CN105521771A - 一种硼酸亲和膜的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硼酸亲和膜分离材料及其制备方法。本发明所制备的分离材料具有吸附容量高，对含顺式邻二羟基的物质具有很好的选择性，并且具有传质速率快的特点，将其用于尿液中多巴胺的富集，多巴胺得到了有效的富集，去除了绝大数物质的干扰。

Description

一种硼酸亲和膜的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种硼酸亲和膜的制备方法，属于分离材料制备领域。

背景技术

含有顺式邻二羟基的生物分子包括糖蛋白、糖、核苷、核苷酸、儿茶酚胺、RNA等，许多都是生命科学研究的主要分析物，其在疾病诊断中具有重要意义。但由于在生物样品中，顺式邻二羟基物质的含量很低，并且存在大量干扰物，因此，选择性的分离富集是准确分析顺式邻二羟基类物质的关键。

硼酸与顺式邻二羟基物质之间具有选择性识别作用，当顺式邻二羟基物质处于碱性环境中时，硼酸与顺式邻二羟基物质生成五元或六元环酯，当pH降至酸性时，环酯解离释放出顺式邻二羟基分子。

膜分离技术作为一种高分离、富集和净化的技术，是近年来新发展起来的可用于化学分析领域中的新技术之一，具有操作程序方便、可与各种分析仪器直接连接和易于在线操作等优点，因此，膜分离技术作为一种新的样品预处理技术已被广泛应用于诸多领域。据发明人所知，目前还没有制备硼酸亲和膜的报道。

发明内容

本发明提供一种吸附容量高、传质速率快的硼酸亲和膜材料及其制备方法，该硼酸亲和膜材料可用于含顺式邻二羟基物质的膜分离和膜萃取。

本发明实现过程如下：

如下结构式所示的聚乙烯亚胺功能化的硼酸亲和分离材料，

上述为纤维素膜或再生纤维素膜，n为10-30。

上述材料的制备方法包括以下步骤：

⑴固相基质预处理：将固相基质在甲醇中浸泡除去表面的油脂及粘附物质，用甲醇和蒸馏水反复洗涤后干燥备用，所述的固相基质为纤维素膜或再生纤维素膜；

⑵固相基质表面氨基化：将固相基质先与环氧氯丙烷反应，然后与聚乙烯亚胺反应得到氨基化的固相基质；

⑶将氨基化固相基质与4-甲酰基苯硼酸和氰基硼氢化钠在无水甲醇中室温反应，反应结束后洗涤、干燥得到聚乙烯亚胺功能化的硼酸亲和分离材料。

上述聚乙烯亚胺功能化的硼酸亲和分离材料在分离和富集含顺式邻二羟基生物分子中的应用。

本发明的优点与积极效果：本发明合成方法简单，制备过程重复性好；制备得到的硼酸亲和膜材料具有吸附容量大、选择性好、传质速率快的特点，可有效提高对含顺式邻二羟基分子的分离和富集效率。

附图说明

图1硼酸亲和膜能够选择性富集含有顺式邻二羟基的邻苯二酚与多巴胺；

图2为硼酸亲和膜材料对多巴胺的吸附动力学及解吸附动力学；

图3为硼酸亲和膜材料对尿液中多巴胺富集前后色谱图；

图4为原膜(a)与硼酸亲和膜(b)的2D显微照片；

图5为原膜(a)与硼酸亲和膜(b)的3D显微照片。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。本发明所列的具体实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1再生纤维素膜预处理

将一整片再生纤维素膜（直径47mm，平均孔径0.45μm，厚度160μm，德国赛得利斯公司）剪成相同大小的1/8扇形小片，共8小片，在甲醇中浸泡15min以除去膜表面油脂及粘附杂质，用甲醇和蒸馏水反复洗涤，真空干燥箱中40℃干燥备用。

实施例2再生纤维素膜的环氧化

将干燥的再生纤维素膜置于10mL环氧氯丙烷与20mL1.4mol/LNaOH的混合液中，60℃油浴中搅拌反应2h，反应结束后，用氢氧化钠溶液、蒸馏水多次洗涤，得到环氧化纤维素膜。

实施例3用分子量为600的聚乙烯亚胺（PEI600）修饰再生纤维素膜

向三颈烧瓶中加入环氧化纤维素膜，1g聚乙烯亚胺（M=600），50mL碳酸氢钠溶液（50mM，pH9），65℃油浴中搅拌反应5h，用碳酸氢钠溶液、蒸馏水反复洗涤，真空干燥箱中40℃干燥，得到PEI600功能化的纤维素膜。

实施例4用分子量为10000的聚乙烯亚胺（PEI10000）修饰再生纤维素膜

向三颈烧瓶中加入环氧化纤维素膜，1g聚乙烯亚胺（M=10000），50mL碳酸氢钠溶液（50mM，pH9），65℃油浴中搅拌反应5h，用碳酸氢钠溶液、蒸馏水反复洗涤，真空干燥箱中40℃干燥，得到PEI10000功能化的纤维素膜。

实施例5用分子量为20000的聚乙烯亚胺（PEI20000）修饰再生纤维素膜

向三颈烧瓶中加入环氧化纤维素膜，1g聚乙烯亚胺（M=20000），50mL碳酸氢钠溶液（50mM，pH9），65℃油浴中搅拌反应5h，用碳酸氢钠溶液、蒸馏水反复洗涤，真空干燥箱中40℃干燥，得到PEI20000功能化的纤维素膜。

实施例6纤维素膜的硼酸功能化

向三颈烧瓶中加入干燥的聚乙烯亚胺功能化的纤维素膜，100mL重蒸甲醇，1.6g4-甲酰基苯硼酸，1g氰基硼氢化钠，摩尔比为1:3，室温下搅拌反应12h，反应结束后，分别用无水甲醇、5%碳酸氢钠溶液、5%氯化钠溶液多次洗涤，40℃真空干燥，得到硼酸亲和膜分离材料。

实施例7：硼酸亲和膜分离材料元素分析表征

利用元素分析对再生纤维素膜、环氧化的RC膜、聚乙烯亚胺接枝的RC膜、硼酸亲和膜的元素含量进行表征，从表1中N元素的含量变化可看出聚乙烯亚胺已成功接枝到再生纤维素膜表面。

实施例8：硼酸亲和膜分离材料对顺式邻二羟基物质选择性吸附

用50mMpH=9的氨-氯化铵缓冲溶液配制的10μg/mL邻苯二酚与对苯二酚（干扰物）混合液，将两片合成好的硼酸亲和膜分别置于两个50mL离心管中，分别加入5mL邻苯二酚与对苯二酚混合液，多巴胺与5-羟色胺混合液，摇床中室温吸附10min，之后用pH=9的氨-氯化铵缓冲溶液、水淋洗，以去除膜表面的物理吸附，将处理好的膜用2mL5%醋酸洗脱10min，洗脱液进行HPLC检测。

图1的⑴为硼酸亲和膜材料在pH=9的氨-氯化铵缓冲溶液配制的10μg/mL邻苯二酚与对苯二酚（干扰物）混合液中，选择性富集含有顺式邻二羟基的邻苯二酚；⑵为硼酸亲和膜材料在pH=9的氨-氯化铵缓冲溶液配制的50μg/mL多巴胺与5-羟色胺（干扰物）混合液中，选择性富集含有顺式邻二羟基的多巴胺。色谱条件：色谱柱4.6×150mmC18柱；流动相:⑴50mmol/LHAc/甲醇=80：20；⑵磷酸二氢钠/乙腈=99:1；流速：1.0mL/min；柱温：室温；紫外检测波长：280nm。图1的A中1为对苯二酚，2为邻苯二酚，色谱图中a为邻苯二酚与对苯二酚混合标液，b为吸附后洗脱液；B中1为多巴胺，2为5-羟色胺，色谱图中a为多巴胺与5-羟色胺混合标液，b为吸附后洗脱液。

实施例9：硼酸亲和膜分离材料吸附动力学测定

将5mg硼酸化的纤维素膜加入至2mL100μg/mL50mMpH=9的氨-氯化铵缓冲溶液配制的多巴胺溶液中吸附，吸附时间分别为1、3、10、30、120min，吸取上清液进行HPLC分析。如图2(A)所示，吸附在1min就能达到平衡。

实施例10：硼酸亲和膜分离材料解吸附动力学测定

将5mg硼酸亲和膜加入至2mL100μg/mL50mMpH=9的氨-氯化铵缓冲溶液配制的的多巴胺溶液中吸附10min，用pH=9的氨-氯化铵缓冲溶液、水淋洗后，用200μL5%醋酸洗脱，洗脱时间分别为1、3、10、30、120min，洗脱液进行HPLC分析，如图2(B)所示，解吸附在1min就能达到平衡。

实施例11：硼酸亲和膜材料对尿液中多巴胺的富集

向10mL尿液中加入2mL乙腈沉淀蛋白，10000rpm离心5min去除沉淀，之后用1mol/LNaOH调节上清液pH至8.0，加入5mg聚乙烯亚胺功能化的硼酸亲和膜吸附，淋洗后，用200μL5%醋酸洗脱，洗脱液进行HPLC分析，如图3所示，经该硼酸亲和膜处理后，多巴胺得到了有效的富集，并去除了绝大数物质的干扰。

实施例12：硼酸亲和膜分离材料原子力显微镜表征

利用原子力显微镜分析原膜与硼酸亲和膜之间的表面形貌和粗糙度值变化，如图4所示，a图为原膜，b图为硼酸亲和膜的2D显微照片。从图中可以看出，与原膜相比较，硼酸亲和膜的孔径较小，这是因为聚乙烯亚胺接枝到膜表面使得孔径变小。图5为原膜(a)与硼酸亲和膜(b)的3D显微照片，Rq是衡量表面粗糙度的一个参数，Rq值越大，说明表面粗糙度越大，RC原膜的Rq值为233nm，接枝了聚乙烯亚胺后的硼酸亲和膜的Rq值降为169nm，说明接枝聚乙烯亚胺后，膜表面更加平滑。

实施例13

参考文献：

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通过不同硼酸亲和吸附材料对顺式邻二羟基物质吸附容量的比较，如表2所示，本实验得到的硼酸亲和膜具有高的吸附容量，并且传质速率快。

Claims (3)

1.如下结构式所示的聚乙烯亚胺功能化的硼酸亲和分离材料，

上述为纤维素膜或再生纤维素膜，n为10-30。

2.权利要求1所述材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

⑴固相基质预处理：将固相基质在甲醇中浸泡除去表面的油脂及粘附物质，用甲醇和蒸馏水反复洗涤后干燥备用，所述的固相基质为纤维素膜或再生纤维素膜；

⑵固相基质表面氨基化：将固相基质先与环氧氯丙烷反应，然后与聚乙烯亚胺反应得到氨基化的固相基质；

⑶将氨基化固相基质与4-甲酰基苯硼酸和氰基硼氢化钠在无水甲醇中室温反应，反应结束后洗涤、干燥得到聚乙烯亚胺功能化的硼酸亲和分离材料。

3.权利要求1所述的聚乙烯亚胺功能化的硼酸亲和分离材料在分离和富集含顺式邻二羟基生物分子中的应用。