TW201907003A

TW201907003A - 自人類產後臍動脈組織獲得細胞之方法

Info

Publication number: TW201907003A
Application number: TW107118631A
Authority: TW
Inventors: 伊恩哈瑞斯; 納丁德耶內卡
Original assignee: 美商健生生物科技公司
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-02-16
Also published as: US20180346874A1; AR112356A1; WO2018220489A3; WO2018220489A2

Abstract

本發明提供自哺乳動物(較佳的是人類)產後臍帶動脈組織獲得細胞之方法，以及此等細胞用以治療眼變性病狀之用途。尤其，本發明之方法導致人類產後臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群之分離。在某些實施例中，該等細胞：表現CD13、CD90、NG2、及HLA-ABC；不表現CD31、CD34、CD45、CD117、FSP1、及E-鈣黏蛋白中之一或多者。在其他實施例中，細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及sVEGFR1中之一或多者。

Description

自人類產後臍帶動脈組織獲得細胞之方法

【相關申請案之交互參照】

本申請案主張2017年6月2日申請之美國臨時專利申請案第62/514,317號的優先權，其全部內容以全文引用方式併入本文中。

本發明係關於自哺乳動物(較佳的是人類)產後臍帶動脈組織獲得細胞之方法，以及此等細胞用以衍生用於治療眼變性病狀之細胞之用途。

已設計出各種規程以獲得適用於前驅細胞療法之細胞。已令所屬領域者感興趣的是用以自易於取得之來源獲得前驅細胞的規程，該等來源係諸如羊水、臍帶血、產後臍帶組織、及產後胎盤組織。

尤其，已自臍帶組織獲得不同前驅細胞群。例如，已自臍帶組織中的華通氏膠(Wharton 's Jelly)獲得適用於細胞療法之細胞。例如，Purchio等人(美國專利第5,919,702號)自華通氏膠分離出軟骨前驅細胞(或前軟骨細胞)。藉由利用混合酶(enzymatic cocktail)清洗臍帶組織，亦已自完整臍帶組織獲得適用於細胞療法之細胞。參見例如Weiss等人，Stem Cells；24：781-792(2006)。或者，利用切碎與酶消化組合之手段，已自完整臍帶組織獲得細胞。參見美國專利第7,510,873號。此等細胞已經證明在治療上有用於治療各種疾病，諸如阿茲海默症、肌萎縮側索硬化症(amyolateral sclerosis)、色素性視網膜炎、及眼變性病狀(包括年齡相關性黃斑變性)。此等規程之各者導致不同前驅細胞群自產後臍帶組織分離，該等前驅細胞群具有不同治療潛能。

需要另一規程用於自臍帶組織獲得前驅細胞，該等前驅細胞係治療上有用的，尤其是用於治療眼變性病狀。

本發明提供自人類臍帶組織產生人類臍帶動脈組織衍生細胞之方法，以及此等細胞之用途。尤其，藉由本發明之方法生產之細胞適用於治療眼變性病狀。

藉由本發明之方法獲得之人類臍帶動脈組織衍生細胞可係前驅細胞。在其他實施例中，藉由本發明之方法獲得之臍帶動脈組織衍生細胞係臍帶動脈組織平滑肌衍生細胞。

在某些實施例中，本發明之細胞能夠分化成眼譜系或表型。在其他實施例中，該等細胞能夠分化成神經譜系或表型。在替代實施例中，該等細胞能夠分化成：(1)眼譜系或表型；及(2)神經譜系或表型。

在實施例中，該等細胞能夠在培養物中自我更新及擴增，具有分化成其他表型之細胞的潛能，且進一步具有下列特徵：表現CD10、CD13、CD90、NG2、及HLA-ABC中之至少一者；及不表現CD31、CD34、CD45、CD117、FSP1、E-鈣黏蛋白、及HLA DR,DP,DQ中之一或多者。在實施例中，該等細胞能夠在培養物中自我更新及擴增；具有分化成其他表型之細胞的潛能。在一些實施例中，該等細胞表現CD13、CD90、NG2、及HLA-ABC，而不表現CD31、CD34、CD45、CD117、FSP1、及E-鈣黏蛋白。在實施例中，該等細胞表現α-平滑肌肌動蛋白。在一個實施例中，該等細胞具有實例2中表2-1及2-2中所識別特徵中之一或多者、或所有者。

在某些實施例中，該等細胞分泌適用於治療眼變性之營養因子。例如，本發明之細胞分泌突觸新生因子或橋分子中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在一個實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、或血小板反應蛋白-4中之一或多者。在另一個實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4之各者。在本文中所描述或揭示之實施例中，該等臍帶動脈組織衍生細胞分泌血小板反應蛋白-1(TSP-1)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、及可溶VEGFR1中之一或多者。在本文中之實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。在本文中所描述或揭示之實施例中，該等臍帶動脈組織衍生細胞相較於完整臍帶組織細胞，諸如美國專利第7,510,873號中所分離之人類臍帶組織衍生細胞(hUTC)，具有增加的TSP-1表現。

本發明之一個實施例係一種用於自人類臍帶組織產生人類臍帶動脈組織衍生細胞之方法，其涉及：(a)獲得臍帶組織；(b)自該組織移除實質上所有血液以產生實質上不含血液之臍組織；(c)將人類臍帶動脈組織自該臍帶組織分開；(d)藉由機械離解(諸如切碎)將實質上不含血液之該人類臍帶動脈組織解離；(e)利用酶之混合物將該經解離組織消化，該酶之混合物包含金屬蛋白酶、中性蛋白酶、及黏液分解酶；(f)將該等臍帶動脈組織衍生細胞自該經消化之組織分離；及(g)培養該等細胞以獲得經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群。在另一實施例中，用於自人類臍帶組織產生人類臍帶動脈組織衍生細胞之方法涉及：(a)獲得人類臍帶動脈組織；(b)自該組織移除實質上所有血液以產生實質上不含血液之臍組織；(c)藉由機械離解(諸如切碎)將實質上不含血液之該人類臍帶動脈組織解離；(d)利用酶之混合物將該經解離組織消化，該酶之混合物包含金屬蛋白酶、中性蛋白酶、及黏液分解酶；(e)將該等臍帶動脈組織衍生細胞自該經消化之組織分離；及(f)培養該等細胞以獲得經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群。本發明之方法亦包括：將臍帶動脈組織與華通氏膠分開。

在另一實施例中，本發明提供一種用於產生人類臍帶動脈組織衍生細胞之方法，其包含：(a)藉由機械離解(諸如切碎)將實質上不含血液之人類臍帶動脈組織解離；(b)利用酶之混合物將該經解離組織消化，該酶之混合物包含金屬蛋白酶、中性蛋白酶、及黏液分解酶；(c)自該經消化組織將臍帶動脈組織衍生細胞分離；(d)將該等經分離細胞再懸浮於生長培養基中；及(e)培養該等經分離細胞以獲得經分離細胞之均質性族群。

在某些實施例中，此等方法亦包括：在分離之後，將該等細胞懸浮於生長培養基中。彼等亦包括：使該經分離臍帶動脈組織衍生細胞之族群在培養物中擴増(例如約10天)至長滿。

經分離細胞在足以產生經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群之條件下培養。例如，經分離細胞可經培養約10至約100小時，以獲得經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群。

該培養以獲得細胞之均質性族群之步驟亦可包括選擇表現CD10之細胞。因此，在某些實施例中，本發明提供產生人類臍帶動脈組織衍生細胞，其包括：(a)藉由機械離解(諸如切碎)將實質上不含血液之人類臍帶動脈組織解離；(b)利用酶之混合物將該經解離組織消化，該酶之混合物包含金屬蛋白酶、中性蛋白酶、及黏液分解酶；(c)自該經消化組織將臍帶動脈組織衍生細胞分離；(d)將該等經分離細胞再懸浮於生長培養基中；及(g)培養並選擇該等經分離細胞以用於表現CD10之細胞，以獲得經分離細胞之均質性族群。

在較佳實施例中，該解離係藉由切碎組織來進行。移除實質上所有血液(或所有血液)包括藉由下列中之一或多者移除游離或凝結血液：清洗、抽吸、吸乾、離心分離、或酵素移除。在本發明之某些實施例中，所有血液在解離之前經移除。

消化步驟包括：將該經解離組織與該酶之混合物培養一或多個小時。在某些實施例中，消化步驟包含：將該經解離組織與該酶之混合物在約37℃下培養。在某些實施例中，金屬蛋白酶係膠原蛋白酶，中性蛋白酶係分散酶，黏液分解酶係玻尿酸酶或其組合。在某些實施例中，本發明之方法需要利用膠原蛋白酶、分散酶、及玻尿酸酶之混合物來消化經解離組織。

本發明之一實施例係一種治療眼變性病狀之方法，其包含向對象投予臍帶動脈組織衍生細胞，該等臍帶動脈組織衍生細胞係藉由上文所描述或在本文中所揭示之方法獲得。另一實施例係藉由上文所描述或在本文中所揭示之方法獲得之臍帶動脈組織衍生細胞用於治療眼變性病狀之用途。一個實施例係一種組成物，其包含藉由上文所描述或在本文中所揭示之方法獲得之臍帶動脈組織衍生細胞以用於治療眼變性病狀之用途。在上文所描述或在本文中所揭示之實施例中，一種藉由上文所描述或在本文中所揭示之方法獲得之臍帶動脈組織衍生細胞製備之條件培養基，可用於治療眼變性病狀。

本說明書中提及各種專利及其他出版物。這些出版物之各者之全部內容以引用方式併入本文中。在下列說明性實施例之詳細說明中，參照形成本說明書之一部分的隨附圖式。此等實施例係以足夠詳細之方式說明以讓所屬技術領域中具有通常知識者能夠實行本發明，並會理解到尚可利用其他實施例，而且可在不偏離本發明之精神或範疇下作出邏輯結構、機械、電性與化學上之變化。為了避免非為所屬技術領域中具有通常知識者能夠實行本文中所述之實施例所需之細節，本說明書可能會省略某些所屬技術領域中具有通常知識者所習知之資訊。因而不會以限制性的意義來採取下列詳細說明。

1.定義

幹細胞(stem cell)為未分化之細胞，其係以單一細胞同時具有自我更新及分化以生產後裔細胞(progeny cell)之能力來定義，包括自我更新前驅(self-renewing progenitor)、非更新前驅(non-renewing progenitor)與最終分化細胞(terminally differentiated cell)。幹細胞之特徵亦在於其具有體外分化為多個胚層(內胚層、中胚層與外胚層)之各種細胞譜系之功能性細胞的能力，以及在移植後形成多個胚層之組織的能力，並且能夠在注入胚胞(blastocyst)後實質上促成大多數(如果不是全部)組織形成。幹細胞依據其發展潛能分類如下：(1)全能性(totipotent)；(2)多能性(pluripotent)；(3)多潛能性(multipotent)；(4)少能性(oligopotent)；與(5)單能性(unipotent)。全能性細胞能夠形成所有胚胎與胚外細胞型。多能性細胞能夠形成所有胚胎細胞型。多潛能性細胞包括該些能夠形成細胞譜系亞群，但全部在特定組織、器官、或生理系統內之細胞(例如，造血幹細胞(HSC)可生產後裔，包括HSC(自我更新)、血液細胞限制少能性前驅、及作為血液正常組分之所有細胞型及元件(例如，血小板))。少能性細胞可以形成比多潛能性幹細胞更受限之細胞譜系亞群；且單能性細胞能夠形成單一細胞譜系(例如生精幹細胞)。幹細胞亦根據其可獲得來源來分類。成體幹細胞(adult stem cell)通常為多潛能性未分化細胞，其在包含多重分化細胞型之組織中發現。成體幹細胞可自我更新。在正常環境下，其亦可分化以產生其始源組織之特化細胞型，並且亦可能產生其他組織型。誘導型多能性幹細胞(iPS細胞)為轉變成多能性幹細胞之成體細胞。(Takahashi等人，Cell,2006；126(4)：663-676；Takahashi等人，Cell,2007；131：1-12)。胚胎幹細胞(embryonic stem cell)為來自胚胞階段胚胎之內細胞團(inner cell mass)的多能性細胞。胎體幹細胞(fetal stem cell)為源自胎體組織或膜之幹細胞。產後幹細胞(postpartum stem cell)為多潛能性或多能性細胞，其實質上源自生產後所能取得之胚外組織，亦即胎盤及臍帶。已發現這些細胞擁有多能性幹細胞之特性特徵，包括快速增生及分化為多種細胞譜系之潛能。產後幹細胞可為血液衍生(例如該些得自臍帶血之幹細胞)或非血液衍生(例如得自臍帶及胎盤之非血液組織)。

胚胎組織通常定義為源自胚胎(在人類係指自受精至發育約六週之期間)之組織。胎體組織係指源自胎體之組織，胎體在人類係指自發育約六週至分娩之期間。胚外組織為與胚胎或胎體相關但非源自胚胎或胎體之組織。胚外組織包括胚外膜(絨毛膜、羊膜、卵黃囊及尿囊)、臍帶及胎盤(其自身形成自絨毛膜及母體底蛻膜)。

分化(Differentiation)為未特化(「未定向(uncommitted)」)或特化較低之細胞藉以獲得特化細胞(諸如舉例來說神經細胞或肌肉細胞)特徵的過程。已分化細胞為佔據細胞譜系內較高特化(「定向(committed)」)位置之細胞。用語定向(committed)當應用於分化過程時，係指細胞在分化路徑中已進行達到一點，在正常環境下達到該點之細胞將會持續分化為特定細胞型或細胞型亞群，並且在正常環境下無法分化為不同細胞型或回復為較低分化之細胞型。去分化(de-differentiation)係指細胞藉以回復至細胞譜系內較低特化(或定向)位置的過程。如本文中所使用，細胞之譜系(lineage)定義細胞之遺傳，即細胞係來自哪些細胞以及細胞可形成哪些細胞。細胞之譜系將細胞放置於發育及分化之遺傳方案(hereditary scheme)內。廣義而言，前驅細胞(progenitor cell)為能夠產生較其本身更高分化之後裔，但又保有補充前驅池之能力的細胞。就此定義而言，幹細胞本身亦為前驅細胞，如同終末分化細胞之較直接前體細胞(more immediate precursor)。當提及本發明之細胞時，如以下所詳述者，可使用此較廣之前驅細胞定義。狹義而言，前驅細胞通常定義為在分化路徑中作為中間者之細胞，即其係由幹細胞所形成並且在成熟細胞型或細胞型亞群之生產中作為中間者。

此類型之前驅細胞通常無法自我更新。因此，如果在本文中提及此類型之細胞，將會稱其為非新生前驅細胞(non-renewing progenitor cell)或中間前驅或前體細胞(intermediate progenitor or precursor cell)。

如本文中所使用，片語「分化成眼譜系或表型(differentiates into an ocular lineage or phenotype)」係指細胞變得部分或完全定向至特定眼表型，包括但不限於視網膜及角膜幹細胞、視網膜及虹膜之色素上皮細胞、光受體、視網膜神經節及其他視神經譜系(例如，視網膜神經膠細胞、微膠細胞、星狀細胞、繆氏細胞(Mueller cell))、形成水晶體之細胞、及鞏膜、角膜、角膜緣(limbus)及結膜之上皮細胞。片語「分化成神經譜系或表型(differentiates into a neural lineage or phenotype)」係指細胞變得部分或完全定向至CNS或PNS之特定神經表型，亦即，神經元或膠細胞，後一類別包括但不限於星狀細胞、寡樹突細胞、許旺氏細胞(Schwann cell)及微膠細胞。

在本文中所例示且較佳用於本發明之細胞通常稱為產後臍帶動脈組織衍生細胞。彼等亦可被描述為幹細胞或前驅細胞(progenitor cell)，後項用語係以廣義之方式來使用。用語衍生(derived)係用來指明細胞係自其生物來源獲得，且於體外生長或經其他方式調控(例如培養於生長培養基以擴增族群及/或生產細胞系(cell line))。下文將詳細描述臍帶動脈組織衍生細胞之體外調控及其獨特特徵。

使用各種用語來描述在培養物中之細胞。細胞培養物(cell culture)通常係指取自活體生物並且在受控制條件下生長(「在培養物中(in culture)」或「經培養(cultured)」)的細胞。初代細胞培養物(primary cell culture)係直接取自生物且在第一次亞培養前之細胞、組織或器官之培養物。當細胞置於生長培養基中並處於有利細胞生長及/或分裂之條件下時，其在培養物中擴增從而導致更大之細胞群。當細胞在培養物中擴增時，細胞增生之速率有時係以細胞數目倍增所需的時間量來量測。此稱為倍增時間(doubling time)。

細胞系(cell line)為由初代細胞培養物之一或多個亞培養(subcultivation)所形成的細胞群。每一輪亞培養稱為一個繼代(passage)。當細胞經過亞培養時，將它們稱為已繼代。特定之細胞群或細胞系有時會以其繼代次數來指稱或表徵。例如，繼代十次的經培養細胞群可稱為P10培養物。初代培養物(即，在細胞自組織分離出來後之第一次培養物)係命名為P0。在第一次亞培養後，該些細胞係描述為二次培養物(P1或繼代1)。在第二次亞培養後，該些細胞即變成三次培養物(P2或繼代2)，依此類推。所屬技術領域中具有通常知識者將會理解到，在繼代期間會有多次族群倍增；因此，培養物之族群倍增次數大於其繼代次數。在繼代間隔期間之細胞擴增(即族群倍增次數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基材、培養基、生長條件及繼代間隔時間。

用語「生長培養基(growth medium)」通常係指足以培養本發明細胞之培養基。尤其，一種用於培養本發明細胞之培養基包含達爾伯克改質必需培養基(Dulbecco's Modified Essential Media)(在本文中亦縮寫為DMEM)。尤其較佳的是DMEM-低葡萄糖(在本文中亦稱為DMEM-LG)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)。DMEM-低葡萄糖較佳係補充有15%(v/v)胎牛血清(例如特級胎牛血清(defined fetal bovine serum)，Hyclone,Logan Utah)、抗生素/抗黴劑(較佳為50至100個單位/毫升青黴素、50至100微克/毫升鏈黴素、及0至0.25微克/毫升兩性黴素B；Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、及0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma,St.Louis Mo.)。如以下實例中所使用，生長培養基係指具有15%胎牛血清及抗生素/抗黴劑之DMEM-低葡萄糖(當包括青黴素/鏈黴素時，其較佳分別為50U/ml及50微克/ml；當使用青黴素/鏈黴素/兩性黴素時，其較佳分別為100U/ml、100微克/ml、及0.25微克/ml)。在一些情況下，使用不同生長培養基，諸如平滑肌基礎培養基(具有或不具有血清)或提供不同補充劑，此等通常在文中指明為生長培養基之補充劑。

條件培養基(conditioned medium)為其中特定細胞或細胞群係經培養且隨後移除之培養基。當細胞培養於培養基中時，其可分泌可提供營養支持給其他細胞之細胞因子。此類營養因子包括但不限於荷爾蒙、細胞介素、細胞外基質(ECM)、蛋白質、囊泡、抗體、及顆粒。含有細胞因子之培養基為條件培養基。

通常，營養因子(trophic factor)係定義為促進細胞生存、生長、分化、增生及/或成熟之物質，或刺激細胞提高活性之物質。細胞之間經由營養因子的交互作用可發生在不同類型的細胞之間。藉助營養因子之細胞交互作用見於基本上所有的細胞型中，且為神經細胞型之通訊所尤其顯著的手段。營養因子亦可以自泌(autocrine)之方式作用，亦即，細胞可生產影響其自身生存、生長、分化、增生及/或成熟之營養因子。

當指稱經培養之脊椎動物細胞時，用語衰老(senescence)(複製衰老(replicative senescence)或細胞衰老(cellular senescence)亦同)係指可歸因於有限細胞培養之性質；亦即，它們無能力生長超越有限的族群倍增次數(有時稱為海富利克限度(Hayflick’s limit))。儘管細胞衰老最先係使用纖維母細胞樣細胞(fibroblast-like cell)來描述，但是可在培養物中成功生長之大部分正常人類細胞型均經歷細胞衰老。不同細胞型之體外壽命不同，但是最大壽命通常少於100次族群倍增(此為培養物中之所有細胞變衰老且因此使培養物無法分裂之倍增次數)。衰老並非取決於時序時間，而是由培養物所經歷之細胞分裂、或族群倍增之次數所量測。

用語眼(ocular)、眼科(ophthalmic)及視(optic)在本文中可互換使用以定義「眼睛的、或有關眼睛、或與眼睛相關(of,or about,or related to the eye)」。用語眼變性病狀(ocular degenerative condition)(或病症(disorder))為包括性用語，涵蓋涉及細胞損傷、變性或損失之眼睛(包括眼睛與腦之間的神經連接)的急性及慢性病狀、病症或疾病。眼變性病狀可與年齡有關，或可因受傷或創傷所致，或可與特定疾病或病症有關。急性眼變性病狀包括但不限於與細胞死亡相關之病狀或影響眼睛之損害，包括由以下引起之病狀：腦血管機能不全、局灶性或瀰漫性腦創傷、瀰漫性腦損傷、傳染性或發炎性眼睛病狀、視網膜裂開或脫附、眼內病灶(挫傷穿透、壓迫、撕裂)或其他身體受傷(例如，物理或化學灼傷)。慢性眼變性病狀(包括進行性病狀)包括但不限於視網膜病變及其他視網膜/黃斑病症，諸如色素性視網膜炎(RP)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、脈絡膜新生血管膜(CNVM)；視網膜病變，諸如糖尿病視網膜病變、閉塞性視網膜病變、鐮狀細胞視網膜病變及高血壓視網膜病變、中央視網膜靜脈阻塞、頸動脈狹窄、視神經病變，諸如青光眼及相關症候群；水晶體及外眼之病症例如角膜緣幹細胞缺乏(LSCD)，亦稱為角膜緣上皮細胞缺乏(LECD)，諸如發生於化學或熱受傷中、史蒂芬強森症候群症候群(Steven-Johnson syndrome)、隱形眼鏡誘導之角膜病變、眼瘢痕性類天皰瘡、先天無虹膜或外胚層發育不良疾病、及多發性內分泌缺乏相關角膜炎。

用語治療眼變性病狀(treating an ocular degenerative condition)或眼變性病狀之治療(treatment of an ocular degenerative condition)係指緩解如本文所定義之眼變性病狀之作用，或延緩、暫停或逆轉眼變性病狀之進展，或延緩或預防眼變性病狀之發生。

用語有效量(effective amount)係指試劑或醫藥組成物諸如生長因子、分化劑、營養因子、細胞群或其他藥劑之濃度或量，該濃度或量可有效產生預期結果，包括如本文所述之體外或體內之細胞生長及/或分化，或治療眼變性病狀。關於生長因子，有效量可在約1奈克/毫升至約1微克/毫升之範圍內。關於向患者體內投予之細胞，有效量可在少至數百或更少、至多達數百萬或更多之範圍內。在特定實施例中，有效量可在10³至11¹¹個細胞之範圍內，更特定言之為至少約10⁴個細胞。應理解待投予之細胞數目將取決於待治療病症之細節，包括但不限於待治療之大小或總體積/表面積，以及投予位點與待治療區域之位置之靠近性，以及醫藥生物學家熟悉的其他因素而變化。

用語有效期間(effective period)(或時間(time))及有效條件(effective condition)係指對於劑或醫藥組成物而言，為達成其預期結果所必需或較佳之時間期間或其他可控條件(例如，體外方法之溫度、濕度)。

用語患者(patient)或對象(subject)係指用本文所述之醫藥組成物或根據本文所述之方法治療之動物，包括哺乳動物，較佳為人類。

用語醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)(或介質(medium))可與用語生物可相容之載劑或介質(biologically compatible carrier or medium)互換使用，係指試劑、細胞、化合物、材料、組成物、及/或劑型，其不僅可與待治療性投予之細胞及其他藥劑相容，而且在合理的醫學判斷之範疇內適用於與人類及動物之組織接觸，而無過度毒性、刺激、過敏反應、或符合合理的利益/風險比的其他併發症。

在本文中使用數個關於細胞置換療法(cell replacement therapy)之用語。用語自體轉移(autologous transfer)、自體移植(autologous transplantation)、自體移接(autograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者亦為細胞置換療法之接受者之治療。用語同種異體轉移(allogeneic transfer)、同種異體移植(allogeneic transplantation)、同種異體移接(allograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為相同物種，但非相同個體之治療。捐贈者細胞與接受者組織相容性匹配之細胞轉移有時稱為同基因轉移(syngeneic transfer)。用語異種轉移(xenogeneic transfer)、異種移植(xenogeneic transplantation)、異種移接(xenograft)及類似用語係指其中細胞捐贈者與細胞置換療法之接受者為不同物種之治療。如本文中所使用之移植係指將自體、或同種異體捐贈者細胞置換療法引入至接受者。

如本文中所使用，用語「約(about)」在指稱一可測量的值(例如數量、持續時間及類似者)時，意欲涵蓋在指定值之±20%與±0.1%之間、較佳為±20%或±10%、更佳為±5%、甚至更佳為±1%、且仍更佳為±0.1%的變異，若此類變異為適合執行所揭露之方法者。

2.自產後臍帶動脈組織衍生細胞

本發明提供自產後臍帶動脈組織(例如，動脈平滑肌組織)衍生細胞之方法。為了衍生此等細胞，將哺乳動物臍帶在足月或不足月懷孕結束時或結束後不久例如在排出胎衣(after-birth)後回收。在某些實施例中，臍帶可得自豬、大鼠、或小鼠獲得。在其他更佳實施例中，使用人類臍帶。

產後組織可在無菌容器例如燒瓶、燒杯、培養皿或袋中自生產地運輸至實驗室。該容器可具有溶液或培養基，包括但不限於鹽溶液如達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle's Medium,DMEM)或磷酸鹽緩衝液(PBS)，或者任何用來運輸用於移植之器官的溶液如威斯康辛大學溶液(University of Wisconsin solution)或全氟化化合物溶液(perfluorochemical solution)。可將一或多種抗生素及/或抗黴劑(例如但不限於青黴素(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)、兩性黴素B(amphotericin B)、建它黴素(gentamicin)與制黴菌素(nystatin))加至該培養基或緩衝液。產後組織可用抗凝劑溶液例如含肝素溶液來潤洗。較佳為，將該組織在萃取並衍生產後臍帶動脈組織衍生細胞之前保持在約4至10℃下。甚至更佳為，使該組織在萃取產後臍帶動脈組織衍生細胞之前未經冷凍。

臍帶動脈平滑肌組織衍生細胞之衍生較佳為發生於無菌環境中。臍帶可藉由該項技術領域中習知之手段來與胎盤分開。或者，臍帶與胎盤未經分開即可使用。較佳為在分離細胞前自產後組織移除血液與碎屑。例如，產後組織可用緩衝液來清洗，諸如但不限於磷酸鹽緩衝液。清洗緩衝液亦可包含一或多種抗黴劑及/或抗生素，諸如但不限於青黴素、鏈黴素、兩性黴素B、建它黴素及制黴菌素。

在清洗之後，臍帶動脈組織(包括動脈平滑肌組織)藉由所屬技術領域中之手段自臍帶組織(或臍帶組織和胎盤組織)分開。或者，在移除血液和碎屑之前，臍帶動脈組織(包括動脈平滑肌組織)係自臍帶組織(或臍帶組織和胎盤組織)分開。尤其，臍帶動脈壁與華通氏膠分開，使得華通氏膠細胞未經分離。

包含臍帶動脈組織(包括動脈平滑肌組織)、或其片段或區段之產後組織係藉由機械力(切碎或剪切力)來崩解。在目前較佳實施例中，分離程序亦利用酶消化法。許多種酶在該項技術領域中係習知可用來自複雜組織基質中分離出個別細胞以利於在培養物中生長。此類酶為市售可得，範圍自弱消化性(例如去氧核糖核酸酶及中性蛋白酶、分散酶)至強消化性(例如木瓜酶及胰蛋白酶)皆有。相容於本文中之酶的非詳盡無遺清單包括黏液分解酶活性物、金屬蛋白酶(metalloprotease)、中性蛋白酶、絲胺酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或彈性蛋白酶)與去氧核糖核酸酶。目前較佳者為選自金屬蛋白酶、中性蛋白酶與黏液分解活性物之酶活性物。例如，膠原蛋白酶已知可用來自組織分離出各種細胞。去氧核糖核酸酶可消化單股DNA並且可使分離期間之細胞結塊(cell clumping)降至最低。較佳方法涉及用例如膠原蛋白酶及分散酶、或膠原蛋白酶、分散酶、及玻尿酸酶進行酶處理，且提供此類方法，其中在某些較佳實施例中，膠原蛋白酶與中性蛋白酶分散酶之混合物係用於解離步驟中。更佳者為該些於至少一種來自溶組織芽胞梭菌(Clostridium histolyticum)之膠原蛋白酶以及蛋白酶活性物、分散酶與嗜熱菌蛋白酶中之任一者存在下來進行消化之方法。再佳者為同時使用膠原蛋白酶與分散酶酶活性物來進行消化之方法。同樣較佳者為包括除了膠原蛋白酶與分散酶活性物外使用玻尿酸酶活性物來進行消化之方法。熟悉該項技藝人士將會瞭解到，許多種此類酶處理在該項技術領域中皆為習知可用於自各種組織來源分離出細胞。舉例而言，酶組合之LIBERASE^TM Blendzyme 3(Roche)系列適合用於本發明方法中。其他酶來源為習知者，並且熟悉該項技藝人士亦可直接自此類酶之天然來源獲得這些酶。熟悉該項技藝人士亦具有完善設備，能夠針對新的或額外酶或酶組合評估其在分離本發明細胞方面的實用性。

酶處理費時0.5、1、1.5或2小時或更久。在一個實施例中，酶處理持續約0.5小時至約2小時，替代地約0.5至約2.5小時，替代地約1小時至約3小時，替代地約1.5至約2.5小時。在其他實施例中，組織在解離步驟之酶處理期間係培養於37℃下。

將經分離細胞轉移至無菌組織培養容器，該容器未經塗布或經細胞外基質或配體諸如層黏蛋白、膠原蛋白(原生、變性或交聯)、明膠、纖連蛋白素與其他細胞外基質蛋白質塗布。細胞培養於任何能夠維持該等細胞生長之培養基中，諸如但不限於DMEM(高或低葡萄糖)、進階DMEM、DMEM/MCDB 201、伊格爾基礎培養基(Eagle’s basal medium)、哈姆F10培養基(Ham's F10 medium,F10)、哈姆F-12培養基(F12)、伊思考夫改良達爾伯克培養基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)、間葉幹細胞生長培養基(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium,MSCGM)、DMEM/F12、RPMI 1640及Cellgro FREE^TM。培養基可補充一或多種組分，包括例如胎牛血清(FBS)(較佳為約2-15%(v/v))；馬血清(ES)；人血清(HS)；β-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol,BME或2-ME)，較佳為約0.001%(v/v))；一或多種生長因子，例如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子-1(IGF-1)、白血球抑制因子(LIF)及紅血球生成素；胺基酸，包括L-纈胺酸；以及一或多種抗生素及/或抗黴劑以控制微生物污染，例如青黴素G、硫酸鏈黴素、兩性黴素B、建它黴素及制黴菌素，不論單獨或組合使用。在某些實施例中，培養基包含生長培養基(DMEM-低葡萄糖、血清、BME、及抗生素)。細胞係以允許細胞生長之密度接種於培養容器中。在一個實施例中，細胞在約0至約5體積百分比之CO₂下在空氣中培養。在一些實施例中，細胞在約2至約25百分比之O₂下在空氣中，較佳為在約5至約20百分比之O₂下在空氣中培養。細胞可在約25至約40℃下培養，更佳為在37℃下培養。較佳為細胞係於培養器中培養。培養容器中的培養基可為靜止或經攪拌，例如使用生物反應器。較佳為使臍帶動脈組織衍生細胞在低氧化應力(oxidative stress)下生長(例如添加麩胱甘肽、維生素C、過氧化氫酶、維生素E、N-乙醯半胱胺酸)。如本文中所使用之「低氧化應力(low oxidative stress)」係指對於所培養細胞無自由基傷害或最低自由基傷害之條件。

用於選擇最適當培養基、培養基製備與細胞培養技術之方法在該項技術領域為熟知者，並且係描述於各種不同來源中，包括Doyle等人，(編)，1995,Cell &TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES,John Wiley & Sons,Chichester；與Ho及Wang(編),1991,ANIMAL CELL BIOREACTORS,Butterworth-Heinemann,Boston，上述皆以引用方式併入本文中。

在本發明之一些實施例中，臍帶動脈組織衍生細胞係經繼代或移除至含有與初始使用之培養基相同或不同類型之新鮮培養基之分開培養容器中，其中細胞群可經有絲分裂擴增。本發明之細胞可在繼代0與衰老之間的任何時點使用。較佳為將細胞繼代約3與約25次之間，更佳為繼代約4至約12次，並且較佳為繼代10或11次。可執行選殖(Cloning)及/或次選殖(subcloning)以確認已分離出細胞的殖株族群(clonal population)。

細胞可經凍存(cryopreserved)。因此，在一個實施例中，用於自體轉移之臍帶動脈組織衍生細胞(無論是用於母親或小孩)可衍生自在小孩出生後之適當產後組織，接著經過凍存以使得之後需要移植該些細胞時可供使用。

因此，在一個實施例中，本發明提供用於自人類臍帶組織產生人類臍帶動脈組織衍生細胞之方法。該方法需要使用實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織。實質上不含血液之人類臍帶動脈組織係藉由機械締合諸如切碎(或任何其他所屬技術領域中已知程序)解離。然後，利用酶之混合物將經解離組織消化，該酶之混合物包含金屬蛋白酶、中性蛋白酶、及黏液分解酶。例如，可將組織消化一或多個小時，諸如約0.5小時至約2小時期間。消化步驟亦可包括：將該經解離組織與該酶之混合物在約37℃下培養。在某些實施例中，金屬蛋白酶係膠原蛋白酶，黏液分解酶是玻尿酸酶，且中性蛋白酶是分散酶。在更佳實施例中，使用玻尿酸酶、分散酶、及膠原蛋白酶之組合，將經解離組織消化。在消化之後，自經消化組織將人類臍帶動脈組織衍生細胞分離並培養，以獲得經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群。例如，該等細胞可培養約10至約100小時，替代地約12至約72小時，替代地約24小時至約48小時，替代地約12至約96小時，替代地約10、11、12、13、14、15小時至約24、48、72、或96小時。在一個實施例中，該培養包括選擇生長並表現CD10之細胞。

實質上不含血液(或不含血液)之人類動脈組織可藉由各種方式產生。在某些實施例中，人類動脈組織僅含有動脈壁組織，藉此血管與華通氏膠分開。例如，人類臍帶組織可獲得，且自該組織可移除實質上所有血液(或所有血液)以產生實質上不含血液(或不含血液)之臍組織。然後，人類臍帶動脈組織可自臍帶組織分開。或者，在移除實質上所有血液(或所有血液)之前，人類臍帶動脈組織係自人類臍帶組織分開。在某些實施例中，所有血液係經移除。移除步驟包含藉由下列中之一或多者移除游離或凝結血液：清洗、抽吸、吸乾、離心分離、或酵素移除。

本發明之方法導致產後臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群之產生。產後臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群較佳為不含母體譜系細胞。細胞群之均質性可藉由任何該項技術領域中所習知的方法來達成，例如根據習知方法藉由細胞分選(例如流動式細胞測量術)或藉由殖株擴增達成。因此，較佳均質性產後臍帶動脈組織衍生細胞族群可包含產後衍生細胞之殖株細胞系。當分離出具有高度所欲功能性之細胞殖株時，此類族群為尤其有用的。

本文亦提供在一或多種因子存在下，或在刺激幹細胞沿著所欲路徑(例如，神經、上皮)分化之條件下培養之細胞群。此類因子為所屬技術領域中已知的且熟悉該項技藝人士將會瞭解到，判定合適的分化條件可以常規實驗完成。此類條件之最佳化可藉由統計實驗設計及分析來完成，例如回應面方法論(response surface methodology)允許同時最佳化例如在生物培養物中的多個變數。目前較佳因子包括但不限於以下因子，諸如生長或營養因子、去甲基化劑、與神經或上皮譜系細胞共培養或於神經或上皮譜系細胞條件培養基中培養，以及所屬技術領域中已知用以刺激幹細胞沿著此等路徑分化之其他條件(關於可用於神經分化之因子，參見例如Lang,K.J.D.等人，2004,J.Neurosci.Res.76：184-192；Johe,K.K.等人，1996,Genes Devel.10：3129-3140；Gottleib,D.,2002,Ann.Rev.Neurosci.25：381-407)。

3.產後臍帶動脈組織衍生細胞之特徵

本發明之產後臍帶動脈組織衍生細胞可藉由下列加以表徵：例如生長特徵(例如族群倍增能力、倍增時間、到達衰老之繼代數)、核型分析(例如正常核型；母體或新生兒譜系)、流動式細胞測量術(例如FACS分析)、免疫組織化學法及/或免疫細胞化學法(例如偵測表位)、基因表現概況(例如基因晶片陣列分析；聚合酶連鎖反應(例如反轉錄酶PCR、即時PCR、及傳統PCR))、蛋白質陣列分析、蛋白質分泌法(例如藉由血漿凝固檢定或PDC條件培養基分析(例如藉由酶聯免疫吸附檢定法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)))、混合淋巴球反應(例如作為PBMC刺激作用之量測)及/或其他該項技術領域中所習知之方法。

尤其，細胞可基於其表面蛋白或「標記」來表徵，而可用於提供用於識別細胞或細胞系之概況。在某些實施例中，本發明之方法導致具以下條件之細胞分離：表現CD13、CD90、NG2、及HLA-ABC中之一或多者(或各者)，及不表現CD31、CD34、CD45、CD117、FSP1、及E-鈣黏蛋白中之一或多者(或各者)。在其他實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞表現標記CD10、CD13、CD90、HLA-A,B,C、及α-平滑肌肌動蛋白之各者，其中該等細胞生產對應於所列標記的免疫可檢測蛋白。細胞亦可表現NG2。產後臍帶動脈組織衍生細胞亦不表現或生產對應於標記CD31、CD34、CD45、CD117、及HLA DR,DP,DQ中任一者之蛋白質。在某些實施例中，細胞亦不表現或不生產HLA-C、E-鈣黏蛋白、FSP-1、及其組合。

在某些實施例中，臍帶動脈組織衍生細胞擁有正常核型，其在細胞繼代時維持。核型分析方法為所屬技術領域中具有通常知識者可使用且習知者。

產後臍帶動脈組織衍生細胞亦或許能夠在培養物中擴増，具有正常核型，並在經過繼代時保持正常核型。目前較佳用於本發明的細胞為不會例如沿著神經譜系自行分化之細胞。然而，細胞可藉由其分化成至少神經譜系的能力來表徵。在某些實施例中，該等細胞能夠在培養物中自我更新及擴增，具有分化成其他表型(例如神經譜系)之細胞之潛能。

在某些實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞亦可藉由其分泌營養因子的能力來表徵。尤其，該等產後臍帶動脈組織衍生細胞可藉由分泌選自血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、及血小板反應蛋白-4之營養因子來表徵。在其他實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、或血小板反應蛋白-4。此外，本發明之細胞分泌RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。

產後臍帶動脈組織衍生細胞亦可藉由其分泌橋分子的能力來表徵。在某些實施例中，臍帶動脈組織衍生細胞分泌一或多種橋分子。

在較佳實施例中，細胞包含二或更多種以上列舉之生長、蛋白質/表面標記生產、基因表現或物質分泌特徵。更佳者為該些包含三、四、或五或更多種上述特徵之細胞。再佳者為包含六、七或八或更多種上述特徵之產後臍帶動脈組織衍生細胞。本案再佳者為該些包含所有上述特徵之細胞。

在本發明之一個實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現標記CD10、CD13、CD90、HLA-A,B,C、及α-平滑肌肌動蛋白之各者，且不表現或生產對應於標記CD31、CD34、CD45、CD117、及HLA DR,DP,DQ中任一者之蛋白質。細胞亦可表現NG2。在某些實施例中，細胞亦不表現或不生產HLA-C、E-鈣黏蛋白、或FSP-1。在其他實施例中，細胞不表現或生產HLA-C、E-鈣黏蛋白、FSP-1、及其組合。該等細胞亦分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。

在本發明之另一實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現標記CD10、CD13、CD90、HLA-A,B,C、α-平滑肌肌動蛋白、及NG2之各者，且不表現或生產對應於標記CD31、CD34、CD45、CD117、及HLA DR,DP,DQ中任一者之蛋白質。在某些實施例中，細胞亦不表現或不生產HLA-C、E-鈣黏蛋白、FSP-1、及其組合。

在本發明之另一實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現標記CD10、CD13、CD90、HLA-A,B,C、α-平滑肌肌動蛋白、及NG2之各者，且不表現或生產對應於標記CD31、CD34、CD45、CD117、E-鈣黏蛋白、及HLA DR,DP,DQ中任一者之蛋白質。在某些實施例中，細胞亦不表現或不生產HLA-C、FSP-1、或以上兩者。在其他實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。

在本發明之又另一實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現標記CD10、CD13、CD90、HLA-A,B,C、α-平滑肌肌動蛋白之各者，且不表現或生產對應於標記CD31、CD34、CD45、CD117、HLA-C、及HLA DR,DP,DQ中任一者之蛋白質。在某些實施例中，細胞亦不表現或不生產E-鈣黏蛋白、FSP-1、或以上兩者。該等細胞亦可分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。在某些實施例中，該等細胞亦表現NG2；在其他實施例中，該等細胞不表現NG2。

在本發明之一替代實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現標記CD10、CD13、CD90、HLA-A,B,C、α-平滑肌肌動蛋白、及NG2之各者，且不表現或生產對應於標記CD31、CD34、CD45、CD117、HLA-C、E-鈣黏蛋白、及HLA DR,DP,DQ中任一者之蛋白質。在某些實施例中，細胞亦不表現或不生產FSP-1。該等細胞亦分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。

在本發明之又另一實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現標記CD10、CD13、CD90、HLA-A,B,C、α-平滑肌肌動蛋白、及NG2之各者，且不表現或產生對應於標記CD31、CD34、CD45、CD117、HLA-C、E-鈣黏蛋白、FSP-1、及HLA DR,DP,DQ中任一者之蛋白質。該等細胞進一步藉由彼等分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1中之一或多者來表徵。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。

在一替代實施例中，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現CD13、CD90、及HLA-ABC，且不表現CD31、CD34、CD45、CD117、FSP1、E-鈣黏蛋白、及NG2。此等細胞亦分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。

或者，產後臍帶動脈組織衍生細胞係自實質上不含血液(或不含血液)之人類臍帶動脈組織分離，能夠更新及擴增至培養物中，具有分化成其他表型之細胞的潛能，表現CD13、CD90、NG2、及HLA-ABC，而不表現CD31、CD34、CD45、及CD117，且不表現FSP1、及E-鈣黏蛋白中之一或多者。此等細胞亦分泌血小板反應蛋白-1、血小板反應蛋白-2、血小板反應蛋白-4、RTK配體、BDNF、HDF、及可溶VEGFR1。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。在實施例中，該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1。

當較佳細胞生長於生長培養基中時，生產在其表面上之細胞標記，及其各種基因之表現模式(如使用Affymetrix GENECHIP所判定)為實質上穩定的。經由多次族群倍增的繼代，該些細胞例如在其表面標記特徵方面仍保持實質上恆定。

本發明之臍帶動脈組織衍生細胞之一個特徵在於，可藉由使其經歷分化誘導細胞培養條件來有意地誘導其分化成各種譜系表型。在治療某些眼變性病狀之用途中，可使用所屬技術領域中已知之一或多種方法誘導臍帶動脈組織衍生細胞分化成神經表型。舉例而言，如本文中所例示，可將細胞接種於經層黏蛋白塗布之培養瓶中之含有B27(B27補充物，Invitrogen)、L-麩醯胺酸及青黴素/鏈黴素之Neurobasal-A培養基(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)，其組合在本文稱為神經前驅擴增(NPE)培養基。NPE培養基可進一步補充有bFGF及/或EGF。或者，可藉由以下來誘導細胞體外分化：(1)將本發明之臍帶動脈組織衍生細胞與神經前驅細胞共培養；或(2)使本發明之臍帶動脈組織衍生細胞生長於神經前驅細胞條件培養基中。

本發明之臍帶動脈組織衍生細胞分化成神經表型，其可藉由具有伸長突起之雙極細胞形態來證明。經誘導之細胞群可針對巢蛋白(nestin)之存在染色為陽性。可藉由檢測巢蛋白、TuJ1(BIII微管蛋白)、GFAP、酪胺酸羥化酶、GABA及/或MBP，來評估分化之臍帶動脈組織衍生細胞。在一些實施例中，本發明之臍帶動脈組織衍生細胞已展現出形成神經球(neurosphere)之神經元幹細胞形成之三維體特徵之能力。

4.套組及存庫(Bank)

在另一態樣中，本發明提供套組，其於各種如上文所述用於眼再生及修復之方法中利用本發明之細胞/細胞群、自該等細胞製備之條件培養基、及其組分及產物。當用於治療眼變性病狀、或其他計劃治療時，該等套組可包括一或多種細胞群或條件培養基(包括至少本發明細胞或自該等細胞衍生之條件培養基)、及醫藥上可接受之載劑(液體、半固體或固體)。套組亦可選地可包括例如藉由注射投予細胞及條件培養基之手段。套組進一步可包括使用細胞及條件培養基之說明書。經製備用於野外醫院用途，諸如軍事用途之套組可包括全程序供應(full-procedure supply)，其包括組織支架、手術用縫線、及類似物，其中細胞或條件培養基與急性受傷之修復結合使用。如本文所述之用於檢定及體外方法之套組可含有例如以下中之一或多者：(1)產後臍帶動脈組織衍生細胞或其組分，或產後臍帶動脈組織衍生細胞之條件培養基或其他產品；(2)用於實踐體外方法之試劑；(3)適當時選用的其他細胞或細胞群；及(4)用於指導體外方法之說明書。

在另一態樣中，本發明亦提供用於存庫(banking)本發明之組織、細胞、細胞群、條件培養基、及細胞組分。如上文所討論，細胞及條件培養基易於凍存。因此本發明提供凍存細胞於存庫中之方法，其中該些細胞經冷凍儲存且與基於細胞之免疫、生化及基因性質之細胞的完整表徵相關聯。冷凍細胞可經解凍及擴增或直接用於自體、同基因、或同種異體治療，其取決於程序之要求及患者之需要。較佳地，關於每一凍存樣本之資訊儲存於電腦中，其可基於外科醫師、程序及患者之要求來搜尋，其中合適的匹配係基於細胞或族群之表徵來得到。較佳地，使本發明之細胞生長且擴增至所要量之細胞，且治療性細胞組成物係在基質或支持物存在或不存在下分開製備或以共培養之形式製備。儘管對於一些應用而言，使用新鮮製備之細胞可為較佳的，但是可藉由將細胞冷凍且將資訊輸入於電腦中以將電腦條目與樣本相關聯來將剩餘物凍存且存庫。即使在不需要將來源或捐贈者與此類細胞之接受者匹配的情況中，出於免疫目的，存庫系統使其易於將例如存庫細胞之所需生化或基因性質與治療需要匹配。在找到與所需性質相匹配之存庫樣本後，可擷取樣本且製備以供治療使用。如本文中所描述所製備之細胞溶解產物、ECM或細胞組分亦可經凍存或以其他方式保留(例如，藉由凍乾)且根據本發明存庫。

5.產後臍帶動脈組織衍生細胞之用途

在本發明之某些實施例中，有效量之本發明之產後臍帶動脈組織衍生細胞可用於治療眼變性病狀。就此類用途而言，細胞可作為藥物組成物之一部分提供。彼等亦可作為基質或植入式裝置之一部分提供。在某些實施例中，本發明之產後臍帶動脈組織衍生細胞可用於提供適合治療眼變性病狀之營養因子。在替代實施例中，可使用條件培養基代替細胞。在又另一實施例中，可使用由細胞生產之細胞外基質。細胞或條件培養基亦可用於作為組合療法之一部分。

可與細胞及藉由該等細胞生產之條件培養基產物一起投予之其他組分之實例包括但不限於：(1)其他神經保護或神經有益藥品；(2)選定之細胞外基質組分，諸如所屬技術領域中已知的一或多種類型的膠原蛋白、及/或生長因子、富血小板血漿、及藥品(或者，細胞可經基因工程化以表現且生產生長因子)；(3)抗細胞凋亡劑(例如，紅血球生成素(EPO)、EPO模擬體(mimetibody)、血小板生成素(thrombopoietin)、類胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、肝細胞生長因子、凋亡蛋白酶抑制劑)；(4)消炎化合物(例如，p38 MAP激酶抑制劑、TGF-β抑制劑、斯他汀類(statins)、IL-6及IL-I抑制劑、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS、及非固醇類消炎藥品(NSAIDS)(諸如TEPOXALIN、TOLMETIN、及SUPROFEN))；(5)免疫抑制或免疫調節劑，諸如鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、mTOR抑制劑、抗增生劑、皮質類固醇及各種抗體；(6)抗氧化劑，諸如普洛布克(probucol)、維生素C與 E、輔酶Q-10、麩胱甘肽、L-半胱胺酸及N-乙醯半胱胺酸；以及(6)局部麻醉劑等不及備舉。

以下實例進一步說明但不限制本發明。

實例1

自產後臍帶動脈組織衍生細胞

此實例描述自臍帶組織製備產後臍帶動脈組織衍生細胞。在足月或不足月懷孕出生後獲得產後臍帶。

臍帶係在正常分娩後獲得。細胞分離規程係在層流櫃(laminar flow hood)中無菌執行。為了移除血液與碎屑，將臍帶於抗黴劑及抗生素(100個單位/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、0.25微克/毫升兩性黴素B)存在之磷酸鹽緩衝鹽水中清洗。在移除血液和碎屑後，臍帶動脈組織接著與其他臍帶組織分開。具體來說，臍帶動脈壁與華通氏膠分開。臍帶動脈組織接著在150cm²組織培養盤上於50毫升之培養基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖；Invitrogen)存在下機械解離組織，直到將組織切碎為細泥。將切碎之臍帶動脈組織轉移至50毫升錐形管(每管約5公克的組織)。

然後，將組織於DMEM-低葡萄糖培養基中消化，該培養基含有如上文所述之抗黴劑及抗生素。進行消化時，使用膠原蛋白酶、分散酶、及玻尿酸酶之酶混合物(膠原蛋白酶，500個單位/毫升；分散酶，50個單位/毫升；與玻尿酸酶(Sigma)，5個單位/毫升，在DMEM-低葡萄糖中)。使含有組織、培養基與消化酶之錐形管在37℃下在迴轉式振盪器(Environ,Brooklyn,N.Y)中以225rpm培養2小時。

在消化之後，將組織以150×g離心5分鐘，且將上清液吸出。將團塊再懸浮於20毫升之生長培養基(DMEM-低葡萄糖(Invitrogen)、15百分比(v/v)胎牛血清、0.001%(v/v)2-巰基乙醇(Sigma)、1毫升/100毫升之如上文所述之抗生素/抗黴劑)。使細胞懸浮液通過70微米尼龍細胞濾器(BD Biosciences)過濾。使額外5毫升包含生長培養基的潤洗液通過濾器。接著使細胞懸浮液通過40微米的尼龍細胞濾器(BD Biosciences)，然後用額外5毫升的生長培養基潤洗液來趕出。

將濾液再懸浮於生長培養基(總體積50毫升)中然後以150xg離心5分鐘。將上清液吸出然後將細胞再懸浮於50毫升之新鮮生長培養基中。將此過程再重複兩次。

在最終離心後，將上清液吸出然後將細胞團塊再懸浮於5毫升之新鮮生長培養基中。使用台盼藍染色來判定存活細胞數目。然後，在標準條件下培養細胞，直到獲得細胞之均質性族群。

將自臍帶動脈組織分離之細胞以5,000個細胞/cm²接種於經明膠塗布T-75cm²培養瓶(Corning Inc.,Corning,N.Y.)上並且於具有如上文所述之抗生素/抗黴劑之生長培養基中。2天之後，將用過的培養基自燒瓶中吸出。用PBS清洗細胞三次以去除碎屑與血衍生細胞。接著用生長培養基補充細胞並讓其生長至長滿(自繼代0至繼代1約10日)。在後續繼代時(自繼代1至2等等)，細胞在4至5日後達到次長滿(75至85百分比長滿)。針對這些後續繼代，以5000個細胞/cm²接種細胞。使細胞在加濕培養器中於5百分比二氧化碳及大氣氧氣、37℃下生長。使細胞繼代，直到獲得細胞之均質性族群。

實例2

表面標記概況之比較

如上文所討論，使用美國專利第7,510,873號所揭示之分離規程獲得之人類臍帶組織衍生細胞「(hUTC)」已經證明在治療上有用於治療各種疾病。尤其，最近發現該等細胞有用於治療眼變性病狀。參見例如美國案2016/0158293、2016-0166619、及美國案15/366,599。

將hUTC之表面標記概況與下列各者進行比較：內皮細胞(EC)、臍帶血細胞(CBC)、纖維母細胞(FB)、胎盤上皮細胞(PEC)、臍帶平滑肌細胞(USMC)(即，本發明之細胞來源)、及胎盤外被細胞(PC)進行比較。此比較結果顯示於下表2-1及表2-2。

亦測試主動脈平滑肌細胞之HLA-C(2.0%)、HAPLN1(99.8%)、及SYNCAM(62.9%)。

實例3

產後臍帶動脈平滑肌組織衍生細胞之表徵

分析產後臍帶動脈組織衍生細胞之表面標記。具體來說，測試細胞存在或不存在CD13、CD90、NG2、HLA ABC、CD34、CD117、HLA DR,DP,DQ、CD31、CD45、E-鈣黏蛋白、FSP1、CD10、HLA-C、及α-平滑肌肌動蛋白。發現產後臍帶動脈組織衍生細胞之CD13、CD90、NG2、HLA-ABC、α-平滑肌肌動蛋白、及CD10呈陽性。亦發現產後臍帶動脈組織衍生細胞之CD31、CD34、CD45、CD117、HLA-DR,DP,DQ、HLA-C、及E-鈣黏蛋白呈陰性。

實例4

用於營養因子分泌的產後臍帶動脈平滑肌組織衍生細胞之篩選

評估來自臍帶動脈組織衍生細胞之所選營養因子之分泌。尤其，測試臍帶動脈組織衍生細胞分泌突觸新生因子或橋分子的能力。將來自臍帶動脈組織衍生細胞(臍動脈平滑肌細胞；UASMC)之營養因子分泌與來自hUTC之營養因子分泌進行比較(上述實例2)。

簡而言之，細胞在各種條件下經培養，以允許營養因子分泌於培養基中。細胞培養於兩種培養基中：第一種(培養基1)係DMEM-低葡萄糖，其補充有15%(v/v)胎牛血清及4mM L-麩醯胺酸；及第二種(培養基2)係Clonetics^TM平滑肌基礎培養基(Lonza,Inc.)，其含有5% FBS。在培養之後，藉由在14,000×g下離心5分鐘且儲存在-20℃下，收集培養基。使用Vi-CELL XR 2.04(Beckman Coulter,Inc.)，判定各者中之細胞數目及族群體倍増程度(PDL)。

測試細胞之腦衍生神經營養因子(BDNF)、血小板反應蛋白-1(TSP-1)、及可溶血管內皮生長因子受體1(sVEGFR1)。藉由ELISA檢定 (根據製造商之說明書進行)判定各營養因子之量。亦可使用SEARCHLIGHT Multiplexed ELISA判定各營養因子之量。

營養因子分泌與比較之結果顯示於下表4-1。UASMC分泌BDNF、TSP-1、及sVEGFR1於培養基1和2兩者中。相較於hUTC，UASMC中的TSP-1表現顯著更高。

本說明書中提及各種專利及其他出版物。這些出版物之各者之全部內容以引用方式併入本文中。

儘管上文已藉由實例與較佳實施例說明本發明之各種態樣，但是應理解，本發明之範疇並不由前文描述限定，而是以下根據專利法原理正確解讀的申請專利範圍來限定。

Claims

一種用於自人類臍帶組織產生人類臍帶動脈組織衍生細胞之方法，其包含：(a)獲得臍帶組織；(b)自該組織移除實質上所有血液以產生實質上不含血液之臍組織；(c)將人類臍帶動脈組織自該臍帶組織分開；(d)藉由諸如切碎之機械離解將實質上不含血液之該人類臍帶動脈組織解離；(e)利用酶之混合物將經解離之組織消化，該酶之混合物包含金屬蛋白酶、中性蛋白酶及黏液分解酶；(f)將該等臍帶動脈組織衍生細胞自該經消化之組織分離；及(g)培養該等細胞以獲得經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群，其中該等細胞能夠在培養物中自我更新及擴增，具有分化成其他表型之細胞的潛能，且進一步具有下列特徵：表現CD13、CD90、NG2、及HLA-ABC；不表現CD31、CD34、CD45、CD117；及不表現FSP1或E-鈣黏蛋白(cadherin)。
一種用於自人類臍帶組織產生人類臍帶動脈組織衍生細胞之方法，其包含下列步驟：(a)獲得人類臍帶動脈組織；(b)自該組織移除實質上所有血液以產生實質上不含血液之臍組織；(c)藉由諸如切碎之機械離解將實質上不含血液之該人類臍帶動脈組織解離； (d)利用酶之混合物將該經解離之組織消化，該酶之混合物包含金屬蛋白酶、中性蛋白酶及黏液分解酶；(e)將該等臍帶動脈組織衍生細胞自該經消化之組織分離；及(f)培養該等細胞以獲得經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群，其中該等細胞能夠在培養物中自我更新及擴增，具有分化成其他表型之細胞的潛能，且進一步具有下列特徵：表現CD13、CD90、NG2、及HLA-ABC；不表現CD31、CD34、CD45、CD117；及不表現FSP1或E-鈣黏蛋白。
如請求項1或2所述之方法，其中該方法進一步包含：在分離之後，將該等細胞懸浮於生長培養基中。
如請求項1或2所述之方法，其中該方法包含：將該等細胞培養約10至約100小時，以獲得經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群。
如請求項1或2所述之方法，其中該培養包含選擇生長並表現CD10之細胞。
如請求項1或2所述之方法，其中該移除步驟包含藉由下列中之一或多者移除游離或凝結血液：清洗、抽吸、吸乾、離心分離、或酵素移除。
如請求項1或2所述之方法，其中該金屬蛋白酶係膠原蛋白酶。
如請求項1或2所述之方法，其中該中性蛋白酶係分散酶(dispase)。
如請求項1或2所述之方法，其中該黏液分解酶係玻尿酸酶。
如請求項1或2所述之方法，其中該消化步驟包含：將該經解離之組織與該酶之混合物在約37℃下培養。
如請求項1或2所述之方法，其中該消化步驟包含：將該經解離之組織與該酶之混合物培養一或多個小時。
如請求項1或2所述之方法，其中方法包含：利用膠原蛋白酶、分散酶及玻尿酸酶之混合物將該經解離之組織消化。
如請求項1或2所述之方法，其進一步包含：使該經分離臍帶動脈組織衍生細胞之族群在培養物中擴増約10天至長滿。
如請求項1或2所述之方法，其中該等細胞不表現CD31、CD34、CD45、CD117、FSP1、E-鈣黏蛋白。
如請求項1或2所述之方法，其中該等細胞分泌適用於治療眼變性之營養因子。
如請求項1或2所述之方法，其中該等細胞分泌突觸新生因子或橋分子中之一或多者。
如請求項1或2所述之方法，其中該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。
如請求項1或2所述之方法，其中該等細胞相較於臍帶組織衍生細胞具有增加的TSP-1表現。
如請求項1或2所述之方法，其中該等細胞係適用於治療眼變性病狀。
如請求項1或2所述之方法，其中該方法包含：移除所有血液。
如請求項1或2所述之方法，其中該解離步驟包含：將該人類臍帶動脈組織切碎。
如請求項1所述之方法，其中該分開步驟包含：將臍帶動脈組織與華通氏膠(Wharton’s Jelly)分開。
如請求項2所述之方法，其中該獲得步驟包含：將臍帶動脈組織與華通氏膠分開。
如請求項1或2所述之方法，其中該臍帶動脈組織衍生細胞係臍帶動脈平滑肌組織衍生細胞。
如請求項1或2所述之方法，其中該培養步驟包含：使該等細胞在足以產生經分離臍帶動脈組織衍生細胞之均質性族群之條件下繼代。
一種藉由如請求項1或請求項2所述之方法而獲得之人類臍帶動脈組織衍生細胞用於治療眼變性病狀之用途。
如請求項26所述之用途，其中該等細胞分泌適用於治療眼變性之營養因子。
如請求項26所述之用途，其中該等細胞分泌血小板反應蛋白-1、BDNF、及可溶VEGFR1中之一或多者。
如請求項26所述之用途，其中該等細胞相較於臍帶組織衍生細胞具有增加的TSP-1表現。
一種條件培養基，其係自藉由如請求項1或請求項2所述之方法而獲得之人類臍帶動脈組織衍生細胞製備。