CN105420147A - 一种强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种强化硝酸钙治理黑臭河流，减少硝酸钙用量，缩短治理黑臭时间的复合微生物制剂及其制备方法，制备该复合微生物制剂的原料为：脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉？40-80份，复合芽孢杆菌菌粉10-60份，酵母菌与乳酸菌混合菌粉10-60份。本发明针对性的筛选降解黑臭底泥中的硫化物，有机质以及适应在黑臭底泥中生长的菌株，由高效降解硫化氢与脱氮能力的脱氮硫杆菌，高效降解硫化氢与氨态氮的硫氧化细菌--桃红荚硫菌，富产蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶等酶系的芽孢杆菌，酵母菌与乳酸菌，向黑臭河流投入少量的硝酸钙与复合微生物菌剂，能快速改善黑臭河流的水体质量与去除底泥黑臭，并且能够快速减少底泥厚度与有机质含量。

Description

一种强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂

技术领域

本发明涉及黑臭河道治理技术领域，特别是涉及一种强化硝酸钙治理黑臭河流，减少硝酸钙用量，缩短治理黑臭时间，可快速削减底泥有机物的复合微生物制剂及其制备方法。

背景技术

河道黑臭、底泥累积是我国城市河网的普遍现象。研究表明，底泥有机污染物长期厌氧分解产生硫化氢等臭气以及硫化铁等有色金属硫化物，水体发黑主要与吸附了硫化铁的带负电荷胶体悬浮颗粒有关,且腐殖质是吸附构成络合物的主要组成。含硫、氮等有机物降解时逸出的NH3、H2S等能使水体发黑变臭，是造成黑臭的主要原因，底泥氮、磷二次释放会构成水体富营养化。

在河道黑臭治理方面，目前国际上流行的方法是通过提高底泥的氧化还原电位（如投加硝酸钙，过氧化钙），以氧化底泥硫化物和抑制底泥磷释放；其中，通过投加硝酸钙来消除河道黑臭在国内外已有工程应用实例，然而该种技术存在处理周期长（1-2年），且容易促进氨氮和硝酸盐过量释放，造成氮的二次污染等缺点。目前，在快速消除底泥黑臭方面国内外做了一些新的尝试，如在投加硝酸钙的同时加入其它氧化剂（过氧化钙或双氧水），或通过加大硝酸钙投加量来缩短处理周期，然而据报道，硫化物去除率达到96%以上的处理周期仍然需要一个月左右；余光伟等在专利号201310230547.6中公开了一种基于反硝化除硫的黑臭河道底泥原位氧化技术，该技术包括黑臭河道湿法或干法投加底泥氧化剂（硝酸钙与硝酸钠的混合物）、底泥氨氮浸提剂（氯化钠或氯化钾）和底泥酸碱调节剂（石灰或稀硝酸），能够同时除硫脱氮固磷，可快速消除河道黑臭，抑制底泥氮磷释放，提高水体水质，其主要是投加一些化学氧化剂来促进底泥中的反硝化脱硫菌（如Thiobacillusdenitrificans、Thiomicrospiradenitrificans）的生长来降解硫化物，而且MurphyTP等认为加入硝酸钙等能够加速PAHs（多环芳烃）的生物降解作用，但投加硝酸钙后，不同区域的有机物降解差别很大。含有磷的有机物能够提供营养磷酸盐，克服硝酸盐沉淀磷酸盐无生物可用营养盐的缺陷，但磷含量较少的有机物则无法提低足够的磷酸盐。硝酸钙对不同区域中磷的抑制差别较大，因此，有机物降解也呈现较大差别，这也说明了只向黑臭水体投入硝酸钙并不能稳定的快速的降解底泥与水体的有机物；

另外，河流污染底泥生物需氧量较高，修复中需要投加的氧化剂较大，因此存在成本高，实施困难的问题。

生物修复技术是新近发展起来的一项清洁环境的新兴技术，它利用特定生物对水体与底泥中污染物的吸收，氧化，转化或降解，达到减缓或最终消除水体污染，底泥黑臭，恢复水体生态功能的生物措施。污染水体与底泥的污染物主要是通过微生物的代谢活动将其降解转化，与物理化学修复技术相比，生物修复技术具有以下优点：设施简单，运行费用省；操作简单，环境影响小，不会导致污染物的转移或形成二次污染；可最大限度降低污染物浓度。因此生物修复技术是最具发展前景的水体污染修复技术。微生物从以下几个方面对河道水体与底泥进行净化：一方面菌体的同化作用会转化部分有机污染物为自身物质，另一方面微生物分泌的胞外酶能快速降解大分子有机物，实现对水体有机污染物的降解和去除。再一方面通过复合微生物的协同作用，降低水体中氮，磷营养盐水平，通过营养竞争的方式抑制藻类的生长，同时通过改善水体理化环境，促进浮游动物种群的生长壮大，以浮游动物捕食藻类的方式控制藻类的生长，以控制“水华”等。

我国在利用微生物技术修复水体污染与黑臭底泥研究起步晚，与发达国家相比技术有差距。微生物修复在污染治理中的占的比例较小，但也有较多人进行了相关的研究。

中国专利文献CN102815792A公开了一种用于城乡污染河道水体修复的微生物-酶复合制剂有其制备的方法。该发明涉及的修复城乡污染河道的微生物-酶复合制剂，微生物主要是由30-60%的地衣芽孢杆菌，25-35%的硝化细菌和15-25%的恶臭假单胞菌组成；复合酶主要是由40-60%蛋白酶，15-25的淀粉酶和25-35%的纤维素酶构成。针对不同污染程度的水体，优化组合的微生物与复合酶复配为微生物-酶复合制剂，使得微生物的投加量为1-5克/立主水体，复合酶的投加量为0.01-0.05克/立方水体。该微生物-酶复合制剂投入到城乡污染河道水体中，以曝气为辅助措施，进行微生物强化修复，可有效改善现有技术存在的微生物代谢活性低，环境耐受力低，在污染水体中停留时间短等缺陷，具有显著的水质净化效果。其需要曝气设施，投资大，且会影响河道航运。

中国专利CN102050523A公开了一种微生物对黑臭河道处理入原位生态修复的方法。该发明的技术特征是从污水中筛选出有针对性的目的菌种，与现有菌种进行匹配组合成复合微生物菌剂，然后使用匹配的复合微生物菌剂对河道污水进行处理，该发明根据河道污染的具体情况，采用筛选污水中生长的菌株对污水进行治理，并针对河道水体的污染情况将其与现有菌种进行匹配、组合，使之在微生物污水处理系统中发挥协同作用，快速形成优势菌群，对河道中污染物进行分解，吸收，转移，从而达到最佳处理效果。但其每段河道的污染物都有差异，其前期的筛选菌株，生产，时间周期长，难度大，效果难以保证。

中国专利文献CN101886041A公开了一种高效处理城市湖水污染的微生物制剂，由以下成分按体积比配制成，亚硝化螺菌：红螺菌：纳豆芽孢杆菌：链孢拟诺卡氏菌：乳酸杆菌为0-10：5-15：5-15：5-15：5-15；

岳寿松在专利号201410449850.X中公开了一种城市河水污染治理的复合微生物制剂及其制备方法。包括如下微生物菌剂：嗜酸乳杆菌制剂，热带假丝酵母菌剂，枯草芽孢杆菌制剂；本发明制得的城市河水污染治理的复合微生物制剂，有效菌数量大于或等于40亿CFU/克；

公开号CN101607783A的发明专利公开了一种利用投加人工合成的复合菌剂削减底泥的方法，达到对河流底泥进行原位处理。公开号CN102674562A的发明专利提供了一种负载微生物的颗粒物质，能快速絮凝和吸附水体中污染物并提高水体透明度，此后，沉降于底泥上的颗粒物质还能对污染底泥进行修复。这些修复制剂虽然能削减底泥，修复黑臭水体，但都没有针对性的含有降解黑臭硫化物的菌株，针对于较严重黑臭水体的治理速度较慢，且效果不显著。

并且，陈红红等探讨了不同投加方式的硝酸钙法与生物法修复底泥的效果，结果经过34d的处理,对照组、生物组、硝酸钙组上覆水中总磷的去除率分别为35.4%,73.1%,90.4%;总氮的去除率分别为0,12.6%和29.5%;COD的去除率分别为61.0%,71.3%和81.0%;硫化物的去除率分别为95.9%,97.4%和97.9%。生物法及硝酸钙法均可活化底泥,增大底泥的生物降解性能。

但并没有一个将硝酸钙与微生物菌剂结合起来降解黑臭河流的技术方案公开。

此外，在黑臭治理过程中如何消除由于局部过量硝酸钙的投入而导致的底泥氮二次释放尚未得到解决，特别是在投加底泥氧化剂（硝酸钙）去除硫化物的同时投加微生物菌剂实现底泥原位脱氮，降低底泥与水体有机物，降低上覆水体的COD，TP，TN方面尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种用于强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂，具体说是提供一种能快速降解底泥的可挥发性硫化物（AVS），还能在底泥层厌氧情况下将硝酸盐还原成为氮气，解决了底泥二次氮的二次释放问题，同时能够快速削减底泥厚度，降低底泥与水体有机物，降低上覆水体的COD，TP，TN，并且能减少硝酸钙用量，缩短治理黑臭时间的复合微生物菌剂。该复合微生物菌剂含有既能快速降解底泥的可挥发性硫化物（AVS），还能在底泥层厌氧情况下，将亚硝酸盐，氨态氮，硝酸盐还原成为氮气的脱氮硫杆菌，解决了底泥二次氮的二次释放问题，还含有能快速降解硫化物，氨态氮的光合细菌---桃红荚硫菌，同时含有富产蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，能利用多种酶系的分解有机质而产生二氧化碳的酵母菌，二氧化碳可作为脱氮硫杆菌的碳源合成菌体。好氧菌（解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌）能在氧含量充足的河道上层水体进行快速繁殖而快速降解水体中的有机质，氨态氮与总磷。兼性厌氧菌（地衣芽孢杆菌，酵母菌，乳杆菌）能够快速削减底泥厚度，降低上覆水体的COD，TP，TN。其主要由以下重量份的原料混合制备而成：脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉40-80份，复合芽孢杆菌菌粉10-60份，酵母菌与乳酸菌混合菌粉10-60份。

本发明的另一目的是提供该复合微生物制剂的制备方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

该复合微生物制剂的制备方法由以下步骤组成：

步骤：脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉的制备

A、脱氮硫杆菌双层平板种子活化培养：将脱氮硫杆菌种在下层固体脱氮硫杆菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，30℃培养5-7天，待划线的菌线长出菌苔，即可作为活化的脱氮硫杆菌种；

B、桃红荚硫菌双层平板种子活化培养：将桃红荚硫菌菌种在下层固体桃红荚硫菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，25-35℃光照培养5-7天，待划线的菌落变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；

C、脱氮硫杆菌种子培养：将活化的脱氮硫杆菌种接种至脱氮硫杆菌种子液体培养基中，温度30℃，厌氧培养5-7天，检测种子的OD420≥0.35，即为脱氮硫杆菌种子培养液；

D、桃红荚硫菌种子培养：将活化的桃红荚硫菌菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度30-35℃，光照强度为：3000-8000lux，光照厌氧培养6-10天，检测种子的OD650≥1.2，即为桃红荚硫菌种子培养液；

E、发酵培养：将脱氮硫杆菌种子培养液与桃红荚硫菌种子培养液以1：4-4：1的比例混合作为混合种子培养液，将混合种子培养液与发酵培养基以1：5-1：20的接种量接种，培养温度30℃，在光照发酵罐中厌氧培养，光照强度为：3000-8000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第二天，开始流加营养液，在48小时内流加完营养液的体积为发酵培养基的2%，用灭菌的碳酸钠溶液与醋酸溶液调pH7-8，培养5-7天，待检测其OD650≥4，活菌数≥40亿cfu/ml，其中桃红荚硫菌不低于20亿cfu/ml，涂片镜检脱氮硫杆菌所占总菌数不低于30%，即可放罐，过滤后用轻质碳酸钙吸附，调节菌浓度为40亿cfu/g，20-30℃风干，即得脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉；

其中，所述的脱氮硫杆菌种子液体培养基：五水合硫代硫酸钠3.0g，硝酸钾2.0g，碳酸氢钠2.0g，磷酸二氢钾1.0g，六水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.005g，氯化铵0.2g，溶于1000mL水中，调节pH到7.0，121℃灭菌30min备用；

其中，所述的固体脱氮硫杆菌培养基为脱氮硫杆菌种子液体培养基中加2%的琼脂；

其中所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：氯化铵0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5g/L,五水合硫代硫酸钠1-3g/L，氯化钠0.5-4g/L,调节pH到7.0，121℃灭菌30min备用；

其中，所述的固体桃红荚硫菌培养基为桃红荚硫菌种子液体培养基中加2%的琼脂；

其中，所述的琼脂培养基为：琼脂20克，水1L，115℃灭菌30min；

其中，所述的发酵培养基：五水合硫代硫酸钠3g/L，硝酸钾2g/L，氯化铵1g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠4g/L，无水醋酸钠4g/L，微量元素10ml/L,pH到7.2，121℃灭菌30min；

其中，所述的流加营养液为：五水硫代硫酸钠200g/L，硝酸钾100g/L，121℃灭菌15min；

其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.2g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌50mg，氯化锰10mg，硼酸50mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3，121℃灭菌15min；

步骤、复合芽孢杆菌菌粉的制备

取出解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌各芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，30℃培养24小时。在平板下挑取单个菌落接种划线到茄子瓶中的LB培养基中，在培养箱中30℃培养24小时。将茄子瓶中的菌苔用无菌水洗脱，采用5%的接种量，接种至100L种子发酵罐中，装液量为65L芽孢杆菌液体种子培养基，每分钟通气量为液气比为1：0.6，开搅拌180r/min，30℃通气培养12-16小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过40亿cfu/ml，即可作为芽孢杆菌液体菌种；以5-10%的接种量转接至1000L发酵罐，装液量为600L芽孢杆菌发酵培养基，前8小时，每分钟通气量为液气比为1：0.8，8小时后每分钟通气量为液气比为1：1.1，开搅拌120r/min，30℃培养24-36小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过90亿cfu/ml，即可结束发酵，离心除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌体浓度不低于100亿cfu/g，即为芽孢杆菌菌粉；

其中，所述LB液体发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L；pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；

其中，芽孢杆菌液体种子培养基：葡萄糖10g/L，豆粕粉8g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，pH7.2；

其中，芽孢杆菌发酵培养基：玉米粉22g/L，豆粉34g/L，硫酸镁3g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.3g/LpH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

复合芽孢杆菌菌粉为解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌各种芽孢杆菌单一培养制成纯菌粉后，等比例混合后所得；

步骤、酵母菌与乳酸菌混合菌粉的制备

采用酵母菌与乳酸菌按以下步骤进行培养：

A、酵母菌种子液的制备：取出酵母菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升PDA培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用10%的接种量，接种至2LPDA液体培养基中，30℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过2亿cfu/ml，即可作为酿酒酵母菌种子液体；

B、乳酸菌种子液的制备：取出乳酸菌菌种保藏管，用MRS固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有400毫升MRS液体培养基的500毫升三角瓶中，在培养箱中30℃静置培养48小时。种子采用5%的接种量，接种至装有4LMRS培养基的5L三角瓶中，30℃静置培养48小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过10亿cfu/ml，即可作为乳酸菌种子液；

C、混合发酵培养：将上述制备的酵母菌种子液体与乳酸菌种子液按1：1的比例混合均匀后作为混合菌种，以5%-10%的接种量接种至已经灭菌的固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的固体发酵培养基堆在无菌发酵室内，物料高度为25-35cm，用灭菌的塑料膜将其密封，控温30-33℃，每8小时掀开塑料膜，翻料一次，培养40-48小时，待料体表明有大量白点，有明显的酒香味，检测酵母菌含量不低于10亿cfu/g，乳酸菌含量不低于40亿cfu/g，即可停止发酵，烘干或晒干，即得到酵母菌与乳酸菌混合菌粉；

其中，所述的PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，固体培养基中加入琼脂2%。

其中，所述的MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7]2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.2~6.6；固体培养基中加琼脂20g；

其中，所述的固体发酵培养基：麸皮850kg，沸石粉50kg，面粉100kg，水800kg；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

其中，所述的酵母菌为酿酒酵母，面包酵母，啤酒酵母，产朊假丝酵母，热带假丝酵母中的一种；

其中，的述的乳酸菌为植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，保加利亚乳杆菌，罗伊氏乳杆菌中的一种；

步骤、混合粉碎

按脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉40-80份，复合芽孢杆菌菌粉10-60份，酵母菌与乳酸菌混合菌粉10-60份的重量比，混合均匀，粉碎过100目筛，即得到复合微生物制剂。

其中，所述的强化硝酸钙治理黑臭河流施用方法为：向黑臭河流均匀洒复合微生物制剂的量为2-40克/平方米，并同时向河流底泥加入0.5-3倍复合微生物制剂量的硝酸钙。

本发明中的复合微生物制剂中含有桃红荚硫菌：细胞球形，直径1.2-3微米，一般为1.5微米，单个细胞通常被一层粘的荚膜包住，常见有双球形聚合体，四联体和不规则的堆，它们通常被粘液层所包围，厌氧的光能自养菌：有果糖、甘油或有机酸时所有菌株都能在微好氧到好氧的黑暗条件下生长。光合电子供体：硫化物，硫代硫酸盐，硫和分子氢。可光合同化醋酸盐、果糖、延胡索酸盐、甘油、苹果酸盐、丙酮酸和琥珀酸盐。大多数菌株具有同化型硫酸盐还原作用。桃红荚硫菌生活在光线能及的滞水和污泥中，尤其是在含硫化物丰富的环境中。25-30℃、1000-3000lux或更强的光照，PH值7.0-7.5的厌氧环境最适合该菌的生长和氧化作用，在偏离最适条件下，桃红荚硫菌也有较大的适应范围，10-40℃、500-10000lux和PH5-9，均能适应生长，在微好氧黑暗状态下也能生存，条件不适时，该菌的生长处于抑制状态，一旦条件允许，又能继续生长。本发明中的桃红荚硫菌是从全国各地300多处池塘底泥，河涌底泥，猪粪水处理池，污水处理厂，垃圾处理滤池中分离得到的1000多株光合细菌中筛选出来的，该桃红荚硫菌对硫化氢降解效率明显，0.5克/升的硫化氢含量经过48小时后即可全部降解，能快速起到除去硫化物的作用，并且也具有较强的降氨氮的能力。该桃红荚硫菌由发明人保藏在中国普通微生物菌种中心，地址为北京市朝阳区北辰路1号3号，编号为CGMCC10344。保藏日期为2015年1月12日。已经在专利申请号201510095984.0中于2015年6月3日公开。

本发明中的复合微生物制剂中含有脱氮硫杆菌，脱氮硫杆菌广泛存在于土壤、淡水和海洋沉积物、污水处理池中，是一种兼性厌氧菌，兼性厌氧，可在10～37℃，pH为4.0～9.5的条件下生长，最适宜的生长温度为28~30℃，最适宜的pH为6.5～8.0。脱氮硫杆菌为革兰氏阴性化能自养细菌，电镜观察，菌细胞短杆状、单个、成对或短链状排列，具有单根极生鞭毛，无芽孢，菌体大小约为0.3~0.8μm×0.8~3.0μm。脱氮硫杆菌能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和S^2-作为能源、以CO2作为碳源进行生长，厌氧（兼性厌氧）条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为N2。正因为脱氮硫杆菌以二氧化碳为碳源，对水体有害的亚硝酸盐、硫化氢等均可被氧化为无毒的物质，同时减低了水体中的生物消耗量和化学耗氧量，因此将其应用至黑臭河流治理会有较明显的效果。

本发明首次公开了一种桃红荚硫菌与脱氮硫杆菌的混合培养方法，桃红荚硫菌与脱氮硫杆菌的混合培养的各级培养基是经过多年的优化试验得到的，特别是其发酵培养基，是考察了30多种光合细菌培养基与脱氮硫杆菌培养基的成份中筛选出来的，并充分考虑到了各个培养基成份相互影响，采用正交试验进行多次优化培养基与培养条件，特别是流加硫代硫酸钠与硝酸钾的混合营养液是结合了多次试验得出的。

本发明的复合微生物制剂中的脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌施入黑臭河流中与载体轻质碳酸钙一起沉入底泥上，碳酸钙本身作为河道底泥的pH调节剂，使底泥程弱酸或中性，而为脱氮硫杆菌提供繁殖的生存环境，而且在施用复合微生物制剂的同时施入了少量的硝酸钙，在底泥厌氧的环境下，硝酸根会快速促进底泥原著硝氮还原菌：脱氮硫杆菌（Thiobacillusdenitrificans）、脱氮硫小螺菌（Thiomicrospiradenitrificans）和Beggitoa菌属中的一些菌种等生长。硝酸根的施入更加会促进我们施入的脱氮硫杆菌快速适应底泥的厌氧环境，进行快速繁殖，而氧化黑臭河流底泥中的硫化物，从而快速减少黑臭程度，部分菌体悬浮在河道水体中进行有氧繁殖，施入河道的脱离氮硫杆菌能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和S2-作为能源、以CO2作为碳源进行生长，厌氧条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为N2，起到脱硫除氮的作用。同时，硝酸钙中的钙离子会沉淀部分磷酸根离子，可除去总水体中的总磷。而桃红荚硫菌一施入水体中，会快速降解水体与底泥中的硫化物，其降解硫化物的速度较脱氮硫杆菌更快，其只能将氨态氮降解合成自身菌体，但其不能将总氮除去。

本发明中的复合微生物制剂含有解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌作为常用的好氧菌，其在底泥上覆水体中或底泥表面含氧较高的水体中，能够快速萌发，繁殖生长，在生长过程中产生大量的淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，能够快速降解水体中的高分子有机质，从而能快速降低水体中的COD，氨态氮，总磷。

本发明中的复合微生物制剂含有地衣芽孢杆菌，酵母菌，乳酸菌，地衣芽孢杆菌，酵母菌，乳酸菌为兼性厌氧菌，为常用菌株，能够在底泥中的厌氧层或水体中的低氧情况下都能够生长，利用菌体生长过程中所分泌的多种酶系分解底泥与水体中的有机质，并降解底泥中的氨态氮，总磷，酵母菌并产生二氧化碳，可为脱氮硫杆菌提供部分碳源。并且在好氧层的水体中，地衣芽孢杆菌，酵母菌也能生长；解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌，酵母菌，乳酸菌将高分子有机质降解为低分子的二氧化碳，氨态氮，亚硝酸盐，硝酸盐，乙醇，醋酸等低分子物质，而其中的，二氧化碳，硝酸盐，亚硝酸盐，氨态氮，底泥中的硫化物，能够被水体与底泥中的脱氮硫杆菌通过好氧与厌氧反应进行氧化还原成氮气，硫或者硫酸，或者合成自身菌体，而其中的，硫化物，乙醇，醋酸等低分子物质也能够快被桃红荚硫菌等光合细菌利用，这样从高分子有机物到低分子有机物，及硫化氢，氮态氮，总磷都能够有不同的菌针对性的去降解与消耗，从而达到快速去除水体与底泥中黑臭硫化物，COD，总氮，总磷，削减底泥厚度。

本发明将筛选得到的各株菌株，以“共生、共存、共荣”的微生态学原理、功能菌在代谢转化过程中的协同分工机制，代谢产物偶联代谢机制为指导，结合微生物生理生态习性、拮抗共生特性、营养需求等，以正交实验为指导确定各类混合菌株的最佳发酵条件、构建协同代谢、互惠共生的高效复合菌剂。

本发明的优越之处在于：

1、本复合微生物制剂由多种微生物菌种构成，由高效脱氮除硫的脱氮硫杆菌，具有强大的降解硫化物能力的桃红荚硫菌，富产蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，酵母菌，乳酸菌，各菌株在水体与底泥中各有分布，降解各类物质如黑臭硫化物，水体中有机质，底泥有机质针对性强，降解效果显著，菌剂微生物在各类河道底泥与水体中能良好生长，迅速占据有利生态位，抑制产黑臭微生物生长繁殖，降低恶臭释放强度，实现恶臭原位源头控制；

2、加入复合微生物制剂的同时，加入硝酸钙，硝酸钙能够快速促进底泥原著硝氮还原菌：脱氮硫杆菌（Thiobacillusdenitrificans）、脱氮硫小螺菌（Thiomicrospiradenitrificans）和Beggitoa菌属中的一些菌种等生长。更加会促进我们投入的脱氮硫杆菌的生长，因此会更快速的降解底泥的硫化物；同进可以除去部分总磷，利用硝酸钙与本发明的复合微生物制剂治理黑臭河流所需硝酸钙较少，不会产品生局部过量施入硝酸钙而导致的二次氮的释放，以及不会导致将有效磷沉淀过多而不能提供足够的磷酸盐给繁殖的用来降解有机质的微生物；

3、复合微生物制剂投入水体与底泥后，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，酵母菌等在有机质含量丰富的区域快速繁殖，产生酶系降解高分子有机物质为低分子有机质，而乳杆菌，桃红荚硫菌，脱氮硫杆菌则以低分子有机质或二氧化碳作为碳源快速生长，并降解硫化物，氨态氮及总磷，从而达到快速去除水体与底泥中黑臭硫化物，COD，总氮，总磷，削减底泥厚度。

具体实施方式

本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。

实施例1

一种强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂，主要以下重量份的原料混合制备而成：

脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉50份，复合芽孢杆菌菌粉40份，酵母菌与乳酸菌混合菌粉10份；

其制备方法，包括以下步骤：

步骤：脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉的制备

A、脱氮硫杆菌双层平板种子活化培养：将脱氮硫杆菌种（ATCC25259）在下层固体脱氮硫杆菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，30℃培养6天，待划线的菌线长出菌苔，即可作为活化的脱氮硫杆菌种；

B、桃红荚硫菌双层平板种子活化培养：将桃红荚硫菌菌种（CGMCC10344）在下层固体桃红荚硫菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，25-35℃光照培养6天，待划线的菌落变红并长出菌苔，即作为活化的菌种；

C、脱氮硫杆菌种子培养：将活化的脱氮硫杆菌种接种至脱氮硫杆菌种子液体培养基中，温度30℃，厌氧培养5-7天，检测种子的OD420为0.38，作为脱氮硫杆菌种子培养液；

D、桃红荚硫菌种子培养：将活化的桃红荚硫菌菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度30-35℃，光照强度为：6000lux，光照厌氧培养7天，检测种子的OD650为1.3，作为桃红荚硫菌种子培养液；

E、发酵培养：将脱氮硫杆菌种子培养液与桃红荚硫菌种子培养液以1：1的比例混合作为混合种子培养液，将混合种子培养液与发酵培养基以1：10的接种量接种，培养温度30℃，在光照发酵罐中厌氧培养，光照强度为：6000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第二天，开始流加营养液，在48小时内流加完营养液的体积为发酵培养基的2%，用灭菌的碳酸钠溶液与醋酸溶液调pH7-8，培养6天，待检测其OD650为4.4，活菌数为43亿cfu/ml，其中桃红荚硫菌为25亿cfu/ml，涂片镜检脱氮硫杆菌所占总菌数超过40%，放罐，过滤后用轻质碳酸钙吸附，调节菌浓度为40亿cfu/g，20-30℃风干，即得脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉；

其中，所述的脱氮硫杆菌种子液体培养基：五水合硫代硫酸钠3.0g，硝酸钾2.0g，碳酸氢钠2.0g，磷酸二氢钾1.0g，六水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.005g，氯化铵0.2g，溶于1000mL水中，调节pH到7.0，121℃灭菌30min备用；

其中，所述的固体脱氮硫杆菌培养基为脱氮硫杆菌种子液体培养基中加2%的琼脂；

其中所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：氯化铵0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5g/L,五水合硫代硫酸钠1-3g/L，氯化钠0.5-4g/L,调节pH到7.0，121℃灭菌30min备用；

其中，所述的固体桃红荚硫菌培养基为桃红荚硫菌种子液体培养基中加2%的琼脂；

其中，所述的琼脂培养基为：琼脂20克，水1L，115℃灭菌30min；

其中，所述的发酵培养基：五水合硫代硫酸钠3g/L，硝酸钾2g/L，氯化铵1g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠4g/L，无水醋酸钠4g/L，微量元素10ml/L,pH到7.2，121℃灭菌30min；

其中，所述的流加营养液为：五水硫代硫酸钠200g/L，硝酸钾100g/L，121℃灭菌15min；

其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.2g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌50mg，氯化锰10mg，硼酸50mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3，121℃灭菌15min；

步骤、复合芽孢杆菌菌粉的制备

取出解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌各芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，30℃培养24小时。在平板下挑取单个菌落接种划线到茄子瓶中的LB培养基中，在培养箱中30℃培养24小时。将茄子瓶中的菌苔用无菌水洗脱，采用5%的接种量，接种至100L种子发酵罐中，装液量为65L芽孢杆菌液体种子培养基，每分钟通气量为液气比为1：0.6，开搅拌180r/min，30℃通气培养12-16小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过40亿cfu/ml，即可作为芽孢杆菌液体菌种；以5-10%的接种量转接至1000L发酵罐，装液量为600L芽孢杆菌发酵培养基，前8小时，每分钟通气量为液气比为1：0.8，8小时后每分钟通气量为液气比为1：1.1，开搅拌120r/min，30℃培养24-36小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过90亿cfu/ml，即可结束发酵，离心除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌体浓度不低于100亿cfu/g，即为芽孢杆菌菌粉；

其中，所述LB液体发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L；pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；

其中，芽孢杆菌液体种子培养基：葡萄糖10g/L，豆粕粉8g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，pH7.2；

其中，芽孢杆菌发酵培养基：玉米粉22g/L，豆粉34g/L，硫酸镁3g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.3g/LpH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

复合芽孢杆菌菌粉为解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌各种芽孢杆菌单一培养制成纯菌粉后，等比例混合后所得；

步骤、酵母菌与乳酸菌混合菌粉的制备

采用酵母菌与乳酸菌按以下步骤进行培养：

A、酵母菌种子液的制备：取出酵母菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种200毫升PDA培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时。种子采用10%的接种量，接种至2LPDA液体培养基中，30℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过2亿cfu/ml，即可作为酿酒酵母菌种子液体；

B、乳酸菌种子液的制备：取出乳酸菌菌种保藏管，用MRS固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有400毫升MRS液体培养基的500毫升三角瓶中，在培养箱中30℃静置培养48小时。种子采用5%的接种量，接种至装有4LMRS培养基的5L三角瓶中，30℃静置培养48小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过10亿cfu/ml，即可作为乳酸菌种子液；

C、混合发酵培养：将上述制备的酵母菌种子液体与乳酸菌种子液按1：1的比例混合均匀后作为混合菌种，以5%-10%的接种量接种至已经灭菌的固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的固体发酵培养基堆在无菌发酵室内，物料高度为25-35cm，用灭菌的塑料膜将其密封，控温30-33℃，每8小时掀开塑料膜，翻料一次，培养40-48小时，待料体表明有大量白点，有明显的酒香味，检测酵母菌含量不低于10亿cfu/g，乳酸菌含量不低于40亿cfu/g，即可停止发酵，烘干或晒干，即得到酵母菌与乳酸菌混合菌粉；

其中，所述的PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，固体培养基中加入琼脂2%；

其中，所述的MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7]2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.2~6.6；固体培养基中加琼脂20g；

其中，所述的固体发酵培养基：麸皮850kg，沸石粉50kg，面粉100kg，水800kg；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；

其中，所述的酵母菌为酿酒酵母，面包酵母，啤酒酵母，产朊假丝酵母，热带假丝酵母中的一种；

其中，的述的乳酸菌为植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，保加利亚乳杆菌，罗伊氏乳杆菌中的一种；

步骤、混合粉碎

按脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉50份，复合芽孢杆菌菌粉40份，酵母菌与乳酸菌混合菌粉10份的重量比，混合均匀，粉碎过100目筛，即得到复合微生物制剂。

实施例2

广州市番禺区沙湾镇一无名黑臭河涌原位治理试验案例：

该河涌河道周边有工业区和生活区，接纳大量工业废水与生活污水，大量污染物进入河道，严重超出了河道水体的自净能力，底泥大量淤积，水体常年处于黑臭状态。在河道中选取100米长的河段，两边截断。采用本发明的复合微生物制剂进行底泥原位修复试验。河道面积宽约6米，按整个河道面积为600平米计算，每平米撒复合微生物菌剂为8g/平方米。同时洒入硝酸钙的质量为10g/平方米。

试验结果如下：

河涌表观：在施入复合微生物制剂后，第二天开始水体发白，第三天开始，底泥明显不黑，河道黑臭现象明显改善，第四天开始取样，明显底泥已经不黑，少许臭味，底泥厚度明显变少，试验完成后，水体变绿透明度已经达到45cm以上。水体从第6天开始发绿，应该有藻类开始生长，其水质变化如表1，从表1可以看出，在使用复合微生物制剂第16天后，水体中的COD，TN，TP的去除率可达到77%以上；从表2底泥变化中也可看出底泥中的AVS（硫化物）在第4天即去除率已经达到了97.78%，到第8天已经去除率达到了99.33%，经过16天的氧化，其底泥厚度被削减了42cm，底泥中的有机物去除了接近70%。底泥总氮也去除率超过了78%。

表1河涌水体水质指标

表2河涌底泥指标

实施例3

利用复合微生物制剂对顺德区某河涌水体治理效果

佛山市顺德区某生活区河涌，河水常年发黑发臭，COD超标，氨氮，总磷超标严重。投菌量为5克/平方米，硝酸钙5克/平方米。一周后进行检测，结果如表3，投入微生物制剂与硝酸钙后，两天后，就无黑臭现象，经过一周的反应，水体COD下降比较明显，从190mg/L下降至35.5mg/L，达到了四类水的标准，氨氮与总磷也下降明显，基本上整个河流水色清爽，无黑臭现象，水体透明度达到了50cm以上，底泥有点灰，有底层鱼在活动。

表3利用复合微生物制剂对顺德区某河涌水体治理效果

Claims (3)

1.一种强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂，其特征在于主要以下重量份的原料混合制备而成：

脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉40-80份，复合芽孢杆菌菌粉10-60份，酵母菌与乳酸菌混合菌粉10-60份。

2.根据权利要求1所述的一种强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤：脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉的制备

A、脱氮硫杆菌双层平板种子活化培养：将脱氮硫杆菌种在下层固体脱氮硫杆菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，30℃培养5-7天，待划线的菌线长出菌苔，即可作为活化的脱氮硫杆菌种；

B、桃红荚硫菌双层平板种子活化培养：将桃红荚硫菌菌种在下层固体桃红荚硫菌培养基中划线后，再在上面倒一层琼脂培养基，25-35℃光照培养5-7天，待划线的菌落变红并长出菌苔，即可为活化的菌种；

C、脱氮硫杆菌种子培养：将活化的脱氮硫杆菌种接种至脱氮硫杆菌种子液体培养基中，温度30℃，厌氧培养5-7天，检测种子的OD420≥0.35，即为脱氮硫杆菌种子培养液；

D、桃红荚硫菌种子培养：将活化的桃红荚硫菌菌种接种至桃红荚硫菌种子液体培养基中，温度30-35℃，光照强度为：3000-8000lux，光照厌氧培养6-10天，检测种子的OD650≥1.2，即为桃红荚硫菌种子培养液；

E、发酵培养：将脱氮硫杆菌种子培养液与桃红荚硫菌种子培养液以1：4-4：1的比例混合作为混合种子培养液，将混合种子培养液与发酵培养基以1：5-1：20的接种量接种，培养温度30℃，在光照发酵罐中厌氧培养，光照强度为：3000-8000lux，搅拌速度为120转/分钟，待培养至第二天，开始流加营养液，在48小时内流加完营养液的体积为发酵培养基的2%，用灭菌的碳酸钠溶液与醋酸溶液调pH7-8，培养5-7天，待检测其OD650≥4，活菌数≥40亿cfu/ml，其中桃红荚硫菌不低于20亿cfu/ml，涂片镜检脱氮硫杆菌所占总菌数不低于30%，即可放罐，过滤后用轻质碳酸钙吸附，调节菌浓度为40亿cfu/g，20-30℃风干，即得脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉；

其中，所述的脱氮硫杆菌种子液体培养基：五水合硫代硫酸钠3.0g，硝酸钾2.0g，碳酸氢钠2.0g，磷酸二氢钾1.0g，六水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.005g，氯化铵0.2g，溶于1000mL水中，调节pH到7.0，121℃灭菌30min备用；

其中，所述的固体脱氮硫杆菌培养基为脱氮硫杆菌种子液体培养基中加2%的琼脂；

其中所述的桃红荚硫菌种子液体培养基为：氯化铵0.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-5g/L,五水合硫代硫酸钠1-3g/L，氯化钠0.5-4g/L,调节pH到7.0，121℃灭菌30min备用；

其中，所述的固体桃红荚硫菌培养基为桃红荚硫菌种子液体培养基中加2%的琼脂；

其中，所述的琼脂培养基为：琼脂20克，水1L，115℃灭菌30min；

其中，所述的发酵培养基：五水合硫代硫酸钠3g/L，硝酸钾2g/L，氯化铵1g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠4g/L，无水醋酸钠4g/L，微量元素10ml/L,pH到7.2，121℃灭菌30min；

其中，所述的流加营养液为：五水硫代硫酸钠200g/L，硝酸钾100g/L，121℃灭菌15min；

其中，所述的微量元素组成为：EDTA二钠0.2g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌50mg，氯化锰10mg，硼酸50mg，氯化钴20mg，氯化铜1mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，蒸馏水1000毫升，PH3，121℃灭菌15min；

步骤、复合芽孢杆菌菌粉的制备

取出解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌各芽孢杆菌菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，30℃培养24小时，在平板下挑取单个菌落接种划线到茄子瓶中的LB培养基中，在培养箱中30℃培养24小时，将茄子瓶中的菌苔用无菌水洗脱，采用5%的接种量，接种至100L种子发酵罐中，装液量为65L芽孢杆菌液体种子培养基，每分钟通气量为液气比为1：0.6，开搅拌180r/min，30℃通气培养12-16小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过40亿cfu/ml，即可作为芽孢杆菌液体菌种；以5-10%的接种量转接至1000L发酵罐，装液量为600L芽孢杆菌发酵培养基，前8小时，每分钟通气量为液气比为1：0.8，8小时后每分钟通气量为液气比为1：1.1，开搅拌120r/min，30℃培养24-36小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过90亿cfu/ml，即可结束发酵，离心除水，剩下菌体加轻质碳酸钙，调节菌体浓度不低于100亿cfu/g，即为芽孢杆菌菌粉；

其中，所述LB液体发酵培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L；pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；

其中，芽孢杆菌液体种子培养基：葡萄糖10g/L，豆粕粉8g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，pH7.2；

其中，芽孢杆菌发酵培养基：玉米粉22g/L，豆粉34g/L，硫酸镁3g/L，磷酸氢二钾2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锰0.3g/LpH7.2；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30min；

复合芽孢杆菌菌粉为解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌各种芽孢杆菌单一培养制成纯菌粉后，等比例混合后所得；

步骤、酵母菌与乳酸菌混合菌粉的制备

采用酵母菌与乳酸菌按以下步骤进行培养：

A、酵母菌种子液的制备：取出酵母菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种200毫升PDA培养基中，在培养箱中30℃震荡培养24小时；种子采用10%的接种量，接种至2LPDA液体培养基中，30℃震荡培养20-28小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过2亿cfu/ml，即可作为酿酒酵母菌种子液体；

B、乳酸菌种子液的制备：取出乳酸菌菌种保藏管，用MRS固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时；在平板下挑取单个菌落接种至装有400毫升MRS液体培养基的500毫升三角瓶中，在培养箱中30℃静置培养48小时；种子采用5%的接种量，接种至装有4LMRS培养基的5L三角瓶中，30℃静置培养48小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过10亿cfu/ml，即可作为乳酸菌种子液；

C、混合发酵培养：将上述制备的酵母菌种子液体与乳酸菌种子液按1：1的比例混合均匀后作为混合菌种，以5%-10%的接种量接种至已经灭菌的固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的固体发酵培养基堆在无菌发酵室内，物料高度为25-35cm，用灭菌的塑料膜将其密封，控温30-33℃，每8小时掀开塑料膜，翻料一次，培养40-48小时，待料体表明有大量白点，有明显的酒香味，检测酵母菌含量不低于10亿cfu/g，乳酸菌含量不低于40亿cfu/g，即可停止发酵，烘干或晒干，即得到酵母菌与乳酸菌混合菌粉；

其中，所述的PDA培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，固体培养基中加入琼脂2%；

其中，所述的MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7]2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，蒸馏水1000mL，pH6.2~6.6；固体培养基中加琼脂20g；

其中，所述的固体发酵培养基：麸皮850kg，沸石粉50kg，面粉100kg，水800kg；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30min；

其中，所述的酵母菌为酿酒酵母，面包酵母，啤酒酵母，产朊假丝酵母，热带假丝酵母中的一种；

其中，的述的乳酸菌为植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，干酪乳杆菌，保加利亚乳杆菌，罗伊氏乳杆菌中的一种；

步骤、混合粉碎

按脱氮硫杆菌与桃红荚硫菌混合菌粉40-80份，复合芽孢杆菌菌粉10-60份，酵母菌与乳酸菌混合菌粉10-60份的重量比，混合均匀，粉碎过100目筛，即得到复合微生物制剂。

3.根据权利要求1所述的一种强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂，其特征在于所述的治理黑臭河流施用方法为：向黑臭河流均匀洒复合微生物制剂的量为2-40克/平方米并同时，向河流底泥加入0.5-3倍复合微生物制剂量的硝酸钙。