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KR101264810B1 - Ａｌｋ 유전자의 재배열 검출방법 및 이를 이용한 암 진단방법 - Google Patents

Ａｌｋ 유전자의 재배열 검출방법 및 이를 이용한 암 진단방법 Download PDF

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KR101264810B1
KR101264810B1 KR1020100118308A KR20100118308A KR101264810B1 KR 101264810 B1 KR101264810 B1 KR 101264810B1 KR 1020100118308 A KR1020100118308 A KR 1020100118308A KR 20100118308 A KR20100118308 A KR 20100118308A KR 101264810 B1 KR101264810 B1 KR 101264810B1
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백진호
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한국과학기술연구원
서울대학교병원 (분사무소)
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Abstract

본 발명은 ALK 유전자 전위로 인해 발생하는 ALK 유전자 재배열을 ALK 항체 반응을 통해 ALK 단백질 과발현 여부를 통해 확인하는 검출방법 및 이를 포함한 암 진단방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 ALK 유전자 재배열 검출 방법은 기존의 고비용과 장시간이 요구되는 검출방법이었던 FISH의 단점을 보완한 검출방법을 구체적인 ALK 항체 반응의 프로토콜과 ALK 염색 패턴 분석 기준을 제시함으로서, ALK 단백질 과발현 양상을 효과적으로 분석하여 1차적으로 신속 정확하게 ALK 억제제로 투여 대상 여부를 효율적으로 판가름 할 수 있게 하는 ALK 유전자 재배열 검출 방법을 제공함으로서, 분자적 타겟이 될 수 있는 치료법(therapy)의 범위를 넓힐 수 있는 효과를 지닌다.

Description

ＡＬＫ 유전자의 재배열 검출방법 및 이를 이용한 암 진단방법{Method for Screening of ALK gene rearrangement and diagnosis of cancer using the same}
본 발명은 비소세포폐암(NSCLC) 환자에서 나타나는 ALK 유전자 전위로 인해 발생하는 ALK 단백질이 과발현된 조직을 면역조직염색법을 통해 간편하고 효율적으로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
세계적으로 암 발생율 및 사망률이 증가하고 있는 가운데, 선진국에서는 그 중에서 폐암이 차지하는 비중이 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 우리나라에서도 폐암은 사망률 1위인 암으로서, 많은 기초 및 임상 연구에도 불구하고 쉽게 정복되지 않는 과제임에 틀림없다. 이에 폐암에 대한 더 조직화되고 임상적으로 응용성에 중점을 둔 연구가 절실한 실정이다.
폐암의 사망률이 높은 이유 중의 하나는 조기 진단이 어려워 많은 경우 진행된 병기에서 발견되기 때문으로 추측되며, 수술적 절제 후에도 재발하는 경우가 많기 때문이라고 알려져 있다. 따라서 폐암 정복을 위해서는 두 가지 큰 전략적 지향점이 설정될 수 있는데, 첫째는 조기 진단법의 개발을 통한 조기 수술 전략이며, 둘째는 수술적 치료에 더하여 추가적으로 투여할 수 있는, 혹은 그 자체로서 절제 불가능한 폐암 환자에 일차적으로 적용할 수 있는, 효과적인 전신 항암화학요법 치료제의 개발이다. 특히, 전자의 경우 혜택을 받을 수 있는 대상이 현재 건강하거나 조기의 폐암을 가진 사람 중 정기적으로 선별 검사를 받는 사람에 국한되는 데에 반하여, 후자의 전략은 이미 진행된 병을 가지고 있거나 최선의 치료에도 불구하고 병이 진행하게 되는 많은 잠재적 환자들에게 직접 혜택이 돌아가는 접근 방법이라는 면에서 그 중요성이 더해진다고 볼 수 있다.
폐암은 병리학적으로 크게 소세포 폐암(small cell lung cancer: SCLC)와 비소세포폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC)으로 구분되며, 비소세포폐암은 폐암의 약 80%를 차지하고 있다. 비소세포 폐암은 3종류의 서브 타입으로 구성되는데, 각각 40%를 차지하는 샘암종 세포암(adenocarcinoma)과 편평상피세포암(squamous cell carcinoma) 및 나머지 20%를 차지하는 대세포 폐암(large cell carcinoma)으로 나누어지며, 이러한 TMN 병기 구분법(staging system)이 폐암의 관리에 널리 받아들여지고 있다. 폐암은 상기 종류에 따라 조직학적 특성이 차이가 날뿐 아니라 서로 다른 종류의 조직형에 따라 발생하기 쉬운 부위, 진행형식과 속도 및 증상 등의 임상상이 다양하며 치료방법 또한 다양하다(Brambilla et al., Eur Respir J.18(6):1059-68, 2001).
일반적으로 비소세포폐암은 소세포 폐암에 비해 항암제의 효과가 적어 화학요법만으로는 치료가 거의 불가능하며, 종양을 외과적으로 완전히 제거하는 것이 유일한 효과적인 치료법이다. 그러나 폐암 환자의 30% 이하가 진단시 전부 절제할 수 없는 종양을 가지며, 이들 중의 3분의 1 이하만이 외과적 절제술 이후 5년간 생존할 뿐이어서 비소세포폐암의 경우, 최근의 암 치료법의 발달에도 불구하고 10년 생존률이 10% 이하로 매우 낮다. 따라서 치료 효과를 높이기 위해서는 폐암의 유형을 정확하게 알아내고, 폐암의 발생 및 그의 원인 기전, 암의 성장, 그리고 전이에 관여하는 분자생물학적 조절 기전 등을 규명하여 각 단계별로 대응하는 새로운 진단 및 치료 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
또한, 폐암의 발암기전과 관련하여 유전적 변이의 역할이 꾸준히 연구되어 왔는데, 다른 고형 종양에서와 마찬가지로, 염색체 이상은 폐암 발생에 있어서의 매우 중요한 분자적 현상으로 분류되어 왔다. 그 중 EGFR, p53과 k-ras 등의 유전적 변이가 주로 많이 연구되어 있다. 특히 비소세포폐암 환자에서 아시아인종, 여성, 비흡연자 및 선암종일 경우에는 EGFR 유전자 돌연변이가 흔하며, 이를 치료하기 위한 방법으로 EGFR 타이로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor)(TKI)인 gefitinib("Iressa")의 투여가 사용되고 있으나 약제 내성으로 인해 치료 실패의 문제가 대두되었다.
그리하여 최근 폐암에 대한 새로운 표적 치료제의 대상이 될 수 있는 새로운 유전자 돌연변이원으로 ALK 유전자에 대한 관심이 학계에서 집중되고 있으며, 여러 다국적 제약회사들이 폐암의 발병원인인 ALK의 억제제 개발에 박차를 가하고 있다. 한편, ALK를 대상으로 하는 표적 치료방법의 경우, ALK 유전자 전위(translocation)를 효과적으로 검출하는 방법이 미비하여 ALK 억제제를 투여해야하는 대상 환자들을 선별하는데 있어 많은 어려움이 있다. 따라서 무엇보다 ALK 유전자 전위가 일어난 폐암을 검출할 수 있는 효율적이면서도 효과적인 새로운 방법에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 최근 새로운 표적 치료제로서 주목받고 있는 ALK 억제제의 투여를 위해 적합한 후보 표적 유전자로 ALK 유전자 전위를 타겟으로 하여, 상기 ALK 유전자 전위를 검출해 낼 수 있는 검출 방법 및 ALK 유전자전위의 존재 여부를 통해 폐암의 진단여부를 확인할 수 있는 진단방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 환자의 조직 표본에 ALK 항체를 반응시켜 나타난 염색 패턴을 토대로 ALK 단백질 과발현 양상을 분석하여, 1차적으로 신속하게 ALK 억제제 투여 대상 여부를 판가름 할 수 있게 하는 ALK 유전자 전위 폐암환자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
그리하여 본 발명은 궁극적으로 암의 분자적 타겟(molecular target)이 될 수 있는 치료법(therapy)의 범위를 넓힐 수 있음 동시에 비교적 낮은 빈도의 유전자 변화를 가지고 있는 암환자를 신속하게 선별해내는 진단 방법을 제공할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은
전처리된 표본에 ALK 항체를 반응시키는 단계;
상기 ALK 항체를 반응시킨 표본을 염색하는 단계; 및
표본의 염색 패턴을 해석하는 단계를 포함하는 ALK 유전자 재배열 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
전처리된 표본에 ALK 항체를 반응시키는 단계;
상기 ALK 항체를 반응시킨 표본을 염색하는 단계;
표본의 염색 패턴을 통해 단백질 발현 정도를 파악하는 단계; 및
단백질 발현 정도를 통해 ALK 유전자 전위여부를 판단하는 단계를 포함하는 ALK 유전자 재배열 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ALK 항체를 반응시키는 단계는 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역 블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군 중에서 선택된 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표본의 전처리는 파라핀 절편을 탈파라핀화 시키고, TBE(Tris-Borate-EDTA) 버퍼를 포함한 사염화탄소(CCl4) 용매에서 95℃~105℃, 15분~25분간 열처리하는 것 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ALK 항체를 반응시키는 단계는 ALK 항체를 1:25~1:35 비율로 희석하여 처리하고, 40℃~45℃ 온도에서 90분~120분 동안 반응시키는 것 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염색하는 단계는,
상기 ALK 항체와 결합하는 2차 항체를 처리하는 단계; 및
발색기질을 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발색기질은 DAB(diaminobenzidine), BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), TMB(3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine), BCIP/INT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF(New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), 4-CN, AEC(3-amino-9-ethylcarbasole), X-Gal 및 IPTG(isopropyl beta-D-thiogalactoside)로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표본의 염색 패턴을 분석하는 단계는 세포질이 염색된 세포 수를 판단하는 단계 또는 세포질의 염색 강도를 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 미만일 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 음성일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 강한 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 음성일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 약한 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 양성일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 중등도인 경우, FISH(fluorescence in situ hybridization), SISH(Silver In Situ Hybridization) 및 PCR(polymerase chain reaction)로 구성된 군 중에서 선택되는 방법으로 ALK 유전자의 전위여부를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기의 ALK 유전자 재배열 검출 방법을 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암일 수 있다.
본 발명에 따른 ALK 유전자의 재배열 검출방법은 기존의 고비용의 장시간의 검출방법이었던 FISH의 단점을 보완한 검출방법을 제시함으로서, ALK 단백질 과발현 양상을 분석하여 1차적으로 신속 정확하게 ALK 억제제로 투여 대상 여부를 판가름 할 수 있게 하는 ALK 유전자 재배열 선별 방법을 제공한다. 따라서 본 발명은 분자적 타겟이 될 수 있는 치료법(therapy)의 범위를 넓힐 수 있는 효과를 지님과 동시에 암의 진단방법으로도 사용할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 LSI ALK Dual Color break-apart probe을 이용한 FISH(Fluorescence in situ hybridization)-양성 패턴을 보여주는 그림이다. (a) 두 개의 떨어진 빨간색 및 녹색(red and green break-apart) 시그널들과 하나의 고유의 혼합 시그널(intact fusion signal), (b) IRS(isolated red signal) 및 하나의 고유 혼합 시그널(intact fusion signal)의 모습이다.
도 2a, 2b 및 2c는 ALK의 면역조직화학적(immunohistochmical) 염색 패턴을 나타낸 사진으로, 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 강한 경우(3+)를 나타낸다.
도 3a, 3b 및 3c는 ALK의 면역조직화학적(immunohistochmical) 염색 패턴을 나타낸 사진으로, 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 중등도인 경우(2+)를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 ALK의 면역조직화학적(immunohistochmical) 염색 패턴을 나타낸 사진으로, 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 미만이거나 5% 이상이나 세포질의 염색강도가 약한 경우(1+)를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 ALK의 면역조직화학적(immunohistochemical) 염색 패턴을 나타낸 사진으로, 세포질 염색이 전혀 되지 않은 경우(0)를 나타낸다.
도 6은 비소세포 폐암(NSCLC)에서의 ALK IHC 및 FISH의 정확하며 비용-효과적인 임상적 적용을 위한 진단 알고리즘을 나타낸 것이다.
본 발명은 전위되어 재배열된 ALK 유전자를 가진 환자를 신속 정확하게 선별해낼 수 있는, 면역조직화학적(immunohistochemical) 검사법을 이용한 ALK 유전자 재배열 검출방법을 제공함에 특징이 있다.
일반적으로 많은 암들은 세포의 비정상적인 조절 또는 조절되지 않는 성장이나 증식을 야기하는 세포 신호전달 경로에 의하여 야기된다. 특히, 비소세포폐암(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)과 같은 고형 종양들에서는 비정상적인 신호 활성을 가지는 키나아제(kinase) 융합 단백질을 야기하는 유전자 결손 및 전위와 같은 돌연변이가 직접적으로 암을 야기한다고 알려져 있다.
특히, 신규한 ALK 키나아제 돌연변이체 및 유전자 결손과 전위 돌연변이의 동정은 하나 이상의 이들 융합 단백질에 의하여 특징지어지는 NSCLC와 같은 고형 종양들의 강력한 진단 및 치료에 중요한 관련을 가진다. 예를 들어 NSCLC는 종종 전위된 후에만 검출되고 있으며, 진단 2년 이내에 75%의 높은 치사율을 나타내고 있어 최대한 조기에 NSCLC이 발병할 수 있는 환자들을 동정하는 기술 개발이 매우 시급한 실정이라 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 고형암, 특히 NSCLC의 증식 및 생존을 촉진하는 것으로 생각되는 유전자 전위 돌연변이로부터 야기된 ALK 융합 단백질(짧은 것과 긴 변이체)을, NSCLC와 같은 폐암을 포함하는 포유류의 고형 종양에서 뿐만 아니라, ALK 유전자 재배열로 의한 발생하는 ALK 융합 단백질을 발현하는 다른 암들로부터, 그 존재 여부를 정확하고 간편하게 검출할 수 있는 새로운 방법을 고안하였다.
ALK(anaplastic lymphoma kinase)는 수용체 타이로신 인산화 효소의 하나로서, 역행성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma, ALCL)이라는 특정 악성 림프종 유형에서 2번과 5번 염색체의 전위(translocation; t(2;5)(p23;q35))를 통해 NPM(nucleophosmin)이라는 단백질과 융합된 NPM-ALK 융합 단백질의 형태로 발견된 바 있으며, ALK를 통한 신호전달은 PLCγ, PI3K, RAS/MAPK, JAK(Janus kinase)/STAT 경로 등 여러 가지 생물학적으로 중요한 신호 전달체를 통해, 세포 증식, 분화, 항-세포자살과 같은 생물학적으로 중요한 경로에 관여하는 것으로 알려져 있다(Palmer RH, Vernersson E, Grabbe C, Hallberg B. Anaplastic lymphoma kinase: signalling in development and disease. Biochem J 2009;420:345-61). 특히 ALK 유전자는 NPM뿐만 아니라, 다른 대상 유전자(partner gene)와의 융합으로 특정 질환의 종양화에 기여하고 있다.
ALK 유전자의 변이(genetic alteration) 혹은 과발현(overexpression)은 여러 다른 유형의 림프종이나 다른 종양에서도 보고되어 왔으며, 미만성 대세포 B세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL), 염증성 근섬유모세포 종양(inflammatory myofibroblastic tumor, IMT), 비소세포폐암, 갑상선 암, 유방암, 악성 흑색종(malignant melanoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 교모세포종 (glioblastoma), 별아교세포종(astrocytoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 유잉육종(Ewing sarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma) 등 다양한 종양에서 보고되어 있다(Dirks WG, Fahnrich S, Lis Y,Becker E, MacLeod RA, Drexler HG. Expression and functional analysis of the anaplastic lymphoma kinase(ALK) gene in tumor cell lines. Int J Cancer 2002;100:49-56).
특히, 비소세포폐암에서 ALK유전자는 EML4 유전자와 융합되어 작용하는 것으로 2007년에 보고된 바 있으며, ALK 유전자 재배열의 발견 빈도는 보고자마다 방법과 환자 그룹에 따라 차이가 있으나 비소세포폐암의 3-7% 정도로, 대략 5% 내외의 빈도를 보이고 있다(Martelli MP, Sozzi G, Hernandez L, Pettirossi V, Navarro A, Conte D, Gasparini P, Perrone F, Modena P, Pastorino U, Carbone A, Fabbri A, et al. EML4-ALK rearrangement in non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. Am J Pathol 2009;174:661-70).
전체 비소세포폐암 중 빈도가 그렇게 높지는 않으나 비소세포폐암이 전체 폐암의 약 80%에 이르는 점을 감안하면 상당한 수의 환자가 재배열된 ALK 유전자 를 가지고 있으며, 이에 종양화 현상이 관련되어 있는 것으로 생각된다. 한편 현재 진행된 비소세포폐암 환자들에게는 EGFR 돌연변이를 타겟으로 한 표적 치료제로서 ERFR TKI인 Irresa가 사용되고 있는데 Irresa를 적용할 수 없는 환자들에게는 효과적인 표적 치료제가 없다는 점을 감안하면, 재배열된 ALK 유전자는 새로운 표적 치료제의 대상이 될 수 있다는 점에서 그 중요성이 매우 크다고 할 수 있다.
그동안 폐암 환자에서의 ALK 전위의 중요성에 주목하여 다양한 ALK 억제제가 동물실험과 셀라인(cell line)에서 조사되었고, 현재 다국적 제약회사인 화이자(pfizer)가 개발한 경구용 c-MET/ALK 억제제인 크리조티닙(Crizotinib, PF-02341066)의 3상 임상실험이 하버드 의과대학을 비롯하여 미국 5개 기관, 호주 1개 기관 및 아시아에서는 서울대병원이 유일하게 참여하여 진행되고 있는 실정이다. 또한 2010년도 제46회 미국임상종양학회(ASCO: American Society of Clinical Oncology)에서 서울대학교 방영주 교수가 발표한 ALK 양성 비소세포폐암 환자 대상 1상 임상연구 결과에 따르면, 총 79명의 ALK 유전자 전위를 갖는 환자에서 약제 반응율 70%의 우수한 성적이 보고되어 ALK 억제제의 효과가 증명되었다. 이 연구의 성공적 결과와 높은 관심으로 인하여 향후 ALK 억제제 크리조티닙은 미국 식약청의 승인을 받아 시판될 가능성이 높아지게 되었으며, 어떤 환자가 상기 약제의 치료대상이 될 것인지 신속하면서도 정확하고 선별해낼 수 있는 검사방법의 정립이 무엇보다 중요하다고 하겠다.
현재 ALK 전위여부를 판별하기 위해 시행되고 있는 표준적 방법은 폐암환자에서 EGFR 변이검사를 시행한 후 음성인 환자를 대상으로 하는 ALK “FISH(fluorescence in situ hybridization)” 검사가 있다. FISH 검사는 조직 내에서의 특정 유전자의 상태를 형광 프로브를 이용하여 그대로 관찰할 수 있다는 점에서 유전자 검사에서 가장 신뢰성을 인정받고 있는 방법이다. 그러나 FISH 검사는 시간적 지연(최소 3주) 뿐만 아니라 고가의 장비와 시약의 사용으로 인해 비급여 의료비상승(EGFR 변이검사 30-40만원, FISH 검사 40만원대) 이라는 부작용을 낳고 있는 실정이며, 질병으로 고통 받고 있는 환자에게 이중고를 안겨주고 있는 상황이다. 더불어 암실의 형광 현미경 하에서 형광 프로브의 패턴과 개수를 일일이 체크하여 샘플들의 ALK FISH 결과를 판독하는 병리학자의 과도한 육체적 부담 또한 가중되고 있는 실정이다. 왜냐하면, EML4와 ALK 유전자간에는 다양한 융합 포인트(fusion points)가 존재하여 ALK 유전자 변형 상태(ALK gene alteration status)를 결정하는 것은 어렵고 복잡한 문제이며, 동일한 염색체 내에 ALK 유전자와 EML4 유전자가 비교적 가깝게 존재하여 본래의 정상 상태와 전위가 일어나 융합 유전자를 형성하였을 때(ALK 유전자 재배열)의 상태를 판별하는 데 상당한 시간과 고도의 집중력이 필요하기 때문이다. 따라서 간편하고 저렴한 비용으로 ALK 유전자 전위 여부를 검출할 수 있는 기법 수립이 절실한 상황이라고 할 수 있다.
그리하여 본 발명자들은 신속하게 ALK 전위여부에 대한 판별을 가능하게 하면서도 경제적이며, 판독하는 병리학자의 수고를 덜어줄 수 있는 간편한 면역조직화학검사법(IHC)을 통한 ALK 유전자 재배열 검출 방법을 제공하고자 하였다.
즉, 본 발명자들은 유전자 변이 판별에 있어, 병리학 실험실에서 가장 쉽게 접근할 수 있는 검색 방법이 면역조직화학염색법임에도 불구하고, 지금까지 ALK 유전자 변이 판별을 위해 FISH 방법을 이용해야만 했던, 기존의 ALK 면역조직화학염색법이 가졌던 단점과 문제점을 극복한, 실질적으로 병리학 실험실에서 활용도가 높은 ALK 면역조직화학염색법에 대한 구체적 염색방법과 전위여부 판별 기준을 정립하였다.
ALK 유전자 재배열 검출 방법에 있어, 기존에 면역조직화학염색법을 사용하지 않았던 이유는, 우선 ALK양성 림프종과는 달리 폐암에서는 ALK유전자 전위가 일어난다고 해도 단백질 발현에 대한 전사적 활성(transcriptional activity)이 낮아 유전자 전위를 단백발현으로 검출하는 것에는 한계가 있다고 보여졌기 때문이다. 또한 면역조직화학염색법이 보편화된 만큼 다양한 종류의 클론을 이용한 항체와 염색 방법이 사용되고 있어 대량의 조직을 이용한 ALK 전위 여부 판단을 위한 면역조직화학염색법을 위한 가이드라인이나 표준화된 검사지침이 없었기 때문이다(Palmer RH et al., J Natl Cancer Inst 2005;97:339-346., Inamura K et al., Mod Pathol 2009;22:508-515).
실제로 외국의 연구 결과, ALK에 대한 면역조직화학염색 결과와 FISH의 결과의 일치율은 면역조직화학염색의 낮은 민감도로 인하여 매우 낮은 편이었고, 2007년 ALK를 처음 보고한 Mano 등도 면역조직화학검사법으로 ALK 유전자 전위를 신속 정확하게 찾는 방법에 대해서는 추가 연구가 필요함을 인정하였다(Han SW et al., J Clin Oncol 2005;23:2493-2501., Shepherd FA et al., N Engl J Med 2005;353:123-132., Dirks WG et al., Int J Cancer 2002;100:49-56., Martelli MP et al., Am J Pathol 2009;174:661-670., Perner S et al., Neoplasia 2008;10:298-302).
이에 본 발명자들은 비소세포폐암(NSCLC)의 5% 내외로 알려져 있는 ALK 유전자 재배열을 가진 환자를 일차적으로 신속, 정확하게 선별해낼 수 있는 면역조직화학검사법의 구체적인 프로토콜(protocol) 및 진단 알고리즘(algorithm )을 제공하고자 하였으며, 본 발명의 일실시예에 따른 결과에 의하면 본 발명자들이 수립한 ALK 면역조직화학검사법은 FISH 결과와 높은 일치율을 보였다.
따라서 본 발명은 피험체로부터 표본을 제공받는 단계, 상기 표본에 전처리를 시행하는 단계, 전처리된 표본에 ALK 항체를 반응 시키는 단계, 상기 ALK 항체를 반응시킨 표본을 염색하는 단계 및 표본의 염색패턴을 분석하는 단계를 포함하는 ALK 유전자 재배열 검출방법을 제공할 수 있다. 더불어, 상기 표본의 염색패턴 분석을 통해 단백질 발현 정도를 파악하는 단계 및 단백질 발현 정도를 통해 ALK 유전자 전위여부를 판단하는 단계를 더 포함하는 ALK 유전자 재배열 검출방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 “ALK 유전자 재배열(ALK gene rearrangement)”에서 “유전자 재배열(gene rearrangement)”이란 일반적으로 체세포의 유전자 단편 사이에서 재조합이 일어나 염색체 상의 유전자 위치 및 순서의 변화를 일으키는 구조적 변화를 말한다. 또한, 전위(translocation, 전좌)란, 염색체 이상의 하나로서 염색체의 일부분에 절단이 일어나 그 단편이 같은 염색체의 다른 부분 또는 다른 염색체 상에 결합하여 염색체의 형태를 바꾸는 이상 현상을 말한다. 구체적으로, 같은 염색체의 내부에서 일어난 전좌를 염색체내 전좌 또는 단지 전좌, 다른 염색체간의 전좌를 염색체간 전좌라고 한다. 또한, 1개의 염색체의 일부분이 다른 염색체에 부착한 경우를 단순전좌, 2개의 염색체에 절단이 일어나 서로 부분을 교환한 경우를 상호전좌라고 한다.
따라서, 본 발명에 따른 “ALK 유전자 재배열(ALK gene rearrangement)”이란, ALK 유전자의 전위(translocation, 전좌) 현상으로 인해 ALK 유전자의 일부가 다른 유전자 내로 이동된 후, 그 유전자 내에 삽입되어 새로이 재배열된 비정상적인 상태를 말하며, 이러한 전위 현상으로 발생된 ALK 유전자 재배열로 인해, 결과적으로 세포 내에서는 정상적인 ALK 단백질이 생성되지 않고 다른 단백질과 융합된 형태인 ALK 융합 단백질이 생성되게 된다. 이에, 본 발명의 일실시예에서는 ALK 유전자가 EML4 유전자 내로 전위되어 재배열된 형태인 ALK-EML4 융합 유전자의 검출방법에 대한 실험을 실시하였다.
본 발명의 ALK 유전자 재배열 검출을 위해 요구되는 ALK 항체 반응은 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역 블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군 중에서 선택된 방법으로 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 면역조직화학법일 수 있다.
본 발명에서 “표본”이란, 사람의 인체로부터 분리된 세포 또는 생검 조직으로서, 암을 가진 피험체로부터 준비된 표본(예컨대, 폐암 조직 표본) 또는 정상인으로부터 준비된 표본일 수 있다. 피험자로부터 제공된 표본은 파라핀 포매 조직절편(Paraffin Embedded Tissues), 냉동조직절편(Frozen Tissues, Formalin Fixed Tissues) 및 Cell Smear 등으로 처리할 수 있으며, 일반적으로 파라핀 절편이 가장 많이 이용되고 있다.
세포나 조직의 형태학적 관찰을 원활하게 하기 위해서는 검체의 고정 과정이 가장 중요하다. 고정이 잘된 조직은 세포의 소기관이 잘 유지되지만, 고정이 부족하면 형태학적 구조가 불완전하게 되고, 고정이 너무 지나치면 항원의 소실과 비특이적인 반응이 나타날 수 있기 때문이다. 통상적으로 조직 고정제는 응고형 고정제와 비응고형(변성형) 고정제로 구분되는데, 가장 많이 사용되고 있는 조직 고정제는 비응고형 고정제인 포르말린이다. 포르말린은 1시간에 1mm 정도 조직에 침투하면서 조직 고정을 이루는데, 항원결정부위(epitope)의 파괴가 적고 단백질과 펩타이드를 교차결합시키므로 세포의 형태가 잘 유지시킨다는 장점이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 ALK IHC를 실시하기 위해 NSCLC 환자로부터 획득한 조직 표본을 포르말린에 고정하였고, 파라핀으로 포매하였다.
조직 고정제로 고정시킨 조직은 파리핀 등으로 포매하고, 섹션하여 아주 얇은 절편을 만든 다음, 탈파라핀화 단계를 포함한 전처리 단계를 시행하는 것이 바람직하다. 상기 전처리 단계는, 파라핀 절편은 탈파라핀화 시키고, TBE(Tris-borate-EDTA) 버퍼(buffer)를 포함한 사염화탄소(CCl4) 용매에서 95℃~105℃, 15~25분간 열처리하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 파라핀 절편을 EZ 프렙(EZ Prep)을 이용하여 75℃에서 4분간 탈파라핀화 단계를 거친 후, TBE를 포함한 사염화탄소 용매에서 100℃, 20분간 열 전처리를 실시하였다.
또한, 본 발명자들은 ALK 전위로 인한 ALK 과발현을 보다 정확히 검출하기 위해 특유의 ALK 항체 반응 조건을 수립하였다. 본 발명은 ALK 유전자 재배열 여부를 검출하기 위하여 경제적이면서도 신속한 1차 스크리닝으로서 ALK IHC 방법을 제공하고자 하는바, 기존의 ALK 유전자 재배열 여부를 검출방법으로 사용되었던 ALK FISH 검사 결과와 부합하는 정확한 조직면역화학검사 결과를 제공하기 위하여 수많은 비교 실험 끝에 본 발명에 따른 ALK 항체 반응의 최적 조건을 완성하였다.
본 발명에 따른 ALK 항체 반응은 ALK 항체를 1: 25 내지 1:35의 비율로 희석하여 처리할 수 있고, 40℃~45℃ 온도에서 110분~130분 동안 반응시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 ALK 항체를 1:30으로 희석시켜 처리한 후, 42℃에서 2시간 동안 인큐베이트 하였다.
상기의 항체 반응 조건에 따른 ALK IHC 결과에 대한 정확도를 측정하기 위하여, ALK 항체를 1:20, 1: 25, 1:30, 1:35, 1:40의 비율 희석하여 ALK IHC 실험을 실시하고, ALK 전위여부에 대한 IHC 결과와 FISH 결과를 상호 비교하였다(실시예 8 참조).
그 결과, 1:20 및 1:40의 비율로 ALK 항체를 처리한 경우에 비해 1:25 및 1:35의 비율로 희석하여 ALK 항체를 처리하였을 때 IHC와 FISH 간의 높은 상관관계를 확인할 수 있었다. 또한, 인큐베이션 시간을 달리하여 IHC 실험을 수행한 결과, 60분 및 90분, 150분 및 180분 동안 인큐베이션 시켰을 때와 달리, 110분 및 130분 동안 반응 시킨 IHC 실험의 결과가 FISH와 높은 상관관계가 있음이 드러났다. 더불어, ALK 항체를 1:30의 비율로 희석하여 120분간 인큐베이션 시키면서, 반응 온도를 다르게 설정하여 실험을 진행한 결과, 35℃ 및 50℃에서 진행된 IHC 결과와 비교하여 40℃ 및 45℃에서 진행한 IHC 실험 결과가 FISH 결과와 높은 상관관계를 보였다.
상기의 ALK 항체 반응 이후, 연속되는 염색 단계에서는 상기 ALK 항체와 결합하는 2차 항체(secondary antibody)를 처리하는 단계 및 발색기질을 처리하는 단계를 포함한다. 상기의 2차 항체를 처리하는 단계에서는 이에 제한되지는 않으나, ABC(Avidin-Biotinylated enzyme complex) 방법이나 Enzyme-labeled secondary antibody 중 택일하여 실시할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 전자의 ABC 방법으로 2차 항체를 처리하였다(실시예 2 참조).
또한, 2차 항체 처리 후, 사용하는 상기의 발색 기질은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), DAB(diaminobenzidine), TMB(3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine), BCIP/INT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF(New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), 4-CN, AEC(3-amino-9-ethylcarbasole), X-Gal 및 IPTG(isopropyl beta-D-thiogalactoside)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, HRP(Horseradish Peroxidase)를 부착시킨 검출계(detection system)를 사용하고 발색 기질로서 DAB(diaminobenzidine)를 사용하였다(실시예 2 참조).
본 발명에 따른 표본의 염색방법을 통해 염색된 표본 패턴을 분석하는 단계는 세포질이 염색된 세포 수를 판단하는 단계 또는 세포질의 염색 강도를 판단하는 단계를 포함한다. 즉 본 발명은 세포질이 염색된 세포 수 및 세포질의 염색 강도를 파악하여, 단백질 발현 정도를 파악할 수 있으며, 파악된 단백질 발현 정도를 통해 ALK 유전자 전위여부를 판단하는 단계를 통해 ALK 유전자 재배열 검출방법을 제공한다.이에, 본 발명자들은 상기 염색 패턴 분석 결과를 스코어링 시스템을 통해 점수로 나타내었다.
우선, 표본의 염색 패턴 분석에 있어 세포질이 염색된 세포수를 판단하여 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포의 수가 5% 미만일 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 음성으로 판단한다. 다만 이러한 경우, 스코어는 세포질이 염색된 세포의 수가 0% 초과 5% 미만일 경우는 1+로, 만약 세포질이 염색된 세포가 전혀 없을 경우(no staining, 0%)는 0으로 정의한다.
또한, 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 동시에 세포질의 염색 강도를 판단하여, 그 염색 강도가 약한 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 음성으로 판단하며, 스코어는 상기의 경우와 동일하게 1+로 정의한다.
이와 달리, 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 강한 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 양성이라고 판단할 수 있으며, 스코어는 3+으로 정의한다.
다만, 세포질이 염색된 세포 수가 총 세포수를 기준으로 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도의 명도가 중등도인 경우, ALK 유전자의 전위여부를 확인하는 단계로서 FISH(fluorescence in situ hybridization), SISH(Silver In Situ Hybridization) 및 PCR(polymerase chain reaction)로 구성된 군 중에서 선택되는 방법을 더 포함하여 실시하여야 하며, 스코어는 2+로 정의한다. 본 발명의 일실시예에서는 상기의 경우에 FISH 검사 방법을 추가로 실시하여, ALK 유전자 재배열 여부를 판단하였다.
상기의 염색 강도에 대한 판단에서, 염색 강도가 “강한 경우”는 구체적으로 그 명도가 6 이상인 경우를 의미하며, “중등도인 경우”는 명도가 4 초과 6 미만인 경우를 의미고, “약한 경우”는 명도가 0 초과 4 이하인 경우를 말한다.
상기 “명도”는 색상끼리의 명암상태 또는 색채의 밝기를 나타내는 성질로 이러한 밝음의 감각을 척도화한 것을 말하는데, 무채색과 유채색 모두에서 나타나는 밝기를 명도라 한다. 백색에 가까울수록 높은 명도이며 흑색에 가까울수록 낮은 명도에 해당한다.
본 발명에 따른 스코어에 따른 명도의 범위는 발색기질에 따른 색상의 명도차이를 말하는 것으로, 특정 색상의 명도에 한정되지는 않으나, 바람직하게 사용될 수 있는 발색기질에 따라 스코어에 따른 색상의 명도단계는 다음과 같으며, 색상을 나타내는 괄호안의 기호는 1905년 A.H.먼셀이 고안한 먼셀표색계(Munsell color system)에 따른 색상의 표기법에 의한 것이다. 이는 1943년 미국 광학회 측색위원회가 수정하여 국제적 기준으로 통용되고 있는 색표시법으로, 색을 색상(Hue)명도(value)채도(chroma)의 세 가지로 분류하여 H V/C라는 형식에 의해 번호로 표시한다. 따라서 본 발명에서 염색 패턴 기준으로 사용되는 “명도” 또한 먼셀표색계에 기초한 것으로, 이에 따라 0(백색)~10(흑색)까지의 수로 나타내었다.
우선, 본래 발색기질의 색상이 갈색(brown)을 나타내는 발색기질, 예컨대 DAB(diaminobenzidine), BCIP/INT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium) 등의 경우, 1+에 해당되는 명도의 색상은 연한 노랑 주황(10YR 8/7), 흐린 황갈색(10YR 6/4)를 말하며, 2+에 해당되는 명도의 색상은 황갈색(10YR 5/9)과 탁한 황갈색(10YR 5/5)을 말한다. 3+에 해당되는 명도의 색상은 갈색(10YR 4/7) 및 탁한 갈색(10YR 4/4)을 말한다.
본래 발색기질의 색상이 빨강(red)을 나타내는 발색기질, 예컨대 NF(New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), AEC(3-amino-9-ethylcarbasole) 등의 경우, 1+에 해당되는 명도의 색상은 흐린 분홍(7.5R 8/4), 탁한 분홍(7.5R 6/6)을 말하며, 2+에 해당되는 명도의 색상은 흐린 빨강(7.5R 4/6)과 탁한 빨강(7.5R 5/8)을 말한다. 3+에 해당되는 명도의 색상은 빨강(7.5R 4/14), 선명한 빨강(7.5R 4/16), 진한 빨강(7.5R 3/12)을 말한다.
본래 발색기질의 색상이 보라(purple)를 나타내는 발색기질, 예컨대 BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), 4-CN, IPTG(isopropyl beta-D-thiogalactoside) 등의 경우, 1+에 해당되는 명도의 색상은 흐린 보라(2.5P 6.5/4), 연한 보라(2.5P 7/7)를 말하며, 2+에 해당되는 명도의 색상은 탁한 보라(2.5P 5/5)를 말한다. 3+에 해당되는 명도의 색상은 보라(2.5P 3/9) 및 진한 보라(2.5P 2/9)를 말한다.
본래 발색기질의 색상이 파랑(blue)를 나타내는 발색기질, 예컨대 TMB(3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine), X-Gal 등의 경우, 1+에 해당되는 명도의 색상은 연한 파랑(5PB 8/7)을 말하며, 2+에 해당되는 명도의 색상은 흐린 파랑(5PB 5.5/5)을 말한다. 3+에 해당되는 명도의 색상은 파랑(5PB 3/9), 탁한 파랑(5PB 4/5), 연한 남색(5PB 3/5)을 말한다.
본래 발색기질의 색상이 녹색(green)을 나타내는 발색기질, 예컨대 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)의 경우, 1+에 해당되는 명도의 색상은 연한 녹연두(2.5G 8/8), 흐린 녹연두(2.5G 7/5)를 말하며, 2+에 해당되는 명도의 색상은 흐린 초록(2.5G 5/5) 및 탁한 녹연두(2.5G 5.5/5)를 말한다. 3+에 해당되는 명도의 색상은 녹색(2.5G 3/9), 탁한 녹색(2.5G 3.5/5) 및 진초록(2.5G 3/6)을 말한다.
본 발명자들은 ALK의 유전적 상태를 반영할 수 있는 IHC의 염색 패턴 분석에 대한 최고의 기준을 결정하기 위하여, 현재 병리학 검사실에서 ALK 유전자 재배열 검출방법으로 사용되고 있는 FISH를 통한 ALK 전위 여부 검사 결과를, 본 발명에 의한 IHC를 통한 ALK 전위 여부 검사 결과와 상호 비교하였다(실시예 6 참조). 본 발명자들이 실시한 ALK FISH 검사는 <실시예 3>에서와 같은 방법으로 수행하였고, 그 결과 도출된 ALK FISH-양성 및 FISH-음성으로 판단된 NSCLC 조직들의 임상병리학적 특성은 표 1 내지 3에서와 같다.
상기의 ALK FISH 결과와 본 발명에 따른 IHC 방법으로 ALK 단백질 발현을 분석한 결과, 모든 ALK IHC 3+ 케이스들 전부는 AKL FISH-양성이었고, 모든 ALK IHC 0 혹은 1+케이스들은 ALK FISH-음성임이 발견되었다. ALK IHC 2+ 케이스들의 경우는 30% (3/10)가 ALK FISH-양성이었고, 나머지 70% (7/10)는 FISH-음성이었다. 이러한 결과에 기초하여 ALK IHC 0/1+를 생물학적 음성으로, ALK IHC 3+를 생물학적 양성으로, ALK IHC 2+는 불확실한(equivocal) 중간층, 즉 그레이존(grey zone)으로 가정했을 때, 생물학적 ALK IHC 해석과 FISH는 강한 상관관계를 보였다((p= 0.000 by Pearson’s chi-square test, Pearson’s R=0.933, p=0.000). 즉, ALK IHC 2+(equivocal) 케이스들을 제외하고, ALK IHC(0,1+ vs 3+) 및 ALK FISH(음성 대 양성)은 완벽하게 상관관계을 이뤘으며, 이는 ALK IHC 3+가 FISH-양성을, 0/1+는 FISH-음성을 강력하게 예측할 수 있었다(표 4 참조).
또한, 이러한 결과를 확인하기 위한 밸리데이션 세트(validation set)로서, 폐 선암(ADC)가 예상되는 187명의 환자로부터 획득한 표본을 대상으로 검증 실험을 한 결과, 표 4에서와 같이 ALK IHC와 FISH 사이의 일관적인 관계가 확인되었다. 그리하여 본 발명자들은 ALK IHC와 ALK FISH의 임상적 적용의 진단적 알고리즘을 완성할 수 있었다(도 6 참조).
따라서, 본 발명은 피험체로부터 공급받은 표본에 ALK 항체반응 및 염색단계를 포함한 ALK 유전자 재배열 검출방법을 제공할 수 있으며, ALK 유전자는 전위로 인해 다른 유전자와의 융합 유전자를 형성하여 세포 종양화에 기여한다고 알려져 있는바, 상기 ALK 유전자 재배열 검출 방법을 포함한 암 진단방법 또한 제공할 수 있다. 특히, ALK 유전자 재배열은 비소세포성 폐암(NSCLC) 환자의 5% 정도에서 발견된다고 보고되고 있는바, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 ALK 유전자 전위는 ALK와 유사하게 유전자 돌연변이로 하여금 종양화를 발생시킨다고 알려진 EGFR 또는 K-RAS 유전자 돌연변이와는 상호배타적임을 특징으로 하면서도(실시예 4 및 표1 내지 3 참조), 성별 취향을 제외하고 EGFR과 ALK 유전자 변경 그룹 사이에 환자 프로파일이 비슷한 것을 고려할 때, EGFR-타켓팅 에이전트(targeting agent)가 듣지 않는 환자들은 ALK 유전자 전위를 가질 것이라 사료되는바, 본 발명은 기존의 EGFR-타겟팅 치료제로 효과를 보지 못했던 암 환자들에게 ALK 억제제 투여 대상 여부를 신속하게 판가름 할 수 있게 하는 ALK 유전자 재배열 검출 방법을 제공할 수 있으며, 이로써 분자적 타겟이 될 수 있는 치료법(therapy)의 범위를 넓힐 수 있는 효과를 지닌다고 하겠다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 참고예 >
환자 및 샘플 획득
465명의 NSCLC 환자들은 2003년 5월부터 2008년 5월까지 분당서울대학교병원에서 외과적 절제술을 받았으며 이를 통해 465개의 환자샘플을 획득하여 조직 마이크로어레이(TMA)에 사용하였다. 모든 케이스들은 결과적으로 초기 폐 기원의 NSCLC로 진단되었으며, 적절한 IHC에 의한 병리학적 슬라이드와 의료 기록을 통해 다시 한번 검토함으로서 NSCLC임을 확인하였다. 465개의 NSCLC 케이스들은 269개의 ADCs(선암, adenocarcinoma) 케이스와 169개의 SCCs(편평상피세포암, squamous cell carcinoma), 10개의 ASC(선편평암, adenosquamous carcinoma), 5개의 PLC(다형성암, pleomorphic carcinomas), 2개의 LCC(대세포암, large cell carcinomas), 8개의 LCNEC(대세포 신경내분비 암종, large cell neuroendocrine carcinomas), 한 개의 CS(암육종, carcinosarcoma)와 1개의 lymphoepithelioma-like carcinoma로 이루어져 있었다. 총 465명의 환자의 평균 나이는 63.8세였고 21세부터 84세까지의 환자들로 구성되어 있었다. 조직 부착(tissue attachment) 또는 저품질(poor quality) 문제로 인해 453 케이스들에서는 FISH 결과를 살폈다.
밸리데이션 세트(validation set)로, 본 발명가들은 분당서울대학교병원에서 2009년 9월부터 2010년 6월 까지 187명의 폐 선암(lung ADC) 환자들로부터 외과적으로 절제한(surgically resected) 모든 섹션 또는 조직검사한 샘플(biopsied samples)들을 IHC를 통해 실험을 실시하였다. 더불어 IHC 1+, 2+ 및 3+에 해당하는 모든 케이스들은 FISH를 통해 다시 평가되었다. 본 실험은 분당서울대학교병원의 기관 윤리 심의 위원회(institutional ethics review boards)로부터 승인 받았다.
통계처리
본 발명의 실시예에서 수행한 실험들의 분석결과는 SPSS 버전 12.0(Systat, Chicago, IL, USA)를 사용하여 맨-휘트니 테스트(Mann-Whitney test), 피어슨의 카이-스퀘어 테스트(Pearson’s chi-square test)와 피어슨의 R(Pearson’s R)을 기초로 통계적으로 분석했으며, p < 0.05 때 통계적인 유의성이 있다고 보았다.
< 실시예 1>
조직 마이크로어레이 준비
대표적인 중요 조직 섹션(지름 2mm)은 파라핀 블록으로 포매하였고, 새로운 조직 마이크로어레이(TMA) 블록에서 트레핀(trephine) 기계(Superbiochips Laboratories, Seoul, Korea)를 이용하여 이전에 보고된 바(Lee HJ, Xu X, Choe G, et al, 2010)에서와 같이 정렬하였다.
< 실시예 2>
면역조직화학( Immunohistochemistry ) 검사법
포르말린으로 고정되고, 파라핀으로 포매한 FFPEs(paraffin-embedded tissues)는 4μm 두께로 섹션하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 벤타나 자동 면역염색기(Ventana automated immunostainner)(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)를 이용하여 염색하였다.
구체적으로 섹션된 슬라이드들은 60℃에서 1시간동안 건조되었고, EZ 프렙(EZ Prep)(Ventana Medical Systems)을 이용하여 75℃에서 4분 동안 탈파라핀화(deparaffinized) 되었다. 세포 컨디셔닝(열 전처리)는 Tris/Borate/EDTA를 포함한 CCl 용매에서 20분 동안 100℃ 온도에서 이뤄졌다.
ALK 항체(mouse monoclonal, clone 5A4)는 노보카스트라(Novocastra, Newcastle, UK)사의 것을 사용하였으며, 1:30으로 희석시켜 처리하였고 42℃에서 2시간 동안 인큐베이트 하였다. 시그날은 i-view 검출 키트(detection kit)(Ventana Medical Systems)를 사용하여 LSAB(labelled streptavidin-biotin) 방법에 기초하여 검출하였다. 키트의 각 단계는 37˚C에서 억제제의 처리(1% H2O2, 4분), 바이오티닐레이티드(biotinylated) Ig(8분), 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-Horseradish peroxydase, 8분), DAB(chromogen+substrate, 8분)와 코퍼(Copper, 4분)로 구성되었다. 또한, 대조염색(Counterstaining)은 메이어의 헤마토자일린(Mayer’s hematoxylin)(ScyTek, Logan, UT)으로 상온에서 2분 동안 행했다.
모든 케이스들은 세 명의 병리학자(J.H.P., G.C. and J.H.C.)들에 의해 아래의 평가 시스템을 이용하여 평가되었고, 점수로 매겨졌다; 1) 염색이 되지 않았을 경우는 0, 2) 양성 부분이 종양 세포들의 5% 미만일 경우나 혹은 양성적으로 염색된 세포가 차지하는 부분에 상관없이 약하고 희미한 염색 강도(weak and faint intensity)일 경우로 염색의 명도가 6 이상 10 이하인 경우는 1+, 3) 종양 세포들의 5% 를 초과하는 부분이 양성이면서 보통 정도(중등도)의 염색 강도(moderate intensity)를 보일 경우로 염색의 명도가 4 초과 6 미만인 경우는 2+, 4) 종양 세포들의 5%를 초과하는 부분이 양성이면서 강한 염색 강도(strong intensity)를 보일 경우인 염색의 명도가 0 초과 4 이하인 경우는 3+.
< 실시예 3>
FISH ( Fluorescence in situ hybridization ) 검사법
ALK를 위한 FISH는 TMA를 이용한 테스트 세트에서 모든 케이스를 대상으로 시행되었고, 14개의 케이스들은 이전에 보고된 것(Boland JM, Erdogan S, Vasmatzis G, et al, Hum Pathol 40:1152-1158, 2009)처럼 밸리데이션 세트에서 IHC를 통해 ALK 양성으로 밝혀졌다.
포르말린으로 고정한 파라핀-엠베디드(FFPE) 조직 블록에서 절단한 3μm-두께의 섹션들은 탈파라핀하였고, 탈수하여 0.2N HCl에 담가놓은 후 세척하였다. 이 섹션들은 0.01M 구연산염(citrate) 버퍼에 담가놓고, 전자레인지에서 5분 동안 끓였다. 그리고 80℃에서 30분간 전처리 시약(pretreatment reagent)(Abbott Molecular Inc., Abbott Park, IL)을 처리한 후, 프로테아제 버퍼(Abbott Molecular Inc.)와 프로테아제를 섞어 반응시켰다.
듀얼-프로브 혼성화(dual-probe hybridization)는 LSI ALK 듀얼 컬러 프로브(dual color probe)를 이용하여 수행하였으며, 상기 프로브는 밴드(band) 2p23을 스펙트럼레드와 스펙트럼그린을 가지고 ALK 유전자 브레이크포인트(break point)(Vysis, Downers Grove, IL)에서 혼성화시켰다. 프로브 혼합을 마친 후에는· 프로테아제를 처리했고, humidified atmosphere의 75℃ HybriteTM(Vysis)에서 5분 동안 프로브와 타켓 DNA를 변성시키기 위해 인큐베이트하였으며, 순차적으로 혼성화를 가능하게 하기 위해 37℃에서 16시간 동안 다시 인큐베이트하였다. 그런 다음에는 샘플을 세척(washing)하기 위해 0.3% NP-40(Abbott Molecular Inc.)/2X 살린 구연산나트륨(Saline Sodium Citrate)에 담갔다.
핵의 대조염색(counterstaining)을 위해, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)II(Vysis)과 anti-fade 화합물(p-phenylenediamine)을 사용하였고, 각 프로브의 신호는 유침물체(oil immersion objective)와 트리플-패스 필터(triple-pass filter (DAPI/Green/Orange, Vysis)가 탑재된 현미경 하에서 평가되었다.
모든 FISH 실험들은 ALK에 대한 IHC 결과를 알지 못한 채 진행되었고, ALK 로커스 재배열에 대한 FISH는 분석된 만약 200개의 세포 중 15%가 ALK 로커스에 인접한 형광 프로브가 절단된 것으로 나타난다면, 양성으로 판단하였다. 절단되어 나타난 거리는 시그널 사이즈를 사용하여 측정하였다.
두 개의 융합(orange과 green adjacent, 또는 fused yellow) 시그널을 나타내는 정상적인 간기(interphase) 핵과는 달리, 종양 세포의 5% 이상에서 세 개의 시그널이 모두 나타났다. 즉 하나의 융합 시그널(native ALK)과 각각 하나의 빨간색과 녹색(“break-apart”)의 시그널(translocated ALK)은 예전에 보고된 연구에 따라 ALK 유전자 전좌(translocation)로 해석하였다. 또한, 종양 세포의 15% 이상에서 하나의 융합 시그널(native ALK)과 함께 녹색 시그널과 대응되지 않는 하나의 빨간 시그널이 발견되었는데, 이들은 “독립된 빨간 시그널(isolated red signal, IRS)” 패턴으로 지정하였다(도 1 참조).
< 실시예 4>
EGFR 및 K- RAS 돌연변이 분석
ALK FISH-양성을 보이는 모든 케이스들은 이전에 보고된(Chung JH, Choe G, Jheon S, et al., J Thorac Oncol 2009) Direct DNA sequencing 방법과 PCR(polymerase chain reaction) 방법에 따라 코돈 12, 13 및 61에서의 K-ras 돌연변이 및 엑손(exon) 18에서 21까지의 EGFR 돌연변이를 분석하였다. DNA는 포르말린으로 고정된 파라핀-포매(embedded) 조직으로부터 추출하였고, PCR 증폭은 10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2.5mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphates), 각 프라이머 0.5μM, 0.9 units Taq DNA 중합효소(polymerase)(Takara Bio, Shiga, Japan)를 포함한 총 20μL 부피의 용매에서 수행되었다. 또한, 94℃에서 2분 동안 프리인큐베이션(preincubation) 후에, DNA는 다음의 조건하에서 35 사이클(cycles)을 통해 증폭되었다 : 94℃에서 30초간 변성과정(denaturation), 풀림과정(annealing) 및 72℃에서 30초간 신장과정(elongation).
PCR 생산물(products)들은 BigDye Terminator version 3.1 cycle sequencing kit(AppliedBiosystems, Foster, CA)로 처리되었으며, 시퀀스 데이터(sequence data)는 ABI PRISM 3100 DNA Analyzer(Applied Biosystems)에서 생성되어졌다. 모든 시퀀스 변이(sequence variants)들은 독립적 PCR 증폭의 생산물을 양방향에서 시퀀싱함으로써 확인하였다.
< 실시예 5>
ALK FISH -양성과 음성 NSCLC 의 임상병리학적 특성( Clinicopathologic characteristics) 분석
총 453개의 NSCLC는 조직 마이크로어레이(TMA) 섹션에서 FISH를 통해 적절하게 평가되었고, 12개의 TMA 코어(cores)들은 좋지 않은 혼성화 상태(poor hybridization quality)로 인해 제외하였다. 하기의 표 1에서와 같이, ALK FISH-양성과 음성 케이스들 사이의 임상병리학적 특성의 비교를 살펴보면, ALK FISH-양성 NSCLC은 총 NSCLC 중 4.2%(19/453)를 차지하였고, 이들은 ALK FISH-음성 NSCLC(p=0.001, by Mann-Whitney test, two-sided)와 비교하여 조직학적 ADC 존재와 매우 강한 연관이 있었다. 테스트 환자군 세트와 밸리데이션 세트(validation set)에서 ALK FISH 양성인 환자와 음성인 환자간의 임상병리학적 차이를 함께 고려하였을 경우, 두 집단의 합인 전체 비소세포 폐암에서 ALK FISH-양성 환자들은 음성(p=0.006, by Mann-Whitney test, two-sided) 환자들보다 어렸으며, 밸리데이션 환자 세트에서도 이러한 경향이 관찰되었으나(p=0.014, by Mann-Whitney test, two-sided), 테스트 환자 세트에서는 유의한 차이가 없어(p>0.05), 연령 분포가 ALK 유전자 재배열된 이상 현상을 보이는 폐암을 이루는 강한 특징은 아닌 것으로 관찰되었다. 또한 종양의 사이즈와 성별은 두 그룹 사이의 두드러진 차이점은 아닌 것을 알 수 있었다.
Figure 112010077314805-pat00001
Figure 112010077314805-pat00003
< 실시예 6>
IHC 에 따른 ALK 단백질 발현 및 FISH 결과와의 상관관계 분석
ALK 단백질 발현 패턴은 월등히 우세한 세포질(cytoplasmic) 염색 패턴을 가진 종양 세포에서 특이적으로 관찰되었다. 폐 세포에 연접한 비종양성 기관지 상피(Nonneoplastic bronchial epithelium), alveolar type1 및 type2 폐포세포(pneumocytes), 중간엽 조직(mesenchymal tissue) 및 항염증 세포는 모든 465개의 케이스에서 전부 ALK IHC 음성이었기 때문이다.
ALK가 면역염색된(immunostained) 종양세포 비율은 ALK 단백질 발현이 발견된 대부분의 케이스들에서 사실상 총 종양 세포들의 5% 보다 많이 나타났다. 염색 강도의 정도는 약하고 희미한 세포질 염색(cytoplasmic staining)에서부터 강한, 다크 브라운의 세포질 염색까지 다양하였다. IHC에 의한 ALK 단백질 발현은 NSCLC의 8.6%(40/465)에서 발견되었고, 이는 1+(14/40, 35%), 2+(10/40, 25%) 및 3+(16/40, 40%)로 구성되었다(도 2 내지 5 참조).
유전자 재배열 상태를 반영하는 IHC 양성에 대한 최고의 기준을 결정하기 위해 본 발명자들은 표 4에서와 같이 ALK IHC 및 FISH의 결과를 비교하였다. 모든 ALK IHC 3+ 케이스들은 FISH-양성이었고, 모든 ALK IHC 0/1+ 케이스들은 FISH-음성이었다. ALK IHC 2+ 케이스들의 경우, 30%(3/10)은 FISH-양성이었고 70%(7/10)는 FISH-음성이었다.
그리하여 본 발명가들은 ALK FISH 상태에 대한 ALK IHC의 예측가능성을 분석하였다. ALK IHC 0/1+를 생물학적 음성으로, ALK IHC 3+를 생물학적 양성으로, ALK IHC 2+는 불확실한 것(equivocal)으로 가정했을 때, 생물학적 ALK IHC 해석과 FISH는 강한 상관관계를 보였다((p= 0.000 by Pearson’s chi-square test, Pearson’s R=0.933, p=0.000). ALK IHC 2+(equivocal) 케이스들을 제외하고, ALK IHC(0,1 vs 3) 및 ALK FISH(음성 대 양성)은 완벽하게 상관관계을 이뤘으며, 이는 ALK IHC 3+가 FISH-양성을, 0/1+는 FISH-음성을 강력하게 예측할 수 있음을 암시하는 것이었다. 따라서 본 발명자들은 NSCLC에서의 ALK IHC와 ALK FISH의 임상적 적용의 진단적 알고리즘을 완성할 수 있었다(도 6 참조).
Figure 112010077314805-pat00004
< 실시예 7>
ALK FISH -양성 NSCLC 를 찾아내기 위한 IHC 해석 기준의 입증
밸리데이션 세트(validation set)로서, 본 발명가들은 폐 ADC가 유망되는 187명의 환자들로부터 외과적으로 절제한(surgically resected) 또는 생체검사(biopsied)를 통해 획득한 표본을 대상으로 IHC와 FISH 검사를 실시하였다. 그들 중, 14개의 케이스를 ALK 면역염색에 양성이었는데, 이들의 염색패턴을 분석한 결과 ALK IHC 1+은 2개 케이스, ALK IHC 2+는 6개 케이스 및 ALK IHC 3+는 6개 케이스였다. 상기 14개 케이스들은 9명의 여성과 5명의 남성으로부터 채취한 7개의 외과적 절제술을 통한 표본 및 7개의 생체검사(biopsy)를 통한 표본으로 구성되어 있었으며, 환자들의 나이는 28세에서 84세까지로 평균 연령은 55.1세였다.
FISH 테스트 결과 IHC 음성인 환자들은 전부 FISH 음성이었으며, IHC 1+(생물학적 음성)의 2개 케이스들은 모두 FISH-음성이었던 반면, IHC 3+(생물학적 양성)의 6개의 모든 케이스들은 FISH-음성이었고(표 5 및 6 참조), IHC 2+의 케이스들은 50%(3/6)가 FISH-양성을 나타내었다. FISH-양성 케이스들은 8개의 Break-apart 패턴 및 2개의 IRS 패턴으로 구성되었다.
예상한대로, 모든 ALK FISH-양성 케이스들은 EGRF 및 K-RAS 돌연변이에 대해 음성이었으나, 반면에 2개의 ALK IHC 1+ 케이스들은 모두 EGFR 엑손(exon) 19 결실 돌연변이(deletion mutation)를 나타냈다. 이와 더불어, ALK IHC 1+(생물학적 음성) 및 3+(생물학적 양성) 케이스들의 FISH에 대한 완벽한 예측가능성 또한 검증 세트에서 유지되었다. 또한, ALK IHC 2+ 케이스들의 상당 부분은 ALK FISH-양성이었는데, 이는 TMA를 사용한 테스트 환자군 세트(test patients set)의 결과에서도 일관적이었다.
Figure 112010077314805-pat00005
Figure 112010077314805-pat00006
< 실시예 8>
항체 반응 조건에 따른 ALK IHC 와 FISH 와의 상관관계 분석
본 발명에 따른 ALK 항체 반응을 통한 ALK IHC 실험 결과의 정확도를 검증하기 위하여, 다양한 항체 반응의 조건에 따른 표본들의 ALK IHC 결과와 이의 FISH 결과와의 상관관계를 분석해보았다. ALK 단백질의 과발현을 검출해내는 IHC 결과가 ALK 유전자 재배열을 검출해내는 FISH 결과와 높은 상관관계를 보인다면, 고비용의 장시간이 소요되는 FISH 대신 경제적이며 신속한 IHC 방법을 사용하여 ALK 유전자 재배열의 검출이 가능할 것이기 때문이다.
따라서 본 발명자들은 본 발명에서 규명하고 있는 ALK 항체반응 조건이 ALK IHC와 FISH 와의 높은 상관관계를 보증해줄 수 있는 것인지 확인해보기 위하여 IHC의 다양한 반응 조건에 따른 FISH 와의 상관관계를 비교 분석해보았다. 즉, 다양한 ALK 항체 반응에 따른 표본들의 IHC 결과를 본 발명의 ALK IHC 염색 패턴 분석 기준에 따른 스코어링 시스템을 통해 점수로 분류하고, 그 중 0, 1+ 스코어를 가진 “생물학적 음성”으로 판단되는 군 및 3+ 스코어의 “생물학적 양성”으로 판단되는 군과의 FISH 결과와의 일치율을 비교하였다. “생물학적 음성군”의 경우 FISH 결과 ALK 전위 여부가 음성, 즉 ALK 유전자 재배열이 발생하지 않았을 경우 두 결과(IHC와 FISH)가 일치한다고 보았고, “생물학적 양성군”의 경우는 FISH 결과 ALK 전위가 발생되어 ALK 유전자 재배열이 생성이 확인되었을 경우 IHC 결과와 FISH 결과가 일치하는 것으로 판단하였다.
항체 반응 조건에 따른 ALK IHC 결과에 대한 정확도를 측정하기 위하여, ALK 항체를 1:10, 1:15, 1:20, 1: 25, 1:30, 1:35, 1:40의 비율로 ALK IHC 실험을 실시하였다. 그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이 1:20이나 1:40 등의 비율로 ALK 항체를 처리한 경우에 비해 1:25 및 1:35의 비율로 희석하여 ALK 항체를 처리하였을 때 IHC 결과와 FISH 간의 높은 일치율, 즉 상관관계를 확인할 수 있었다.
Figure 112010077314805-pat00007
또한, 본 발명자들은 또 다른 ALK 항체 반응 조건인 인큐베이션 시간에 대한 비교 실험을 실시하였다. 표 8에서와 같이 다양한 인큐베이션 시간에 따라 IHC 실험을 수행한 결과, 60분 및 90분, 150분 및 180분 동안 표본 샘플과 ALK 항체를 인큐베이션 시켰을 때와 달리, 110분 및 130분 동안 ALK 항체와 반응시킨 IHC 실험의 결과가 FISH와 높은 일치율을 나타내었다.
Figure 112010077314805-pat00008
더불어, 본 발명자들은 항체 반응 온도에 대한 비교 실험을 실시하였다. 상기 비교 실험에서 밝혀진 최적의 ALK 반응 조건을 반영하여, ALK 항체를 1:30의 비율로 희석하여 120분간 인큐베이션 시키면서, 반응 온도를 다르게 설정하여 실험을 진행한 결과, 표 9에서와 같이 35℃ 및 50℃에서 진행된 IHC 결과와 비교하여 40℃ 및 45℃에서 진행한 IHC 실험 결과가 FISH 결과와 높은 상관관계를 보였다.
Figure 112010077314805-pat00009
그리하여, 본 발명자들은 ALK 항체를 1:25~1:35 비율로 희석하여 40℃~45℃ 온도에서 90분~120분 동안 인큐베이션 시키는 ALK 항체 반응이 FISH 결과와 가장 일치율이 높은 탁월한 ALK IHC 결과를 도출해 낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 전처리된 표본에 ALK 항체를 1:25~1:35 비율로 희석하여 처리하고, 40℃~45℃ 온도에서 110분~130분 동안 반응시키는 단계;
    상기 ALK 항체를 반응시킨 표본을 염색하는 단계; 및
    표본의 염색 패턴을 분석하는 단계를 포함하는 ALK 유전자 재배열 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 ALK 항체 반응은 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역 블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 표본의 전처리는 파라핀 절편을 탈파라핀화 시키고, TBE(Tris-Borate-EDTA) 버퍼를 포함한 사염화탄소(CCl4) 용매에서 95℃~105℃, 15분~25분간 열처리하는 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 염색하는 단계는,
    상기 ALK 항체와 결합하는 2차 항체를 처리하는 단계; 및
    발색기질을 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 발색기질은 BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium), DAB(diaminobenzidine), TMB(3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine), BCIP/INT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/iodonitrotetrazolium), NF(New fuchsin), FRT(Fast Red TR Salt), ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), 4-CN, AEC(3-amino-9-ethylcarbasole), X-Gal 및 IPTG(isopropyl beta-D-thiogalactoside)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 표본의 염색 패턴을 분석하는 단계는 세포질이 염색된 세포 수를 판단하는 단계 또는 세포질의 염색 강도를 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 미만일 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 음성인 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 약한 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 음성인 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 강한 경우, ALK 유전자 재배열 여부는 양성인 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 염색된 세포수를 판단할 때 분석대상의 총 세포수를 기준으로 세포질이 염색된 세포 수가 5% 이상이면서 세포질의 염색 강도가 중등도인 경우, FISH(fluorescence in situ hybridization), SISH(Silver In Situ Hybridization) 및 PCR(polymerase chain reaction)로 구성된 군 중에서 선택되는 방법으로 ALK 유전자의 전위여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 ALK 유전자 재배열 검출방법.
  12. 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 ALK 유전자 재배열 검출방법을 이용하여 환자의 시료로부터 재배열된 ALK 유전자 포함 여부를 판단하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 암은 폐암임을 특징으로 하는 환자의 시료로부터 재배열된 ALK 유전자 포함 여부를 판단하는 방법.
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