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CN105441381B - 体外诱导人脂肪间充质干细胞向有功能肝细胞分化的方法 - Google Patents

体外诱导人脂肪间充质干细胞向有功能肝细胞分化的方法 Download PDF

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CN105441381B CN201511026437.3A CN201511026437A CN105441381B CN 105441381 B CN105441381 B CN 105441381B CN 201511026437 A CN201511026437 A CN 201511026437A CN 105441381 B CN105441381 B CN 105441381B
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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种体外诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hADSCs)向有功能肝细胞(iHeps)分化的方法。该方法包括的步骤为：分离出hADSCs；体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为4个阶段：预处理阶段；内胚层诱导阶段；成肝诱导阶段；肝细胞的成熟阶段。使用本发明的诱导分化方法，只需要十天左右的时间就足够产生具有肝细胞形态，基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的非转基因法实现肝细胞分化的方法。这将有利于个体化临床治疗方案的应用。

Description

体外诱导人脂肪间充质干细胞向有功能肝细胞分化的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种体外诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hADSCs)向有功能肝细胞(iHeps)分化的方法。
背景技术
肝脏是一个调节多种生理过程的关键器官。肝脏疾病，如肝炎、肝硬化以及爆发性肝损伤，是导致死亡的重要原因。原位肝移植(OLT)是目前治疗终末期肝脏疾病的唯一方法，但由于免疫排斥等副作用及其肝脏供体的短缺限制了肝移植的临床应用。肝细胞移植是治疗肝功能不全的整体肝移植的替代疗法；虽然原代肝细胞可以从供体肝脏中分离得到，但每次移植需要1～5×109个肝细胞，这就需要获得大量的供体肝或大量的可体外扩增的原代肝细胞。供体肝脏的缺乏和原代肝细胞体外扩增困难等原因使得获得充足的可用于细胞治疗的肝细胞非常困难。为了解决目前这种窘境，迫切需要可快速产生大量肝细胞的新方法。
过去几年，发现了多种可用于治疗肝脏疾病的肝外细胞群，其中具有多向分化潜能和半无限增殖能力的间充质干细胞(MSCs)就是一种重要的具有潜在应用价值的细胞。间充质干细胞可从骨髓、脂肪、脐带血、羊膜液、头皮、胎盘等多种组织中获得。其中，脂肪来源的MSCs(ADSCs)被认为是最有应用前景的一类间充质干细胞，其在脂肪组织的占比介于1：100到1：500之间，远高于骨髓间充质干细胞在骨髓中所占比例，在再生医学中有良好的应用前景。ADSCs来源充足，易得到，创伤小，可取材于患者自身的脂肪组织，这样就避免了免疫排斥反应，也解决了伦理问题等的障碍。已有研究表明ADSCs在体外具有诱导分化成肝细胞的潜力。
目前的技术由ADSCs向肝细胞诱导分化都需要大约1个月的时间，使得这些诱导分化方法并不适用于实际临床应用。而临床应用需要尽可能缩短体外诱导分化的时间。因此，开发新的能在短时间内将ADSCs高效地诱导成为成熟肝细胞(iHeps)的方法是本领域的一个难题。
发明内容
本发明要求解决的技术问题是现有ADSCs诱导成为iHeps的方法耗时长，效率低的缺陷。
本发明解决技术问题的技术方案是提供一种新的体外诱导hADSCs向iHeps分化的方法。该方法包括以下步骤：
a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs；
b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段：
预处理阶段：在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5～2μM的ATRA的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；
内胚层诱导阶段：将预处理后的hADSCs在含有浓度为50～200nM的IDE1、1～5μΜ的CHIR99021和5～20μM的LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；
成肝诱导阶段：完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50～200nM的IDE1、10～30ng/mL的FGF4、5～20μM的LY294002和50～200nM的LDN-193189的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中诱导培养36～60小时；接着加入含有浓度为50～200nM的IDE1、10～30ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM的LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20～28小时；
肝细胞的成熟阶段：完成了成肝诱导后的细胞在含有浓度为100～200ng/mL的肝细胞生长因子(HGF)、10～30ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、20～40ng/mL抑瘤素M(OsM)、1.5～3×10-5mol/L地塞米松(Dex)以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中进行成熟阶段的诱导培养，培养时间为112～144小时；得到由hADSCs分化而来的iHeps细胞。
其中，上述方法步骤b所述的内胚层诱导阶段为将预处理后的hADSCs在含有100nM的IDE1和3μΜ的CHIR99021的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为24小时。
其中，上述方法步骤b所述成肝诱导阶段为将完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002和50～200nM LDN-193189的RPMI-1640培养基DMEM/F12培养基中诱导培养36～60小时；接着加入含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μMLY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20～28小时。
其中，上述方法步骤b所述肝细胞的成熟阶段为将完成肝诱导阶段后的细胞在含有150ng/mL的肝细胞生长因子(HGF)、20ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、30ng/mL的抑瘤素M(OSM)、2×10-5mol/L的地塞米松以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中诱导培养，培养时间114-140小时。
其中，上述方法步骤a分离得到的hADSCs经培养3～7代后再按步骤b所述方法进行诱导培养。
其中，上述方法所述的hADSCs在步骤b之前接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中进行后续诱导培养。
其中，上述方法所述hADSCs接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中，当细胞长满培养皿底部后按步骤b的进行诱导培养。
同时，本发明还提供了使用上述方法由hADSCs诱导得到的iHeps细胞。
本发明的优点在于：使用本发明的分化方法，仅需要十天左右的时间就能产生足够的具有特异的形态、基因表达及功能的肝细胞，是目前用时最短的肝细胞分化方法。本发明方法能获得由hADSCs来源的肝细胞，使来自患者的自体脂肪组织的细胞用于治疗肝病成为可能，从而可以避免异体细胞的免疫排斥反应。其次，本发明方法的诱导过程快速而高效，这将有利于临床治疗方案的及时应用。此外，根据诱导分化后的肝细胞的功能分析，使用本发明方法诱导获得的细胞作为肝细胞的资源，将有助于肝细胞移植的发展。因此，该方法为hADSCs在肝脏疾病细胞治疗中的应用迈出了重要的一步。
附图说明
图1为诱导培养后的细胞形态图片。
图2为对诱导结束的细胞进行ELISA和RT-PCR检测结果。
图3为肝细胞特异性基因表达的qPCR检测结果。
图4为使用诱导得到的iHeps进行改善CCl4诱导的急性肝损伤的功能试验结果。
具体实施方式
本发明方法具体可按以下步骤实施：
a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs；
b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段：
预处理阶段：在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5～2μM的ATRA的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；
内胚层诱导阶段：将预处理后的hADSCs在含有浓度为50～200nM的IDE1、1～5μΜ的CHIR99021和5～20μM的LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；
成肝诱导阶段：完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50～200nM的IDE1、10～30ng/mL的FGF4、5～20μM的LY294002和50～200nM的LDN-193189的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中诱导培养36～60小时；接着加入含有浓度为50～200nM的IDE1、10～30ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM的LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20～28小时；
肝细胞的成熟阶段：完成了成肝诱导后的细胞在含有浓度为100～200ng/mL的肝细胞生长因子(HGF)、10～30ng/mL的纤维母细胞生长因子4(FGF4)、20～40ng/mL抑瘤素M(OsM)、1.5～3×10-5mol/L地塞米松(Dex)以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中进行成熟阶段的诱导培养，培养时间为112～144小时；得到由hADSCs分化而来的iHeps细胞。
其中hADSCs的分离、培养与扩增可按常规方法进行。
作为参考，本发明以人腹腔脂肪组织为例，介绍以下具体方法：
步骤a人腹腔脂肪间充质干细胞的分离：剖腹产手术取出人腹部皮下脂肪组织，在冷D-Hank’s液中漂洗3次，去除肉眼可见的纤维成分和血管，用弯头镊子将其撕碎成1mm3左右的小颗粒。将脂肪组织小粒转入50mL离心管并加入0.1％Ⅰ型胶原酶(每克脂肪组织加2-5mL)，置于37℃，振荡消化30min。加入等量的含10％血清(FBS)的DMEM-LG培养基后，将离心管上下颠倒振荡几次进一步加速组织块离散，并用滤网过滤去除组织碎片。过滤液于4℃1500rpm离心10分钟，重复离心过程并弃去上清。将沉淀细胞用红细胞裂解缓冲液重悬，室温静置10min以裂解红细胞。4℃1500rpm离心10min，弃上清后用完全培养基(hADSCs用含有15％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM-LG培养基)重悬细胞于75cm2培养皿中，并放置于5％CO237℃培养箱中培养。1天后，用Hank's平衡盐溶液漂洗培养皿2-3次，清除未贴壁细胞，加入完全培养基继续培养。每2天换培养液1次，直至细胞达到80-90％融合后用0.25％胰酶溶液消化进行细胞传代。
将培养了3-7代的hADSCs接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中。当细胞长满培养皿底部后进行为期约10天的成肝诱导(hADSCs向肝细胞诱导分化的培养条件参见表1)
表1.ADSC向肝细胞诱导分化的培养条件
本发明中使用的部分添加物介绍如下：
1、IDE1(购自tocris公司，CAS号.1160927-48-9)，分子量:306.31；
化学式:C15H18N2O5。
化学名:1-[2-[(2-Carboxyphenyl)methylene]hydrazide]heptanoic acid(1-[2-[(2-羧基苯基)亚甲基]酰肼]庚酸)。
结构式：
2、CHIR99021(购自selleck公司，ct99021)分子量：465.34。化学式：C22H18CL2N8；CAS号：252917-06-09；
化学名：
6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile hydrochloride(6((2((4-(2,4-二氯苯基)－5－(4-甲基-1氢-咪唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)氨基)烟腈)。
结构式：
3、LY294002(购自selleck公司，S1105)分子量：307.34。
化学式：C19H17NO3；CAS号：154447-36-6；
化学名：2-morpholino-8-phenyl-4H-chromen-4-one(2-吗啉-8-苯基-4氢-苯并吡喃-4-酮)。
结构式：
4、LDN-193189(购自selleck公司，S2618)分子量：406.48
化学名：4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline((4-(6-(4-哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉))。
化学式：C25H22N6；CAS号：1062368-24-4；
结构式：
本发明实施例使用的所述ITS预混通用培养添加物为康宁公司产品(ITSPremix Universal Culture Supplement,20mL,1/Pack(Product#354350)),使用时按说明书要求添加即可。
以下通过实施例，对本发明进行更加具体的描述。
实施例一、使用本发明方法由hADSCs具体诱导成有功能的iHeps
将从人腹腔脂肪组织中分离得到的hADSCs传代培养3代后，接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中。待hADSCs长满培养皿底部后，用上述方法对hADSCs进行诱导培养，图1展示了诱导过程中从开始诱导(D0)到第10天诱导结束(D10)细胞的形态变化，在该方法中，hADSCs更换第Ⅰ阶段培养基，1天后细胞形态由长梭形变为短梭形(图1，D0-D1)，接着用成肝诱导培养基培养3天。最后将培养基换成肝细胞成熟培养基，细胞形态变为类似于原代肝细胞的具有细胞紧密接触的立方形(图1，D5-D10)。培养基具体配方和培养时间如下:
表2.实施例一中hADSCs向肝细胞诱导分化的培养条件
对诱导结束的细胞进行ELISA检测，诱导后后iHeps较诱导前的hADSCs(图2)。我们更进一步分析了肝细胞特异基因的表达，用未诱导的hADSCs和肝原代细胞(PHH)分别为阴、阳性对照发现在成肝诱导过程中，肝细胞的特异性基因表达逐渐上调(图2)，其中，ALB、AAT是肝细胞的特异性表达蛋白，并且也是成熟肝细胞功能的体现。而HNF4α是不成熟肝细胞的特异性蛋白，在肝脏发育中高表达，但成熟肝脏细胞中表达不高。实验结果显示由hADSCs诱导分化后的iHeps细胞表现出了成熟肝细胞的典型特征。这些现象说明hADSCs细胞在向成熟肝细胞稳定分化。这些结果表明我们这种新方法成功获得了hADSCs来源的肝细胞。
试验例一、诱导得到的iHeps有改善CCl4诱导的急性肝损伤的体内功能试验
为了评估iHeps是否具有肝细胞功能，我们使用了上述实施例1诱导得到的iHeps对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠模型进行细胞移植实验。
1、取按照实例一中相同方法对hADSCs进行成肝诱导后得到的iHeps细胞，加入适当量的0.25％胰酶铺满皿底，在37℃消化1分钟，轻轻拍打培养皿使细胞脱离皿底并分散成单个细胞。
加入5mL含有10％FBS的Willianm’E培养基终止消化。将胰酶和细胞的混合液移到15ml离心管1000rpm离心3分钟，去上清液，加入无血清williams’E培养基5mL，重新悬浮细胞。反复用无血清williams’E培养基离心重悬的方法洗3次，最后一次定浓度至2×106/100μL
2、准备同样浓度为2×106/100μL的hADSCs和rHeps
3、20只NPG(6周龄,雄性,北京维通达公司)小鼠分为四组，每组5只，分别标为作为空白对照的假手术组(sham)，作为阴性对照的hADSCs组，作为实验组的iHeps组和作为阳性对照的rHeps组
4、用将CCl4用橄榄油配制成5％溶液，将NPG小鼠按照0.3mL/kg CCl4体重注射CCl4溶液后引起急性爆发性肝衰竭(图4)。CCl4处理8小时后，将小鼠左侧背部脾脏下端剪一个5mm长的小口，用棉签小心将脾脏拖出半截，分别给hADSCs组小鼠脾腔移植hADSCs，iHeps组小鼠脾脏移植iHeps，rHeps组移植原代肝细胞(rHeps)细胞，假手术组只注射生理盐水(图4)，每组细胞用量为2×106/只。注射完生理盐水或者细胞后，将脾脏放回体内，用4号手术线缝合开口，每只小鼠3万单位青霉素和链霉素腹腔注射。
5、生存曲线分析：hADSCs组和假手术(sham组)组在CCl4处理24小时内几乎全部死亡(假手术组的一只小鼠在第2天死亡(图4A)，rHeps移植组明显提高了急性肝衰竭小鼠的存活率并延长了存活时间(图4A)。在iHeps移植组，2只小鼠(总共5只)完全从急性肝损伤中恢复(图4A)；
6、重复上述试验的分组和操作步骤。实验组和rHeps组在CCl4处理前(d0)和处理7天后(d7)，的小鼠各取三只，共4组，用眼球取血的方式收集这些小鼠的血液，静置于4℃过夜，1500rpm离心10分钟，取上层血清，送至血生化分析，分析显示，处理7天后，血清中谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST恢复正常水平，并且iHeps组治疗效果与rHeps组没有明显差别(图4B)；
7、将在CCl4处理前(d0)和处理7天后(d7)的实验组小鼠处死解剖取出肝脏，制作HE组织切片。组织分析显示iHeps明显改善了CCl4诱导的急性肝损伤(图4C)，CCl4处理前(d0)的损伤肝细胞的细胞核裂解、溶解、细胞肿胀、细胞膜不完整的特征(箭头所指处)相比于处理后(d7)得到有效缓解。

Claims (8)

1.体外诱导hADSCs向iHeps分化的方法，其特征包括以下步骤：
a、从人的离体脂肪组织中分离出hADSCs；
b、体外诱导培养hADSCs向iHeps分化，诱导分化过程分为以下4个阶段：
预处理阶段：在步骤a分离得到的hADSCs中加入含有0.5～2μM ATRA的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基，进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；
内胚层诱导阶段：将预处理后的hADSCs在含有浓度为50～200nM IDE1、1～5μΜCHIR99021和5～20μM LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中进行诱导培养，诱导时间为20～28小时；
成肝诱导阶段：完成内胚层诱导后的细胞在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002和50～200nM LDN-193189的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中诱导培养36～60小时；接着在含有浓度为50～200nM IDE1、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、5～20μM LY294002的RPMI-1640培养基或DMEM/F12培养基中继续进行诱导培养20～28小时；
肝细胞的成熟阶段：完成了成肝诱导后的细胞在含有浓度为100～200ng/mL肝细胞生长因子(HGF)、10～30ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、20～40ng/mL抑瘤素M(OsM)、1.5～3×10-5mol/L地塞米松(Dex)以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中进行成熟阶段的诱导培养，培养时间为112～144小时；得到由hADSCs分化而来的iHeps细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a述所的hADSCs，采用Ⅰ型胶原酶消化法从人离体脂肪组织中分离所得，其细胞形态为长梭型；步骤b所述的预处理阶段为hADSCs在含有1μΜ ATRA的RPMI-1640培养基中处理24h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述内胚层诱导阶段为将预处理后的hADSCs在含有100nM IDE1、3μΜCHIR99021和10μΜ LY294002的RPMI-1640培养基中进行诱导培养，诱导时间为24小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述成肝诱导阶段为将完成内胚层诱导后的细胞在含有100nM IDE1、20ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、10μΜ LY294002和100nM LDN-193189的RPMI-1640培养基中诱导培养48小时；接着将其在含有100nM IDE1、20ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、10μΜ LY294002的RPMI-1640培养基中诱导培养24小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b所述肝细胞的成熟阶段为将完成肝诱导阶段后的细胞在含有150ng/mL肝细胞生长因子(HGF)、20ng/mL纤维母细胞生长因子4(FGF4)、30ng/mL抑瘤素M(OSM)、2×10-5mol/L地塞米松以及ITS预混通用培养添加物的Williams’E培养基中诱导培养，培养时间120小时。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤a分离得到的hADSCs培养3-7代后再按步骤b所述方法进行诱导培养。
7.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：所述hADSCs在步骤b之前接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中进行后续诱导培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述hADSC接种于Ⅰ型胶原包被的培养皿中，当细胞长满培养皿底部后按步骤b的进行诱导培养。
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"人脂肪间充质干细胞的分离鉴定及向肝脏样细胞分化的实验研究";张云巍;《中国优秀硕士论文全文数据库（电子期刊）》;20150315(第03期);正文第21-23页
"全反式维甲酸诱导肝前体细胞向肝细胞分化的研究";白光文 等;《重庆医科大学学报》;20121231;第37卷(第3期);摘要，第204页左栏第3段
"视黄酸核受体β介导的ATRA对骨髓间充质干细胞成神经分化促进作用的实验研究";龚敏;《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）》;20121115(第11期);正文第24-25页

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