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CN105641746B - 一种基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法 - Google Patents

一种基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法 Download PDF

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CN105641746B CN201511031450.8A CN201511031450A CN105641746B CN 105641746 B CN105641746 B CN 105641746B CN 201511031450 A CN201511031450 A CN 201511031450A CN 105641746 B CN105641746 B CN 105641746B
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Abstract

一种基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，将细菌纤维素加入取咪唑类离子液体中得细菌纤维素溶液，将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中得DABC溶液；将胶原蛋白溶解于DABC溶液中得CDABC溶液；向CDABC溶液中加入模板微粒得分散液；将分散液和表面活性剂倾倒入有机溶剂中，均质乳化，得w/o型CDABC乳液，向CDABC乳液中加入沉淀剂，收集沉淀，洗涤、抽提后冷冻干燥，得CDABC多孔支架；将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架混合，真空震荡吸附，离心收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性CDABC多孔支架。本发明反应产物稳定性能良好，反应效率高。负载了生长因子，使该支架能够更有效的促进细胞繁殖及组织再生，功能性更强。

Description

一种基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制 备方法
技术领域
本发明属于生物医药、生物材料领域，具体涉及一种基于胶原和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法。
背景技术
组织工程是应用细胞生物学和工程学原理，研究和开发具有修复和改善损伤组织功能生物替代物的一门新兴科学。组织工程学的基本原理和方法是将体外培养的高浓度组织细胞，吸附扩增于一种生物相容性良好并可被人体逐步降解吸收的生物材料上，使细胞能够按照预先设计在三维空间结构支架上生长，然后将细胞-生物材料复合物植入机体组织受损部位。从而对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。该技术目前在骨组织工程、人造血管、人造皮肤等领域受到了广泛关注。
组织工程的核心要素包括种子细胞、细胞支架和生长因子。其中生长因子的功能是诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活、促进组织再生以及进行辅助治疗。细胞支架的功能则是为细胞的增殖提供三维空间和新陈代谢环境，并决定新生组织、器官的形状和大小，同时可支持细胞生长、引导体内组织生长、帮助生物活性分子转导以及其组成和结构可以通过剪裁来适应特殊需要的特性。目前用于体外三维细胞培养的支架种类各异。其中，多孔微球支架作为一种重要的新型材料，具有密度低、比表面积大、稳定性好和表面渗透能力强等特点。能更好地模拟复杂的生理环境，是目前公认的最有发展前途的一种组织工程支架，并且已经应用于细胞的大量培养中。国内外在微载体的开发方面已做了许多工作，并有一些商品化的微载体在科研生产领域中得到应用。
胶原蛋白和细菌纤维素均来自生物细胞，均具有良好的生物相容性和降解性，目前已成为国际上新型组织工程材料的研究热点。同时胶原蛋白良好的促细胞生长作用和细菌纤维素高机械强度可使其相互弥补缺陷，更好的发挥各自的作用。如何有效的复合胶原蛋白及细菌纤维素，将其制备成多孔微球支架，并负载生长因子使其功能化，是该类组织工程支架制备技术的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备稳定性好，促细胞繁殖及组织再生能力强的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的制备方法如下：
1)细菌纤维素的制备：
首先，取具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，然后，将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后于80～90℃，在碱性溶液中浸泡20～40min，取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得细菌纤维素；
2)制备DABC溶液：
取咪唑类离子液体置于烧瓶中后放入鼓风干燥箱中101～110℃干燥2～3h，再向其中加入咪唑类离子液体质量4～8％的细菌纤维素，于90～120℃油浴搅拌得透明的细菌纤维素溶液，按高碘酸钠与细菌纤维素为1：3的摩尔比将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中，40～60℃水浴避光搅拌反应，反应结束后向反应体系中加入反应体系1～2倍体积的乙二醇，持续搅拌避光反应40～60min，得DABC溶液；
3)将胶原蛋白与细菌纤维素按2:1～5:1质量比溶解于DABC溶液中室温下反应12～24h，得CDABC溶液；
4)制备CDABC多孔支架：向CDABC溶液中加入模板微粒，使模板微粒的质量浓度为10％，置于超声波分散机中，超声使微粒分散均匀，得分散液；
5)将分散液和表面活性剂倾倒入有机溶剂中，均质乳化，得w/o型CDABC乳液，其中表面活性剂加量为有机溶剂的0.15～0.45wt％，所述分散液与有机溶剂质量比为1:5～1:10；
6)向CDABC乳液中加入沉淀剂正丁醇，沉淀剂与CDABC乳液的体积比为5:1～15:1，搅拌得悬浮液，悬浮液减压过滤，收集沉淀，依次用正丁醇、丙酮、丙酮洗涤三次，再经乙醇抽提，收集沉淀，冷冻干燥，得CDABC多孔支架；
7)制备功能性CDABC多孔支架：配制质量浓度为0.4～1.0mg/mL药用蛋白溶液，将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架按100：1(V/m)混合，真空震荡吸附，离心收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性组织工程支架。
所述的具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种为木醋杆菌或木葡糖醋酸杆菌。
所述的菌种活化是将菌种接种于pH值为5.5～6.5的活化培养基中，在28～32℃下，一次培养28～32h，得到一次培养菌种，将一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在28～32℃下，二次培养28～32h，得到活化的菌种；其中，所述的活化培养基中含有蔗糖40～50g/L，牛肉膏10～15g/L，磷酸氢二钠4～5g/L，柠檬酸0.8～1.0g/L，乙醇8～10g/L，琼脂15～20g/L。
所述的扩大培养是将活化菌种接种于pH值为5.5～6.5的扩培培养基中，在温度为28～32℃，转速为150～200rpm的条件下，振荡培养18～22h，得到种子液；其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖40～50g/L，牛肉膏10～15g/L，磷酸氢二钠4～5g/L，柠檬酸0.8～1.0g/L，乙醇8～10g/L。
所述的发酵是按照每100mL接种3～6mL的接种量将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在28～32℃下，发酵8～10天，得到细菌纤维素发酵液。
所述的咪唑类离子液体为1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-甲基-3-乙基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐或1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐；所述的高碘酸钠溶液采用的溶剂为1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，所述咪唑类离子液体与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮的体积比8:2～3:2。
所述的模板微粒采用粒径为100～500μm的聚苯乙烯微粒，超声温度为60～90℃，超声时间为5～10min。
所述表面活性剂为司盘-80或聚硅氧烷，所述有机溶剂为正十六烷或真空泵油，所述均质乳化速度为3000～7000r/min，均质乳化时间为5～10min。
所述药用蛋白为牛血清白蛋白、骨形态发生蛋白或细胞粘附肽；所述溶解药用蛋白的溶剂为PBS溶液。
所述真空震荡吸附是在真空干燥箱内真空度<0.085MPa，吸附温度为2～6℃，吸附时间为10～30min，震荡转速为100～150r/min；所述离心收集沉淀离心速度为2000～2500r/min，离心时间为10～20min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明公开的基于胶原和细菌纤维素的功能性组织工程支架制备方法中，胶原蛋白和细菌纤维素的复合采用了Malaprade反应和希夫碱反应。反应过程中无毒性物质的加入，反应产物稳定性能良好。而传统方法大多采用两者物理混合或加入戊二醛等交联剂复合的方法，要么产物稳定性差，要么引入了具有生物毒性的化学交联剂，影响复合材料在组织工程中的应用。
(2)本发明公开的基于胶原和细菌纤维素的功能性组织工程支架制备方法中，选择了离子液体作为溶剂溶解细菌纤维素，使其氧化反应为均相反应，提高了反应效率。
(3)本发明公开的基于胶原和细菌纤维素的功能性组织工程支架制备方法中，采用了溶剂释放法联合模板法制备组织工程支架，使得制备工艺简单，所制备支架孔径可由模板粒径进行控制，扩大了其应用范围。
(4)本发明公开的基于胶原和细菌纤维素的功能性组织工程支架制备过程中负载了生长因子，使该支架能够更有效的促进细胞繁殖及组织再生，功能性更强。
本发明公开的基于胶原和细菌纤维素的功能性组织工程支架制备方法操作简便，便于工业化生产，稳定性及重现性都较好，适宜进行大规模生产。
具体实施方式
实施例1：
1)细菌纤维素的制备
首先，取具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种木醋杆菌(Acetobacterxylinum)接种于pH值为5.5的活化培养基中，在30℃下，一次培养30h，得到一次培养菌种，将一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在30℃下，二次培养30h，得到活化的菌种；其中，活化培养基中含有蔗糖40g/L，牛肉膏12g/L，磷酸氢二钠4g/L，柠檬酸0.9g/L，乙醇9g/L，琼脂18g/L；将活化菌种接种于pH值为5.5的扩培培养基中，在温度为30℃，转速为200rpm的条件下，振荡培养18h，得到种子液；其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖45g/L，牛肉膏12g/L，磷酸氢二钠4.2g/L，柠檬酸1.0g/L，乙醇9g/L；按照每100mL接种5mL的接种量将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在30℃下，发酵9天，得到细菌纤维素发酵液，然后，将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后于80℃，在碱性溶液中浸泡40min，取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得细菌纤维素；
2)制备DABC溶液：
取咪唑类离子液体1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐(AMIMCl)置于烧瓶中后放入鼓风干燥箱中101℃干燥3h，再向其中加入咪唑类离子液体质量7％的细菌纤维素，于90℃油浴搅拌得透明的细菌纤维素溶液，按高碘酸钠与细菌纤维素为1：3的摩尔比将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中，40℃水浴避光搅拌反应，反应结束后向反应体系中加入反应体系1倍体积的乙二醇，持续搅拌避光反应40min，得DABC溶液；
所述的高碘酸钠溶液采用的溶剂为1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，所述咪唑类离子液体与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮的体积比8：2
3)将胶原蛋白与细菌纤维素按2：1质量比溶解于DABC溶液中室温下反应12h，得CDABC溶液；
4)制备CDABC多孔支架：向CDABC溶液中加入粒径为100～500μm的聚苯乙烯(polystyrene,PS)模板微粒，使模板微粒的质量浓度为10％，置于温度为60℃的超声波分散机中，超声分散10min使微粒分散均匀，得分散液；
5)将分散液和表面活性剂司盘-80倾倒入有机溶剂正十六烷中，在转速为3000r/min下均质乳化10min得w/o型CDABC乳液，其中表面活性剂加量为有机溶剂的0.15wt％，所述分散液与有机溶剂质量比为1：8；
6)向CDABC乳液中加入沉淀剂正丁醇，沉淀剂与CDABC乳液的体积比为5：1，搅拌得悬浮液，悬浮液减压过滤，收集沉淀，依次用正丁醇、丙酮、丙酮洗涤三次，再经乙醇抽提，收集沉淀，冷冻干燥，得CDABC多孔支架；
7)制备功能性CDABC多孔支架：将药用蛋白牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)溶解在PBS溶液中配制成质量浓度为0.4mg/mL的药用蛋白溶液，将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架按100：1(V/m)混合，在震荡转速为100r/min，真空度<0.085MPa、吸附温度为2℃的真空干燥箱内吸附30min，在离心转速为2000r/min离心20min后收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性组织工程支架。
实施例2：
1)细菌纤维素的制备
首先，取具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种木葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacterxylinus)接种于pH值为6.0的活化培养基中，在28℃下，一次培养32h，得到一次培养菌种，将一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在28℃下，二次培养32h，得到活化的菌种；其中，活化培养基中含有蔗糖40、50、45、42、48g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钠4.5g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇10g/L，琼脂16g/L；将活化菌种接种于pH值为6.0的扩培培养基中，在温度为28℃，转速为180rpm的条件下，振荡培养22h，得到种子液；其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖40g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氢二钠4.5g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇8g/L；按照每100mL接种3mL的接种量将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在32℃下，发酵8天，得到细菌纤维素发酵液，然后，将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后于85℃，在碱性溶液中浸泡30min，取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得细菌纤维素；
2)制备DABC溶液：
取咪唑类离子液体1-甲基-3-乙基咪唑溴盐(EMIMBr)置于烧瓶中后放入鼓风干燥箱中103℃干燥2.5h，再向其中加入咪唑类离子液体质量5％的细菌纤维素，于100℃油浴搅拌得透明的细菌纤维素溶液，按高碘酸钠与细菌纤维素为1：3的摩尔比将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中，55℃水浴避光搅拌反应，反应结束后向反应体系中加入反应体系1.5倍体积的乙二醇，持续搅拌避光反应50min，得DABC溶液；
所述的高碘酸钠溶液采用的溶剂为1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，所述咪唑类离子液体与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮的体积比5：2
3)将胶原蛋白与细菌纤维素按5：1质量比溶解于DABC溶液中室温下反应20h，得CDABC溶液；
4)制备CDABC多孔支架：向CDABC溶液中加入粒径为100～500μm的聚苯乙烯(polystyrene,PS)模板微粒，使模板微粒的质量浓度为10％，置于温度为70℃的超声波分散机中，超声分散8min使微粒分散均匀，得分散液；
5)将分散液和表面活性剂聚硅氧烷倾倒入有机溶剂真空泵油中，在转速为5000r/min下均质乳化7min得w/o型CDABC乳液，其中表面活性剂加量为有机溶剂的0.3wt％，所述分散液与有机溶剂质量比为1：6；
6)向CDABC乳液中加入沉淀剂正丁醇，沉淀剂与CDABC乳液的体积比为10：1，搅拌得悬浮液，悬浮液减压过滤，收集沉淀，依次用正丁醇、丙酮、丙酮洗涤三次，再经乙醇抽提，收集沉淀，冷冻干燥，得CDABC多孔支架；
7)制备功能性CDABC多孔支架：将药用蛋白骨形态发生蛋白(Bone morphogeneticprotein,BMP)溶解在PBS溶液中配制成质量浓度为0.6mg/mL的药用蛋白溶液，将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架按100：1(V/m)混合，在震荡转速为130r/min，真空度<0.085MPa、吸附温度为4℃的真空干燥箱内吸附20min，在离心转速为2300r/min离心15min后收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性组织工程支架。
实施例3：
1)细菌纤维素的制备
首先，取具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种木醋杆菌(Acetobacterxylinum)接种于pH值为6.0的活化培养基中，在28℃下，一次培养32h，得到一次培养菌种，将一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在28℃下，二次培养32h，得到活化的菌种；其中，活化培养基中含有蔗糖50g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钠4.5g/L，柠檬酸1.0g/L，乙醇8g/L，琼脂20g/L；将活化菌种接种于pH值为5.8的扩培培养基中，在温度为32℃，转速为160rpm的条件下，振荡培养20h，得到种子液；其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖48g/L，牛肉膏10g/L，磷酸氢二钠4g/L，柠檬酸0.9g/L，乙醇9.5g/L；按照每100mL接种6mL的接种量将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在28℃下，发酵10天，得到细菌纤维素发酵液，然后，将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后于93℃，在碱性溶液中浸泡25min，取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得细菌纤维素；
2)制备DABC溶液：
取咪唑类离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐BMIMCl置于烧瓶中后放入鼓风干燥箱中105℃干燥2.5h，再向其中加入咪唑类离子液体质量6％的细菌纤维素，于110℃油浴搅拌得透明的细菌纤维素溶液，按高碘酸钠与细菌纤维素为1：3的摩尔比将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中，45℃水浴避光搅拌反应，反应结束后向反应体系中加入反应体系1.3倍体积的乙二醇，持续搅拌避光反应45min，得DABC溶液；
所述的高碘酸钠溶液采用的溶剂为1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，所述咪唑类离子液体与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮的体积比3：2
3)将胶原蛋白与细菌纤维素按3：1质量比溶解于DABC溶液中室温下反应16h，得CDABC溶液；
4)制备CDABC多孔支架：向CDABC溶液中加入粒径为100～500μm的聚苯乙烯(polystyrene,PS)模板微粒，使模板微粒的质量浓度为10％，置于温度为80℃的超声波分散机中，超声分散6min使微粒分散均匀，得分散液；
5)将分散液和表面活性剂司盘-80倾倒入有机溶剂真空泵油中，在转速为4000r/min下均质乳化9min得w/o型CDABC乳液，其中表面活性剂加量为有机溶剂的0.2wt％，所述分散液与有机溶剂质量比为1：10；
6)向CDABC乳液中加入沉淀剂正丁醇，沉淀剂与CDABC乳液的体积比为15：1，搅拌得悬浮液，悬浮液减压过滤，收集沉淀，依次用正丁醇、丙酮、丙酮洗涤三次，再经乙醇抽提，收集沉淀，冷冻干燥，得CDABC多孔支架；
7)制备功能性CDABC多孔支架：将药用蛋白细胞粘附肽(Cell adhesion peptide,RGD)溶解在PBS溶液中配制成质量浓度为0.8mg/mL的药用蛋白溶液，将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架按100：1(V/m)混合，在震荡转速为110r/min，真空度<0.085MPa、吸附温度为3℃的真空干燥箱内吸附25min，在离心转速为2500r/min离心10min后收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性组织工程支架。
实施例4：
1)细菌纤维素的制备
首先，取具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种木葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacterxylinus)接种于pH值为6.2的活化培养基中，在29℃下，一次培养31h，得到一次培养菌种，将一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在29℃下，二次培养31h，得到活化的菌种；其中，活化培养基中含有蔗糖42g/L，牛肉膏15g/L，磷酸氢二钠4.7g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇9.5g/L，琼脂15g/L；将活化菌种接种于pH值为6.2的扩培培养基中，在温度为29℃，转速为190rpm的条件下，振荡培养19h，得到种子液；其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖50g/L，牛肉膏13g/L，磷酸氢二钠4.8g/L，柠檬酸1.0g/L，乙醇8.5g/L；按照每100mL接种4mL的接种量将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在31℃下，发酵10天，得到细菌纤维素发酵液，然后，将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后于90℃，在碱性溶液中浸泡20min，取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得细菌纤维素；
2)制备DABC溶液：
取咪唑类离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐(EMIMAc)置于烧瓶中后放入鼓风干燥箱中108℃干燥2h，再向其中加入咪唑类离子液体质量4％的细菌纤维素，于95℃油浴搅拌得透明的细菌纤维素溶液，按高碘酸钠与细菌纤维素为1：3的摩尔比将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中，60℃水浴避光搅拌反应，反应结束后向反应体系中加入反应体系2倍体积的乙二醇，持续搅拌避光反应55min，得DABC溶液；
所述的高碘酸钠溶液采用的溶剂为1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，所述咪唑类离子液体与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮的体积比6：2
3)将胶原蛋白与细菌纤维素按4：1质量比溶解于DABC溶液中室温下反应22h，得CDABC溶液；
4)制备CDABC多孔支架：向CDABC溶液中加入粒径为100～500μm的聚苯乙烯(polystyrene,PS)模板微粒，使模板微粒的质量浓度为10％，置于温度为80℃的超声波分散机中，超声分散5min使微粒分散均匀，得分散液；
5)将分散液和表面活性剂聚硅氧烷倾倒入有机溶剂正十六烷中，在转速为7000r/min下均质乳化5min得w/o型CDABC乳液，其中表面活性剂加量为有机溶剂的0.4wt％，所述分散液与有机溶剂质量比为1：5；
6)向CDABC乳液中加入沉淀剂正丁醇，沉淀剂与CDABC乳液的体积比为8：1，搅拌得悬浮液，悬浮液减压过滤，收集沉淀，依次用正丁醇、丙酮、丙酮洗涤三次，再经乙醇抽提，收集沉淀，冷冻干燥，得CDABC多孔支架；
7)制备功能性CDABC多孔支架：将药用蛋白牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin,BSA)溶解在PBS溶液中配制成质量浓度为0.5mg/mL的药用蛋白溶液，将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架按100：1(V/m)混合，在震荡转速为120r/min，真空度<0.085MPa、吸附温度为5℃的真空干燥箱内吸附15min，在离心转速为2200r/min离心18min后收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性组织工程支架。
实施例5：
1)细菌纤维素的制备
首先，取具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种木醋杆菌(Acetobacterxylinum)接种于pH值为6.5的活化培养基中，在31℃下，一次培养29h，得到一次培养菌种，将一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在31℃下，二次培养29h，得到活化的菌种；其中，活化培养基中含有蔗糖48g/L，牛肉膏11g/L，磷酸氢二钠5g/L，柠檬酸1.0g/L，乙醇8.5g/L，琼脂19g/L；将活化菌种接种于pH值为6.5的扩培培养基中，在温度为31℃，转速为150rpm的条件下，振荡培养21h，得到种子液；其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖43g/L，牛肉膏11g/L，磷酸氢二钠5g/L，柠檬酸0.8g/L，乙醇10g/L；按照每100mL接种5mL的接种量将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在29℃下，发酵8天，得到细菌纤维素发酵液，然后，将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后于88℃，在碱性溶液中浸泡35min，取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得细菌纤维素；
2)制备DABC溶液：
取咪唑类离子液体1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐(AMIMCl)置于烧瓶中后放入鼓风干燥箱中110℃干燥3h，再向其中加入咪唑类离子液体质量8％的细菌纤维素，于120℃油浴搅拌得透明的细菌纤维素溶液，按高碘酸钠与细菌纤维素为1：3的摩尔比将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中，50℃水浴避光搅拌反应，反应结束后向反应体系中加入反应体系1.8倍体积的乙二醇，持续搅拌避光反应60min，得DABC溶液；
所述的高碘酸钠溶液采用的溶剂为1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，所述咪唑类离子液体与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮的体积比4：2
3)将胶原蛋白与细菌纤维素按5：1质量比溶解于DABC溶液中室温下反应24h，得CDABC溶液；
4)制备CDABC多孔支架：向CDABC溶液中加入粒径为100～500μm的聚苯乙烯(polystyrene,PS)模板微粒，使模板微粒的质量浓度为10％，置于温度为90℃的超声波分散机中，超声分散5min使微粒分散均匀，得分散液；
5)将分散液和表面活性剂司盘-80倾倒入有机溶剂正十六烷中，在转速为6000r/min下均质乳化6min得w/o型CDABC乳液，其中表面活性剂加量为有机溶剂的0.45wt％，所述分散液与有机溶剂质量比为1：9；
6)向CDABC乳液中加入沉淀剂正丁醇，沉淀剂与CDABC乳液的体积比为12：1，搅拌得悬浮液，悬浮液减压过滤，收集沉淀，依次用正丁醇、丙酮、丙酮洗涤三次，再经乙醇抽提，收集沉淀，冷冻干燥，得CDABC多孔支架；
7)制备功能性CDABC多孔支架：将药用蛋白细胞粘附肽(Cell adhesion peptide,RGD)溶解在PBS溶液中配制成质量浓度为1.0mg/mL的药用蛋白溶液，将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架按100：1(V/m)混合，在震荡转速为150r/min，真空度<0.085MPa、吸附温度为6℃的真空干燥箱内吸附10min，在离心转速为2400r/min离心12min后收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性组织工程支架。
综上所述，本发明采用了Malaprade反应和希夫碱反应制备胶原蛋白-细菌纤维素复合材料，采用溶剂释放法联合模板法制备功能性组织工程支架，该支架结合了胶原蛋白和细菌纤维素的优良性能，具有独特的功能性，能够满足不同组织再生的需求，该制备方法工艺简单，稳定性及重现性都较好，适宜进行大规模生产。因此该技术具有重要意义。

Claims (10)

1.一种基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：
1)细菌纤维素的制备
首先，取具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，然后，将细菌纤维素发酵液液面上层的细菌纤维素膜取出，水洗后于80～90℃，在碱性溶液中浸泡20～40min，取出，反复冲洗至细菌纤维素膜呈透明状，吸干水分，干燥至恒重，得细菌纤维素；
2)制备DABC溶液：
取咪唑类离子液体置于烧瓶中后放入鼓风干燥箱中101～110℃干燥2～3h，再向其中加入咪唑类离子液体质量4～8％的细菌纤维素，于90～120℃油浴搅拌得透明的细菌纤维素溶液，按高碘酸钠与细菌纤维素为1：3的摩尔比将高碘酸钠溶液加入到细菌纤维素溶液中，40～60℃水浴避光搅拌反应，反应结束后向反应体系中加入反应体系1～2倍体积的乙二醇，持续搅拌避光反应40～60min，得DABC溶液；
3)将胶原蛋白与细菌纤维素按2:1～5:1质量比溶解于DABC溶液中室温下反应12～24h，得CDABC溶液；
4)制备CDABC多孔支架：向CDABC溶液中加入模板微粒，使模板微粒的质量浓度为10％，置于超声波分散机中，超声使微粒分散均匀，得分散液；
5)将分散液和表面活性剂倾倒入有机溶剂中，均质乳化，得w/o型CDABC乳液，其中表面活性剂加量为有机溶剂的0.15～0.45wt％，所述分散液与有机溶剂质量比为1:5～1:10；
6)向CDABC乳液中加入沉淀剂正丁醇，沉淀剂与CDABC乳液的体积比为5:1～15:1，搅拌得悬浮液，悬浮液减压过滤，收集沉淀，依次用正丁醇、丙酮、丙酮洗涤三次，再经乙醇抽提，收集沉淀，冷冻干燥，得CDABC多孔支架；
7)制备功能性CDABC多孔支架：配制质量浓度为0.4～1.0mg/mL药用蛋白溶液，将药用蛋白溶液与CDABC多孔支架按100：1(V/m)混合，真空震荡吸附，离心收集沉淀，洗涤，冷冻干燥制成功能性组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述的具有细菌纤维素生产能力的微生物菌种为木醋杆菌或木葡糖醋酸杆菌。
3.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述的菌种活化是将菌种接种于pH值为5.5～6.5的活化培养基中，在28～32℃下，一次培养28～32h，得到一次培养菌种，将一次培养菌株再次接种于活化培养基中，在28～32℃下，二次培养28～32h，得到活化的菌种；其中，所述的活化培养基中含有蔗糖40～50g/L，牛肉膏10～15g/L，磷酸氢二钠4～5g/L，柠檬酸0.8～1.0g/L，乙醇8～10g/L，琼脂15～20g/L。
4.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述的扩大培养是将活化菌种接种于pH值为5.5～6.5的扩培培养基中，在温度为28～32℃，转速为150～200rpm的条件下，振荡培养18～22h，得到种子液；其中，所述的扩培培养基中含有蔗糖40～50g/L，牛肉膏10～15g/L，磷酸氢二钠4～5g/L，柠檬酸0.8～1.0g/L，乙醇8～10g/L。
5.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述的发酵是按照每100mL接种3～6mL的接种量将种子液接种至细菌纤维素发酵培养基中，在28～32℃下，发酵8～10天，得到细菌纤维素发酵液。
6.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述的咪唑类离子液体为1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-甲基-3-乙基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐或1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐；所述的高碘酸钠溶液采用的溶剂为1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，所述咪唑类离子液体与1,3-二甲基-2-咪唑啉酮的体积比8:2～3:2。
7.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述的模板微粒采用粒径为100～500μm的聚苯乙烯微粒，超声温度为60～90℃，超声时间为5～10min。
8.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述表面活性剂为司盘-80或聚硅氧烷，所述有机溶剂为正十六烷或真空泵油，所述均质乳化速度为3000～7000r/min，均质乳化时间为5～10min。
9.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述药用蛋白为牛血清白蛋白、骨形态发生蛋白或细胞粘附肽；所述溶解药用蛋白的溶剂为PBS溶液。
10.根据权利要求1所述的基于胶原蛋白和细菌纤维素的功能性组织工程支架的制备方法，其特征在于：所述真空震荡吸附是在真空干燥箱内真空度<0.085MPa，吸附温度为2～6℃，吸附时间为10～30min，震荡转速为100～150r/min；所述离心收集沉淀离心速度为2000～2500r/min，离心时间为10～20min。
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