sinápticos. Alguns deles chegaram a ser aprovados. Por exemplo, a Memantina está atualmente aprovada para casos moderados a graves de doença de Alzheimer. Está clinicamente testada para outras indicações, incluindo a componente de excitotoxicidade como a dependência de álcool (fase II), Esclerose Lateral Amiotrófica (fase III), demência associada com Parkinson (Fase II), epilepsia, doença de Huntington (fase IV), Esclerose Múltipla (fase IV), doença de Parkinson (fase IV) e traumatismo crânio-encefálico (fase IV). Esta molécula, no entanto tem benefícios limitados para a maioria dos doentes com Alzheimer, porque tem efeitos sintomáticos modestos. Outra abordagem para limitar a excitotoxicidade consiste em inibir a libertação pré- sináptica de glutamato. Riluzol, atualmente aprovado para a Esclerose Lateral Amiotrófica, mostrou resultados encorajadores em modelos de isquemia e traumatismo crânio- encefálico (22-25). Atualmente, está a ser testado em ensaios fase II para Esclerose Múltipla, doença de Parkinson (não está a demonstrar melhores resultados que o grupo placebo) assim como em lesões da medula espinhal. Em 1995, o fármaco passou a ser o único para o tratamento de Esclerose Lateral Amiotrófica e em 1996 para o tratamento da doença de Huntington. A utilização de antagonistas dos receptores de NMDA como a memantina, felbamato, acamprosato e MRZ 2/579 para o tratamento da depressão também foi sugerido na patente US2010076075

[0011] As patentes WO2009133128, WO2009133141, WO2009133142 e WO2011054759 divulgam composições de fármacos para uso no tratamento da DA.

[0012] Apesar da vasta pesquisa nesta área, continua sendo necessária uma alternativa ou métodos mais eficientes de tratamento para distúrbios neurológicos, e, particularmente, distúrbios neurológicos relacionados com o glutamato e/ou toxicidade beta amilóide. A presente invenção oferece novos tratamentos para estas doenças neurológicas do sistema nervoso central (SNC) e do sistema nervoso periférico (SNP).

RESUMO DA INVENÇÃO

[0013] É objeto da presente invenção é proporcionar novos métodos e composições terapêuticas para o tratamento de distúrbios neurológicos. Mais particularmente a invenção relaciona-se com composições e métodos para o tratamento de distúrbios neurológicos relacionados com a toxicidade do glutamato e/ou beta amilóide, baseados em uma composição de Baclofeno e Acamprosato.

[0014] A invenção resulta, inter alia, da descoberta inesperada pelos inventores de que a composição de Baclofeno e Acamprosato disponibiliza benefícios substanciais e inesperados aos doentes com a doença de Alzheimer. Além disso, os inventores descobriram surpreendentemente que esta composição disponibiliza uma proteção substancial e inesperada das células neuronais contra várias lesões encontradas em distúrbios neurológicos incluindo a toxicidade de glutamato. Assim, esta composição de Baclofeno e Acamprosato constitui um tratamento eficiente para doentes que sofrem de, têm predisposição para, ou se pensa que possam sofrer de distúrbios neurológicos.

[0015] Um objeto desta invenção, assim sendo, relaciona-se com composições contendo uma composição de Baclofeno e Acamprosato para uso no tratamento de um distúrbio neurológico, particularmente a DA e doenças relacionadas, Esclerose Múltipla (MS), Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), doença de Parkinson (PD), neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência do álcool, doença de Huntington (HD) e lesões da medula espinhal.

[0016] As composições desta invenção podem conter Baclofeno e Acamprosato como únicas substâncias ativas. Em alternativa, as composições podem incluir substâncias ativas adicionais. Neste sentido, um outro objeto desta invenção relaciona-se com uma composição contendo uma composição de Baclofeno, acamprosato e pelo menos um terceiro composto selecionado a partir do grupo Sulfisoxazol, Metimazol, Prilocaína, Difilina, Quinacrina, Carbenoxolona, ácido Aminocapróico, Cabergolina, Dietilcarbamazina, Cinacalcet, Cinarizina, Eplerenona, Fenoldopam, Leflunomida, Levosimendan, Sulodexida, Terbinafina, Zonisamida, Etomidato, Fenformina, Trimetazidina, Mexiletina, Ifenprodil, Bromocriptina ou Torasemida, para uso no tratamento de distúrbios neurológicos em um doente a precisar dos mesmos.

[0017] Como será ainda divulgado nesta aplicação, os compostos em uma composição terapêutica podem ser administrados simultaneamente, separadamente, sequencialmente e/ou repetidamente ao doente.

[0018] A invenção também se relaciona com qualquer composição farmacêutica per se que contenha uma composição de pelo menos dois compostos como definida acima.

[0019] As composições da invenção incluem ainda um ou vários excipientes ou veículos farmacologicamente aceitáveis. Igualmente, os compostos usados pela presente invenção podem apresentar-se sob a forma de um sal, hidrato, éster, éter, ácido, amida, racemato ou isómero. Elas podem também estar apresentar-se sob a forma de formulações de libertação controlada. Pró-fármacos ou derivados podem também ser utilizados.

[0020] Em um modo de realização preferencial, o composto é utilizado como tal ou na forma de um sal, hidrato, éster, éter ou formulação de libertação controlada. Um sal particularmente preferido para utilização na presente invenção é o acamprosato de cálcio.

[0021] Em um outro modo de realização preferencial, um pró-fármaco ou derivado é utilizado.

[0022] Um outro objetivo desta invenção é um método de preparação de uma composição farmacêutica, o método de mistura de Baclofeno e Acamprosato, em um excipiente ou veículo farmacologicamente aceitável.

[0023] Um outro objeto desta invenção relaciona- se com um método para o tratamento de um distúrbio neurológico em um mamífero com necessidade do mesmo, preferencialmente um humano com necessidade do mesmo, o método inclui a administração ao referido doente de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção.

[0024] Um outro objetivo desta invenção está relacionado com um método para o tratamento do Alzheimer ou de um distúrbio relacionado a um mamífero com necessidade do mesmo, preferencialmente um humano com necessidade do mesmo, o método inclui a administração ao referido doente de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção.

[0025] Um objetivo preferido desta invenção está relacionado com um método para o tratamento de um distúrbio neurológico a um mamífero com necessidade do mesmo, preferencialmente um humano com necessidade do mesmo, o método inclui a administração simultânea, separada ou sequencial ao referido doente de uma quantidade eficaz de Caclofeno e Acamprosato.

[0026] A invenção pode ser usada para o tratamento de um distúrbio neurológico em qualquer mamífero, preferencialmente no homem, em qualquer fase da doença. Como será descrito nos exemplos, as composições da invenção são capazes de melhorar a condição patológica dos referidos doentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] Figura 1: Validação do modelo experimental de toxicidade da amilóide β humana em células endoteliais usado para a triagem dos fármacos. Uma hora de VEGF pré-tratamento a 10nM protegeu significativamente a rede capilar desta lesão da amilóide (+70% de rede capilar comparada com a intoxicação da amilóide

[0028] Figura 2: Efeito da terapêutica de composição do Baclofeno (BCL) e do Acamprosato (ACP) em toda a rede capilar das culturas HBMEC (células endoteliais microvasculares do cérebro humano) intoxicadas com beta- amilóide. O agregado do peptídeo amilóide humano (Aβ1-42 2,5μM) produz uma intoxicação significativa, acima de 40%, quando comparado com as células controle. Esta intoxicação é significativamente evitada pela composição de Acamprosato e Baclofeno (A) onde, nestas concentrações, o Acamprosato (B) o Baclofeno (C) isolados não têm um efeito significativo na intoxicação. : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0029] Figura 3: Efeito da terapêutica de composição de Baclofeno (BCL) e Terbinafina (TBN) em toda a rede capilar das culturas HBMEC intoxicadas com beta- amilóide. O agregado do peptídeo amilóide humano (Aβ1-42 2,5μM) produz uma intoxicação significativa, acima de 40%, quando comparado com as células controle. Esta intoxicação é significativamente evitada pela composição de Terbinafina e Baclofeno *p<0,05, significativamente diferente do controle (sem intoxicação).

[0030] Figura 4: Validação do modelo experimental de toxicidade da amilóide β humana em células neuronais usado para a triagem dos fármacos. Uma hora de pré- tratamento com Estradiol (150 nM) ou BDNF (50ng/,L) protegeu significativamente os neurônios desta lesão amilóide (-94%), o que é considerado um controle positivo para a neuroproteção. *p<0,05, significativamente diferente do controle (sem intoxicação); : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42.

[0031] Figura 5: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato (ACP) e Baclofeno (BCL) na libertação de LDH na toxicidade Aβ1-42 humana nas células corticais primárias do rato. O peptídeo amilóide humano (Aβ1- 42 10μM) produz uma intoxicação significativa quando comparado com os neurônios controle. Esta intoxicação é significativamente evitada pela composição de Acamprosato e Baclofeno (A) onde, nestas concentrações, Acamprosato (B) e Baclofeno (C) isolados não têm um efeito significativo na intoxicação. : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0032] Figura 6: Efeito da terapêutica de composição de Cinacalcet (CNC) e Sulfisoxasol (SFX) na libertação de LDH na toxicidade Aβ1-42 humana nas células corticais primárias do rato. O peptídeo amilóide humano (Aβ1- 42 10μM) produz uma intoxicação significativa, quando comparado com os neurônios controle. Esta intoxicação é evitada pela composição de Cinacalcet e Sulfisoxasol (A) onde, nestas concentrações, Cinacalcet (B) e Sulfisoxasol (C) isolados não têm um efeito significativo na intoxicação. : p<0,05, significativamente diferente do veículo.

[0033] Figura 7: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato (ACP) e Baclofeno (BCL) em toda a rede de axônios em neurônios corticais intoxicados com amilóide beta. O peptídeo amilóide humano (Aβi-42 2,5μM) produz uma intoxicação significativa, acima de 15%, quando comparado com as células controle. Esta intoxicação é significativamente evitada pela composição de Acamprosato e Baclofeno onde, nestas concentrações, Acamprosato e Baclofeno isolados não têm um efeito significativo na intoxicação. : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1- 42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0034] Figura 8: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno no comportamento tal como definido pelo teste do labirinto em Y. O peptídeo amilóide produz uma diminuição significativa na cognição como medido pela percentagem de alternância (53,8% contra 73,5%). Este efeito prejudicial é significativamente prevenido (48,2% de proteção) pela combinação de Acamprosato (0,2mg/Kg/dia) e Baclofeno (3mg/Kg). : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0035] Figura 9: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno na memória tal como definido pela evasão passiva (latência de fuga). O peptídeo amilóide produz uma diminuição significativa nos desempenhos de memória como medido pela latência de fuga comparada com o controle. Este efeito prejudicial é significativamente prevenido (proteção total) pela combinação de Acamprosato (0,2mg/Kg) e Baclofeno (3mg/Kg). : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0036] Figura 10: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno na memória tal como definido pela evasão passiva (latência de passagem). O peptídeo amilóide produz uma diminuição significativa nos desempenhos de memória como medido pela latência de passagem, acima de 44%, comparada com o controle. Este efeito prejudicial é significativamente prevenido (78,8% de proteção) pela combinação de Acamprosato (0,2mg/Kg) e Baclofeno (3mg/Kg). : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0037] Figura 11: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno na densidade de neurônios no hipocampo. O peptídeo amilóide produz uma diminuição significativa da densidade neuronal como medido pelo número de neurônios por milímetro no hipocampo, 21% acima, comparada com o controle. Esta lesão neuronal é significativamente prevenida (63,2% neurônios lesionados são protegidos) pela combinação de Acamprosato (0,2mg/Kg) e Baclofeno (3mg/Kg). : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0038] Figura 12: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno na integridade da barreira hematoencefálica (BBB) induzindo uma diminuição significativa da sua permeabilidade, acima de 51% comparada com o controle. Esses danos na barreira hematoencefálica são significativamente prevenidos (66,6% de integridade restaurada) pela combinação de Acamprosato (0,2mg/Kg) e Baclofeno (3mg/Kg). : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0039] Figura 13: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno na densidade sináptica refletida pela concentração de sinaptofisina. O peptídeo amilóide afeta a função sináptica induzindo uma diminuição significativa da concentração de sinaptofisina no cérebro, acima de 34%, comparada com o controle. Esses danos na densidade sináptica são significativamente prevenidos (76%) pela combinação de Acamprosato (0,2mg/Kg/dia) e Baclofeno (3mg/Kg). : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0040] Figura 14: Efeito protetor da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno no stress oxidativo no hipocampo. O peptídeo amilóide induz um aumento significativo de stress oxidativo no hipocampo como medido pela peroxidação lipídica, acima de 59%, comparada com o controle. Este stress oxidativo é significativamente prevenido (65,9%) pela combinação de Acamprosato (0,2mg/Kg) e Baclofeno (3mg/Kg). : p<0,05, significativamente diferente da intoxicação por Aβ1-42; *: p<0,05: significativamente diferente do controle (sem intoxicação); "ns": sem efeito significativo (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0041] Figura 15: Efeito da terapêutica de composição de Baclofeno e Acamprosato contra a toxicidade de glutamato nas células corticais neuronais. A intoxicação de glutamato é significativamente prevenida pela combinação de Baclofeno (400 nM) e Acamprosato (1,6 nM), onde, a estas concentrações, o Baclofeno e o Acamprosato isolados não têm um efeito significativo na intoxicação. : p<0,001, significativamente diferente da intoxicação de glutamato; (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0042] Figura 16: Efeito da terapêutica de composição de Donepezil, Acamprosato e Baclofeno nas performances comportamentais e cognitivas como definidas pelo teste do labirinto em Y. O peptídeo amilóide produz uma diminuição significativa da cognição como medido pela percentagem de alternância (51,5% contra 71,8%). Este efeito degenerativo é significativamente prevenido (98% de proteção) pela combinação de Donepezil (0,25mg/kg/dia), Acamprosato (32μg/kg/dia) e Baclofeno (480μg/kg/dia), onde, a estas concentrações, os fármacos isolados não têm um efeito significativo. : p<0,01, significativamente diferente da intoxicação de Ab25-35 glutamato (ANOVA + teste Post-Hoc de Dunnett).

[0043] Figura 17: Comparação do efeito protetor do pré-tratamento de Acamprosato e do seu derivado Homotaurina nos ensaios de toxicidade Ab1-42 humana em células corticais primárias de ratos. Ab1-42 produz uma intoxicação significativa comparada com os neurônios tratados por veículo. A intoxicação é igualmente prevenida pela Homotaurina e pelo Acamprosato (99%, 8nM): : p<0.0001: significativamente diferente da intoxicação de Ab25-35 .

[0044] Figura 18: Efeito da terapêutica de composição de Acamprosato e Baclofeno na progressão crônica da encefalomielite autoimune experimental (EAE) como definida pelo resultado clínico. A imunização induz uma diminuição significativa dos aspectos físicos como medidos pelos resultados clínicos. Este efeito prejudicial é significativamente prevenido (valor de p< 0,01) pela combinação de Acamprosato (2mg/kg/dia) e Baclofeno (30 mg/kg/dia).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0045] Esta invenção oferece novos métodos e composições para o tratamento de distúrbios neurológicos. A invenção revela novas composições de fármacos que permitem uma correção efetiva de tais distúrbios e podem ser usados em qualquer mamífero doente.

[0046] A invenção é aplicável para o tratamento de quaisquer distúrbios neurológicos, central ou periférico, particularmente distúrbios em que estão envolvidas lesões nervosas ou neuronais, amilóide b, colapso da BBB ou excitotoxicidade por glutamato. Exemplos específicos destes distúrbios incluem doenças neurodegenerativas, neuropatias, lesões da medula espinhal e abuso de substâncias como o alcoolismo

[0047] Os distúrbios neurodegenerativos referem- se a doenças, como o Alzheimer e distúrbios relacionados, Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), Esclerose Múltipla (EM), doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (DH), que envolvam uma perda progressiva de funções e a morte de neurônios.

[0048] As neuropatias referem-se a situações em que os nervos do sistema nervoso periférico são danificados, isto inclui danos do sistema nervos periférico causados por fatores genéticos, doenças inflamatórias, ou por substâncias químicas, incluindo fármacos (vincristina, oxaliplatina, álcool etílico). O tratamento de neuropatias também inclui o tratamento de dor neuropática.

[0049] A invenção é particularmente adequada para o tratamento da DA e distúrbios relacionados. No contexto desta invenção, o termo “distúrbio relacionado” inclui demência senil do tipo da DA (SDAT), demência de corpos de Lewis, demência vascular, comprometimento cognitivo ligeiro (MCI) e perda de memória associada à idade (AAMI).

[0050] Como usado no presente documento, “tratamento” inclui a terapêutica, prevenção, profilaxia, atraso ou diminuição dos sintomas provocados por ou das causas das doenças e distúrbios acima referidos. O termo tratamento inclui em particular o controle da progressão da doença e dos sintomas associados. O termo tratamento inclui em particular uma proteção contra a toxicidade causada pela beta-amilóide, ou uma redução ou atraso da referida toxicidade, e/ou ii) uma proteção contra a excitotoxicidade por glutamato, ou a redução ou atraso na referida toxicidade, nos doentes tratados. O termo tratamento também designa uma melhoria dos sintomas cognitivos ou uma proteção das células neuronais.

[0051] Dentro do contexto desta invenção, a designação de um composto específico pretende incluir não só a molécula referida especificamente, mas também qualquer sal, hidrato, derivado, isómero, racemato, conjugado, ou pró- fármaco ou derivado do mesmo de qualquer pureza química, aceites farmacologicamente.

[0052] O termo “terapia de combinação ou combinatória terapêutica” designa um tratamento onde pelo menos o Baclofeno e o Acamprosato são co-administrados a um doente para causar efeito biológico. Para esta invenção, em uma terapia de combinação os pelo menos dois fármacos podem ser administrados juntos ou separados, ao mesmo tempo ou sequencialmente. Também, os pelo menos Baclofeno e Acamprosato podem ser administrados por vias e protocolos diferentes. Como resultado, apesar de poderem ser formulados juntos, os fármacos de uma combinação também podem ser formulados separadamente.

[0053] O termo "pró-fármaco"como usado no presente documento refere-se a qualquer derivado (ou precursor) funcional de um composto da presente invenção, que, quando administrado a um sistema biológico, gera o referido composto como resultado de por exemplo, reação(ões) químicas espontâneas, reação(ões) químicas catalisadas por uma enzima, e/ou reação(ões) químicas metabólicas. Os pró- fármacos são habitualmente inativos ou menos ativos que o fármaco resultante e podem ser usados, por exemplo, para melhorar as propriedades físico-químicas do fármaco, para dirigir o fármaco para um tecido específico, para melhorar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do fármaco e/ou reduzir efeitos secundários indesejados. Alguns dos grupos funcionais responsáveis pela estrutura do pró-fármaco incluem, mas não estão limitados a, grupos carboxílico, hidroxilo, amino, fosfato/fosfonato e carbonila. Tipicamente produzidos através de modificações destes grupos, os pró- fármacos incluem, mas não estão limitados a, esteres, carbonatos, carbamatos, amidos e fosfatos. A orientação técnica específica para a seleção de pró-fármacos adequados é do conhecimento comum geral (29-33). Além disso, a preparação dos pró-fármacos pode ser feita por métodos convencionais por pessoas especializadas na área. Os métodos que podem ser utilizados para sintetizar os pró-fármacos estão descritos em vários artigos sobre o assunto (30; 34-40). Por exemplo, Arbaclofeno Placarbil está listado na base de dados da ChemID plus (website: chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/) e Arbaclofeno Placarbil é um pró-fármaco muito conhecido do Baclofeno (41-42).

[0054] O termo “derivado” de um composto inclui qualquer molécula que seja funcional ou estruturalmente relacionada com o composto referido, tal como um ácido, amido, éster, éter, variante acetilada, variante hidroxilada, ou uma variante alquilada (C1-C6) do referido composto. O termo derivado também inclui compostos com estruturas semelhantes que tenham perdido um ou mais substituintes acima referidos. Por exemplo, Homotaurina é um derivado desacetilado do Acamprosato. Os derivados preferenciais de um composto são moléculas que apresentam um grau substancial de parecenças com o composto referido, determinados por métodos conhecidos. Compostos similares assim como o seu índice de semelhança relativamente à molécula original podem ser encontrados em várias bases de dados, como por exemplo, PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/) ou DrugBank (http://www.drugbank.ca/). Preferencialmente, os derivados devem apresentar um índice de similaridade de Tanimoto maior que 0,4, preferencialmente superior a 0,5, mais preferencialmente superior a 0,6, e ainda mais preferencialmente superior a 0,7 com um fármaco original. O índice de similaridade de Tanimoto é amplamente usado para medir o grau de similaridade entre duas moléculas. O índice pode ser calculado através de software como o Small Molecule Subgraph Detector (43-44) disponível online (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/). Os derivados preferenciais devem ser estrutural e funcionalmente semelhantes ao composto original, isto é, devem conservar pelo menos uma parte da função do composto original, mais preferencialmente devem proteger contra a toxicidade de Aβ ou do glutamato.

[0055] O termo derivados também inclui metabolitos de um fármaco, por exemplo, uma molécula que resulta da modificação(ões) (bioquímica) ou processamento desse fármaco após administração a um organismo, normalmente através de sistemas de enzimas especializados, e que exibe ou retém a atividade biológica do fármaco. Os metabolitos foram considerados responsáveis por muita da ação terapêutica do fármaco original. Em uma realização específica, um “metabolito” como usado acima designa um fármaco modificado ou processado que retém pelo menos parte da atividade do fármaco original, preferencialmente que tenha uma ação protetora contra a toxicidade da Aβ e do glutamato.

[0056] O termo "sal" refere-se à adição de um sal farmacologicamente aceitável e relativamente não tóxico, ácido inorgânico ou orgânico a um composto desta invenção. A formação de sal farmacêutica consiste no emparelhamento de uma molécula de um fármaco ácido, básico ou dipolar (zwiter) com um contra-íon para criar uma versão de sal do fármaco. Os sais farmacologicamente aceitáveis desta invenção incluem os obtidos por fazer reagir o composto principal, funcionando como base, com um ácido orgânico ou inorgânico para formar um sal, por exemplo, sais de ácido acético, ácido nítrico, ácido tartárico, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfônico, ácido canforsulfônico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico ou ácido cítrico. Os sais farmacologicamente aceitáveis desta invenção também incluem os sais em que o composto principal funciona como um ácido e reage com uma base apropriada para formar, por exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônio, ou sais de colina. Apesar da maioria dos sais de um dado princípio ativo serem bioequivalentes, alguns podem ter, entre outras, propriedades aumentadas de solubilidade ou de biodisponibilidade. A seleção de sal é agora uma operação padrão comum no processo de desenvolvimento de fármacos, como explicado por H. Stahl e C.G Wermuth no seu manual (45).

[0057] Em uma realização preferida, a designação de um composto deve designar o composto em si, assim como qualquer sal, hidrato, isómero, racemato, éster ou éter do mesmo farmacologicamente aceitável.

[0058] Em uma realização ainda mais preferida, a designação de um composto deve designar o composto tanto como especificamente desenhado per se, como qualquer sal do mesmo farmacologicamente aceitável.

[0059] Em uma realização particular, uma fórmula de libertação sustentada é utilizada.

[0060] Como acima discutido, a invenção relaciona-se com combinações particulares de fármacos que exercem um efeito forte e inesperado em vários processos biológicos envolvidos em perturbações neurológicos. Estas combinações de fármacos representam assim novas abordagens para o tratamento de doenças neurológicas, como a doença de Alzheimer e distúrbios relacionados, Esclerose Múltipla, Esclerose Lateral Amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Huntington, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool, e lesões da medula espinhal. Mais especificamente, esta invenção revela composições, que incluem o Baclofeno em combinação com o Acamprosato, que proporcionam, in vivo, um efeito significativo em distúrbios neurológicos.

[0061] De fato, a invenção mostra, na parte experimental, que terapêuticas de combinação que incluem o Baclofeno e o Acamprosato podem melhorar substancialmente a condição de doentes com distúrbios neurológicos. Em particular, os inventores descobriram, surpreendentemente, que as combinações de Baclofeno e de Acamprosato têm um efeito, inesperado e forte no comprimento da rede capilar ou na libertação de LDH em células nervosas intoxicadas com amilóide beta e representam novas abordagens da DA. Também, e os exemplos mostram isso, em uma terapia de combinação da invenção, o Baclofeno pode ser eficaz em doses de 80 nM ou menos, e o Acamprosato pode ser eficaz em doses de 1 nM ou menos. Estes resultados são notáveis e particularmente vantajosos pois, com doses tão baixas, quaisquer efeitos secundários são evitados.

[0062] Além disso, estas combinações protegem células neuronais efetivamente de vários problemas como a toxicidade por glutamato, stress oxidativo e previnem a permeabilização da BBB ou células neuronais com apoptose induzida que estão envolvidas em vários distúrbios neurológicos

[0063] A presente invenção propõe deste modo uma nova terapêutica para distúrbios neurológicos, baseada em composições de Baclofeno e Acamprosato. Mais particularmente, a presente invenção propõem deste modo uma nova terapêutica para a doença de Alzheimer e distúrbios relacionados, Esclerose Múltipla, Esclerose Lateral Amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Huntington, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool, e lesões da medula espinhal, baseada em composições de Baclofeno e Acamprosato.

[0064] A este respeito, em uma realização em particular, a invenção relaciona-se com uma composição que inclui o Baclofeno e o Acamprosato para uso no tratamento da DA, distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal.

[0065] Em uma outra realização, a invenção relaciona-se com a utilização de Baclofeno e Acamprosato para a produção de um medicamento para o tratamento da DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal.

[0066] Os números CAS ilustrativos para o Baclofeno e o Acamprosato são apresentados na Tabela 1 em baixo. A Tabela 1 também cita, de uma maneira não limitativa, sais comuns, racematos, pró-fármacos, metabolitos ou derivados destes compostos usados nas composições desta invenção. Tabela 1

[0067] Exemplos específicos de pró-fármacos de Baclofeno são apresentados em Hanafi et al, 2011 (41), particularmente ésteres de Baclofeno e carbamatos de éster de Baclofeno que são de particular interesse para a segmentação do SNC. Por isso estes pró-fármacos são particularmente adequados para composições desta invenção. Como já foi mencionado, o Baclofeno placarbil também é um pró-fármaco conhecido e pode assim ser utilizado em vez do Baclofeno em composições desta invenção. Outros pró-fármacos do Baclofeno podem ser encontrados nos pedidos das seguintes patentes: WO2010102071, US2009197958, WO2009096985, WO2009061934, WO2008086492, US2009216037, WO2005066122, US2011021571, WO2003077902, WO2010120370.

[0068] Pró-fármacos úteis para acamprosato tais esteres de sulfonil neopentilico de ácido pantóico, pró-fármacos de esteres sulfonil neopentilico ou pró-fármacos de éster sulfonil neopentilico mascarado de acamprosato estão nomeadamente listados em: WO2009033069, WO2009033061, WO2009033054 WO2009052191, WO2009033079, US 2009/0099253, US 2009/0069419, US 2009/0082464, US 2009/0082440, e US 2009/0076147.

[0069] O Baclofeno e o Acamprosato podem ser utilizados individualmente ou podem ser ainda combinados compostos adicionais. A este respeito, em uma realização particular, as composições da invenção podem ainda incluir pelo menos um composto selecionado a partir de Sulfisoxazol, Metimazol, Prilocaína, Difilina, Quinacrina, Carbenoxolona, ácido Aminocapróico, Cabergolina, Dietilcarbamazina, Cinacalcet, Cinarizina, Eplerenona, Fenoldopam, Leflunomida, Levosimendan, Sulodexida, Terbinafina, Zonisamida, Etomidato, Fenformina, Trimetazidina, Mexiletina, Ifenprodil, Moxifloxacina, Bromocriptina ou Torasemida, os números CAS ilustrativos para cada um destes compostos são apresentados na tabela 2 abaixo: Tabela 2

[0070] Em uma realização preferencial, a invenção está relacionada com a utilização desta combinação para o tratamento da DA ou distúrbios relacionados em um doente com necessidade do mesmo.

[0071] Em uma realização preferencial, a invenção está relacionada com a utilização desta combinação para o tratamento da MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal, em um doente com necessidade do mesmo.

[0072] Como demonstrado nos exemplos, a terapêutica de composição utilizando pelo menos Baclofeno e Acamprosato tem um efeito, inesperado, forte nos processos biológicos que levam a lesões neuronais. Além disso, estas combinações também demonstraram, in vivo, uma habilidade muito eficiente de corrigir os sintomas das doenças neuronais. Estas combinações, por isso, representam novas abordagens no tratamento de distúrbios neurológicos, como a doença de Alzheimer, Esclerose Múltipla, esclerose Lateral Amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Huntington, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal. Estas composições previnem eficientemente a toxicidade do peptídeo amilóide b (Ab) ou a excitotoxicidade por glutamato em células neuronais. Além disso estas composições, in vivo, levam a uma melhoria de vários sintomas cognitivos assim como a uma proteção das células neuronais. Por isso representam novos e potentes métodos para o tratamento destes distúrbios.

[0073] A secção experimental revela ainda que as composições acima mencionadas são também eficazes i) na proteção sinergética das células neuronais in vitro da excitotoxicidade do glutamato, e ii) em proporcionar benefícios clínicos em modelos in vivo para doenças relacionadas com excitotoxicidade por glutamato.

[0074] As composições da invenção podem abranger 1, 2, 3, 4 ou 5 fármacos diferentes, ainda mais preferencialmente 2, 3 ou 4 fármacos diferentes para o tratamento por composição da doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal em um indivíduo que dele necessite. Em uma especificação preferencial, os fármacos da invenção são utilizados em composição(ões) para administração combinada, isolada ou sequencial, de forma a proporcionar o efeito mais eficaz.

[0075] Especificações preferenciais da invenção, para uso no tratamento de doenças neurológicas como a doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal, compreende uma das seguintes composições de fármacos, para administração combinada, isolada ou sequencial: - Baclofeno e Acamprosato, - Baclofeno e Acamprosato e Dietilcarbamazina, - Baclofeno e Acamprosato e Cinacalcet, - Baclofeno e Acamprosato e Sulfisoxasol, - Baclofeno e Acamprosato e Torasemida, - Baclofeno e Acamprosato e Ifenprodil, - Baclofeno e Acamprosato e Mexiletina, - Baclofeno e Acamprosato e Eplerenona, - Baclofeno e Acamprosato e Levosimendan, - Baclofeno e Acamprosato e Terbinafina ou - Baclofeno e Acamprosato e Leflunomida. Como mencionado na secção experimental as terapêuticas combinatórias da invenção fornecem um efeito terapêutico e biológico substancial para melhorar a doença de Alzheimer ou distúrbios relacionados em doentes humanos. Estas induzem um forte efeito neuroprotetor contra a toxicidade da Aβ e apresentam resultados positivos em desempenhos comportamentais e ensaios bioquímicos in vivo. Os resultados mostram que as composições da invenção i) corrigem vias moleculares desencadeadas, in vivo, por agregados de Aβ e ii) levam a uma melhoria das deficiências neurofisiológicas observadas em animais doentes como a sobrevivência de neurônios e a integridade sináptica.

[0076] Além disso, os resultados apresentados mostram também que as composições terapêuticas acima têm um efeito neuroprotetor importante contra a excitotoxicidade por glutamato (figura 15), uma via que está implicada em várias doenças neurológicas como a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal. Estas composições oferecem resultados positivos em modelos in vivo ou in vitro destas doenças.

[0077] Além disso, os resultados in vivo demonstram que as composições da invenção restauram de modo eficiente a integridade da Barreira hematoencefálica e previnem, retardam ou diminuem a ocorrência de apoptoses, que se sabem ser afetadas em várias doenças neurológicas.

[0078] Além disso, a interacção sinergética particularmente elevada observada para estes dois fármacos permite a utilização de concentrações de fármacos que não apresentam nenhum efeito quando utilizadas em um tratamento com um só fármaco. Além disso, como demonstrado na secção experimental, a combinação de Baclofeno e Acamprosato dá origem a um efeito terapêutico melhorado na doença de Alzheimer quando comparado com outras combinações terapêuticas. Estas composições previnem eficientemente os efeitos tóxicos do peptídeo ou da proteína amilóide b em células humanas e em um modelo in vivo e representa métodos novos e potentes para o tratamento deste distúrbio.

[0079] Um objeto desta invenção reside portanto também, em uma composição como definida acima para o tratamento de perturbações neurológicas como a doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal.

[0080] Como indicado anteriormente, em uma terapia de combinação desta invenção, os compostos ou fármacos podem ser formulados juntos ou separados e administrados juntos, separados ou sequencialmente.

[0081] Um outro objeto desta invenção reside no uso de uma composição definida acima para a produção de medicamentos para o tratamento de perturbações neurológicas como a doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal.

[0082] A invenção além disso fornece um método para o tratamento de perturbações neurológicas como a doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal, que compreende a administração a um indivíduo com essa necessidade de uma dose eficaz de uma composição das descritas acima.

[0083] Um outro objeto da invenção é um método para o tratamento de um distúrbio neurológico como a doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal, o método compreende a administração simultânea, separada ou sequencial a um doente com necessidade da mesma de uma quantidade efetiva de uma composição como descrita acima.

[0084] Em uma forma de realização preferencial, a invenção relaciona-se com um método para o tratamento de um distúrbio neurológico como a doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal em um doente com essa necessidade, incluindo a administração simultânea, separada ou sequencial a um doente de uma dose eficaz de Baclofeno e Acamprosato.

[0085] As composições da invenção compreendem tipicamente um ou vários veículos ou excipientes farmacologicamente aceitáveis. Também, para uso na presente invenção, os fármacos ou compostos são por norma misturados com excipientes ou veículos farmacologicamente aceitáveis.

[0086] A este respeito, um outro objeto desta invenção é um método de preparação de uma composição farmacêutica, o método compreende misturar os compostos acima em um excipiente ou veículo farmacologicamente aceitável.

[0087] Em uma forma de realização particular, o método compreende misturar Baclofeno e Acamprosato em um excipiente ou veículo farmacologicamente aceitável.

[0088] De acordo com as formas de realização particulares da invenção, como indicado acima, os compostos são usados como tal ou na forma de um sal, pró-fármaco, derivado ou formulação de libertação sustentada do mesmo farmacologicamente aceitável.

[0089] Apesar serem muito eficazes in vitro e in vivo, dependendo do indivíduo e da patologia específica, a terapia de combinação da invenção pode ser utilizada em conjunto, associação ou combinação com fármacos ou tratamentos adicionais benéficos para a doença neurológica do indivíduo.

[0090] Outras terapias utilizadas em conjunto com o(s) fármaco(s) ou composição(ões) de fármaco(s) de acordo com esta invenção, podem abranger um ou mais fármacos que melhorem os sintomas da doença de Alzheimer (DA), distúrbios relacionados com a DA, MS, PD, ALS, HD, neuropatias (por exemplo, dor neuropática ou neuropatia alcoólica), alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal, ou fármaco(s) que possam ser utilizados nos cuidados paliativos destas doenças. Por exemplo, os resultados mostram também que as terapêuticas de combinação acima têm um efeito neuroprotetor sinergético importante quando combinadas com Donepezil (figura 16). Assim, terapias ilustrativas que podem ser utilizadas com combinações da invenção são Donepezil (CAS: 120014-06-4), Gabapentina (CAS: 478296-72-9; 60142-96-3), Rivastigmina (123441-03-2) ou Memantina (CAS: 19982-08-2).

[0091] A este respeito, em uma forma de realização particular, de acordo com a presente invenção o(s) fármaco(s) ou composições podem ser ainda combinados com extratos de Ginkgo Biloba. Extratos adequados incluem, mas não limitam, extratos de Ginkgo Biloba, extratos melhorados de Gingko Biloba (por exemplo, enriquecidos em ingredientes ativos ou diminuídos em contaminante) ou qualquer fármaco que contenha extratos de Gingko Biloba.

[0092] A terapêutica de acordo com a invenção pode ser administrada em casa, consultório médico, clínica, centro de doentes externos de um hospital, ou em um hospital, para que o médico possa observar os efeitos da terapêutica de perto e fazer os ajustes que são necessários.

[0093] A duração da terapêutica depende do estado da doença ou perturbação a ser tratada, da composição utilizada, da idade e estado de saúde do doente, e da forma como o doente reage ao tratamento. A dosagem, frequência e modo de administração de cada componente da composição podem ser controlados independentemente. Por exemplo, um fármaco pode ser administrado oralmente enquanto o segundo fármaco pode ser administrado intramuscularmente. A terapêutica de composição pode ser administrada em ciclos “on-e-off” que incluem períodos de descanso para que o corpo do doente tenha uma oportunidade de recuperar de quaisquer efeitos secundários imprevistos. Os fármacos também podem ser formulados em conjunto para que uma única administração liberte todos os fármacos.

[0094] A administração de cada composição de fármacos pode ser efetuada por qualquer meio adequado que resulte em uma concentração do fármaco, que em composição com o outro componente, seja capaz de melhorar o estado de saúde do doente ou tratar eficientemente a doença ou o distúrbio.

[0095] Embora seja possível administrar os fármacos da composição como produto químico puro é preferível apresentá-los como uma composição farmacêutica, também referida neste contexto como formulação farmacêutica. As composições possíveis incluem as adequadas para administração oral, retal, tópica (incluindo transdérmica, bucal e sublingual), ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).

[0096] Mais comumente estas formulações farmacêuticas são prescritas ao doente em “embalagens individualizadas” que contêm um número de unidades de dosagem ou outros meios para a administração doses unitárias calibradas para uso durante uma fase de tratamento distinto em uma embalagem única, normalmente uma embalagem blister. As embalagens individualizadas têm uma vantagem sobre as receitas tradicionais, onde um farmacêutico separa a dispensa de um medicamento para um dado doente a partir de um fornecimento por grosso, em que o doente tem sempre acesso ao folheto informativo incluso na embalagem, por norma em falta nas receitas tradicionais. A inclusão de um folheto informativo tem mostrado melhorias no cumprimento das indicações do médico por parte do doente. Assim, a invenção inclui ainda uma formulação farmacêutica, como descrita anteriormente, em composição com material de embalagem adequado para as referidas formulações. Nas referidas embalagens individualizadas, a formulação para a composição terapêutica pode ser inferida através de instruções, equipamentos, provisões e/ou outros meios de ajuda para usar a formulação mais adequada para o tratamento. Estas medidas fazem com que a embalagem individualizada seja especificamente adequada e adaptada para uso no tratamento com a composição presente nesta invenção.

[0097] O fármaco pode ser incluído, em qualquer quantidade apropriada, em qualquer substância adequada. O fármaco pode representar até 99% do peso total da composição. A composição pode ser proporcionada em doses adequadas a uma via de administração oral, parentérica (ex. Intravenosa, intramuscular), retal, cutânea, nasal, vaginal, por inalação, cutânea (dispositivo transdérmico) ou ocular. Assim, a composição pode ser apresentada sob a forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, emplastros, poções, dispositivos de entrega osmótica, supositórios, enemas, injetáveis, implantes, sprays ou aerossóis.

[0098] As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a pratica convencional farmacêutica (ver por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).

[0099] Composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser formuladas para libertar o fármaco ativo substancialmente de forma imediata após a administração ou em qualquer período determinado após a administração.

[00100] A libertação controlada inclui (i) formulações que criam uma concentração substancial constante do fármaco no organismo durante um período de tempo prolongado; (ii) formulações que após um período de tempo predeterminado criam uma concentração substancial constante do fármaco no organismo durante um período de tempo prolongado; (iii) formulações que sustentam a ação do fármaco durante um período de tempo predeterminado mantendo um nível relativo, constante e eficaz de fármaco no organismo com o compromisso de minimizar efeitos secundários indesejados associados à flutuação dos níveis de substância ativa no plasma; (iv) formulações que localizam a ação do fármaco por, ex., colocação espacial de uma composição de libertação controlada adjacente a ou no tecido ou órgão danificado; e (v) formulações que visam a ação do fármaco usando transportadores ou derivados químicos para entregar o fármaco a um tipo de célula-alvo específico.

[00101] A administração de fármacos na forma de libertação controlada é especialmente preferencial em casos nos quais o fármaco apresenta (i) um índice terapêutico estreito (isto é, a diferença entre a concentração plasmática que conduz a efeitos secundários prejudiciais ou reações tóxicas e a concentração plasmática que conduz a um efeito terapêutico é pequena; em geral, o índice terapêutico, TI, é definido como a razão entre a dose letal média (DL50) e a dose eficaz média (ED50)); (ii) uma janela de absorção estreita no trato gastrointestinal; ou (iii) uma semi-vida biológica muito curta de modo a que a dosagem frequente durante um dia é necessária a fim de manter os níveis terapêuticos plasmáticos.

[00102] Qualquer uma de uma série de estratégias pode ser seguida para obter uma libertação controlada em que a taxa de libertação supera a taxa de metabolismo do fármaco em questão. A libertação controlada pode ser obtida através da seleção apropriada de vários parâmetros de formulação e ingredientes, incluindo, por exemplo, vários tipos de composições e revestimentos de libertação controlada. Assim, o fármaco é formulado com excipientes apropriados em uma composição farmacêutica que, após a administração, liberta o fármaco de forma controlada (comprimido único ou múltiplo ou composição de cápsulas, soluções oleosas, suspensões, emulsões, micro cápsulas, micro esferas, nano partículas, dispositivos transdérmicos e lipossomas).

Formas Farmacêuticas Sólidas Para Administração Oral

[00103] Formulações para uso oral incluem comprimidos contendo a composição da invenção em uma mistura com excipientes não-tóxicos e farmacologicamente aceitáveis. Este excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes ou enchimentos (por exemplo, sacarose, celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio); agentes de granulação e de desintegração (por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, Croscarmelose sódica, alginatos ou ácido algínico); agentes ligantes (por exemplo, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré-gelatinizado, celulose microcristalina, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, etilcelulose, polivinilpirrolidona ou polietilenoglicol); e agentes lubrificantes, deslizantes e antiadesivos (por exemplo, ácido esteárico, sílicas, ou talco). Outros excipientes farmacologicamente aceitáveis podem ser corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, umectantes, agentes tampão, e semelhantes.

[00104] Os comprimidos podem ser não revestidos ou revestidos por técnicas conhecidas, opcionalmente para atrasar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal, proporcionando assim uma ação sustentada em um período mais longo. O revestimento pode ser adaptado para libertar a substância ativa em um padrão predeterminado (por exemplo, para conseguir uma formulação de libertação controlada) ou pode ser adaptado para não libertar a substância ativa do fármaco até depois da passagem pelo estômago (revestimento entérico). O revestimento pode ser um revestimento de açúcar, um revestimento de película (por exemplo, baseado em hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, metil hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, copolímero de acrilato, polietilenoglicol e/ou polivinilpirrolidona), ou um revestimento entérico (por exemplo, baseado em copolímero de ácido metacrílico, celulose acetato ftalato, hidroxipropil metilcelulose ftalato, hidroxipropil metilcelulose acetato succinato, polivinil acetato ftalato, goma laca, e/ou etilcelulose). Uma substância retardadora como por exemplo, monoestearato de glicerila ou distearato de glicerila pode ser empregue.

[00105] As composições dos comprimidos sólidos podem incluir um revestimento adaptado para proteger a composição de alterações químicas indesejáveis, (por exemplo, degradação química antes da libertação da substância ativa do fármaco). O revestimento pode ser aplicado sobre a forma farmacêutica sólida de uma maneira semelhante à descrita na Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.

[00106] Os fármacos podem ser misturados no comprimido, ou podem ser divididos. Por exemplo, um primeiro fármaco está contido no interior do comprimido, e um segundo fármaco está no exterior, de tal forma que uma porção substancial do segundo fármaco é libertada antes da libertação do primeiro fármaco.

[00107] Formulações para uso oral podem também apresentar-se como comprimidos mastigáveis ou na forma de cápsulas de gelatina dura em que a substância ativa é misturada com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino), ou na forma de cápsulas de gelatina mole em que a substância ativa é misturada com água ou com um meio oleoso, por exemplo, parafina líquida, ou azeite. Pós e granulados podem ser preparados utilizando os ingredientes mencionados acima em comprimidos e cápsulas de uma maneira convencional.

[00108] Composições de libertação controlada para uso oral podem, por exemplo, ser desenvolvidas para libertar a substância ativa controlando a sua dissolução e/ou a difusão da substância ativa do fármaco.

[00109] A dissolução ou difusão de libertação controlada pode ser alcançada por um revestimento adequado de um comprimido, cápsula, pastilha ou formulação granulada do fármaco, ou incorporando o fármaco em uma matriz adequada. Um revestimento de libertação controlada adequado pode incluir uma ou mais das substâncias de revestimento acima mencionadas e/ou, ex., goma laca, cera de abelha, cera de glicerina, cera de rícino, cera de carnaúba, álcool esteárico, monoesterato de glicerila, distearato de glicerila, palmitoestearato de glicerol, etilcelulose, resinas acrílicas, ácido di- poliláctico, butirato de acetato de celulose, cloreto de polivinila, acetato de polivinila, pirrolidona de vinila, polietileno, polimetacrilato, metilmetacrilato, 2- hidroximetacrilato, hidrogéis de metacrilato, 1,3 butilenoglicol, etilenoglicol metacrilato, e/ou polietilenoglicol. Em uma formulação de matriz de libertação controlada, o material da matriz pode também incluir, ex., metilcelulose hidratada, cera de carnaúba e álcool esteárico, carbopol 934, silicone, triestearato de glicerila, metil acrilato-metil metacrilato, cloreto de polivinil, polietileno, e/ou fluorocarbonetos halogenados.

[00110] Uma composição de libertação controlada contendo uma ou mais das composições de fármacos reivindicadas pode também ser apresentadas na forma de um comprimido ou cápsula flutuante (isto é, um comprimido ou cápsula que, após administração oral, flutua no topo do conteúdo gástrico durante um certo período de tempo). A formulação de comprimido flutuante do fármaco(s) pode ser preparada por granulação de uma mistura do(s) fármaco(s) com excipientes e 20-75% m/m de hidrocolóides, tal como a hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, ou hidroxipropilmetilcelulose. Os grânulos obtidos podem depois ser prensados em comprimidos. Em contato com o suco gástrico, o comprimido forma uma barreira de gel substancialmente impermeável à água em torno da sua superfície. Esta barreira de gel mantém a densidade a menos de um, permitindo assim que o comprimido permaneça a flutuar no suco gástrico.

Líquidos para Administração Oral

[00111] Os pós, pós dispersáveis, ou grânulos apropriados para preparação de uma suspensão aquosa por adição de água, são formas de dosagem convenientes para administração oral. A formulação como suspensão fornece a substância ativa em uma mistura com um agente dispersante ou molhante, agente de suspensão, e um ou mais conservantes. Os agentes de suspensão adequados são, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, alginato de sódio e similares.

Composições Parentéricas

[00112] A composição farmacêutica também pode ser administrada parentericamente por injeção, infusão ou implantação (intravenosa, intramuscular, subcutânea, ou semelhante) em formas de dosagem, formulações, ou por meio de dispositivos de entrega ou implantes adequados contendo transportadores não tóxicos e adjuvantes convencionais farmacologicamente aceitáveis. A formulação e preparação destas composições são conhecidas para os peritos da arte de formulação farmacêutica.

[00113] As composições para uso parentérico podem ser fornecidas em formas de dosagem única (por exemplo, em ampolas de dose única), ou em frascos contendo várias doses e nos quais um conservante adequado pode ser usado (ver em baixo). As composições podem ser apresentadas sob a forma de uma solução, uma suspensão, uma emulsão, um dispositivo para infusão, ou um dispositivo de entrega para implantação ou podem ser apresentadas sob a forma de pó seco para ser reconstituído com água ou outro veículo adequado antes da utilização. Além da(s) substância(s) ativa(s), a composição pode incluir transportadores adequados parentericamente aceitáveis e/ou excipientes. A(s) substância(s) ativa(s) podem ser incorporados em micro esferas, micro cápsulas, nano partículas, lipossomas ou semelhantes. A composição pode incluir agentes de suspensão, de solubilização, de estabilização, de ajuste de pH e/ou agentes dispersantes.

[00114] As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem estar em uma forma adequada para injeção esterilizada. Para preparar tal composição, a(s) substância(s) ativa(s) são dissolvidas ou suspensas em um veículo líquido parentericamente aceitável. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão a água, a água ajustada a um pH adequado por adição de uma quantidade apropriada de ácido hidroclorídrico, hidróxido de sódio ou um tampão adequado, 1,3-butanodiol, solução de Ringer, e solução isotônica de Cloreto de Sódio. A formulação aquosa pode também conter um ou mais conservantes (por exemplo, metil, etil ou n-propil p-hidroxibenzoato). Nos casos em que um dos fármacos é apenas fracamente ou ligeiramente solúvel em água, uma dissolução melhorada ou um agente solubilizador podem ser adicionados, ou o solvente pode incluir 10-60% m/m de propilenoglicol ou semelhante.

[00115] As composições parentéricas de libertação controlada podem ser apresentadas sob a forma de suspensões aquosas, micro esferas, micro cápsulas, micro esferas magnéticas, soluções oleosas, suspensões oleosas ou emulsões. Alternativamente, a(s) substância(s) ativa(s) podem ser incorporadas em portadores biocompatíveis, lipossomas, nano partículas, implantes ou dispositivos de infusão. Os materiais para uso na preparação das micro esferas e/ou das micro cápsulas são por exemplo, polímeros biodegradáveis/bioerodíveis tais como poligalactina, poli- (isobutil cianoacrilato), poli(2-hidroxietil-L-glutamina). Os portadores biocompatíveis que podem ser usados para a formulação parentérica de libertação controlada são hidratos de carbono (por exemplo, dextranos), proteínas (por exemplo, albumina), lipoproteínas, ou anticorpos. Os materiais utilizados nos implantes podem não ser biodegradáveis (por exemplo, polidimetil siloxano) ou biodegradáveis (por exemplo, poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) ou poli(orto ésteres)).

[00116] Vias Alternativas

[00117] Apesar de menos preferenciais e menos convenientes, outras vias de administração e, deste modo, outras formulações, podem ser contempladas. A este respeito, para aplicação retal, as formas de dosagem adequadas incluem supositórios (do tipo de emulsão ou suspensão), e cápsulas de gelatina retais (soluções ou suspensões). Em uma formulação de supositório típica, a(s) substância(s) ativa(s) são associadas com uma base farmacologicamente aceitável de supositório tal como manteiga de cacau, ácidos gordos esterificados, gelatina glecerinada, e várias bases solúveis na água ou dispersáveis tais como polietilenoglicol. Vários aditivos, potenciadores ou tensioativos podem ser incorporados.

[00118] As composições farmacêuticas podem também ser administradas topicamente na pele para absorção percutânea em formas de dosagem ou formulações contendo transportadores farmacologicamente aceitáveis e convencionalmente não-tóxicos e excipientes incluindo micro esferas e lipossomas. As formulações incluem cremes, unguentos, loções, linimentos, géis, hidrogéis, soluções, suspensões, sticks, aerossóis, pastas, adesivos, e outros tipos de sistemas transdérmicos de fornecimento de fármacos. Os veículos ou excipientes farmacologicamente aceitáveis podem incluir agentes emulsionantes, antioxidantes, agentes tamponadores, conservantes, umectantes, promotores da penetração, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de unguentos, perfumes e agentes protetores da pele.

[00119] Os conservantes, umectantes, intensificadores da penetração podem ser parabenos, como o metil ou propil p-hidroxibenzoato, e cloreto de benzalcônio, glicerina, propilenoglicol, ureia, etc.

[00120] As composições farmacêuticas descritas acima para administração tópica na pele podem também ser utilizadas em ligação com a administração tópica sobre, ou próxima da parte do corpo que está a ser tratada. As composições podem ser adaptadas para aplicação direta ou para aplicação por meios de dispositivos especiais de libertação de fármacos tais como ligaduras ou alternativamente pensos, almofadas, esponjas, tiras, ou outras formas de material flexível adequado.

Dosagens e duração do Tratamento

[00121] Será valorizado que os fármacos da composição possam ser administrados concomitantemente, quer na mesma ou em diferentes formulações farmacêuticas ou sequencialmente. Se a administração for sequencial, o atraso na administração da segunda (ou adicional) substância ativa não deveria ser suficiente para perder o benefício do efeito eficaz da composição de substâncias ativas. A exigência mínima para a composição de acordo com esta descrição é que a composição deve ser destinada para uso em composição com o benefício do efeito eficaz da composição de ingredientes ativos. O uso pretendido de uma composição pode ser deduzido por equipamentos, provisões, adaptações e / ou outros meios para ajudar a usar a composição de acordo com a invenção.

[00122] Quantidades de fármacos terapeuticamente eficazes em uma combinação desta invenção incluem, por exemplo, quantidades que são eficazes para reduzir os sintomas da doença de Alzheimer, interrompem ou atrasam a progressão da doença após a sua manifestação clínica, ou previnem ou reduzem o risco de desenvolver a doença.

[00123] Apesar das substâncias ativas da presente invenção poderem ser administradas em doses divididas, por exemplo, duas ou três vezes ao dia, uma dose única diária de cada fármaco da composição é preferencial, com uma dose única diária de todos os fármacos em uma única composição farmacêutica (forma de dosagem unitária), sendo o mais preferencial.

[00124] A administração pode ser feita várias vezes ao dia durante vários dias a vários anos, e podendo ainda ser administrada durante o resto da vida do doente. Administração a longo prazo crônica ou pelo menos periódica é indicada na maioria dos casos.

[00125] O termo “forma de dosagem unitária” refere-se a unidades físicas discriminadas (tais como cápsulas, comprimidos ou frascos para injetáveis carregados) adequadas como dosagens unitárias para uso no homem, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de substância, ou substâncias, ativa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em composição com o veículo farmacêutico necessário.

[00126] A quantidade de cada fármaco em uma composição unitária de dosagem depende de vários fatores incluindo o método de administração, o peso e a idade do doente, o estágio da doença, o risco de efeitos secundários potenciais considerando o estado de saúde da pessoa a ser tratada. Adicionalmente, a informação farmacogenômica (o efeito do genótipo na farmacocinética, farmacodinâmica ou perfil de eficácia de um tratamento) sobre um determinado doente pode afetar a dosagem utilizada.

[00127] Exceto em resposta a casos especialmente incapacitantes, onde doses mais elevadas podem ser necessárias, a dosagem preferencial de cada fármaco da composição vai geralmente situar-se entre o intervalo de dosagens e não acima das normalmente prescritas para o tratamento de manutenção a longo prazo ou que tenha provado ser segura na fase 3 de estudos clínicos.

[00128] Uma vantagem notável da presente invenção é que cada composto pode ser utilizado em doses baixas em uma composição terapêutica, produzindo, em composição, um benefício clínico substancial para o doente. A composição terapêutica pode certamente ser eficaz em doses em que os compostos têm pouco ou nenhum efeito individualmente. Em conformidade, uma vantagem particular da invenção reside na capacidade de utilizar doses sub-ótimas de cada composto, isto é, doses que são mais pequenas que as doses terapêuticas normalmente prescritas, preferencialmente 1/2 das doses terapêuticas, mais preferencialmente 1/3, 1/4, 1/5, ou ainda mais preferencialmente 1/10 das doses terapêuticas. Em exemplos particulares, doses tão baixas como 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, ou até mais baixas das doses terapêuticas são usadas.

[00129] Em tais dosagens sub-terapêuticas, os compostos não exibiriam nenhum efeito secundário, enquanto que a(s) composição(ões) de acordo com a invenção são plenamente eficazes no tratamento da doença de Alzheimer.

[00130] Uma dosagem preferencial corresponde a valores desde 1% até 50% da normalmente prescrita para o tratamento de manutenção a longo prazo.

[00131] A dosagem mais preferencial pode corresponder a valores desde 1% até 10% da normalmente prescrita para o tratamento de manutenção a longo prazo.

[00132] Exemplos específicos das dosagens dos fármacos para uso na invenção são apresentados em baixo: - Acamprosato desde cerca de 1 a 1000 mg por dia, preferencialmente menos de 400 mg por dia, mais preferencialmente menos 200 mg por dia, ainda mais preferencialmente menos de 50 mg por dia; estas dosagens são particularmente adequadas para administração oral, - Baclofeno desde cerca de 0,01 a 150 mg por dia, preferencialmente menos de 100 mg por dia, mais preferencialmente menos 50 mg por dia, ainda mais preferencialmente menos de 25 mg por dia; estas dosagens são particularmente adequadas para administração oral, - Ácido aminocapróico por via oral desde cerca de 0,1 a 2,4 mg por dia, - Bromocriptina por via oral desde cerca de 0,01 a 10 mg por dia, - Dietilcarbamazina por via oral desde cerca de 0,6 a 600 mg por dia, - Cabergolina por via oral desde cerca de 1 a 10 μg por dia, - Cinacalcet por via oral desde cerca de 0,3 a 36 mg por dia, - Cinnarizina por via oral desde cerca de 0,6 a 23 mg por dia, - Difilina por via oral desde cerca de 9 a 320 mg por dia, - Eplerenona por via oral desde cerca de 0,25 a 10 mg por dia, - Ifenprodil por via oral desde cerca de 0,4 a 6 mg por dia, - Leflunomida por via oral desde cerca de 0,1 a 10 mg por dia, - Levosimendan por via oral desde cerca de 0,04 a 0,8 mg por dia, - Mexiletina por via oral desde cerca de 6 a 120 mg por dia, - Moxifloxacina por via oral desde cerca de 4 a 40 mg por dia - Fenformina por via oral desde cerca de 0,25 a 15 mg por dia, - Quinacrina por via oral desde cerca de 1 a 30 mg por dia, - Sulfisoxazol por via oral desde cerca de 20 a 800 mg por dia, - Sulodexida por via oral desde cerca de 0,05 a 40 mg por dia, - Terbinafina por via oral desde cerca de 2,5 a 25 mg por dia, - Torasemida por via oral desde cerca de 0,05 a 4 mg por dia, - Trimetazidina por via oral desde cerca de 0,4 a 6 mg por dia, - Zonisamida por via oral desde cerca de 0,5 a 50 mg por dia.

[00133] Quando a composição compreende, como substância ativa, apenas Baclofeno e Acamprosato, estes dois compostos podem ser usados em proporções diferentes, por exemplo, em uma proporção em peso Acamprosato/ Baclofeno compreendida entre 0,05 a 1000 (P:P), preferencialmente entre 0,05 a 500 (P:P), mais preferencialmente 0,05 a 50 (P:P).

[00134] Será entendido que a quantidade de fármaco realmente administrada será determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes incluindo a doença ou doenças a serem tratadas, a composição exata a ser administrada, a idade, peso, e resposta do doente individual, a gravidade dos sintomas do doente, a via de administração selecionada. Deste modo, os intervalos de dosagem acima referidos destinam-se a fornecer orientações gerais e apoio para os ensinamentos neste documento, mas não se destinam a limitar o âmbito da invenção.

[00135] Os exemplos que se seguem são apresentados apenas como ilustração e não como forma de limitação.

EXEMPLOS

[00136] O cuidado e a criação de animais bem como as experiências pré-clínicas são realizados de acordo com as orientações do Committee for Research and Ethical Issue do I.A.S.P. (1983).

TRATAMENTO DE DOENÇAS RELACIONADAS COM A TOXICIDADE A Aβ

[00137] Nesta série de experiências, as composições candidatas foram testadas quanto à sua capacidade de prevenir ou reduzir os efeitos tóxicos da Aβ1-42 humana. Aβ1-42 é o comprimento total do peptídeo que forma agregados encontrados em biopsias de doentes humanos que sofrem de DA. O efeito é determinado em vários tipos de células, para documentar ainda mais a atividade das combinações em modelos in vitro que ilustram diferentes características fisiológicas da DA. Estudos in vivo também são realizados em um modelo de camundongo para a DA confirmando este efeito protetor através da avaliação do efeito das combinações no i) desempenho cognitivo dos animais e ii) em marcas moleculares (indução da apoptose, indução de stress oxidativo, indução de via de inflamação) da DA.

TERAPÊUTICAS DE COMBINAÇÃO DE BACLOFENO E ACAMPROSATO PREVINEM A TOXICIDADE DA Aβ1-42 HUMANA IN VITRO

[00138] I.1. Efeito da toxicidade do peptídeo Aβ1- 42 humano em células HBME humanas

[00139] Culturas de células microvasculares endoteliais do cérebro humano (HBMEC) foram usadas para estudar a proteção conferida pelo(s) composto(s) candidato(s) face à toxicidade da Aβ1-42.

[00140] As células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMEC, ScienCell Ref: 1000, Congelada à passagem de 10) foram descongeladas rapidamente em banho- maria a +37°C. O sobrenadante foi imediatamente colocado em meio essencial de 9 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Pan Biotech ref: P04-03600) contendo 10% de soro fetal de vitelo (FCS; GIBCO ref 10270-106). A suspensão de células foi centrifugada a 180 x g durante 10 min a +4°C e os sedimentos foram suspensos em um meio isento de soro CSC (CSC isento de soro, Cell System, Ref: SF-4Z0-500-R, Lote 51407-4) com 1,6% de RocketFuel isento de soro (Cell System, Ref: SF- 4Z0-500-R, Lote 54102), 2% de Penicilina 10.000 U/ml e Estreptomicina 10mg/ml (PS ; Pan Biotech ref: P06-07100 lote 133080808) e foram inoculadas a uma densidade de 20 000 células por poço em 96 pratos-poço (sistema de camadas matrigel biocoat angiogénese, BD, Ref 354150, lote A8662) com um volume final de 100μl. No suporte de matrigel, células cerebrais endoteliais começaram espontaneamente o processo de morfogénese da rede capilar (33).

[00141] Três culturas separadas foram realizadas por condição, 6 poços por condição.

[00142] Compostos de teste e tratamento da β amilóide 1-42 humana

[00143] Brevemente, o peptídeo Aβ1-42 (Bachem, ref: H1368 lote 1010533) foi reconstituído em meios de cultura definidos a 20μM (solução mãe) e foi lentamente agitado a +37 °C durante 3 dias no escuro para a agregação. O meio de controle foi preparado nas mesmas condições.

[00144] Após 3 dias, este peptídeo agregado de amilóide humana foi utilizado em HBMEC a 2,5μM diluído em um meio de controle (período de incubação ideal). O peptídeo da Aβ1-42 foi adicionado 2 horas depois das HBMEC estarem inoculadas em matrigel para uma incubação de 18 horas.

[00145] Uma hora depois das HBMEC estarem inoculadas em matrigel, compostos de teste e VEGF-165 foram solvidos no meio de cultura (+ 0,1 % DMSO) e depois pré- incubados com as HBMEC durante 1 hora antes da aplicação da Aβi-42 (em um volume final de cultura por poço de 100μl) . Uma hora após a incubação dos compostos de teste ou do VEGF (duas horas depois da inoculação das células em matrigel), 100μl de peptídeo da Aβ1-42 foi adicionado para uma concentração final de 2,5μM diluído no meio de cultura na presença de compostos de teste ou de VEGF (em um volume total de 200 μl /poço) , a fim de evitar diluições adicionais do fármaco. Organização de placas de cultura

[00146] O VEGF-165 conhecido como uma isoforma pró-angiogénica do VEGF-A, foi utilizado para todas as experiências neste estudo como composto de referência. O VEGF-165 é uma das isoformas mais abundantes de VEGF envolvidas em angiogénese. O VEGF foi utilizado como composto de referência do ensaio a 10nM (Figura 1).

[00147] As condições seguintes foram avaliadas: Controle Negativo: meio isolado + 0,1% DMSO Intoxicação: β amilóide 1-42 (2,5μM) durante 18h Controle Positivo: VEGF-165 (10nM) (1 composto de referência /cultura) 1hr antes da adição da Aβi-42 (2,5 μM) durante um período de incubação de 18h. Compostos de testes: Composto de teste 1hr antes da adição de Aβ1-42 (2,5 μM) durante um tempo de incubação de 18h.

Quantificação da rede capilar

[00148] Por poço, foram tiradas duas fotografias com lentes 4x usando o InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) na transmissão de luz. Todas as imagens foram tiradas nas mesmas condições. A análise das redes angiogénicas foi feita utilizando o software Developer (GE Healthcare). O comprimento total da rede capilar foi avaliado.

Tratamento de dados

[00149] Os dados foram expressos em percentagens de condições de controle (sem intoxicação, sem amilóide = 100%) de forma a expressar a lesão amilóide. Todos os valores foram expressos como médias +/- DPM (d.p.média) das 3 culturas (n = 6 poços por condição). As análises estatísticas foram realizadas nas diferentes condições (ONE-WAY ANOVA seguida pelo teste de Dunnett quando o mesmo era permitido, Statview software versão 5,0).

Resultados

[00150] A combinação de Baclofeno e de Acamprosato oferece um efeito protetor significativo contra a toxicidade do peptídeo Ab 1-42 humano em um modelo HBMEC (é observada uma redução de 24% da lesão do peptídeo Ab 1-42), como demonstrado na Figura 2. Os resultados mostram claramente que a intoxicação do peptídeo amilóide humano (Ab 1-42 2,5μM) é significativamente prevenida pela combinação de fármacos, onde, nessas concentrações, os fármacos isolados não têm um efeito significativo na intoxicação nas condições experimentais descritas acima.

[00151] Reciprocamente, a associação de Baclofeno e Terbinafina (que é apresentada aqui apenas para comparação) oferece uma proteção mais fraca (é observada uma redução de 15% da lesão do peptídeo Ab 1-42) contra a Ab 1-42 (figura 3).

[00152] Assim, apesar de ambas as combinações oferecerem uma proteção contra a Ab 1-42, a combinação de Baclofeno - Acamprosato destaca-se claramente. De fato, estes fármacos em concentrações em que isolados não teriam praticamente nenhum efeito, em combinação oferecem uma proteção significativa de células humanas HBME conta a Ab 1-42. Além disso, a combinação de Baclofeno - Acamprosato é mais eficaz que a de Baclofeno - Torasemida. Este efeito de Baclofeno e Acamprosato representa uma melhoria notável de 60% em comparação com por exemplo, o efeito da combinação de Baclofeno - Terbinafina.

[00153] Além disso, a concentração de Baclofeno utilizada na combinação de Baclofeno - Acamprosato é muito mais baixa que a concentração de Baclofeno utilizada na combinação de Baclofeno - Terbinafina (25x menos).

[00154] I.2 Efeito na toxicidade do peptídeo Aβ1- 42 humano em células neuronais corticais primárias.

[00155] Cultura de neurônios corticais primários

[00156] Neurônios corticais de rato foram cultivados como descrito por Singer et al. (47). Ratos fêmeas brevemente grávidas com 15 dias de gestação foram mortos por deslocação cervical (Ratos Wistar) e os fetos foram removidos do útero. O córtex foi removido e colocado em um meio gelado de Leibovitz (L15) contendo 2% de Penicilina 10.000 U/ml e estreptomicina 10mg/ml e 1% de soro albumina bovina (BSA). Os córtices foram dissociados por tripsina durante 20 min a 37°C (0,05%). A reação foi parada com a adição do meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo DNase1 grau II e 10% de soro fetal de vitelo (FCS). As células foram em seguida dissociadas mecanicamente por 3 passagens em série através de uma pipeta de 10 ml e centrifugadas a 515 x g durante 10 min a +4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet de células foi ressuspenso em um meio de cultura definido composto por Neurobasal complementado com B27 (2%), L-glutamina (0,2mM), 2% de solução PS e 10ng/ml de BDNF. As células viáveis foram contadas em um citómetro de Neubauer usando o teste de exclusão de azul de triptano. As células foram inoculadas a uma densidade de 30 000 células/poço em 96 pratos-poço (poços foram pré-emulsionados com poli-L-lisina (10μg/ml)) e foram cultivadas a +37°C em uma atmosfera de ar umidificado (95%)/CO2 (5%).

[00157] Três culturas independentes separadas foram realizadas por condição, 6 poços por condição.

[00158] Compostos de teste e tratamento de amilóide b 1-42 humana

[00159] Brevemente, o peptídeo Aβ1-42 foi reconstituído em meios de cultura definidos a 40μM (solução mãe) e foi lentamente agitado a +37 °C durante 3 dias no escuro para a agregação. O meio de controle foi preparado nas mesmas condições.

[00160] Após 3 dias, a solução foi utilizada em neurônios corticais primários do seguinte modo:

[00161] após 10 dias de cultura de neurônios, os compostos de teste foram solvidos no meio de cultura (+0,1 % DMSO) e depois pré-incubado com neurônios durante 1 hora antes da aplicação da Aβi-42 (em um volume total de 100 μl por poço de cultura). Uma hora após a incubação dos compostos de teste, 100μl do peptídeo da Aβ1-42 foram adicionados para uma concentração final de 10μM diluídos em presença do(s) fármaco(s), a fim de evitar mais diluições compostos de teste. Os neurônios corticais foram intoxicados durante 24 horas. Três culturas separadas foram efetuadas por condição, 6 poços por condição.

[00162] BDNF (50ng/ml) e Estradiol-β (150nM) foram utilizados como controle positivo e compostos de referência, respectivamente. Três culturas separadas foram efetuadas por condição, 12 poços por condição

Organização de placas de cultura

[00163] O Estradiol-β a 150nM foi utilizado como um controle positivo (figura 4).

[00164] O Estradiol-β foi solvido no meio de cultura e pré-incubado durante 1 h antes da aplicação do agregado amil0ide-βi—42.

[00165] As condições seguintes foram avaliados: PLACA DE CONTROLE: 12 poços/condição Controle Negativo: meio isolado + 0,1% DMSO Intoxicação: amol0ide-βi-42 (10 μM) durante 24h Composto de Referência: Estradiol (150nM) 1hr. PLACA DE FÁRMACO: 6 poços/condição Controle Negativo: meio isolado + 0,1% DMSO Intoxicação: amil0ide-βi-42 (10 μM) durante 24h

Composto(s) de teste: Composto(s) de teste - 1hr seguido pela β amilóide 1-42 (10 μM) durante 24h

[00166] Ensaio de atividade de lactato desidrogenasse (LDH)

[00167] 24 horas após intoxicação, o sobrenadante foi retirado e analisado com o Kit de Detecção de Citotoxicidade (LDH, Roche Applied Science, ref: 11644793001, lote: 11800300). Este ensaio colorimétrico para a quantificação da toxicidade celular é baseado na determinação da atividade do lactato desidrogenado (LDH) libertado do citosol das células mortas no sobrenadante.

Tratamento de dados

[00168] Os dados foram expressos em percentagens de condições de controle (sem intoxicação, sem amilóide = 100%) de forma a expressar a lesão amilóide. Todos os valores foram expressos como médias +/- DPM (d.p.média) das 3 culturas (n = 6 poços por condição). As análises estatísticas foram realizadas nas diferentes condições (ONE-WAY ANOVA seguida pelo teste de Dunnett quando o mesmo era permitido, Statview software versão 5,0).

Resultados

[00169] A combinação de Baclofeno e de Acamprosato oferece um efeito protetor significativo contra a toxicidade do peptídeo Ab 1-42 humano (aumento de 34% da sobrevivência de células) em células neuronais corticais primárias como demonstrado na Figura 5. Os resultados mostram claramente que a intoxicação do peptídeo amilóide humano (Ab 1-42 2,5μM) é significativamente prevenida pela combinação, onde, a essas concentrações, o Baclofeno e o Acamprosato isolados não têm um efeito significativo na intoxicação.

[00170] Reciprocamente, apesar de ativa neste modelo, a associação de Sulfisoxasol e Cinacalcet oferece uma proteção mais fraca (19%, figura 6) contra a Ab 1-42 (figura 3).

[00171] Assim, apesar de ambas as combinações oferecerem proteção contra a Ab 1-42, a combinação de Baclofeno - Acamprosato destaca-se claramente. De fato, estes fármacos em concentrações em que isolados não teriam praticamente nenhum efeito em combinação oferecem uma proteção significativa de células neuronais corticais primárias contra a Ab 1-42. Além disso, a combinação de Baclofeno - Acamprosato é muito mais eficaz que a de Sulfisoxasol - Cinacalcet. Este efeito de Baclofeno e Acamprosato representa uma melhoria notável de 60% em comparação com por exemplo, o efeito da combinação de Sulfisoxasol - Cinacalcet.

[00172] Em conjunto estes resultados mostram um efeito, inesperado, muito positivo da combinação de Baclofeno - Acamprosato em vários modelos in vitro da doença de Alzheimer. O efeito observado é muito superior ao provocado por outras combinações terapêuticas baseadas em Baclofeno (por exemplo, Baclofeno - Terbinafina), ou outras combinações terapêuticas ativas (Sulfisoxasol - Cinecalcet)

[00173] Foi efetuada uma comparação da ação protetora do Acamprosato e da Homotaurina em células corticais (Figura 17). Esses resultados mostram que o derivado do Acamprosato, chamado Homotaurina, oferece uma proteção efetiva contra a Ab 1-42. No contexto desta invenção, o Baclofeno e o Acamprosato podem assim ser substituídos pelos seus derivados, desde que esses derivados sejam eficientes nos ensaios descritos acima.

I.3 Proteção contra a toxicidade da Ab 1-42 em um modelo de crescimento de neurônios e de funcionalidade sináptica

[00174] Neurônios corticais de rato foram cultivados como descrito por Singer et al. (35). Ratos fêmeas brevemente grávidas com 15 dias de gestação foram mortos por deslocação cervical (Ratos Wistar) e os fetos foram removidos do útero. O córtex foi removido e colocado em um meio gelado de Leibovitz (L15) contendo 2% de Penicilina 10.000 U/ml e estreptomicina 10mg/ml e 1% de soro albumina bovina (BSA). Os córtices foram dissociados por tripsina durante 20 min a 37°C (0,05%). A reação foi parada com a adição do meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo DNase1 grau II e 10% de soro fetal de vitelo (FCS). As células foram em seguida dissociadas mecanicamente por 3 passagens em série através de uma pipeta de 10 ml e centrifugadas a 515 x g durante 10 min a +4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet de células foi ressuspenso em um meio de cultura definido composto por Neurobasal complementado com B27 (2%), L-glutamina (0,2mM), 2% de solução PS e 10ng/ml de BDNF. As células viáveis foram contadas em um citómetro de Neubauer usando o teste de exclusão de azul de triptano. As células foram inoculadas a uma densidade de 30 000 células/poço em 96 pratos-poço (poços foram pré-emulsionados com poli-L-lisina (10μg/ml)) e foram cultivadas a +37°C em uma atmosfera de ar umidificado (95%)/CO2 (5%).

[00175] Após 10 dias de cultura, as células são incubadas com fármacos. Após 1 hora, as células são intoxicadas por 2,5 μM de beta-amilóide (1-42; Bachem) em um meio definido sem BDNF mas em conjunto com fármacos. Os neurônios corticais são intoxicados durante 24 horas. O BDNF (10ng/ml) é utilizado como um controle (neuroprotetor) positivo. Três culturas independentes foram realizadas por condição, 6 poços por condição.

Comprimento de axônios e quantificação sináptica

[00176] Após 24 horas de intoxicação, é retirado o sobrenadante e os neurônios corticais são fixos por uma solução fria de etanol (95%) e ácido acético (5%) durante 5 min. Após a permeabilização com 0,1% de saponina, as células são bloqueadas durante 2 h com PBS contendo 1% soro fetal de vitelo. Em seguida, as células são incubadas, com um anticorpo monoclonal contra os microtúbulos da proteína 2 associada (MAP-2; Sigma) ou com os anticorpos anti sinaptofisina (SYN,S5798, Sigma) em conjunto com anti PSD95 (P246, Sigma) para quantificar as sinapses. Estes anticorpos marcam especificamente corpos celulares e axônios de neurônios (MAP2) ou elementos pré e pós sinápticos (SYN e PSD95, respectivamente).

[00177] Estes anticorpos são revelados pela com o Flúor 488 IgG anti-camundongo de cabra (Sonda molecular). Os núcleos dos neurônios foram marcados com um marcador fluorescente (solução de Hoechst, SIGMA).

[00178] Por poço, foram tiradas 10 fotografias com o InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) com uma ampliação de 20x. Todas as fotografias foram tiradas nas mesmas condições. A análise da rede de axônios é feita utilizando o software Developer (GE Healthcare) a fim de avaliar o comprimento total da rede de axônios.

Resultados

[00179] A composição de Baclofeno e Acamprosato induz um efeito protetor significativo contra a toxicidade do peptídeo Aβ1-42 humano (melhoria de 80% da rede de axônios) em células neuronais corticais primárias como mostrado na figura 23. Os resultados mostram claramente que a intoxicação por peptídeo humano agregado (Aβi-42 2,5 μM) é significativamente evitada pela combinação, onde nessas concentrações, o Baclofeno e o Acamprosato, isolados, não têm um efeito significativo na intoxicação.

[00180] Além disso, o comprimento total da rede de axônios tratados com esta combinação já não é significativamente diferente das células de controle. Por isso, esta combinação permite uma proteção efetiva de células corticais neuronais contra a toxicidade do peptídeo Aβi-42 humano mas também um crescimento de axônios comparável com o de uma célula neuronal cortical saudável.

II. TERAPÊUTICAS DE COMBINAÇÃO DE BACLOFENO - ACAMPROSATO PREVINEM A TOXICIDADE DA Aβ25-35 HUMANA IN VIVO Animais

[00181] Os camundongos macho suíços são utilizados durante todo o estudo. Os animais são alojados em jaulas de plástico, com acesso livre a ração e água, exceto durante experiências comportamentais, e mantidos em um ambiente regulado, sob um ciclo de luz/obscuridade (a luz acende às 8:00 a.m.). Experiências são realizadas em uma sala experimental à prova de som e com controle de ar, à qual os camundongos foram habituados pelo menos 30 min antes de cada experiência.

Tratamento combinatório

[00182] O(s) fármaco(s) é/são administrado(s) por gavagem (via oral) . O peptídeo Aβ25-35 e o peptídeo Aβ 25-35 misturado (controle) foram dissolvidos em água bidestilada e esterilizada, e armazenados a -20°C até à utilização. Observação microscópica ligeira indicou que a incubação do peptídeo Aβ 25-35, mas não o peptídeo Aβ25-35 misturado, levou à presença de dois tipos de precipitados insolúveis, estruturas similares a fibrilosas birrefringentes e agregados globulares amorfos. Os peptídeos β amilóide são depois administrados intracerebroventricularmente (i.c.v.). Em resumo, cada camundongo é anestesiado ligeiramente com éter, e uma agulha de aço inoxidável aferida é inserida unilateralmente 1 mm à direita do ponto médio equidistante entre os dois olhos, a uma distância igual entre os olhos e os ouvidos e perpendicular ao plano do crânio. Os peptídeos ou veículo são administrados gradualmente em aproximadamente 3 s. O camundongo exibe um comportamento normal 1 min após a injeção. O local de administração é verificado injetando tinta Nanquim em experiências preliminares. Nem a inserção da agulha, nem a injeção do veículo tiveram uma influência significante na sobrevivência, resposta comportamental ou funções cognitivas.

[00183] Tratamento com fármaco(s)

[00184] No dia -1, isto é 24 h antes da injeção do peptídeo Aβ25-35, fármacos, combinações de fármacos ou a solução veículo são administrados por via oral por gavagem duas vezes ao dia (08:00 e 18:00).

[00185] No dia 0 (10:00), os camundongos são injetados i.c.v. com o peptídeo Aβ25-35 ou o peptídeo Aβ 2535 misturado (controle) em um volume final de 3 μ1 (3 mM).

[00186] Entre o dia 0 e o dia 7, fármacos, composições de fármacos ou a solução veículo são administrados por via oral por gavagem duas vezes ao dia (08:00 e 18:00). Um grupo animal recebe donepezilo (composto de referência - 1 mg/kg/dia) via oral por gavagem em uma única injeção (08:00). Os fármacos são solubilizados em água e preparados pouco antes de cada administração por gavagem.

[00187] No dia 7, todos os animais são testados para a alteração espontânea na performance no teste do labirinto-Y, um índice de memória de trabalho espacial.

[00188] Nos dias 7 e 8, a memória de longo prazo contextual dos animais é avaliada usando o procedimento do tipo comportamento suprimido (step-down) por falta de resposta (passive avoidance).

[00189] No dia 8, os animais são sacrificados. O seu cérebro é dissecado e guardado a -80°C para análise futura.

[00190] As combinações melhoram os desempenhos comportamentais e cognitivos dos animais intoxicados

[00191] Alternância espontânea de desempenhos - Teste do Labirinto Y

[00192] No dia 7, todos os animais são testados para a alteração espontânea do desempenho no teste do labirinto-Y, um índice de memória de trabalho espacial. O labirinto-Y é feito de policloreto de vinila cinzento. Cada braço tem 40 cm de comprimento, 13 cm de altura, 3 cm de largura no fundo e 10 cm de largura no topo, convergindo em um ângulo igual. Cada camundongo é colocado na extremidade de um braço e é livre de percorrer pelo labirinto durante uma sessão de 8 min. A série de entradas em um braço, incluindo possíveis regressos para dentro do mesmo braço, são verificadas visualmente. Uma alternância é definida como entradas em todos os três braços em ocasiões consecutivas. O número total de alternâncias é portanto o número total de entradas menos dois e a percentagem de alternância é calculada como (alternâncias reais/alternâncias máximas) x 100. Os parâmetros incluem a percentagem de alternância (índice de memoria) e o número total de entradas em braços (índice de exploração). Os animais que demonstrem comportamentos extremos (percentagem de alternâncias < 25% ou > 85% ou número de entradas em braços < 10) são eliminados. Normalmente, corresponde a 0-5% dos animais. Este teste serve incidentalmente para analisar a nível comportamental o impacto e o efeito amnésico induzido no camundongo pela injeção da Aβ25-35.

[00193] Teste de falta de resposta (passive avoidance)

[00194] O aparelho é uma caixa com dois compartimentos (15 x 20x 15 cm de altura) sendo uma iluminada com paredes de policloreto de vinila brancas e a outra obscurecida com paredes de policloreto de vinila pretas e um chão de grelha. Uma porta de guilhotina separa cada compartimento. Uma lâmpada de 60 W posicionada 40 cm acima do aparelho ilumina o compartimento branco durante a experiência. Descargas aleatórias (0,3 mA for 3 s) podem ser transmitidas ao chão em grelha usando um gerador de descargas aleatórias (Lafayette Instruments, Lafayette, USA). A porta de guilhotina está inicialmente fechada durante a sessão de treino. Cada camundongo é colocado no compartimento branco. Após 5 s, a porta é aberta. Quando o camundongo entra no compartimento obscurecido e coloca todas as patas no chão em grelha, a porta fecha e a descarga é dada durante 3 s. A latência de passagem, isto é, a latência gasta para entrar no compartimento obscurecido, e o número de vocalizações é registada. O teste de retenção é realizado 24 h depois do treino. Cada camundongo é colocado outra vez no compartimento branco. Após 5 s a porta é aberta, a latência de passagem e a latência de escape, isto é o tempo gasto para voltar para o compartimento branco, são registadas até 300 s.

[00195] São observados resultados positivos nos desempenhos comportamentais e nos ensaios biológicos efetuados 7 dias depois da injeção icv do peptídeo b 25-35.

[00196] A combinação de Baclofeno e Acamprosato induz um efeito protetor significativo nas performances comportamentais e cognitivas de animais intoxicados como mostram as figuras 8,9 e 10.

[00197] Na figura 8, com apenas 53,8% de alternância, os camundongos intoxicados mostram uma memória de trabalho espacial muito debilitada quando comparada com a de controle. Com uma melhoria de mais de 48% da percentagem de alternância, comparada com o controle, a debilidade é significativamente prevenida em camundongos tratados com Baclofeno - Acamprosato.

[00198] Similarmente, as figuras 9 e 10 mostram que os animais intoxicados mostram performances comportamentais e cognitivas debilitadas de acordo com a sua pontuação nos testes de latência de escape e de latência de passagem respectivamente. Em ambos os testes, a combinação de Baclofeno e Acamprosato permite uma correção significativa da debilitação. A latência de escape dos camundongos tratados com esta combinação deixa de ser significativamente diferente dos camundongos de controle (Figura 9) e a latência de passagem (Figura 10) aumenta significativamente com as combinações da invenção, com um aumento mais significativo com as combinações do que com os fármacos isolados.

[00199] O comprometimento da memória é um dos primeiros sinais da doença de Alzheimer e estes resultados mostram claramente que o efeito tóxico do peptídeo amilóide nos desempenhos comportamentais e cognitivos (incluindo a memória) é prevenido significativamente pelas combinações da invenção.

[00200] Além disso, a figura 16 mostra que uma dose extremamente baixa de Baclofeno (480μg/kg/dia), de Acamprosato (32μg/kg/dia) e de Doneprezil (0,25mg/kg/dia) pode ser combinada para oferecer uma proteção completa dos desempenhos comportamentais e cognitivos de camundongos como medido pelo teste do labirinto em Y. Onde o Doneprezil, a esta concentração, não tem um efeito significativo (32% de proteção) na memória de trabalho espacial, o seu uso em conjunto com a combinação de Baclofeno e Acamprosato oferece uma proteção completa (98%) nos desempenhos cognitivos de camundongos intoxicados. As combinações da invenção podem ser ainda combinadas com outras terapias para potenciar a sua ação.

[00201] As combinações melhoram a preocupação neurofisiológica das doenças neurológicas

[00202] As composições terapêuticas são testadas nos modelos in vivo da intoxicação da Aβ. Os seus efeitos em vários parâmetros afetados por distúrbios neurológicos são avaliados: Nível de expressão de Caspases 3 e 9, considerado como um indicador da apoptose, peroxidação lipídica, considerada como um marcador para níveis de stress oxidativo, ensaio de expressão da GFAP, considerado como um marcador para o nível de inflamação do cérebro, Integridade da Barreira hematoencefálica, Integridade sináptica geral (sinaptofisina ELISA), Quantificação de neurônios viáveis no CAI Integridade da Barreira hematoencefálica

[00203] O desenho experimental sobre a intoxicação por Aβ é o mesmo descrito na parte III.

[00204] O efeito protetor potencial das composições terapêuticas na integridade da barreira hematoencefálica (BBB) é analisado em ratos injetados intracerebroventricularmente (i.c.v.) com o peptídeo amil0ide-β25-35 oligómero (Aβ25-35) ou mistura de peptídeo de controle Aβ25- (Sc.Aβ), 7 dias após a injeção.

[00205] No dia 7 após a injeção da Aβ25-35, os animais são testados para determinar a integridade da BBB usando o método EB (Evans Blue). O corante ED é conhecido por se ligar à albumina plasmática após injeção periférica e tem sido usado como um marcador para a albumina plasmática.

[00206] O corante EB (2% em solução salina, 4 ml/kg) é injetado por via intraperitoneal (i.p.) 3 h antes da perfusão transcardíaca. Os ratos são anestesiados via i.p. com 200 μl de pré-mistura de quetamina 80 mg/kg, e xilazina 10 mg/kg, o tórax é aberto. São administrados 250 ml de solução salina por perfusão transcardíaca durante aproximadamente 15 min até que o fluído da aurícula direita se torne incolor. Após a decapitação, o cérebro é removido e separado por dissecação em três regiões: córtex cerebral (esquerdo + direito), hipo campo (esquerdo + direito), diencéfalo. Em seguida, cada região do cérebro é pesada para medição quantitativa da extravasão de albumina EB.

[00207] As amostras são homogeneizadas em uma solução salina tampão de fosfato e misturadas em vórtex após a adição de 60% de ácido tricloroacético para precipitar a proteína. As amostras são arrefecidas a 4°C, e depois centrifugadas durante 30 min a 10.000 g, 4°C. O sobrenadante é medido a 610 nm para absorvência de EB usando um espectro fotómetro.

[00208] O EB é quantificado quer como μg/mg de tecido cerebral utilizando uma curva padrão, obtida por concentrações conhecidas de albumina EB. quer como μg/mg de proteína.

Integridade geral sináptica (sinaptofisina ELISA)

[00209] A Sinaptofisina foi escolhida como marcador da integridade sináptica e é analisada utilizando um kit comercial ELISA (USCN , Ref. E90425Mu). As amostras são preparadas a partir de tecidos do hipocampo e homogeneizadas em um tampão de extração específico, tal como descrito pelo fabricante e pela literatura de referência.

[00210] Os tecidos são lavados em PBS (0,02 mol/l, pH 7,0-7,2) gelado para remover completamente o excesso de sangue e pesados antes do congelamento de nitrogénio e armazenamento a -80°C. Os tecidos são cortados em pedaços pequenos e homogeneizados em 1 ml de solução tampão fosfato-salina (PBS) com um homogeneizador de vidro. A suspensão resultante é sonicada com um disruptor de células ultrassônico ou submetida a dois ciclos de congelação- descongelação para romper ainda mais as membranas celulares. Em seguida, os homogenados são centrifugados durante 5 min a 5.000 g e o sobrenadante é avaliado imediatamente.

[00211] Todas as amostras são testadas em triplicado.

[00212] A quantificação de proteínas é realizada com o kit de avaliação de proteínas BCA (ácido bicinconínico) de Pierce (Pierce, Ref. #23227) para avaliar o rendimento de extração e permitir a normalização.

[00213] As concentrações totais de proteínas são depois calculadas com base na curva padrão de diluições e servem para normalizar os resultados ELISA.

Quantificação de neurônios viáveis no CAI

[00214] No dia 8, cada camundongo é anestesiado com 200 μl i.p, com uma pré-mistura de cetamina 80mg/kg e de xilazina 10 mg/kg perfundidos por via transcardíaca com 100 ml de solução salina seguido de 100 ml de paraformaldeído 4%. Os cérebros são removidos e mantidos em uma solução de fixação de paraformaldeído 4% a 4°C durante 24 h.

[00215] Após a fixação, os cérebros são lavados em uma solução salina tampão de fosfato, depois os cerebelos são removidos e os prosencéfalos são colocados em uma plataforma vibratória (Leica VT100OS, Leica, Wetzlar, Alemanha) para corte.

[00216] Os cérebros são cortados em cortes coronais (20 μm de espessura) utilizando uma plataforma vibratória (Leica VT100OS, Leica, Wetzlar, Alemanha). Os cortes seriados são colocados em um prato com 24 poços com PBS. São então selecionados para incluírem uma formação hipocampal e 9 secções são colocadas em tiras de vidro revestidas de gelatina (um slide por animal para o violeta cresil). Todos os slides são armazenados à temperatura ambiente até à coloração do violeta cresil.

[00217] As secções são marcadas com um reagente de violeta cresil 0,2% (Sigma-Aldrich), depois desidratadas com etanol, tratado com tolueno e são montadas com um meio de Montex (BDH Laboratory Supplies, Poole, Dorset, UK).

[00218] Após a montagem, os slides são mantidos em RT durante 24 h a secar. A examinação da área CA 1 é efetuada utilizando um microscópio leve (Dialux 22, Leitz) e os cortes digitalizados por uma câmara CCD (Sony XC-77CE, Sony, Paris, França) com o software NIHImage® v1,63 (NIH). As medidas CA 1 e a contagem piramidal de células são processados utilizado o ImageJ® (NIH). Os resultados são expressos pela média de nove cortes das células piramidais de CA 1 por milímetro de cada grupo (contagem de CAI do hipocampo esquerdo e direito)(49).

Ensaio de stress oxidativo

[00219] Os ratos são sacrificados por decapitação e os dois hipocampos são removidos rapidamente, pesados e armazenados em nitrogénio líquido até serem avaliados. Após o descongelamento, os hipocampos são homogeneizados em metanol frio (1/10 w/v), centrifugados a 1.000 g durante 5 min e o sobrenadante é colocado em um tubo de eppendorf. Os volumes de reação de cada homogenato são adicionados a FeSO4 1 mM, H2SO4 0,25 M, e xilenol laranja 1 mM e incubados durante 30 min à temperatura ambiente. Depois de ler a absorvância a 580 nm (A580 1), 10 μl de hidroperóxido de cumeno 1 mM (CHP) é adicionada à amostra e incubado durante 30 min à temperatura ambiente, para determinar o nível máximo de oxidação. A absorvância é medida a 580 nm (A580 2). O nível de peroxidação lipídica é determinado como equivalentes de CHP (CHPE) de acordo com: CHPE = A580 1/A580 2 x [CHP] e expresso como equivalentes de CHP por peso do tecido e como uma percentagem dos dados do grupo de controle.

Ensaio da via de indução das caspases e ensaio de expressão da GFAP

[00220] Os ratos são sacrificados por decapitação e os dois hipocampos são removidos rapidamente, lavados em PBS (0,02 mol/l, pH 7,0-7,2) gelado para remover completamente o excesso de sangue, pesados e armazenados em nitrogénio líquido até serem avaliados. Os tecidos são cortados em pedaços pequenos e homogeneizados em um 1ml de PBS gelado com um homogeneizador de vidro. A suspensão resultante é sonicada com um disruptor de células ultrassônico ou submetido a dois ciclos de congelação- descongelação para romper ainda mais as membranas celulares. Em seguida, os homogenados são centrifugados durante 5 min a 5.000 g e o sobrenadante é avaliado imediatamente.

[00221] As experiências são realizadas com os ensaios comerciais: Caspase-3 (USCN - E90626Mu), Caspase-9 (USCN - E90627Mu), GFAP (USCN - E90068).

[00222] A quantificação de proteínas é realizada com o kit de avaliação de proteínas BCA (ácido bicinconínico) de Pierce (Pierce, Ref. #23227) para avaliar o rendimento de extração e permitir a normalização.

[00223] As composições de Baclofeno e Acamprosato induzem um efeito protetor significativo em funções neurofisológicas de animais intoxicados como demonstrado nas figuras 11, 12, 13 e 14.

[00224] Com uma proteção de mais 60% comparada com os animais intoxicados não tratados, a combinação é eficaz na proteção de neurônios (Figura 11) e densidade sináptica (Figura 13).

[00225] Similarmente, a figura 12 mostra que a combinação de Baclofeno e Acamprosato protege a integridade da BBB (76%) comparada com os animais intoxicados não tratados.

[00226] Finalmente, a terapia de combinação é eficiente na redução do stress oxidativo geral induzido pela Ab no cérebro dos animais tratados comparada com os animais intoxicados não tratados (figura 14).

[00227] Como demonstrado na parte A dos exemplos, várias funções neurológicas debilitadas por numerosos distúrbios neuronais, incluindo distúrbios neurodegenerativos como a doença de Alzheimer e distúrbios relacionados foram protegidas e os sintomas atrasados ou reduzidos pela combinação de Baclofeno - Acamprosato.

PREVENÇÃO DA TOXICIDADE DO GLUTAMATO EM CÉLULAS NEURONAIS

[00228] Nesta nova série de experiências, os compostos candidatos foram testados quanto à sua capacidade de prevenir ou reduzir os efeitos da toxicidade do glutamato em células neuronais. A toxicidade do glutamato está envolvida na patogénese de doenças ou distúrbios neurológicos como a esclerose múltipla, a doença de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica, a doença de Parkinson, a doença de Huntington, neuropatias, alcoolismo ou síndrome de abstinência de álcool e lesões da medula espinhal. Os fármacos são primeiro testados individualmente, seguidos por testes da sua ação quando associados.

Métodos

[00229] A eficácia das composições de fármacos da invenção é avaliada nas células neuronais corticais primárias. O protocolo utilizado nestes ensaios é o descrito na secção A.I.2 acima.

Ensaios de toxicidade do glutamato

[00230] O efeito neuroprotetor dos compostos é avaliado por quantificação da rede de axônios (imunomarcação de neurofilamentos (NF)) que revela especificamente os neurônios glutamatérgicos.

[00231] Após 12 dias de cultura de neurônios, os fármacos das composições candidatas são solvidos no meio de cultura (+0,1% DMSO). As composições candidatas são então pré-incubadas com neurônios durante l hora antes da lesão de Glutamato. Uma hora após a incubação é adicionado Glutamato durante 20 min, para uma concentração final de 40μM, na presença de composições candidatas, de forma a evitar diluições adicionais de fármacos. No fim da incubação, o meio é mudado para um meio com composições candidatas mas sem glutamato. A cultura é fixa 24 horas depois da lesão de glutamato. O MK801 (maleato de Dizocilpina hidrogénio, 77086-22-7 - 20μM) é utilizado como controle positivo.

[00232] Após permeabilização com saponina (Sigma), as células são bloqueadas durante 2 h com PBS contendo 10% de soro de cabra, depois as células são incubadas com anticorpos monoclonais primários de camundongos versus anticorpos de neurofilamentos (NF, Sigma). Este anticorpo é revelado com Flúor de Alexa 488 cabra anti lgG de camundongo.

[00233] Os núcleos das células são marcados com um marcador fluorescente (solução de Hoechst, SIGMA), e a rede de axônios é quantificada. Seis poços por condição são utilizados para avaliar a sobrevivência neuronal em 3 culturas diferentes.

Resultados

[00234] A combinação de Baclofeno - Acamprosato proporciona um efeito protetor contra a toxicidade do glutamato para as células neuronais corticais. Como exemplificado na figura 15, as composições da invenção protegem fortemente os neurônios da toxicidade do glutamato sob as condições experimentais descritas acima. É digno de nota que uma proteção efetiva é observada utilizando concentrações de fármacos nas quais os fármacos isolados têm um efeito protetor mais reduzido. A combinação de baclofeno - Acamprosato induz uma melhoria de mais de 200% comparada com o Acamprosato isolado e de mais de 47% comparada com o Baclofeno isolado.

MELHORIA DE OUTROS DISTÚRBIOS RELACIONADOS COM EXCITOXICIDADE DO GLUTAMATO UTILIZANDO COMPOSIÇÕES DA INVENÇÃO

[00235] Os efeitos protetores contra a toxicidade do glutamato in vitro mencionados acima e as composições de fármacos da invenção combinadas com os efeitos protetores aqui exemplificados em diversos modelos da DA, levaram os investigadores a testar esses fármacos e composições em alguns modelos de outros distúrbios nos quais a toxicidade do glutamato também está envolvida na sua patogénese, como a MS, a ALS e a dor neuropática.

EFEITO PROTETOR DE COMPOSIÇÕES EM MODELOS IN VIVO DE Esclerose Múltipla.

[00236] Um modelo em que um camundongo imunizado com glicoproteína da mielina do oligodendrócito (MOG- imunizada) desenvolve progressivamente EAE crônica é utilizado para demonstrar o efeito benéfico de composições da invenção no tratamento da Esclerose Múltipla.

Animais e produtos químicos

[00237] Os camundongos fêmea C57L/6J (8 semanas de idade) são comprados em Janvier (França); após duas semanas de habituação, os camundongos fêmea (10 semanas de idade) desenvolvem paralisia crônica após imunização com o peptídeo da MOG (glicoproteína da mielina do oligodendrócito). A encefalomielite experimental é induzida com o kit de Hooke, a emulsão de MOG35-55/CFA PTX (toxina de Pertussis) para a indução de EAE (EK-0110, EK-0115; laboratórios Hooke). O kit de controle é o CK-0115 (Laboratórios Hooke).

Procedimento experimental

[00238] A encefalomielite experimental é induzida seguindo o seguinte procedimento:

[00239] O dia 0, duas injeções subcutâneas de 0,1 ml cada; uma na parte superior das costas do camundongo e uma na parte inferior. Cada injeção contém 100μg do peptídeo de MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) , 200μg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra inativada e é emulsificada em adjuvante completo de Freund (CFA) (Laboratórios Hooke). A emulsão oferece o antigénio necessário para expandir e diferenciar as células T auto-imunes específicas MOG.

[00240] Duas injeções intraperitoneais de 500 ng de toxina de Pertussis em PBS (Hooke kit) são administradas 2 horas (Dia 0) e 24 horas (Dia 1) depois da injeção de MOG. A toxina de Pertussis melhora o desenvolvimento de EAE fornecendo adjuvantes adicionais.

[00241] Os camundongos desenvolvem EAE 8 dias após a imunização e ficam cronicamente paralisados durante a experiência. Após a imunização, os camundongos são observados diariamente para sintomas clínicos em um procedimento em ocultação. Os animais são mantidos em instalações convencionais isentos de organismos patogénicos e todas as experiências são realizadas de acordo com as diretrizes estabelecidas e aprovadas pela Comissão Local de Bioética.

[00242] Grupos experimentais e tratamento com fármacos:

[00243] Os grupos de camundongos fêmea como descrito são homogeneizados por peso antes da imunização: Grupo de controle: injeção do veículo nas mesmas condições que os camundongos com EAE (desde o Dia -1 ao Dia 28, placebo é administrado diariamente) Grupo com EAE: injeção com MOG (dia 0) + injeções de toxina de Pertussis (Dia 0 e 1) - desde o Dia -1 ao Dia 28, placebo é administrado por via oral diariamente EAE + controle positivo: injeção com MOG (dia 0) + injeções de toxina de Pertussis (Dia 0 e 1) - desde o Dia -1 ao Dia 28, dexametazona é administrada por via oral diariamente. EAE + grupo de tratamento: injeção com MOG (dia 0) + injeções de toxina de Pertussis (Dia 0 e 1). O tratamento começa um Dia antes da imunização e dura até ao Dia 28.

[00244] As pontuações clínicas são medidas nos dias 0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28.

[00245] Software de estatística (Statsoft Inc.) é utilizado em toda a análise estatística. A análise ANOVA e o teste t de Student são empregues para analisar a pontuação da patologia clínica. P < 0,05 é considerado significativo.

[00246] Atrasos na ocorrência da doença, pontuação clínica e retardamento da morte, foram comparadas entre cada grupo e o grupo de ‘immu" com curvas de Kaplan- Meier e um modelo de Cox (pacote ‘sobrevivência’ R). Os valores p resultantes são unilaterais e testam a hipótese de serem melhores que o grupo de referência ‘immu’.

[00247] A pontuação clínica total é composta pela pontuação da cauda, a pontuação dos membros anteriores, a pontuação dos membros posteriores e a pontuação da bexiga como descrito abaixo: Pontuação da cauda:

Pontuação dos membros anteriores:

Pontuação dos membros superiores:

Pontuação da bexiga:

[00248] A pontuação global para cada animal é determinada pela soma de todas as categorias acima mencionadas. O resultado máximo para um animal vivo é de 10.

Resultados - Composições terapêuticas são eficientes em um modelo de MS

[00249] Uma melhoria significativa na pontuação clínica global é observada nos camundongos do “EAE+ grupo de tratamento” para a combinação de Baclofeno - Acamprosato.

[00250] A combinação de Baclofeno (30 mg/kg/dia) e de Acamprosato(2 mg/kg/dia) induziu um efeito protetor significativo contra o desenvolvimento de EAE crônica progressiva e assim confirmou o efeito benéfico da composição no tratamento da esclerose múltipla (Figura 18). Com uma redução dos sintomas de mais de 30%, os resultados mostram claramente que a combinação induz uma redução significativa do desenvolvimento da doença desde o dia 13. Este resultado confirma o efeito positivo notável da combinação de Baclofeno - Acamprosato na proteção neuronal incluindo na desmielinização e nas suas implicações. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a combinação permite uma proteção eficaz dos neurônios contra muito do stress envolvido no desenvolvimento de doenças neurológicas como a amilóide b, colapso da BBB, excitotoxicidade do glutamato ou desmielinização.

II. EFEITO PROTETOR DE COMPOSIÇÕES EM MODELOS DE ALS.

[00251] O efeito das composições terapêuticas de acordo com a presente invenção na ALS foram demonstrados in vitro, em um modelo de co-cultura, e in vivo, em um camundongo modelo de ALS. Os protocolos e resultados são apresentados nesta secção.

II.1 Efeito protetor contra a toxicidade do glutamato em culturas primárias de co-culturas nervo- musculares Co-culturas primárias de células nervosas e musculares

[00252] O músculo humano é preparado de acordo com o método previamente descrito a partir de porções da biopsia de doentes saudáveis (48). As células musculares são estabelecidas a partir de células dissociadas (10000 células por poço), semeadas em um revestimento de gelatina 0,1% em 48 placas de poços e crescem em um meio proliferante que consiste na mistura de um meio MEM e um meio M199.

[00253] Imediatamente após a fusão das células satélite, fatias transversais inteiras de medulas espinhais com gânglios da raiz dorsal (DRG) ligados de embriões de rato Wistar com 13 dias de idade são colocadas em monocamada do músculo 1 explanante por poço (na área central). Os DRG são necessários para alcançar um bom rácio de inervações. As culturas inervadas são mantidas na mistura de meios. Após 24h na co-cultura habitual são observados axônios a crescer para fora dos explantes da medula espinhal. Estas fazem contato com miotubos e induzem as primeiras contracções após 8 dias. A partir daí rapidamente, as fibras musculares inervadas localizadas na proximidade dos explantes da medula espinhal, estão praticamente a contrair continuamente. As fibras inervadas são morfologicamente e espacialmente distintas das não inervadas e podem ser facilmente distinguidas delas.

[00254] É realizada uma co-cultura (6 poços por condição).

Lesão de glutamato

[00255] No dia 27, as co-culturas são incubadas com os compostos candidatos ou Riluzol uma hora antes da intoxicação do glutamato (60 μM) durante 20 min. Em seguida, as co-culturas são lavadas e os compostos candidatos ou Riluzol são adicionados durante 48h adicionais. Após este tempo de incubação, as co-culturas não fixas são incubadas com α bungarotoxina juntamente com Alexa 488 a concentração de 500 nmol/L durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, as co-culturas são fixas com PFA durante 20 min à temperatura ambiente. Após a permeabilização com 0,1% de saponina, co-culturas são incubadas com um anticorpo anti- neurofilamento (NF).

[00256] Estes anticorpos são detetados com o Flúor Alexa 568 de cabra IgG anti camundongo (sonda molecular). Os núcleos dos neurônios são marcados com um marcador fluorescente (solução de Hoechst).

[00257] Os parâmetros são (1) Comprimento de axônios total, (2) Numero de unidades motoras, (3) Área total da unidade motora, que são indicativos da sobrevivência e funcionalidade dos neurônios motores.

[00258] Por cada condição, foram tiradas 2 x 10 fotografias por poço usando o InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) com uma ampliação de 20x. Todas as fotografias são tiradas nas mesmas condições.

Resultados

[00259] A combinação de Baclofeno e de Acamprosato protege efetivamente os neurônios motores e unidades motoras no modelo da co-cultura.

II.2 - Composições terapêuticas são eficientes no modelo de camundongo ALS

[00260] As experiências são realizadas em camundongos macho. Camundongos macho transgénicos B6SJL- Tg(SOD1)2Gur/J e o seu controle (respectivamente SN2726 e SN2297 de Jackson Laboratories, Ben Harbor, USA e distribuídos por Charles River em França) são escolhidos neste conjunto de experiências para simular a ALS.

[00261] Os camundongos mortos expressam o transgene SOD1-G93A, desenhado com o gene humano mutante SOD1 (uma única substituição de um aminoácido de glicina por alanina no codão 93) movido pelo seu promotor endógeno humano SOD1. Os camundongos de controle expressam o gene humano SOD1.

Aleatoriedade dos animais:

[00262] A atribuição e a aleatoriedade dos grupos de animais é baseada no peso; para cada grupo, a aleatorização é feita um dia antes do primeiro tratamento.

[00263] Administração do fármaco

[00264] É administrado aos camundongos o tratamento farmacológico candidato diluído em um veículo desde o 60° dia após o nascimento até à morte. Soluções diluídas dos fármacos candidatos são preparadas com água à temperatura ambiente imediatamente antes do início da administração.

• Em água potável:

[00265] Riluzol é adicionado a água potável a uma concentração final de 6mg/ml (ajustada à média de peso de cada grupo) em 5% ciclodextrina. Como um camundongo bebe cerca de 5 ml/dia, a dose administradas estimada é de 30mg/kg/dia, uma dose que mostrou aumentar a sobrevivência dos camundongos. - A Ciclodextrina é utilizada como veículo em uma concentração final de 5 %, diluída em água à temperatura ambiente da solução de reserva (ciclodextrina 20%). • Administração oral (via oral) : - Composições de fármacos são administradas por via oral, diariamente. - A Ciclodextrina é utilizada como veículo em uma concentração final de 5 %, diluída em água à temperatura ambiente da solução de reserva (ciclodextrina 20%).

Observação clínica

[00266] A observação química de cada camundongo é efetuada diariamente, desde o primeiro dia de tratamento (60 dias de idade) até à morte (ou sacrifício). A observação clínica consiste em estudar testes comportamentais: início da paralisia, perda de capacidade de distensão “splay”, “perda do reflexo de endireitamento”, e observação geral da marcha: - início da paralisia: A observação consiste na observação da paralisia para cada membro. Início da paralisia corresponde ao dia dos primeiros sinais de paralisia. - O teste da perda de capacidade de distensão “splay” consiste na notificação de tremores ou agitação e a posição do membro posterior (pendente ou distendido para o exterior) quando o camundongo é suspenso pela cauda. - O teste da perda do reflexo de endireitamento avalia a capacidade do camundongo se endireitar no prazo de 30 seg depois de ter sido virado para qualquer dos lados. O reflexo de endireitamento considera-se perdido quando o camundongo não é capaz de se endireitar. A perda do reflexo de endireitamento determina a fase terminal da doença: o camundongo que não consegue endireitar-se é submetido à eutanásia.

Resultados - As composições terapêuticas são eficientes em modelos in vivo de ALS l

[00267] É observada uma melhoria da doença nos animais doentes tratados com a combinação de Baclofeno e de Acamprosato.

III) EFEITO PROTETOR DAS COMPOSIÇÕES EM NEUROPATIAS INDUZIDAS PELA OXALIPLATINA COMO MODELO IN VIVO PARA A DOR NEUROPÁTICA.

[00268] As composições terapêuticas da presente invenção são testadas in vivo, em modelos adequados de neuropatia periférica, isto é, um modelo agudo de neuropatia induzida pela oxiplatina e um modelo crônico de neuropatia induzida pela oxiplatina. Os animais, protocolos e resultados estão apresentados nesta secção.

Criação dos Animais

[00269] São utilizados ratos Sprague-Dawley (CERJ, França), com peso entre 150 - 175 g no início da experiência do tratamento com Oxaliplatina (D0). Os animais são alojados em uma instalação para animais de acesso limitado em uma sala com temperatura (19,5°C - 24,5°C) e humidade relativa (45 % - 65 %) controladas com um ciclo de luz/obscuridade de 12 h, com acesso à vontade a uma ração de laboratório padrão peletizada e água durante todo o estudo. São alojados 4 ou 5 animais por gaiola e um período de habituação é observado antes de qualquer teste.

Desenho experimental

[00270] Os quatro grupos seguintes de ratos foram utilizados em todas as experiências:

Grupos de controle:

[00271] Grupo 1: Veículo de Oxaliplatina (Água destilada), i.p. / Veículo de composição(ões) candidata(s) (Água destilada), via oral diariamente.

[00272] Grupo 2: Oxaliplatina (Água destilada), i.p. / Veículo de composição(ões) candidata(s) (Água destilada), via oral diariamente.

[00273] Grupo 3: Oxaliplatina 3 mg/kg i.p. / fármaco isolado em Água destilada, via oral 9x ao dia.

[00274] Grupos de composições testadas:

[00275] Grupo 4: Oxaliplatina 3 mg/kg i.p. / composição(ões) candidata(s) em Água destilada, via oral 9x ao dia.

[00276] Grupo 5: Oxaliplatina 3 mg/kg i.p. / Gabapentina (100 mg/kg) em Água destilada, por via oral nos dias de teste (isto é D1 & D8);

[00277] Os veículos e os fármacos em teste são administrados diariamente desde o D-1 ao D7 (o dia antes do último dia de testes) enquanto que Gabapentina é administrada nos dias de teste (120 minutos antes do teste).

[00278] Todos os tratamentos são administrados de uma forma codificada e aleatória quando possível. As doses são expressas em termos de substância ativa livre.

Indução da neuropatia

[00279] A neuropatia aguda é induzida por uma única injeção intraperitoneal de oxaliplatina (3 mg/kg).

[00280] A neuropatia periférica crônica é induzida por injeções intraperitoneais repetidas de oxaliplatina (3 mg/kg, i.p.) nos dias 0, 2, 4 e 7 (CD= 12 mg/kg, i.p.). A neuropatia crônica em humanos é cumulativa também e mais comummente observadas em doentes que tenham recebido um total de doses de oxaliplatina > ou =540 mg/m2 que corresponde a ~15 mg/kg como doses cumulativas em ratos (Cersosimo R.J. 2005).

[00281] A neuropatia dolorosa induzida pela oxiplatina em ratos reproduz os sintomas de dor em doentes tratados com oxaliplatina: - A hiperalgesia térmica é o primeiro sintoma. Pode ser medida com o teste de imersão da cauda; - A hiperalgesia mecânica aparece mais tarde. Pode ser quantificada com o teste de Von Frey ou o teste de pressão da pata.

Dosagem e testes no animal

[00282] Todas as composições de fármacos são administradas desde o dia antes da primeira injeção intraperitoneal de oxaliplatina 3 mg/kg (D-1) e administrados diariamente por via oral até ao D7. Durante os dias de teste (isto é D1 e D7), as composições de fármacos são administradas após o teste. Os animais do grupo tratado de referência (gabapentina) recebem a dosagem apenas nos dias de teste.

Teste de acetona

[00283] A alodínia ao frio é avaliada utilizando o teste de acetona medindo as respostas a estímulos não nociceptivos térmicos no D1 (por volta de 24h depois da primeira injeção de oxaliplatina 3 mg/kg (efeito agudo de oxaliplatina), e no D8 (efeito crônico da oxaliplatina).

[00284] No teste de acetona, a latência da retirada da pata posterior é medida após a aplicação de uma gota de acetona à planta de ambas as patas posteriores (tempo de reação) e a intensidade da resposta é pontuada (resultado frio). O tempo de reação para o efeito de arrefecimento é medido no período de 20 sec (terminar) após a aplicação da acetona. As reações à acetona são também avaliadas na seguinte escala de 4 pontos: 0 (sem reação); 1 (retirada rápida, sacudir de pata leve); 2 (retirada prolongada ou um marcado sacudir de pata); 3 (sacudidelas repetidas da pata com lambidelas ou mordidelas).

[00285] Para cada grupo experimental. Os resultados estão expressos como: - O tempo de reação definido como o tempo expresso em segundos necessário para provocar a reação da pata (média de 6 medidas para cada rato juntas ± SEM). - A pontuação cumulativa do frio definida como a soma de 6 resultados para cada rato juntos ± SEM. A pontuação mínima é 0 (sem resposta a nenhum dos 6 ensaios) e a pontuação máxima é 18 (sacudidelas repetidas e lambidelas ou mordidelas das patas em cada um dos seis ensaios).

Análises estatísticas

[00286] É realizado um teste de Student, unilateral. O nível de relevância é definido como p< 0,05; todos os grupos são comparados com o grupo doença+veículo (grupo tratado com oxaliplatina). As médias e desvios padrão das médias são mostrados nas figuras.

Resultados

[00287] A oxaliplatina induziu um decréscimo significativo no tempo de reação de retirada da pata após a aplicação da acetona (grupo doença+veículo) durante o curso de tempo. Este decréscimo é progressivo e significante desde o dia 1 (modelo de neuropatia aguda induzida por oxaliplatina) ao dia 8 (modelo crônico) quando comparado com o grupo veículo.

• Efeito de anti-alodinia em um modelo de neuropatia aguda e crônica induzida por oxaliplatina

[00288] A combinação de Baclofeno e Acamprosato é testada nos dois modelos de neuropatia induzida por oxiplatina. Esta induz uma diminuição significativa no resultado cumulativo do frio e um aumento significativo no tempo de reação quando comparado com o grupo tratado com veículo de oxaliplatina. Em conclusão, esta composição de fármacos protege os animais de neuropatias agudas e crônicas induzidas por oxaliplatina. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Crook R.et al. (1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4(4): 452-5. 2. Houlden H., Baker M., et al. (2000). Variant Alzheimer's disease with spastic paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to excetionally high amyloid-beta concentrations. Ann Neurol. 48(5): 806-8. 3. Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997). Two novel presenilin-1 mutations in early-onset Alzheimer's disease pedigrees and preliminary evidence for association of presenilin-1 mutations with a novel phenotype. Neuroreport. 8(6): 1537-42. 4. Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92. 5. Citron M. (2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5(9): 677-85. 6. Suh Y.H. e Checler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525. 7. Blacker D., Albert M.S., et al. (1994). Reliability and validity of NINCDS-ADRDA criteria for Alzheimer's disease. The National Institute of Mental Health Genetics Initiative. Arch Neurol. 51(12): 1198-204. 8. Rossor M.N., Fox N.C., et al. (1996). Clinical features of sporadic and familial Alzheimer's disease. Neurodegeneration. 5(4): 393-7. 9. Glenner G.G., Wong C.W., et al. (1984). The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol. 2(6): 357-69. 10. Ballatore C., Lee V.M., et al. (2007). Tau- mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8(9): 663-72. 11. Bell K.F. e Claudio Cuello A. (2006). Altered synaptic function in Alzheimer's disease. Eur J Pharmacol. 545(1): 11-21. 12. Hardy J.A. e Higgins G.A. (1992). Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256(5054): 184-5. 13. Braak H. e Braak E. (1991). Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82(4): 239-59. 14. Golde T.E. (2005). The Abeta hypothesis: leading us to rationally-designed therapeutic strategies for the treatment or prevention of Alzheimer disease. Brain Pathol. 15(1): 84-7. 15. Hardy J. e Selkoe D.J. (2002). The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297(5580): 353-6. 16. Selkoe D.J. (2000). The genetics and molecular pathology of Alzheimer's disease: roles of amyloid and the presenilins. Neurol Clin. 18(4): 903-22. 17. Zlokovic B. V., The Blood Brain Barrier In Health And Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron review. 2008, 57, 178-201. 18. Budd Haeberlein, S.L. e S.A. Lipton, Excitotoxicity in neurodegenerative disease, in Encyclopedia of neuroscience, L.R. Squire, Editor. 2009, Elsevier. p. 7786. 19. Hughes, J.R., Alcohol withdrawal seizures. Epilepsy Behav, 2009. 15(2): p. 92-7. 20. Kim, A.H., G.A. Kerchner, and C. DW, Blocking Excitotoxicity, in CNS Neuroprotetion, F.W. Marcoux and D.W. Choi, Editors. 2002, Springer: New York. p. 3-36. 21. Hama A, Sagen J., Antinociceptive effect of riluzole in rats with neuropathic spinal cord injury pain. J Neurotrauma. 2011 Jan;28(1):127-34. 22. Malgouris, C., et al., Riluzole, a novel antiglutamate, prevents memory loss and hippocampal neuronal damage in ischemic gerbils. J Neurosci, 1989. 9(11): p. 37207. 23. Wahl, F., et al., Effect of riluzole on focal cerebral ischemia in rats. Eur J Pharmacol, 1993. 230(2): p. 209-14. 24. Wahl, F., et al., Riluzole reduces brain lesions and improves neurological function in rats after a traumatic brain injury. Brain Res, 1997. 756(1-2): p. 247-55. 25. McGleenon B.M., Dynan K.B. e Passmore A.P. (1999). Acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer’s disease. Br J Clin Pharmacol. 48(4): 471-480. 26. Parsons C.G., Danysz W, Quack G. (1999). Memantine is a clinically well tolerated N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist--a review of preclinical data. Neuropharmacology. 38(6):735-67. 27. Magnaghi V, et al. GABA receptor-mediated effects in the peripheral nervous system: a cross-interaction with neuroative steroids. Journal of Molecular Neuroscience. 2006, 28:89-102. 28. Ettmayer, P., Amidon, G. L., Clement, B. & Testa, B. Lessons learned from marketed and investigational prodrugs. J. Med. Chem. 47, 2393-2404 (2004). 29. Beaumont, K., Webster, R., Gardner, I. & Dack, K. Design of ester prodrugs to enhance oral absorption of poorly permeable compounds: challenges to the discovery scientist. Curr. Drug Metab. 4, 461-485 (2003). 30. Heimbach, T. et al. Enzyme-mediated precipitation of parent drugs from their phosphate prodrugs. Int. J. Pharm. 261, 81-92 (2003) . 31. Yang, C. Y., Dantzig, A. H. & Pidgeon, C. Intestinal peptide transport systems and oral drug availability. Pharm. Res. 16, 1331-1343 (1999). 32. Steffansen, B. et al. Intestinal solute carriers: an overview of trends and strategies for improving oral drug absorption. Eur. J. Pharm. Sci. 21, 3-16 (2004). 33. Stella, V. et al. Prodrugs: Challenges and Rewards (AAPS, New York, 2007). 34. Wermuth, CG. The Practice of Medicinal Chemistry. (Hardbound, 2003). Part VI, Chap 33: Designing prodrugs and bioprecursors. 35. Pezron, I. et al. Prodrug strategies in nasal drug delivery. Expert Opin. Ther. Pat., Vol. 12, No. 3 , 331340 (2002). 36. Stella, V. J. Prodrugs as therapeutics. Expert Opin. Ther. Pat. 14, 277-280 (2004). 37. Stella, V. J. & Nti-Addae, K. W. Prodrug strategies to overcome poor water solubility. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 677-694 (2007). 38. Higuchi, T.; Stella, V. eds. Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems. ACS Symposium Series. American Chemical Society: Washington, DC (1975). 31. 39. Roche, E. B. Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs. American Pharmaceutical Association: Washington, DC (1977). 40. Lal, R., et al., Arbaclofen placarbil, a novel R-baclofen prodrug: improved absorption, distribution, metabolism, and elimination properties compared with R- baclofen. J Pharmacol Exp Ther, 2009. 330(3): p. 911-21. 41. Feng Xu, Ge Peng, Thu Phan, Usha Dilip, Jian Lu Chen, Tania Chernov-Rogan, Xuexiang Zhang, Kent Grindstaff, Thamil Annamalai, Kerry Koller, Mark A. Gallop, David J. Wustrow, Discovery of a novel potent GABAB receptor agonist; Bioorg Med Chem Lett. 2011 Nov 1;21(21):6582-5.) 42. Andrew R. Leach,Valerie J. Gillet. An Introduction to Chemoinformatics. Springer 2007. 43. S. Asad Rahman, M. Bashton, G. L. Holliday, R. Schrader and J. M. Thornton: Small Molecule Subgraph Detector (SMSD) Toolkit, Journal of Cheminformatics 2009, 1:12 doi:10,1186/1758-2946-1-12 44. Stahl H., Wermuth C. G. (Eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use. Wiley- VCH; 2 edition (March 29, 2011). 45. Wishart DS, Knox C, Guo AC, Cheng D, Shrivastava S, Tzur D, Gautam B, Hassanali M. DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets. Nucleic Acids Res. 36, Issuesuppl 1. D901-D906 (2008). 46. Singer C. et al. Mitogen-ativated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotetion after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J. Neuroscience, 1999, 19(7):2455-2463. 47. Braun S, Croizatb B, Lagrangec MC, Wartera JM, Poindron P. Neurotrophins increase motoneurons' ability to innervate skeletal muscle fibers in rat spinal cord-human muscle cocultures.Volume 136, Issues 1-2, March 1996, Pages 17-23. 48. Meunier J, Ieni J, Maurice T. The anti-amnesic and neuroprotetive effects of donepezil against amyloid ~25- 35 peptide-induced toxicity in mice involve an interaction with the G, receptor. Br J Pham1acoI. 149, 998-1012,2006

Claims

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender Baclofeno e Acamprosato ou sais farmacologicamente aceitáveis dos mesmos.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente, pelo menos, um composto selecionado a partir de Sulfisoxazol, Metimazol, Prilocaína, Difilina, Quinacrina, Carbenoxolona, ácido Aminocapróico, Cabergolina, Dietilcarbamazina, Cinacalcet, Cinarizina, Eplerenona, Fenoldopam, Leflunomida, Levosimendan, Sulodexida, Terbinafina, Zonisamida, Etomidato, Fenformina, Trimetazidina, Mexiletina, Ifenprodil, Moxifloxacina, Bromocriptina ou Torasemida, ou sais farmacologicamente aceitáveis dos mesmos.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pela referida composição compreender, pelo menos, uma das seguintes combinações de compostos: Baclofeno e Acamprosato, Baclofeno e Acamprosato e Dietilcarbamazina, Baclofeno e Acamprosato e Cinacalcet, Baclofeno e Acamprosato e Sulfisoxasol, Baclofeno e Acamprosato e Torasemida, Baclofeno e Acamprosato e Ifenprodil, Baclofeno e Acamprosato e Mexiletina, Baclofeno e Acamprosato e Eplerenona, Baclofeno e Acamprosato e Levosimendan, Baclofeno e Acamprosato e Terbinafina ou Baclofeno e Acamprosato e Leflunomida, ou sais farmacologicamente aceitáveis dos mesmos.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida composição compreender, pelo menos, uma das seguintes combinações de compostos: Baclofeno e Acamprosato e Donepezil, Baclofeno e Acamprosato e Rivastigmina, Baclofeno e Acamprosato e Memantina, Baclofeno e Acamprosato e Gabapentina, ou sais farmacologicamente aceitáveis dos mesmos.

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender Baclofeno e o Acamprosato como o único agente ativo.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender, adicionalmente, um veículo ou um excipiente farmacologicamente aceitável.

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser para uso no tratamento de um distúrbio neurológico, em que o distúrbio neurológico é selecionado a partir de doenças degenerativas, neuropatias, abuso de substâncias ou lesão da medula espinhal.

8. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo distúrbio neurológico ser selecionado a partir da doença de Alzheimer, doenças relacionadas com a doença de Alzheimer, Esclerose Múltipla, Esclerose Lateral Amiotrófica, doença de Parkinson, doença de Huntington.

9. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela doença relacionada com a doença de Alzheimer ser selecionada a partir da demência senil do tipo da DA (SDAT), demência de corpos de Lewis, demência vascular, comprometimento cognitivo ligeiro (MCI) e perda de memória associada à idade (AAMI).

10. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelos compostos serem formulados para ser administrados juntos, separados ou sequencialmente.

11. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição ser adequada para administração oral.

12. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela referida composição ser administrada repetidamente ao indivíduo.

13. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela proporção entre Acamprosato/Baclofeno (P:P) estar entre 0,05 e 1000.

14. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição ser formulada em uma forma de dosagem unitária para administração diária.

15. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela dose de Baclofeno para administração diária ser menos de 100 mg.

16. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pela dose de Acamprosato para administração diária ser menos do que 1000 mg.

17. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por um sal de cálcio de Acamprosato ser utilizado.