CN105785004B - 细胞分裂周期相关蛋白2在胰腺癌诊断或预后中的用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及细胞分裂周期相关蛋白2在胰腺癌诊断或预后中的用途。具体地，本申请公开了确定受试者样本中细胞分裂周期相关蛋白2表达水平的试剂在制备胰腺癌诊断或预后试剂盒中的用途，优选地胰腺癌是胰腺导管腺癌。本申请首次报道CDCA2蛋白在胰腺导管腺癌组织及其癌旁组织中的表达情况，对后续临床研究的开展具有指导意义。

Description

细胞分裂周期相关蛋白2在胰腺癌诊断或预后中的用途

技术领域

本申请涉及医学、临床诊断领域。具体而言，涉及一种细胞分裂周期相关蛋白2作为标记物在癌症诊断或预后方面的用途。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度很高，并且诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。约90％的胰腺癌起源于腺管上皮的导管腺癌。

根据胰腺癌发生的部位，胰腺癌分类有：1)胰头癌；2)胰体尾癌；3)全胰腺癌。

根据胰腺癌病理类型，胰腺癌分类有：

1)导管腺癌，导管腺癌占胰腺癌的80％至90％，主要由分化不同程度的导管样结构的腺体构成；

2)特殊类型的导管起源的癌，有以下几种：多形性癌、腺鳞癌、粘液癌、粘液表皮样癌和印戒细胞癌、纤毛细胞癌；

3)腺泡细胞癌，占1％，肿瘤细胞呈多角形、圆形或矮柱形；

4)小腺体癌；

5)小细胞癌，胰腺的小细胞癌形态上与肺小细胞癌相似，约占胰腺癌的1％至3％。

胰腺导管腺癌发病隐匿、进展快、预后极差。最新资料表明，胰腺导管腺癌的发病率逐年攀升，发病率和病死率均居美国人群第四位，5年存活率约8％[1]，超过50％的患者初诊时已失去手术机会。因此，寻找胰腺导管腺癌分子治疗的靶点是目前的研究热点，进而对提高胰腺导管腺癌患者的治疗效果具有很大的社会效益[2-3]。

目前，关于胰腺导管腺癌相关的基因组学报道较少，这与胰腺导管腺癌特有的病理特征有关，其肿瘤组织中的大多数成分为肿瘤间质，很难直接提取肿瘤的DNA进行测序。

细胞分裂周期相关蛋白2(Cell division cycle associated 2，CDCA2)又称Repo-Man(Recruits PP1onto mitotic chromatin at anaphase)，是蛋白磷酸酶1的一个结合亚基，参与组蛋白H3在有丝分裂结束时脱磷酸作用的过程[4]。

在细胞内，CDCA2蛋白具有两项重要作用。一是参与有丝分裂，二是参与DNA损伤修复。细胞有丝分裂的过程中，CDCA2蛋白存在与细胞核内。由于受到Cyclin B-CDK1复合体磷酸化，使CDCA2蛋白不能与PP1γ结合，而不能与染色体向结合，无法发挥其作用。在有丝分裂后期，作为蛋白磷酸酶1γ的调节亚基，CDCA2蛋白将PP1γ募集到组蛋白H3上，促使复制好的染色体分离。这一过程还要受到蛋白激酶Aurora B的调节，来保证在DNA还没复制好的时候，CDCA2蛋白不能结合到组蛋白H3上而无法发挥作用[5]。此外，CDCA2蛋白还通过协调细胞核膜的重塑来参与有丝分裂时细胞核的重建。通过RNA干扰技术降低细胞中CDCA2蛋白表达时，不仅会使染色质的复制出现异常，还会出现异常畸形的细胞核[6-7]。

已有的实验证实，CDCA2蛋白在乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、口腔鳞癌的癌组织中均高表达，表达高于癌旁组织。在口腔鳞癌中，免疫组化结果显示CDCA2蛋白的表达与T分期和肿瘤分期相关[8]，这与CDCA2蛋白的生物学功能相符。目前尚未发现关于CDCA2在胰腺导管腺癌中作用的相关研究报道。

考虑到胰腺癌发病隐匿、进展快且预后极差，本领域仍需一种准确、灵敏、特异的标记物用于辅助胰腺癌的诊断或预后。

发明内容

鉴于本领域中的上述需求，本公开的一些实施方式提供了确定受试者样本中CDCA2表达水平的试剂在制备胰腺癌诊断或预后试剂盒中的用途。

在一些实施方式中，胰腺癌选自：胰头癌、胰体癌、胰尾癌和全胰腺癌。在另一些实施方式中，胰腺癌选自：胰腺导管腺癌、多形性胰腺癌、腺鳞癌、胰腺粘液癌、胰腺粘液表皮样癌和印戒细胞癌、胰腺纤毛细胞癌、腺泡细胞癌、胰腺小腺体癌和胰腺小细胞癌。

在具体的实施方式中，提供了确定受试者样本中CDCA2表达水平的试剂在制备胰腺导管腺癌诊断或预后试剂盒中的用途。

在一些实施方式中，在基因水平确定CDCA2的表达水平。当在基因水平确定CDCA2的表达水平时，可用的试剂是探针或引物对。技术人员根据CDCA2的核苷酸序列可以自行制备特异性的探针或引物对。

在另一些实施方式中，在蛋白水平确定CDCA2的表达水平。当在蛋白水平确定CDCA2的表达水平时，可用的试剂是抗CDCA2抗体。多克隆抗体或单克隆抗体均可用于实施本公开的技术方案。在具体的实施方式中，利用免疫组化的原理，采用抗CDCA2单克隆抗体确定CDCA2的表达水平。

在一些实施方式中，受试者样本是癌组织样本。在一些实施方式中，受试者样本是胰腺癌组织。在具体的实施方式中，胰腺癌组织是通过活检的方式获得的，或者外科切除的胰腺癌组织。在另一些具体的实施方式中，当用于胰腺癌的诊断时，样本还包括癌旁组织。癌旁组织是指距离所述癌组织边缘3cm以外的胰腺组织。当所述癌组织中CDCA2的表达水平显著高于所述癌旁组织中CDCA2的表达水平时，指示所述受试者患有所述胰腺癌。

在本说明书的上下文中，预后是指预测胰腺癌的可能病程和结局。预后既包括判断疾病的特定后果(如康复、某种症状、体征、并发症)，也包括提供时间线索(如预测某段时间内发生某种结局的可能性)。当从疾病演进过程的角度考虑时，预后包括例如缓解率、复发率、病残率。当从疾病终极状态的角度考虑时，预后包括例如治愈率、生存率、病死率。当从预后时间考虑时，预后包括例如近期病死率、远期病死率(参见刘振华主编的《肿瘤预后学》)。

在一些实施方式中，预后尤其是指对总体生存的预后。

在一些实施方式中，CDCA2的高表达指示这所述受试者预后不良。在本申请中，预后不良是指患者的术后生存时间短。

在一些实施方式中，CDCA2的高表达是指免疫组织化学评分为4至12的表达，所述的免疫组织化学评分采用了本领域公知的评分系统，例如但不限于Fang L等人Oncotarget.2014中描述的评分系统。

在具体的实施方式中，免疫组织化学评分是按照如下方法进行的：

-细胞核出现染色的细胞作为阳性细胞；

-细胞核的染色强度按照无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别判定为0、1、2、3的分值；

-所述阳性细胞比率按0％至24％、25％至49％、50％至74％、≥75％分别判定为1、2、3、4的分值；

-将染色强度的分值和阳性细胞比率的分值乘积得到0至12的分值，其中0至3分为低表达，4至12分为高表达。

本领域技术人员理解，尽管此处采用了具体的淡黄色、棕黄色、棕褐色的表述。但是，并不限于黄色色相的明度变化，因为这与染色时所采用的显色剂色相有关。

在一些实施方式中，在诊断的情况时，受试者是任何人类，可以是未患有或患有胰腺癌的受试者。在预后的情况时，受试者是正患有胰腺癌的受试者、或者曾经患有胰腺癌的受试者(而无论是否治愈)。

在具体的实施方式中，受试者是男性受试者或者是无神经侵犯(也作周围神经侵犯，PNI)的受试者。更优选，受试者是男性的正患有或曾经患有胰腺癌的受试者；或者，受试者是无神经侵犯(也作周围神经侵犯，PNI)的正患有或曾经患有胰腺癌的受试者。

在具体的实施方式中，对受试者进行预后评价时，还涉及对受试者的N分期进行确定。在本公开的上下文中，所述的N分期基于国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合委员会(AJCC)的TNM分期系统。字母N后缀数字0到1，分别代表没有淋巴结转移癌、有淋巴结转移癌。在优选的实施方式中，当所述CDCA2的表达水平为高表达且N分期为N1时，指示所述受试者预后不良。

根据本公开的另一方面，提供了CDCA2表达水平和N分期两者组合用于胰腺癌预后的方法。

根据本公开的另一方面，提供一种用于胰腺癌诊断或预后试剂盒，其包含用于确定CDCA2表达水平的试剂。

在具体的实施方式中，用于胰腺癌诊断或预后试剂盒包含抗CDCA2的抗体。在另一些具体的实施方式中，用于胰腺癌诊断或预后试剂盒包含特异于CDCA2的探针或引物对。在一些实施方式中，试剂盒可以制备成芯片的形式。

附图说明

图1为CDCA2在胰腺导管腺癌组织和癌旁组织中表达的比较。

图2.CDCA2蛋白表达与随访患者Kaplan-Meier生存分析。

图3A.在男性患者中，CDCA2蛋白表达与随访患者Kaplan-Meier生存分析。

图3B.在无神经侵犯的患者中，CDCA2蛋白表达与随访患者Kaplan-Meier生存分析。

具体实施方式

以下试验通过中国医学科学院北京协和医院伦理委员会审核，并遵守赫尔辛基宣言，所有患者均被详细告知样本采集及储藏的目的并签署书面同意书。

1.材料

1.1组织病理标本

收集经外科手术切除、并经病理学检查确诊的183例胰腺导管腺癌患者组织标本(病理学诊断及分期标准为美国癌症协会癌症分期手册第七版)。患者年龄34-85岁，平均年龄60.6±10.64岁，中位年龄61岁。183例患者中有155例有较好的随访结果。生存时间定义为手术结束至患者死亡或随访截止。

1.2纳入标准如下：

-接受外科手术切除的病例；

-术后病理确诊为胰腺导管腺癌并有相应的癌旁组织，癌旁组织定义为距肿瘤边缘3cm以外的胰腺组织；

-病人均未接受过术前新辅助治疗。

2.试验方法

2.1试验所用试剂见表1。

表1.免疫组织化学染色所需试剂

2.2组织芯片的制备及免疫组化所需相关设备及仪器见表2。

表2.组织芯片的制备及免疫组化所需相关设备及仪器

2.3制备实验所需的免疫组织化学染色切片

由病理科医师阅片筛选出具备典型胰腺癌特征的癌组织和癌旁组织的病理组织切片，依据编号查找病人资料，并调出病理标本库内保存的所对应的标本石蜡块。由技术人员协助完成免疫组织化学染色所需的组织芯片制备，每点直径1.5mm，厚度5μm。

2.4免疫组织化学染色实验步骤

(1)防止脱片：将组织芯片在68℃下烘烤1.5小时；(2)切片脱蜡水化：将组织芯片在二甲苯中浸泡3次，每次10分钟；然后依次浸泡于100％、95％、80％、70％酒精和PBS中，每次2分钟，仔细观察组织样本留水效果，确定脱蜡成功；(3)抗原修复：将脱蜡后的免疫组织化学切片倒立放入煮沸的枸橼酸盐缓冲液，调至800瓦，130℃修复4分钟。自然冷却后，PBS中清洗3次，每次2分钟，轻柔操作，防止脱片；(4)清除内源性过氧化物酶：切片甩干后，置于培养皿中加3％H₂O₂浸没，置入湿盒避光孵育15分钟后PBS洗3次，2分钟/次；(5)孵育CDCA2一抗：按1：400比例用抗体稀释液稀释CDCA2单克隆抗体，制备成CDCA2一抗工作液，同比例稀释非免疫兔血清作为阴性对照。切片甩干后滴加CDCA2一抗工作液约100μL，保证组织标本完全被一抗所覆盖，均匀铺平，防止边缘效应，置于4℃冰箱过夜。之后取出放入PBS中洗3次，2分钟/次；(6)孵育二抗：将二抗工作液100μL滴加至切片，将切片放入恒温箱37℃孵育30分钟，取出后用PBS洗3次，2分钟/次；(7)DAB显色：DAB稀释液II试剂1ml加浓缩的DABI试剂1滴混合制备DAB显色液，避光保存，尽快使用，半小时内完成DAB显色步骤。切片干燥后，滴加50μL DAB显色混合液，均匀铺开，放置在显微镜下观察，根据观察的显色程度，当背景着色时及时将切片放于自来水冲洗；(8)苏木素复染：将病理切片置于苏木素中染色2分钟，用水反复冲洗去除背景；(9)分化、返蓝：将病理切片放入分化液以去除未结合的苏木素，蒸馏水冲洗。然后将切片置于返蓝液2分钟，蒸馏水冲洗；(10)切片脱水、透明和封片：将切片放置于70％、80％、95％和100％酒精中各2分钟；二甲苯浸泡3次，5分钟/次，取出晾干。滴加中性快干胶将切片封片，镜下观察。

3.免疫组织化学染色结果观察及判读

免疫组织化学染色的结果由两名病理科医师分别判读结果并计分，最终取平均值。

对组织标本的癌组织和癌旁组织分别进行评价，每个切片阳性细胞计数随机选择5个高倍视野。

以细胞核出现染色作为阳性表达的标志。阳性细胞著色强度按无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别判定为0、1、2、3分，阳性细胞比率按0-24％，25-49％、50-74％、＞75％分别判定为1、2、3、4分，根据两项积分乘积结果作为最后综合评分标准[9]。

0-3分判定为低表达；4-12分判定为高表达。

4.收集纳入病例的临床病理资料，具体内容如下：

(1)病例的基本信息：病人姓名、病案编号、病人年龄、病人性别、联系方式；

(2)临床病例信息：肿瘤部位及大小、手术具体方式、手术切除的类型、切除范围；

(3)病理学信息：手术切缘情况、病理学分型、肿瘤分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移情况、外周神经浸润情况；

(4)分期标准：纳入病例的胰腺癌TNM分期依据国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合委员会2009年公布的TNM分期系统(第7版)；

(5)结局：对纳入病例进行随访，并查询病例的门诊病历。收集病例的结局、总生存时间信息。最终收集有效患者预后信息155例。

5.统计学分析

采用统计学软件SPSS 17.0，统计学显著性差异定义为P＜0.05。应用McNemar检验和Mann–Whitney U检验比较CDCA2在胰腺癌细胞与癌旁正常胰腺导管细胞表达的差异。计数资料应用卡方或者Fisher’s精确检验评价CDCA2的表达与胰腺癌病例的临床病理各变量是否存在相关性。用Kaplan-meier方法进行生存时间分析，拟合总生存时间曲线，应用Log-rank检验进行单因素分析不同组间的生存曲线差异；应用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。

6.结果

6.1免疫组化检测CDCA2在胰腺导管腺癌和癌旁组织中的表达

CDCA2均表达在细胞核中，表达为淡黄色至深棕色，部分癌旁组织中也有CDCA2蛋白表达(图1)。根据评分标准，CDCA2在胰腺导管腺癌组织中的总体表达水平高于癌旁组织，p＜0.001(图1)。提示CDCA2蛋白可能具有很好的辅助诊断价值。临床工作中常见到影像学检查发现胰腺肿物的患者，对于其中肿瘤标记物升高不明显或肿物较小的患者，诊断相对困难，后续治疗方式的选择更加棘手。现有的超声内镜穿刺活检等技术有时未能获取很好的组织进行病理形态学的检查，可以考虑加做免疫组化，通过CDCA2蛋白等恶性肿瘤中表达较高的蛋白来对良、恶性诊断提供参考。

6.2胰腺导管腺癌组织中CDCA2表达水平与临床病理特征的关系

根据阳性细胞数比率和染色强度进行的综合评分，将0至3分作低表达组，4至12分作高表达组，对免疫组化染色进行评分和统计学分析。

结果发现，除了年龄外(p＝0.041)，CDCA2表达水平与性别、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分化程度、T分期、N分期没有相关性(表3)。

表3.CDCA2蛋白表达水平与临床病理信息

上述结果中，没有发现CDCA2蛋白表达的高低差异与肿瘤T分期相关，这可能与病理组织的获取来源有关。胰腺导管腺癌患者预后差，往往在初诊时已经失去手术机会。本公开中纳入的病理标本均为手术切除标本。因此，本公开中纳入的患者均为病情相对较早的胰腺导管腺癌患者，故而可能在患者选取中存在偏倚，这是胰腺导管腺癌研究中不可避免的，因而未能发现CDCA2蛋白与肿瘤分期的相关性。

上述结果中，发现CDCA2蛋白表达与年龄相关，本发明人认为这也与患者的选择偏移有关，因为大部分高龄胰腺导管腺癌患者不会选择根治性手术切除。

6.3各指标对总生存期影响的单因素分析

对有随访资料的155例胰腺导管腺癌患者进行总体生存相关性分析。根据癌组织CDCA2免疫组化结果、年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分化程度、T分期、N分期、神经浸润等指标进行分组，采用Kaplan-Meier比较各组指标与总体生存期之间的相关性。

结果显示：CDCA2蛋白表达水平的高低、不同N分期所对应的胰腺导管腺癌患者总生存期有显著性差异(p＜0.05)，是影响预后的危险因素(表4和图2)。

表4.生存分析

6.4各指标对总生存期影响的多因素分析

对于单因素分析对总生存期有意义的指标，包括CDCA2蛋白表达水平的高低、N分期纳入Cox回归模型进行多因素分析，统计各因素对总生存期的影响，并确定相对危险度。结果表明，N分期是影响预后的独立危险因素，具有统计学意义(p＜0.05)。其中N1期的危险度是N0期的1.667倍。CDCA2蛋白表达水平并非独立危险因素(表4)。

6.5不同亚组的生存分析

将患者分成不同亚组进行多因素生存分析。

结果显示在男性患者(p＝0.003)(图3A)、无神经侵犯患者(p＝0.012)(图3B)中，预后与癌细胞中CDCA2蛋白的高表达显著相关。这表明，CDCA2蛋白的表达水平在尤其是男性和无神经侵犯(PNI)的群体中，能够作为预后的独立危险因素，具有统计学意义。

7.讨论

在单因素分析中(参见6.4节)，CDCA2蛋白表达、N分期与患者预后相关。CDCA2蛋白表达高的患者，预后较差。存在淋巴结转移的患者预后较差。亚组分析中，男性患者和无神经侵犯患者中，CDCA2蛋白表达高者预后较差(参见6.5节)。

虽然在多因素分析中CDCA2蛋白表达并非独立危险因素，但可以考虑作为判断预后的参考指标，在胰腺导管腺癌术后患者进行病理诊断时加做免疫组化检查，来帮助临床医师更好的选择术后辅助治疗方式。

综上所述，CDCA2蛋白在胰腺导管腺癌中高表达，可能通过促进肿瘤细胞增殖、抵抗细胞凋亡等方式促进胰腺导管腺癌恶性进展。作为诊断和判断预后的参考指标来帮助临床指导诊治。

参考文献

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[11]Witkiewicz AK,McMillan EA,Balaji U等人Whole-exome sequencing ofpancreatic cancer defines genetic diversity and therapeutic targets.NatCommun.2015；6:6744。

Claims (15)

1.确定受试者样本中细胞分裂周期相关蛋白2表达水平的试剂在制备胰腺癌诊断或预后试剂盒中的用途，

其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌，

其中在蛋白水平确定细胞分裂周期相关蛋白2的表达水平。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的试剂是抗体。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述的受试者样本是癌组织样本。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌组织样本是活检样本。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述癌组织样本是外科切除的样本。

7.根据权利要求4所述的用途，其中所述的受试者样本还包括癌旁组织，其中所述癌旁组织是指距离所述癌组织边缘3cm以外的胰腺组织。

8.根据权利要求1所述的用途，所述的预后是指总体生存的预后。

9.根据权利要求7所述的用途，其中

当所述癌组织中细胞分裂周期相关蛋白2的表达水平显著高于所述癌旁组织中细胞分裂周期相关蛋白2的表达水平时，指示所述受试者患有所述胰腺导管腺癌。

10.根据权利要求1所述的用途，当所述细胞分裂周期相关蛋白2的表达水平为高表达时，指示所述受试者预后不良。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述的高表达是指免疫组织化学评分为4至12的表达；

所述免疫组织化学评分是按照如下方法进行的：

-细胞核出现染色的细胞作为阳性细胞；

-细胞核的染色强度按照无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别判定为0、1、2、3的分值；

-所述阳性细胞比率按0％至24％、25％至49％、50％至74％、≥75％分别判定为1、2、3、4的分值；

-将染色强度的分值和阳性细胞比率的分值乘积得到0至12的分值，其中0至3分为低表达，4至12分为高表达。

12.根据权利要求8所述的用途，其中所述的受试者是正在患有胰腺导管腺癌的受试者或者曾经患有胰腺导管腺癌的受试者。

13.根据权利要求8所述的用途，所述的受试者是男性受试者或者无神经侵犯的受试者。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的用途，其中评价所述预后还包括确定所述受试者的N分期。

15.根据权利要求14所述的用途，当所述细胞分裂周期相关蛋白2的表达水平为高表达且N分期为N1时，指示所述受试者预后不良。