Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN105671211A - 小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用 - Google Patents

小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105671211A
CN105671211A CN201610212457.8A CN201610212457A CN105671211A CN 105671211 A CN105671211 A CN 105671211A CN 201610212457 A CN201610212457 A CN 201610212457A CN 105671211 A CN105671211 A CN 105671211A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
kbv
sbv
pprv
primer pair
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610212457.8A
Other languages
English (en)
Inventor
翟少伦
魏文康
吕殿红
温肖会
贾春玲
周秀蓉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610212457.8A priority Critical patent/CN105671211A/zh
Publication of CN105671211A publication Critical patent/CN105671211A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了同时鉴别检测小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒的多重PCR方法。多重PCR方法引物包括PPRV引物对、SBV引物对及KBV引物对。该方法利用不同引物对扩增出不同大小的病毒核酸片段来达到鉴别诊断的目的。本发明可同时检测并区分小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点，可用于牛羊临床样品的检测。

Description

小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用
技术领域
本发明专利属于动物病原微生物检测技术领域，具体的说是一种同时鉴别小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒的多重RT-PCR检测方法。
背景技术
近年来，农业部及各省市农业部门出台了一系列促进草食畜牧业发展的文件和措施，牛羊产业得到前所未有的发展良机。然而，一些牛羊外来病、新发传染病(如小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒)常引起牛羊大量发病、死亡，养殖场损失严重。
小反刍兽疫(Pestedespetitsruminants，PPR)，又名小反刍兽假性牛瘟(pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoenteritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitis-pneumoenteritiscomplex)，是由小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，包括绵羊、山羊、水牛、岩羊、盘羊等，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征，病死率高。非洲、亚洲、欧洲等国家流行广泛，影响严重。
施马伦贝格病(Schmallenbergdisease，SBD)，由施马伦贝格病毒(Schmallenbergvirus，SBV)感染引起，临床症状为发热、腹泻、乏力等，以及奶牛产奶量降低，新生幼畜出现缺陷等。目前，该病席卷整个欧洲，部分非洲和亚洲国家也被波及。
库布病毒(Kobuvirus，KBV)是小核糖核酸病毒科库布病毒属成员，为无囊膜RNA病毒，库布病毒属至少分为4个种：人库布病毒(也称Aichi病毒)、牛库布病毒、羊库布病毒及猪库布病毒。目前，库布病毒引起的临床症状主要为腹泻。呈世界流行。
当前，牛羊等养殖场中病原混合感染严重。且现有的检测方法检测病原单一，存在着费时费力、不能同时鉴别小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒等三种病毒的缺点。
发明内容
本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对及反应体系优化，构建小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法，实现小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒“一样三检”的快速检测效果。该方法为小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒诊断提供一种快速检测方法，填补三种病毒不能同时诊断的空白，为牛羊疫病的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
本发明专利要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
本发明涉及的检测引物有3对，分别是PPRV引物对、SBV引物对及KBV引物对，其中用于PPRV检测的PPRV引物对包括PPRV-F和PPRV-R两条引物，用于SBV检测的SBV引物对包括SBV-F和SBV-R两条引物以及用于KBV检测的KBV引物对包括KBV-F和KBV-R两条引物。
本发明的特征还涉及到以下步骤。
配置50μLPCR反应体系：2×Buffer25μL，Mix1μL，PPRV-F、PPRV-R、SBV-F、SBV-R、KBV-F和KBV-R各0.5μL，PPRV、SBV及KBV模板分别3μL，RNAse-freeH2O12μL；
PCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min；
结果观察：取10μLPCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。
进一步的，本发明建立的方法，其特征在于包括了本发明所述的引物。
更进一步的，本发明所述的引物用于检测小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒。
所述的步骤用于检测小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒的单一感染或混合感染。
本发明所述的应用或者检测方法不仅仅用于牛羊养殖场的临床样品检测，还可以应用于城市动物园、野生动物园中的反刍动物样品检测。
本发明公开了同时鉴别检测小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒的分子方法，具有特异性强、敏感性高、省时省力等优点。该方法为小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒的诊断提供一种快速检测方法，填补三种病毒不能同时诊断的空白，为牛羊疫病的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
附图说明
图1是多重PCR扩增及特异性试验结果结果；M：DNAMarker2000；1：PPRV阳性质粒；2：SBV阳性质粒；3：KBV阳性质粒；4：PPRV+SBV阳性质粒；5：PPRV+KBV阳性质粒；6：KBV+SBV阳性质粒；7：PPRV+KBV+SBV阳性质粒；8：犬瘟热病毒；9：新城疫病毒；10：羊痘病毒；11：羊口疮病毒；12：口蹄疫病毒；13：牛副流感病毒；14：阴性对照
图2多重PCR敏感性结果；M：DNAMarker2000；1-12∶10-1-10-12质粒倍比稀释。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，其操作步骤会进一步明确。
优化实施例：
1材料和方法
1.1PPRV、SBV和KBV阳性重组质粒，犬瘟热病毒、新城疫病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒、口蹄疫病毒、牛副流感病毒毒株由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存。
1.2主要试剂
DNA/RNA提取试剂盒购自Axygen，一步法RT-PCR试剂及DNAMarker2000购自Takara公司。
1.3引物设计
分别根据最新文献及GenBank中PPRV、SBV、KBV的序列，设计三对引物。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列见表1。
表1多重PCR引物序列
备注：S＝G/C；R＝A/G
1.4RNA的提取
按照DNA/RNA提取试剂盒说明书进行病毒DNA/RNA提取。
1.5多重PCR扩增及特异性试验
以小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和(或)库布病毒阳性重组质粒混合物为多重PCR的模板，建立多重PCR方法。采用50μLPCR反应体系：2×Buffer25μL，PCRMix1μL，PPRV-F、PPRV-R、SBV-F、SBV-R、KBV-F和KBV-R各0.5μL，PPRV、SBV及KBV阳性模板分别3μL，RNAse-freeH2O12μL；
PCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min；
结果观察：取10μLPCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。
1.6多重PCR的敏感性试验
分别测定小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和(或)库布病毒阳性重组质粒的模板浓度，然后进行倍比稀释，来测定该方法的敏感性。
2结果
2.1多重PCR扩增及特异性试验
采用优化好的多重PCR对小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和(或)库布病毒阳性重组质粒及混合液进行扩增，结果获得大小约为750bp，500bp及200bp的片段，与测序结果766bp、474bp及206bp的片段相吻合，结果如图1所示。而犬瘟热病毒、新城疫病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒、口蹄疫病毒、牛副流感病毒毒株等未呈现条带，表明该方法具有较好的特异性(如图1所示)。
2.3多重PCR的敏感性试验
经检测，优化后的多重PCR的敏感性分别为9.268pg/ml(PPRV)、12.45pg/ml(SBV)和16.21pg/ml(KBV)(如图2所示)。
2.4临床样品的检测
对采集的52份牛羊腹泻粪便进行检测，其中PPRV核酸阳性2份、KBV核酸阳性10份，未检出SBV。此外，有1份PPRV和KBV混合感染。

Claims (5)

1.一种小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法，所述方法是小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒一步法RT-PCR，其特征在于：所使用的引物组合物包括PPRV引物对、SBV引物对及KBV引物对，其中PPRV引物对包括PPRV-F和PPRV-R两条引物，SBV引物对包括SBV-F和SBV-R两条引物以及KBV引物对包括KBV-F和KBV-R两条引物。
2.如权利要求1所述的一种小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法，所述的引物组合物具体为：
PPRV-F：GGTACCATAGCATCACCGACTCSEQIDNO.1
PPRV-R：CCCTTGCTCCTAAGTTTTTTGTAATSEQIDNO.2
SBV-F：GGCTTACACTCCCATTGATTTCTSEQIDNO.3
SBV-R：ATTGACCGTCCATAACCTTTGATSEQIDNO.4
KBV-F：GGATTACAAGTGTTTTGATGCCASEQIDNO.5
KBV-R：TGATGGTGTTGATGATSGARGTRSEQIDNO.6。
3.如权利要求1或2所述的一种小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法，所述RT-PCR包括以下步骤：配置50μLPCR反应体系：2×Buffer25μL，Mix1μL，PPRV-F、PPRV-R、SBV-F、SBV-R、KBV-F和KBV-R各0.5μL，PPRV、SBV及KBV阳性模板分别3μL，RNAse-freeH2O12μL；
其中，PPRV-F和PPRV-R用于小反刍兽疫的检测，SBV-F和SBV-R用于施马伦贝格病毒的检测，KBV-F和KBV-R用于库布病毒的检测；
PCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min；
结果观察：取10μLPCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果。
4.一种小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法中所使用的引物组合物，其特征在于所述引物组合物包括：PPRV引物对、SBV引物对及KBV引物对，其中PPRV引物对包括PPRV-F和PPRV-R两条引物，SBV引物对包括SBV-F和SBV-R两条引物以及KBV引物对包括KBV-F和KBV-R两条引物。
5.如权利要求5所述的引物组合物，所述引物组合物具体为：
PPRV-F：GGTACCATAGCATCACCGACTCSEQIDNO.1
PPRV-R：CCCTTGCTCCTAAGTTTTTTGTAATSEQIDNO.2
SBV-F：GGCTTACACTCCCATTGATTTCTSEQIDNO.3
SBV-R：ATTGACCGTCCATAACCTTTGATSEQIDNO.4
KBV-F：GGATTACAAGTGTTTTGATGCCASEQIDNO.5
KBV-R：TGATGGTGTTGATGATSGARGTRSEQIDNO.6。
CN201610212457.8A 2016-04-07 2016-04-07 小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用 Pending CN105671211A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610212457.8A CN105671211A (zh) 2016-04-07 2016-04-07 小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610212457.8A CN105671211A (zh) 2016-04-07 2016-04-07 小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105671211A true CN105671211A (zh) 2016-06-15

Family

ID=56309425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610212457.8A Pending CN105671211A (zh) 2016-04-07 2016-04-07 小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105671211A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013009084A2 (ko) * 2011-07-12 2013-01-17 주식회사 파나진 평행결합 구조의 이중 혼성화 pna 프로브 시스템을 포함하는 실시간 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013009084A2 (ko) * 2011-07-12 2013-01-17 주식회사 파나진 평행결합 구조의 이중 혼성화 pna 프로브 시스템을 포함하는 실시간 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李小鹏等: "小反刍兽疫RT-PCR的鉴定及N基因序列分析", 《亚洲兽医病例研究》 *
王建昌等: "施马伦贝格病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用", 《中国兽医学报》 *
胡军勇等: "猪库布病毒RT-PCR检测方法的建立及湖北省流行病学初步调查", 《华中农业大学学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rodriguez et al. Rapid detection of vesicular stomatitis virus New Jersey serotype in clinical samples by using polymerase chain reaction
CN103160615B (zh) 用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
CN107529559B (zh) 一种手足口病病毒的多重荧光pcr检测试剂盒、及应用
CN110669870B (zh) 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒
CN105018628B (zh) 鉴别布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的试剂盒
CN111118215A (zh) 一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒
CN110592278A (zh) PRoV、PoSaV和PAstV的多重RT-PCR试剂盒
CN101487064B (zh) 检测五种人兽共患病病毒的方法及专用试剂盒
CN111394483B (zh) 一种同时检测三种鱼源链球菌的试剂盒和检测方法
Zaghawa et al. Bovine ephemeral fever epidemics in Kingdom Saudi Arabia: clinical, epidemiological and molecular investigation
CN106086232B (zh) 一种用于鉴别羊口疮病毒和羊痘病毒的二重pcr检测引物、试剂盒和检测方法
CN102108420B (zh) 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒
CN105671211A (zh) 小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用
CN105695637A (zh) 一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型rt-pcr-rflp方法
Ranjan et al. Use of nucleic acid recognition methods (m-PCR and RT-LAMP) for the detection of foot-and-mouth disease virus excreted in cow milk
CN105925727A (zh) 一种用于检测口蹄疫病毒a型和o型混合感染的引物、试剂盒、使用方法及其应用
CN101525671B (zh) 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用
CN100567506C (zh) 一种h5亚型禽流感病毒检测试剂盒及其应用
CN105779659A (zh) 一种用于检测口蹄疫病毒o型的引物、试剂盒、使用方法及其应用
CN108823334B (zh) 肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接pcr检测试剂与检测试剂盒及应用
CN113265488A (zh) 共同检测流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒的rpa-lfd引物、探针及试剂盒
CN116162742B (zh) 一种用于检测引起牛病毒性腹泻病原基因的引物组合物及应用
CN111304342A (zh) 一种鉴别布鲁氏菌猪种s2疫苗株与其他种属野毒株的pcr试剂盒及其使用方法
CN105779658A (zh) 一种用于检测口蹄疫病毒O型、A型和Asia1型混合感染的引物、试剂盒、使用方法及其应用
CN118345201B (zh) 一种检测穿山甲d型轮状病毒的荧光定量pcr引物及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160615